Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi att effektivt diskriminera fluorescens signaler

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59448
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

Summary

Spectral Imaging har blivit en pålitlig lösning för identifiering och separation av multipla fluorescenssignaler i ett enda prov och kan lätt urskilja signaler av intresse från bakgrund eller autofluorescence. Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging förbättrar denna teknik genom att minska den nödvändiga bilden förvärvs tid samtidigt öka signal-brus-förhållande.

Abstract

Flera tekniker förlitar sig på detektion av fluorescenssignaler för att identifiera eller studera fenomen eller för att belysa funktioner. Separation av dessa fluorescenssignaler var bevisat besvärliga fram till tillkomsten av Hyperspektrala avbildning, där fluorescens källor kan separeras från varandra samt från bakgrunds signaler och autofluorescence (ges kunskap om deras spektrala signaturer). Men traditionella, utsläpp scanning Hyperspektrala avbildning lider av långsamma förvärvs tider och låg signal-brus-förhållanden på grund av den nödvändiga filtreringen av både excitation och utsläpp ljus. Det har tidigare visats att excitation-scanning Hyperspektrala Imaging minskar den nödvändiga förvärvs tiden samtidigt öka signal-brus-förhållandet av förvärvade data. Med hjälp av kommersiellt tillgänglig utrustning beskriver detta protokoll hur man monterar, kalibrerar och använder en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi system för separation av signaler från flera fluorescenskällor i ett enda prov. Även om det är mycket tillämpligt på mikroskopisk avbildning av celler och vävnader, kan denna teknik också vara användbar för alla typer av experiment som utnyttjar fluorescens där det är möjligt att variera excitation våglängder, inklusive men inte begränsat till: kemisk avbildning, miljötillämpningar, ögonvård, livsmedelsvetenskap, forensisk vetenskap, medicinsk vetenskap och mineralogi.

Introduction

Spektralavbildning kan utföras på olika sätt och refereras till av flera termer1,2,3,4. I allmänhet avser spektral avbildning data som erhållits i minst två rumsliga dimensioner och en spektraldimension. Multispektrala och Hyperspektrala avbildning kännetecknas oftast av antalet våglängdsband eller om spektralbanden är sammanhängande1. För detta program definieras Hyperspektrala data som spektrala data som erhållits med sammanhängande våglängd band uppnås genom avstånd av centrum våglängder inte mindre än halva full bredd på halva Max (FWHM) av varje bandpass filter som används för excitation (dvs 5 nm mittvåglängdsavstånd för bandpass-filter med 14-20 nm bandbredder). Den sammanhängande karaktären hos data banden möjliggör en översampling av DataSet, vilket säkerställer att Nyquists kriterier uppfylls vid provtagning av spektraldomänen.

Hyperspektrala Imaging utvecklades av NASA under 1970-och 1980-talen i samband med den första LANDSAT Satellite5,6. Att samla in data från flera sammanhängande spektralband tillät uppkomsten av ett utstrålande spektrum av varje pixel. Identifiering och definition av strålningsspektrat av enskilda komponenter gjorde det möjligt att inte bara detektera ytmaterial genom sina karakteristiska spektra, utan också tillåtet för avlägsnande av mellanliggande signaler, såsom variationer i signalen på grund av atmosfäriska förhållanden. Konceptet att detektera material med hjälp av deras karakteristiska spektra tillämpades på biologiska system i 1996 när schröck et al. använde kombinationer av fem olika fluoroforer och deras kända spektra för att särskilja märkta kromosomer i en process som kallas spektralkaryotypning7. Denna teknik utarbetades på 2000 av Tsurui et al. för fluorescens Imaging av vävnadsprover, med hjälp av sju fluorescerande färgämnen och singular värde nedbrytning för att uppnå spektral separation av varje pixel i linjära kombinationer av spektra i referens bibliotek8. Liknar deras fjärranalys motsvarigheter, kan bidraget från varje känd fluorophore beräknas från Hyperspektrala bilden, ges a priori information om spektrumet av varje fluorophore.

Hyperspektral avbildning har också använts inom jordbruksområdet9, astronomi10, biomedicin11, kemisk avbildning12, miljötillämpningar13, ögonvård14, Food Science15, forensisk vetenskap16,17, medicinsk vetenskap18, mineralogi19, och övervakning20. En viktig begränsning av nuvarande fluorescensmikroskop Hyperspektrala avbildningssystem är att standarden Hyperspektrala avbildningsteknik isolerar fluorescens signaler i smala band av 1) först filtrering excitation ljus för att kontrollera prov excitation, sedan 2) ytterligare filtrering avges ljus för att separera fluorescensutsläpp i smala band som senare kan separeras matematiskt21. Filtrering både excitation belysning och utsända fluorescens minskar mängden tillgänglig signal, vilket sänker signal-brus-förhållande och kräver långa förvärvs tider. Den låga signalen och långa förvärvs tider begränsar tillämpligheten av Hyperspektrala avbildning som ett diagnostiskt verktyg.

En bildbehandlings-modalitet har utvecklats som utnyttjar hyperspektral avbildning men ökar den tillgängliga signalen, vilket minskar den nödvändiga förvärvs tiden21,22. Denna nya modalitet, kallad excitation-scanning Hyperspektrala avbildning, förvärvar spektrala bilddata genom att variera excitation våglängd och samla ett brett spektrum av utsläppt ljus. Det har tidigare visats att denna teknik ger order av magnitud ökar i signal-brus-förhållande jämfört med utsläpps skanning tekniker21,22. Ökningen av signal-brus-förhållandet beror till stor del på den breda bandpass (~ 600 Nm) av utsläpps ljus detekteras, medan specificitet tillhandahålls genom filtrering endast excitation ljus i stället för fluorescensutsläpp. Detta gör att alla avgivna ljus (för varje excitation våglängd) för att nå detektorn21. Dessutom kan denna teknik användas för att diskriminera autofluorescence från exogena etiketter. Dessutom minskar förmågan att minska förvärvs tiden på grund av ökad detekterbar signal risken för foto blekning samt möjliggör spektrala skanningar till en förvärvsfrekvens som är godtagbar för spektral video avbildning.

Målet med detta protokoll är att fungera som en datainsamling guide för excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi. Dessutom ingår beskrivningar som hjälper till att förstå ljusbanan och hårdvaran. Beskrivs också är genomförandet av öppen källkod för en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging Mikroskop. Slutligen finns beskrivningar för hur man kalibrerar systemet till en NIST-spårbar standard, justerar program-och maskinvaruinställningar för korrekta resultat och avblandar den upptäckta signalen i bidrag från enskilda komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. apparat uppsättning

  1. Ljuskälla: Välj en bredbandspektral ljuskälla med hög uteffekt och hög kollimation (en 300 W XE Arc-lampa användes för dessa studier).
  2. Slutare (tillval): Lägg till en slutare till den optiska banan för att reducera foto blekning för fotografering med tidsförlopp.
  3. Avstämbara filtersystem: införliva en mekanisk trimmontering och Thin-Film avstämbara filter (tftf) inställd för att möjliggöra önskad våglängd-justerbar excitation Range (t. ex., 360-485 nm).
  4. Mikroskop: Använd en inverterad fluorescens Mikroskop inklusive en motoriserad Dichroic filter torn och styrenhet.
    1. Fluorescensfilterkub: montera en lång pass fluorescens-filterkub. För bästa resultat, Välj en Dichroic spegel och lång-pass utsläpp filter på samma våglängd för att uppnå optimal separation av excitation från utsläpp ljus (t. ex., 495 nm).
    2. Syfte: Använd ett lämpligt apokromatiskt mål för att säkerställa en enhetlig fokusering på det våglängdsområde som används för experimentet (ett mål på 60 x vatten användes för denna studie).
    3. Automatiserat skede (valfritt): Använd en automatiserad fas för snabb provtagning av flera fält av vy och/eller mycket stora fält genom bild sömnad. Kalibrera scenen med målet och kameran.
  5. Kamera: Välj en lämplig kamera för att uppnå den rumsliga upplösningen, känsligheten och bullerkraven för experimentet (det här systemet utnyttjade en sCMOS-kamera med hög känslighet).

2. förvärvs programvara

  1. Välj ett programpaket som tillåter oberoende kontroll av varje maskinvarukomponent, till exempel Micro-Manager.
    1. Skapa konfigurationsfilen: konfigurationsfilen är en sparad uppsättning instrument och instruktioner som Micro-Manager kommer att ladda för att driva systemets hårdvara. Om du vill skapa en konfigurationsfil klickar du på verktyg ≫ guiden maskinvarukonfiguration.
      1. I steg 1 klickar du på Skapa ny konfigurations ≫ bredvid Fortsätt. Observera att användaren kan välja att ändra eller utforska befintlig konfiguration om en sådan redan är tillgänglig.
      2. I steg 2 bläddrar du till listan över tillgängliga enheter för att hitta enheterna som ska styra via mikro-hanterare, till exempel Mikroskop, lampa, scen, slutare och kamera. När det är markerat klickar du på Lägg till... knappen för att lägga till enheten i listan över installerade enheter. Då öppnas ett nytt fönster.
        1. Ange enhetens etikett i rutan etikett . (t. ex. sCMOS-kamera)
        2. Välj lämplig COM-port för varje enhet under värde. Detta medför att en lista över Enhetsegenskaper visas längst ned i fönstret.
        3. Lämna enhetsegenskaperna till standardinställningarna. Observera att anpassade värden för varje enhetsegenskap kan anges efter behov.
        4. När varje enhet läggs till, klicka på Nästa knappen för att fortsätta till nästa steg. Observera att om några enheter utelämnas eller behöver ändras, kan konfigurationsfilen ändras senare enligt beskrivningen i steg 2.1.1.1.
      3. I steg 3 använder du rullgardinsmenyerna för att välja standard kamera, slutare och fokus steg. Om Auto-slutaren önskas, klicka på kryss rutan under den fokus scenen nedrullningsbara listan. Om Z-fasens fokus riktning är känd väljer du den i listrutan under steg fokus riktningar (avancerat). Annars lämnar du standardvärdet som Okänt.
      4. I steg 4 dubbelklickar du på rutorna under rubriken fördröjning [MS] för att ställa in fördröjningar som är associerade med de automatiserade enheterna, till exempel förseningar på 100 ms för lampan, scenen och slutaren, och en 250 ms-fördröjning för kommandon till den mekaniska justerings enheten för att ta hänsyn till mekanisk kopplingstid mellan filtren.
      5. I steg 5 tilldelar du etiketter för tillstånds enheterna. Konfigurationen för excitation-scanning Mikroskop systemet använder etiketter i filter blocket för att identifiera varje fluorescensfilterkub (t. ex. läge 0 motsvarar etiketten Bright, den tomma filterkuben som används vid ljus fälts avbildning; medan tillstånd 3 motsvarar etiketten 495 nm och anpassad 495 nm Dichroic filterkub som används för att separera excitation och emissions ljus vid 495 nm). Etiketter används också i den mekaniska tuning montering för att lagra växling kommandon för varje excitation våglängd (t. ex. stat 0 motsvarar 340 nm excitation våglängd tuning kommando för den mekaniska tuning församling).
      6. I steg 6 klickar du på knappen Bläddra bredvid rutan konfigurationsfil för att välja en spara plats och filnamn förkonfigurationsfilen. Klicka på Slutför för att spara konfigurationsfilen.
    2. Startgrupper och för inställningar: Micro-Manager kan lagra olika grupper inom varje konfigurationsfil för att aktivera eller ändra en delmängd av maskinvaran. Till exempel, en "systemstart" grupp och förinställd kombination kommer att lagra standardinställningar som Binning storlek och avläsning priser för kameran.
      1. Skapa en grupp (t. ex. system) genom att klicka på + i huvudfönstret i grupp underavsnittet.
      2. Kontrollera eventuell användning i grupp? rutor i gruppen som kräver att ett standardvärde ställs in (t. ex. Binning i den tillhörande standard kameran).
      3. Skapa en ny för inställning (t. ex. "Start") genom att klicka på + i huvudfönstret i det förinställda underavsnittet.
      4. Varje ruta som kontrolleras i steg 2 visas som ett förinställt alternativ här. Välj ett standardvärde som ska läsas in för varje markerad ruta.
    3. Gruppera och för inställningar för magnetisering våglängder: mikro-chef fester varje magnetisering våglängd som dess eget kanaliserar med det dess egna våglängd växling befaller; Därför måste var och en sparas som sin egen för inställning.
      1. Skapa en ny grupp för att innehålla en uppsättning önskade excitation våglängder (t. ex., "495 nm Dichroic")
      2. Markera kryssrutan Använd i grupp? med namnet Label som motsvarar VF-5-enheten.
      3. Skapa en ny för inställning uppkallad efter varje excitation våglängd (t. ex., "340 nm").
      4. Tilldela varje för inställning lämpligt egenskapsnamn och förinställt värde (t. ex. egenskapsnamn: "label"; förinställt värde: "340 nm").
    4. Flerdimensionell förvärvs verktyg: Klicka påMulti-D ACQ.nära den övre vänstra delen av Micro-Manager-fönstret för att öppna ett anpassningsbart verktyg att använda för att fånga en bild av provet vid varje excitation våglängd med ett klick på en enda knapp. Det finns flera anpassningsalternativ för att konstruera förvärvet exakt som önskat.
      1. Timepoints (används inte i det här exemplet): för studier utan tids fördröjnings komponent lämnar du rutan avmarkerad. Om tids fördröjnings studier önskas, kryssa i denna ruta. Om markerad anger du hur många gånger du vill utföra resten av förvärvs inställningarna i rutan nummer . Ställ in tiden mellan successiva förvärv genom att ange varaktigheten i rutan intervall och välja rätt enhet (millisekunder, sekunder eller minuter, vanligtvis sekunder).
      2. Flera positioner (XY; används inte i det här exemplet): för studier av en enda XY-position, lämna rutan avmarkerad. Om du vill ha flera XY-positioner markerar du rutan och klickar på knappen Redigera befattnings lista för att öppna ett separat fönster. Flytta scenen till varje önskad plats och klicka på knappen Markera för att spara positionen i programvaran. Upprepa tills alla önskade XY-positioner har markerats. Stäng det här fönstret för att fortsätta.
      3. Z-stackar (diabilder; används inte i det här exemplet): för studier av en enda Z-position, lämna rutan avmarkerad. Om du vill ha flera Z-positioner markerar du rutan. Flytta scenen till önskad början Z position och klicka på knappen Ange bredvid Z-start -rutan. Flytta scenen till önskad avslutande Z-position och klicka på knappen Ställ in bredvid z-slutrutan . Ange önskad steg storlek (i mikrometer) i rutan Z-steg .
      4. Kanaler: Kontrollera att rutan kanaler är markerad. Här, kanaler är de namn som ges till de enskilda excitation våglängder. Tillgängliga "kanaler" motsvarar de "grupper" som beskrivs i steg 2.1.2 och 2.1.3.
        1. Grupp: Klicka på listrutan för att välja en grupp som du vill välja tillgängliga excitation våglängder (t. ex., 495 nm Dichroic).
        2. Klicka på rutan Håll slutaren öppen för att hålla slutaren öppen mellan anskaffningar för varje kanal. Observera att slutaren fortfarande kommer att stängas mellan successiva spektrala skanningar om denna ruta är markerad, förutsatt att autoslutaralternativet också väljs i huvudfönstret.
      5. Klicka på knappen ny om du vill lägga till kanaler i anskaffnings listan. Observera att ta bort -knappen kan användas för att ta bort alla kanaler som inte längre önskas och att upp och ner kan användas för att ändra ordning på alla valda kanaler.
        1. Se till att använda? kryssrutan är markerad för varje önskad våglängd i spektralskanningen.
        2. Konfiguration: Klicka på rullgardinsmenyn under konfiguration och välj den första våglängd i önskat spektralområde (t. ex. 340 nm).
        3. Exponering: dubbelklicka på rutan under exponering och mata in önskad exponeringstid för den valda våglängden (t. ex., "100" för 100 MS). Se avsnitt 5 ("data insamling") för förslag för att välja lämpliga exponeringstider.
        4. Z-offset (ej tillämpligt i spektralskanning): lämna denna ruta tom (vid 0) när du utför en spektralskanning.
        5. Z-stack: se till att denna ruta är markerad för varje våglängd i spektralområdet om du utför en Z-stack.
        6. Skip fr. (gäller inte i en spektralskanning): lämna denna ruta tom (vid 0) när du utför en spektralskanning. Observera att det kan vara lämpligt att selektivt hoppa över ramar i händelse av att en eller några excitation våglängder är betydligt kraftfullare än andra eller om enskilda excitation våglängder visa sig vara särskilt fototoxisk.
        7. Färg: lämna den här rutan tom när du utför en spektralskanning. Observera att färger kan väljas för enskilda våglängd band för datavisualisering ändamål, men färgen är olämplig för efterföljande spektrala unmixing.
        8. Upprepa dessa steg tills varje önskad magnetisering våglängd inom givna spektrala skanningsområdet tillsätts.
      6. Förvärvs order: Klicka på rullgardinsmenyn för att välja i vilken ordning ovanstående alternativ (2.1.4.1-2.1.4.5) kommer att utföras. För spektrala skanningar som den som visas här är förvärvs ordningen helt enkelt en kanal. Observera att ytterligare alternativ visas när ytterligare rutor kontrolleras inom det flerdimensionella anskaffnings verktyget [timepoints, flera positioner (XY) och Z-stackar (segment)] och tillåter valet av antingen position eller tid först, följt av antingen segment eller Kanal.
      7. Autofokus (används inte i det här exemplet): om flera positioner (XY) väljs, finns flera olika stilar av autofokusering tillgängliga. Klicka på knappen alternativ och välj en autofokusmetod i listrutan bredvid knappen Stäng .
      8. Sammanfattning: granska det här fönstret för en sammanfattning av antal tidspunkter, XY-positioner, Z-segment, kanaler, totalt antal bilder, totalt minne, skannings varaktighet och anskaffnings order för att säkerställa att informationen i listan matchar förväntade anskaffnings inställningar.
      9. Spara bilder: Kontrollera att den här rutan är markerad för att spara data som samlas in med hjälp av det flerdimensionella anskaffnings verktyget.
        1. Klicka på... knappen bredvid katalog roten för att välja en katalog rot där filerna ska sparas. Namnge katalog roten på ett sätt som beskriver relevanta detaljer i experimentet (t. ex. GCaMP-Luftvägsglatta muskelceller).
        2. Ange ett namn i rutan bredvid namnprefix som beskriver det aktuella bild förvärvet (t. ex. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Det är tillrådligt att skapa ett namnprefix som identifierar synfält och exponeringstid, samt annan relevant information, till exempel objektet och Dichroic filter som används. Observera att den första bildstapeln som tas med dessa inställningar kommer att sparas med "_ 1" efter namnprefixet. Alla efterföljande stack tagna med samma katalog rot och namnprefix kommer att sparas med "_ n", där "n" är antalet gånger en stapel har tagits med detta namn i katalogen.
        3. Klicka på separera bildfiler för att se till att bilden som genereras vid varje magnetisering våglängd sparas.
      10. Spara som: Klicka på knappen Spara som... längst upp till höger i det flerdimensionella anskaffnings verktyget för att spara dessa förvärvs inställningar för enkel framtida användning. Observera att katalogens rot-och namnprefix också kommer att sparas.
      11. Förvärva: slutligen, klicka på förvärva! knappen för att börja förvärva bilder enligt förvärvs inställningarna som valts ovan.

3. korrigering av spektralrespons (tillval):

  1. Spektrala utgångs korrektion kan utföras för att kalibrera systemets spektrala respons till en känd standard, såsom en NIST-spårbar lampa eller annan NIST-spårbar standard eller instrument. Detta steg är särskilt viktigt om resultaten jämförs med andra spektrometrar eller mellan olika laboratorier. Denna process har rapporterats i detalj tidigare21,23.
    1. Använd en spektrometer som är kalibrerad till en NIST-spårbar ljuskälla (t. ex. LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) eller annan NIST-spårbar standard för att förvärva spektroradiometriska effekten av belysningen mätt i provtagnings stadiet. Utför en separat korrigering för varje kombination av ljuskälla inställning, Dichroic spegel, och objektiva. Använd en integrerande sfär kopplad till spektrometern för att exakt mäta vidvinkel belysning från mikroskopet mål.
    2. Använd en integrationsmetod, till exempel trapetsregeln, för att integrera spektroradiometriska data över våglängder belysta. En 40 Nm bandbredd för integration centrerad kring centrum våglängd är tillräcklig för de flesta filter som har en nominell bandbredd på mellan 14-20 nm full bredd på halv-maximum (FWHM). Det integrerade värdet representerar intensiteten i spektralbelysningen vid varje magnetisering våglängd band.
    3. Rita den integrerade intensiteten för varje våglängd som en funktion av excitation Center våglängd för att möjliggöra visualisering av den spektrala belysningen intensitet profil.
    4. Bestäm våglängdsbandet med den lägsta integrerade intensiteten.
    5. Normalisera profilen för spektralbelysningsintensitet genom att dividera den lägsta integrerade intensiteten med den integrerade intensiteten för varje våglängd för att generera en våglängd beroende korrektionsfaktor.

4. provberedning

  1. Förbered ett "tomt" prov (t. ex. Placera en glastäckslip i cell kammaren och tillsätt 1 mL buffert). Denna buffert har beskrivits tidigare24.
  2. Förbered ett ej etikettmärkt prov för att fastställa ett prov autofluorescence (t. ex. Placera en glastäckslip som innehåller omärkta luftvägarna glatta muskelceller25,26 i cell kammaren och tillsätt 1 ml buffert).
  3. Förbered ett separat, enkelmärkt prov för varje fluorescerande etikett som används i experimentet enligt följande:
    1. Tillsätt utspädd mitokondriell etikett till buffert för att uppnå en 100 nM-koncentration. Lägg till denna buffert till täckslip som innehåller luftvägarna glatta muskelceller. Inkubera i 20 min vid 20-25 ° c. Flytta täckbrickan till cell kammaren och tillsätt 1 mL buffert. Observera att den optimala koncentrationen av mitokondriell etikett kommer att variera beroende på faktorer som tillverkare, tillhörande färg, och önskad specificitet.
    2. Flytta en täckslip som innehåller luftvägarna släta muskelceller transfekterade med gcamp sonden27 till cell kammaren och tillsätt 1 ml buffert.
  4. Förbered ett eller flera experimentella prover som innehåller en blandning av de önskade fluorescerande etiketterna.
    1. Tillsätt 1 ml buffert (100 nm koncentration av mitokondriell etikett) till en täckslip som innehåller luftvägarna släta muskelceller transfekterade med gcamp sonden och inkubera i 20 min vid 20-25 ° c. Flytta täckbrickan till cell kammaren och tillsätt 1 mL buffert.

5. data insamling:

  1. Kontrollera att rätt Dichroic beamsplitter (t. ex. 495 nm Dichroic filterkub), mål (t. ex., 60x vatten mål), och kamera (sCMOS kamera) är valda.
  2. Fyll på provet på scenen.
  3. Dubbelklicka på rutan bredvid exponering [MS] och skriv "100" för att ställa in exponeringstiden på 100 MS. Observera att exponeringstiden kan behöva ökas eller minskas beroende på provets fluorescensintensitet.
  4. Välj 475 nm från rullgardinsmenyn i Micro-Manager huvudfönstret för inledande prov visning. Observera att 475 nm kanske inte är den optimala våglängden för prov visning eller avgöra om övermättnad kommer att inträffa i hela bild stacken.
  5. Klicka på Live om du vill visa exemplet.
    1. Klicka på knappen automatisk visning av intensitetsintervall automatiskt bredvid histogrammet längst ned i fönstret för att få de lägsta och högsta värdena till meningsfulla visuella intervall.
  6. Använd mikroskopets fokus rattar att fokusera på provet. Det är ofta bra att hitta kanten av provet för att underlätta fokusering. Provet fokuseras när kant funktionerna i bilden ser skarpa ut. Observera att det kan vara nödvändigt att klicka på Auto -knappen flera gånger under fokuseringen för att underlätta visningen av fluorescensbilden. Dessutom, vissa användare kan finna det lättare att fokusera på provet om mikroskopet är i överföringsläge.
    1. Vid fokusering i transmissions läge, för säkerhet, se först till att den spektrala ljuskällan inte sänder ljus till okularen innan du justerar ljusbanan för transmissions avbildning. Observera också att det kan finnas små avvikelser mellan fokus för överföring och fluorescens bilder. När acceptabel fokusering har uppnåtts, konfigurera om ljusbanan för spektralfluorescensavbildning.
  7. Klicka på multi-D ACQ. -knappen längst upp till vänster i fönstret för att öppna det flerdimensionella anskaffnings verktyget (beskrivs och konfigureras i avsnitt 2).
  8. Välj ett lämpligt spektralområde för spektralförvärv (t. ex. 360-485 Nm för 495 nm Dichroic filter) genom att klicka på knappen load... uppe till höger i det flerdimensionella förvärvs verktyget och navigera till magnetisering inställningarna sparat tidigare (i steg 2.1.4.10). Se diskussion för information om lämpliga spektralområden.
  9. Hämta en bakgrund/tom bild som inte innehåller fluorescensdata som ska användas för bakgrunds-och brus subtraktion. Detta kan utföras med ett tomt prov (steg 4,1) eller genom att navigera till en tom region i ett experimentellt prov. Som beskrivs i steg 5,6, är detta enklast uppnås genom att hitta kanten av provet sedan placera den så att kanten är centrerad inom synfältet.
    1. När anskaffnings inställningarna har bekräftats och en bakgrunds region är synlig, klicka på knappen förvärva! för att få en spektralbildstapel som innehåller bakgrund och brus som ska användas för subtraktion senare. Det bör noteras att proverna sannolikt kommer att ha mer intensiv fluorescens bort från kanten av provet. Det kan vara lämpligt att flytta om provet för att hitta den "ljusaste" regioner och utföra flera test bild stackar för att fastställa lämpliga förvärvs tider och undvika överexponering.
  10. Ta en enda bildstapel på en region av provet som verkar ha intensiv fluorescens för att säkerställa att ingen kombination av våglängder och att exponeringstider resultera i överexponering.
  11. Använd ImageJ för att bekräfta att inga våglängder innehåller överexponerade pixlar.
    1. I ImageJ klickar du på fil ≫ importera ≫ bildsekvens och navigera till mappen som innehåller de spektrala bilderna tagna i steg 5,10. Då öppnas ett nytt fönster. Klicka på rutan bredvid antal bilder och ange det antal våglängder som ingår i spektralskanningen (t. ex. 26). Lämna startbilden och öka som "1". Klicka på OK knappen för att fortsätta.
    2. Tryck på M på tangentbordet för att använda imagej ' s Mät funktion. Se till att det nummer som listas under Max inte är kamerans övre detektionsgräns (t. ex. 65 535). Upprepa för varje bild i spektralskanningen. Observera att kamerans detektionsgräns beror på själva kameran. Den övre gränsen visas på den övre högra delen av histogrammet i huvudfönstret i MicroManager. Alternativt kan den övre gränsen bestämmas genom att öppna en bild i ImageJ och navigera till bild ≫ justera ≫ ljusstyrka/kontrast. Klicka på knappen Ange i det resulterande popup-fönstret, ange ett överdrivet stort värde (t. ex. 999 999) i fältet tomt bredvid maximalt visat värdeoch klicka på OK för att fortsätta. Det maximala värdet som visas i det nya histogrammet bör vara kamerans övre detektionsgräns.
    3. Om några bilder innehöll kamerans övre detektionsgräns (t. ex. 65 535) justerar du exponeringstiden för spektralskanningen för att säkerställa att den maximala signalen i hela spektralområdet inte överskrider kamerans dynamiska omfång.
  12. Hämta spektrala bilddata från omärkta prover för att bestämma autofluorescence. Förvärva skanningen för omärkta prover med hjälp av en identisk våglängd intervall och kamerainställningar som resten av experimentet (t. ex., 360-485 Nm vid 100 MS per våglängd).
  13. Förvärva spektrala bilddata från enkelmärkta prover att använda som spektralkontroller för att bygga spektralbiblioteket. Utför skanningen för varje etikett med ett identiskt våglängd intervall, exponeringstid och kamerainställningar. Observera att en längre förvärvs tid kan behövas för vissa prover för att möjliggöra noggrann identifiering av etikett spektrum med minimal bullernivå.
  14. Utföra mätningar på ett experimentellt prov (t. ex. mänskliga luftvägar glatta muskelceller med GCaMP sond och mitokondriell etikett).
    1. Placera en bild eller täckglas som innehåller experiment provet på mikroskopet.
    2. Välj ett synfält med lämpligt märkta celler av vävnader.
    3. Hämta spektrala bilddata med de önskade förvärvs inställningarna, enligt beskrivningen ovan.

6. bildanalys

  1. Korrigera bilder till en platt spektralrespons.
    1. Subtrahera det bakgrunds spektrum som erhålls i avsnitt 5,9 och multiplicera med den korrigeringskoefficient som fastställs i avsnitt 3.1.5. Detta kan göras med en enkel MATLAB-skript eller ImageJ rutin. En subtraktion/korrigering MATLAB kod (används i detta exempel) finns på University of South Alabama bioimaging Resources webbplats.
      1. Fyll på subtraktion/korrektions kod i MATLAB.
      2. Klicka på Körpå fliken redigerare. Då öppnas ett nytt fönster som innehåller en BSQ -korrigeringsknapp. Klicka på BSQ -korrigeringsknappen för att öppna ett annat fönster som innehåller alternativ för arbetskatalog, bakgrunds fil, korrigeringsfaktor fil och okorrigerad TIFF-mapp.
        1. Använd Bläddra... knapp bredvid arbetande adress listen till välja arkivet stig var följande Fönstren vilja öppen. Navigera till mappen som innehåller det sparade bakgrunds spektrumet (i. dat-format).
        2. Använd Bläddra... knapp bredvid bakgrunden arkivera (. dat) till öppen arkivet valde i steg 6.1.1.2.1 och välja den önskat bakgrunden arkivera (i. dat formaten). Klicka på knappen öppna för att fortsätta.
        3. Använd knappen Bläddra... bredvid korrigeringsfaktor (. dat) för att välja en korrigeringsfaktor. Katalogen för korrigeringsfaktorn är som standardplatsen för den överordnade MATLAB-koden. Om det behövs navigerar du till undermappen som innehåller korrigeringsfaktor filen (i. dat-format). Markera rätt korrektionsfaktor fil och klicka på knappen öppna för att fortsätta.
        4. Använd Bläddra... knappen bredvid okorrigerad TIFF-mappen för att öppna den katalog som valts i steg 6.1.1.2.1 och välj mappen för bakgrund subtraktion och bildkorrigering (detta är vanligtvis Pos0 mapp som omedelbart innehåller RAW spektrala bilder). Klicka på knappen Öppna för att fortsätta.
        5. Klicka på knappen Klicka för spektrala korrigering . När bearbetningen är klar öppnas ett fönster med meddelandet "BSQ-korrigering slutförd". Klicka på OK knappen för att fortsätta. Korrigerings bilderna lagras i en ny mapp som namnges med den ursprungliga råa spektrala bildmappen och ytterligare "_ korrigerade" (t. ex. Pos0_Corrected).
  2. Generera spektralbiblioteket. Flera mjukvarupaket kan användas för att extrahera spektrala data från bilder, inklusive ImageJ. För bästa resultat, normalisera varje endmember till våglängdsbandet med störst intensitet genom att bestämma vilket våglängdsband som har det mest intensiva värdet och dividera mätningen vid varje våglängdsband med det maximala värdet. Det bör också noteras att Single-Label kontroller som genereras inom autofluorescent prover kommer att behöva ytterligare ändringar28,29,30,31,32. Se steg 6.2.4 och diskussion för mer information.
    1. I ImageJ klickar du på fil ≫ importera ≫ bildsekvens. Då öppnas ett nytt fönster. Navigera till mappen som innehåller de korrigerade spektrala bilderna. Dubbelklicka på en bildfil i mappen för att öppna ett nytt fönster. Klicka på rutan bredvid antal bilder och ange det antal våglängder som ingår i spektralskanningen (t. ex. 26). Lämna startbilden och öka som "1". Klicka på OK knappen för att fortsätta.
    2. I huvudfönstret i ImageJ klickar du på ikonen Polygonval och använder sedan muspekaren genom att klicka på bilden för att skapa en polygon runt en region som innehåller fluorescensdata. Observera att det kan finnas små eller inga fluorescensdata i den initiala våglängden. Navigera till en annan våglängdsbild och/eller Använd verktyget ljusstyrka/kontrast (bild ≫ justera ≫ ljusstyrka/kontrast ≫ Auto) för att bättre visualisera regioner som innehåller fluorescensdata av intresse.
    3. När polygonen ritas genererar du Z-axelprofilen genom att klicka på bild ≫ staplar ≫ Rita z-axelprofil. Då öppnas ett nytt fönster. Klicka på Spara om du vill spara spektrala data som en CSV-fil.
    4. Utför en subtraktion för att säkerställa ett korrekt spektralbibliotek med rena etiketter som saknar autofluorescenskontaminering. Använd följande ekvation29 för att isolera ett rent spektrum från blandningen av en enda etikett och fluorescens:
      Equation 11
      Där: sPure är det rena spektrat av etiketten, sMixed är det uppmätta spektrumet av provet förorenat med autofluorescence, s autofl är det uppmätta autofluorescenspektrat, "a" är en skalär multiplikatorn för autofluorescenspektrat (mellan 0 och 1; t. ex. 0,4) och "offset" är en offset (vanligtvis 0). Variera "a" sikt tills ett nära-nollvärde uppnås för den skenbara bidraget av autofluorescence. Ytterligare information finns i flera publikationer28,29,30,31,32.
  3. Avblanda spektrala bilddata. Den unmixing steg kommer att generera en överflöd bild för varje fluorescerande etikett, där överflöd är mängden relativ fluorescens signalen i bilden från respektive etikett. Flera oblandningsalgoritmer är tillgängliga för användning med imagej33,34,35. Dessutom, en spektrala unmixing MATLAB kod (används i detta exempel) finns på University of South Alabama bioimaging Resources webbplats. En mer omfattande översikt av spektralunmixing finns36.
    1. Ladda den spektrala unmixing koden i MATLAB.
    2. Redigera den våglängd. mat och bibliotek. mat filer att motsvara de experimentella förhållanden (t. ex., "våglängd" som 360-485 i steg om fem).
      Anmärkning: motsvarande värden för dessa våglängder bör läsas in i "bibliotek" för varje fluorescerande etikett (och autofluorescence). Endmember_Name bör lista etiketterna i samma ordning som kolumnvärdena för "Library". Observera att filen Library. mat ska innehålla variablerna "Library" och "Endmember_Name".
    3. Klicka på Körpå fliken redigerare. Detta kommer att öppna ett nytt fönster som tillåter användaren att välja en katalog. Navigera till mappen som innehåller de spektrala bilderna för att vara oblandad. När detta är valt öppnas ett nytt fönster.
    4. I de resulterande ämnena anger du bildens namn (t. ex. HASMC med GCaMP och Mito FOV1), antal våglängdsband (t. ex. 26), antal tidspunkter (t. ex. 1) och om en FRET mätning önskas (t. ex., n) i sina respektive ämnen. Om n är valt för FRET, lämna båda medlems tomma tom. Tryck på OK för att fortsätta, vilket kommer att öppna ett nytt fönster.
    5. Naviagate till den mapp som innehåller filen våglängd. mat. När du är markerad klickar du på Öppna för att fortsätta, vilket kommer att öppna ett nytt fönster.
    6. Navigera till mappen som innehåller filen Library. mat. En gång valde, klick öppen till fortsätta, vilken vilja rädda den oblandade profilen i en ny "oblandade" broschyren insida den adress listen innehållet den Spectral profilen.
  4. Inspektera de oblandade spektrala bilderna för kvalitet.
    1. Öppna varje oblandad bild för att visuellt inspektera distributionen av rena komponenter.
      1. Jämför omfattningen av fel bilden till de oblandade bilderna (liknande steg 5,11, detta kan göras genom ImageJ s mått funktion). Om omfattningen av fel bilden är liknande i storleksordning till oblandade överflöd bilder, är det troligt att det finns signaler i spektrala bilddata som inte korrekt redovisas av spektralbiblioteket och den linjära spektrala unmixing processen.
      2. Jämför fel bilden med oblandade bilder för att se om det finns oidentifierade reststrukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flera viktiga steg från detta protokoll är nödvändiga för att säkerställa insamling av data som är både korrekt och saknar avbildning och spektrala artefakter. Hoppa över dessa steg kan resultera i data som verkar betydande men inte kan verifieras eller återges med andra spektrala avbildningssystem, vilket effektivt omintetgör alla slutsatser som gjorts med nämnda data. Chief bland dessa viktiga steg är korrekt spektrala output korrigering (avsnitt 3). Korrektionsfaktorn kompenserar för våglängdsberoende variationer i spektralproduktionen av det justerbara exciteringssystemet. Detta åstadkoms genom att skala våglängder med hög effekt excitation så att den optiska belysningen makt är jämförbar med våglängder med en låg effekt excitation, uppnå en platt spektrala excitation profil. Ett exempel på en olämplig korrektionsfaktor är en som innehåller mycket låga värden (t. ex. < 0,001) vid en eller flera våglängder, vilket indikerar att de intensitetsvärden som mäts vid dessa våglängder måste vara kraftigt försvagade för att uppnå en platt spektralrespons.

Kalibrering av systemet till en NIST-spårbar standard säkerställer att data som samlats in med excitation-scanning spektrala avbildnings systemet är jämförbar med andra system också kalibreras till NIST-spårbara standarder. Därför är det viktigt att se till att alla korrigeringsfaktorer justerar insamlade data på lämpligt sätt. Noggrannheten hos en korrektionsfaktor kan verifieras med hjälp av en fluorescensstandard, såsom NIST-spårbar fluorescein. Figur 1 illustrerar en lämplig och olämplig korrektionsfaktor, visualiseras genom grafiska och bilddata. I detta fall var spektralproduktionen vid 340 nm nästan obefintlig jämfört med resten av spektralområdet, vilket resulterade i ett nära-noll (< 0,001) värde för praktiskt taget varje våglängd. Tillämpas på bildstapeln, resulterar detta i nära noll värden genom de flesta av bildstapeln för de flesta pixlar.

Som anges i avsnitt 5 kan exciteringsintervallet, valda fluoroforer och förvärvs inställningar skapa en potential som en eller flera excitation våglängd bild band innehåller övermättade pixlar. Figur 2 illustrerar ett exempel där exponeringstiden var för lång för flera av magnetiseringen våglängder, vilket gör att de efterföljande bilderna innehåller övermättade pixlar. Detta är viktigt att notera eftersom, som figuren visar, både de enskilda bilderna och de falska bilder kan visuellt verkar vara inom acceptabla intensitet intervall.

Lämpligt urval av en bakgrund region för subtraktion är också viktigt för data jämförelse mellan system, eftersom det tar bort delar av kamera brus eller strö ljus före NIST-spårbar spektrala korrigering (figur 3). Det är ofta användbart för efterföljande bildbehandling och dataanalys steg för att generera en RGB-falsk-färgad bild av spektrala bildstapeln för att visualisera spektrala funktioner i bilden. Figur 4 visar en RGB-falsk-färgad bild som genereras genom att sammanfoga tre valda våglängdsband (370 nm = blå, 420 nm = grön, 470 nm = röd).

Spektralunmixing kräver kunskap om spektralprofilen för varje enskild fluorescenskälla. När det gäller excitation-scanning Hyperspektrala avbildning, detta görs genom att förvärva spektrala bild stackar för varje fluorophore (och autofluorescence). Figur 5 ingår som ett exempel för att välja regioner från enetikettkontroller för att generera ett spektralbibliotek. Det bör noteras att varje mätning har normaliserats till sin topp våglängd.

När den utförs på rätt sätt tillåter den spektrala avblandnings processen separation av en spektralbildstapel till respektive bidrag från varje fluorescensetikett. Figur 6 visar ett exempel på oblandad spektrala bilduppsättning, med individuella bilder för var och en av följande signaler: luftvägarna glatt muskel cell autofluorescence, en gcamp sond, och en mitokondriell etikett. Felet i samband med spektrala unmixing visas också och kan undersökas för att jämföra intensitet nivåer av felet till de oblandade signaler. Beräkning och tolkning av detta fel har diskuterats tidigare37. Som framgår av figur 6, det finns ett stort fel i samband med de nukleära och perinukleära regioner i cellerna, vilket tyder på att de uppmätta spektra av dessa regioner inte är väl redovisade av spektra i spektralbiblioteket. En potentiell källa till fel kan vara att Single-Label kontroller för GCaMP och mitokondrie etiketten var beredd med hjälp av luftvägarna glattmuskulatur celler, som har en hög infödda autofluorescence. Därför kan GCaMP och mitokondriell etikett inte representera ren endmember spektra. Dessutom kan autofluorescenssignalen påverka biblioteks spektrat för de två andra etiketterna på ett sätt som inte var korrekt redovisade, vilket resulterade i en mindre exakt montering än om etiketterna hade förvärvats med hjälp av en cellinjer med liten eller ingen autofluorescence. Dessutom inkluderas exempel för när för få eller för många komponenter i ett spektralbibliotek finns tillgängliga, vilket resulterar i underpassning och övermontering av spektrala bilddata, respektive (figur 6, figur 7, figur 8, Figur 9och tabell 1).

Som nämnts i avsnitt 6,2 och specifikt steg 6.2.4, "rena" spektra som samlats in från märkta celler som också autofluorescent kommer sannolikt kontaminera spektrala profilen för den rena komponenten. Som sådan, försiktighet bör iakttas för att separera den rena spektrat av etiketterna av intresse från deras autofluorescent värdar. Figur 10 visar skillnaden i blandning med "rena" spektra förorenade med autofluorescence (blandad) kontra rena spektra beräknat enligt den metod som beskrivs i steg 6.2.4. Skillnaden sker huvudsakligen i att inte blanda autofluorescenssignalen. Utan ordentlig signal separation (t. ex. subtraktion av autofluorescenskontaminering från GCaMP-spektrumet) konkurrerar komponenterna autofluorescence och GCaMP-biblioteket om samma spektrala data i varje pixel, vilket resulterar i karakteristiska hål eller mörka fläckar i autofluorescensbilden.

Figure 1
Figur 1 : Exempel på tillämpningar av olämpliga och lämpliga korrektionsfaktorer som används för att korrigera bilder till ett platt spektralsvar. A) plottade olämpliga och lämpliga korrektionsfaktorer. B) en RGB-bild som genererats med användning av den olämpliga korrektionsfaktorn i a. C) en RGB-bild som genererats med samma synfält som (B), med undantag för användning av en lämplig korrektionsfaktor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Exempel som illustrerar vikten av lämpliga anskaffnings inställningar. (a, B) RGB-bilder som genereras av en lämplig förvärvs tid (A, 100 MS) jämfört med samma synfält med en mätande förvärvs tid (B, 500 ms). Det bör noteras att RGB-bilderna visas identiska när de är falskt färgade. C) den intresse region som valts ut för att kartlägga intensitetsvärden från de mest intensiva regionerna a och B. D) plottade intensitetsvärden per våglängd från 100 MS exponerings tids bild (a, svart linje) och 500 ms exponeringstid (B, röd linje). Det bör noteras att pixel intensiteter för 500 ms exponeringstid har nått gränsen för det dynamiska omfånget av detektorn (65 535 AU) vid 370 nm och inte minska förrän 525 nm, vilket resulterar i spektralartefakt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Val av en region av intresse för bakgrunds subtraktion. A) enbild av den råa, våglängdssummerade intensiteten. (B) de regioner i bilden som valts för att bestämma det pixel-genomsnittliga bakgrunds spektrumet för bakgrunds subtraktion som visas i rött. (C) bakgrundsbilden-subtrarerad, korrigerad och summerad intensitet. D) en RGB-färgning av den korrigerade bilden (C). Processen för att skapa en RGB-falsk-färgad bild visas i figur 4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Process för att skapa en RGB-falsk-färgad bild. (a-C) Tre våglängdsband placerade jämnt fördelade över spektral förvärvs området valdes för falskt färg (blått = 370 nm, grönt = 420 nm, rött = 470 nm). (D) den summerade intensitet bild som genereras genom att lägga till pixel intensiteter från alla våglängd band i bilden kuben. (E-G) Bilderna i paneler (A-C) med sina respektive falska färg-look-up tabeller tillämpas. H) den resulterande sammanslagna bilden av (E-G). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Regionval av Single-Label kontroller för spektralbibliotek generation. (A) RGB falsk-färgad bild av luftvägarna glattmuskulatur (ASM) cell autofluorescence. (B) visas i rött, regioner av (a) som valts för autofluorescenskomponenten i spektralbiblioteket. C) RGB-falskfärgade ASM-celler märkta med mitokondriell etikett. D) visas i rött, regioner av (C) som valts för komponenten mitochondiral Label i spektralbiblioteket. På grund av den autofluorescence av ASM celler lokaliserade nära kärnan, små regioner valdes långt från kärnor för att identifiera mitokondriella etikett spektrum. E) RGB-falskt färgade ASM-celler som transfekterade med gcamp-sonden. (F) regioner av (E) som valts ut för gcamp-komponenten i spektralbiblioteket visas i rött. Liknande (D), regioner bort från atomkärnor valdes. Gspektralbiblioteket som erhålls från a-F, normaliserat till ett värde av enighet vid våglängden med den starkaste signalen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 6
Figur 6 : Exempel på oblandade bilddata där oblandade relativa signal bidrag från varje biblioteks komponent kan visualiseras. (a-D) Den oblandade överflöd av GCaMP, mitokondriell etikett, autofluorescence, och fel term. (E-G) Bilderna i paneler (A-C) med sina respektive falska färg-look-up tabeller tillämpas. (H) den sammansatta, sammanfogade, falskt färgade bilden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 7
Figur 7 : Oblandade relativa signal bidrag, inklusive medelintensitet och procent av total fluorescens, från ett korrekt definierat spektralbibliotek. (a-D) Den oblandade överflöd för autofluorescence, GCaMP, mitokondriell etikett, och fel term. Det bör noteras att fel termen omfattar mindre än 10% av den totala fluorescenssignalen mätt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 8
Figur 8 : Oblandade relativa signal bidrag, inklusive medelintensitet och procent av total fluorescens, från ett spektralbibliotek som saknar en komponent som man vet ingår i provet (dvs. ett underdefinierat spektralbibliotek). (a-C) Den oblandade överflöd av autofluorescence, mitokondriell etikett, och fel term. Observera att utelämnandet av GCaMP från spektralbiblioteket har ökat de beräknade relativa signal bidragen från biblioteks komponenterna samt fel termen, jämfört med figur 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Oblandade relativa signal bidrag, inklusive medelintensitet och procent av total fluorescens, från ett spektralbibliotek som innehåller en ytterligare komponent som man vet saknas i provet (dvs. ett överdefinierat spektralbibliotek). (a-E) Den oblandade överflöd av autofluorescence, GCaMP, mitokondriell etikett, nukleär etikett, och fel term. Observera att tillägg av en nukleär etikett till spektralbiblioteket har minskat den beräknade relativa signalen bidrag från autofluorescence, jämfört med figur 7. Dessutom minskar fel termen under det procentuella fel som anges av det korrekt definierade spektralbiblioteket. Detta beror på att ett överdefinierat bibliotek nästan alltid kommer att möjliggöra en bättre passform till experimentella data än ett korrekt definierat bibliotek, även om överflöd signaler för komponenter som är kända för att vara frånvarande från provet är (i verkligheten) artefakter att överdefiniera spektralbibliotek. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 : Jämförelse av oblandade bilder när du använder ett bibliotek före och efter korrekt autofluorescens kontaminations signal subtraktion. A) de ursprungliga "rena" spektra som härrör från enkeletikettreglagen i mycket autofluorescent glatta muskelceller före den skalade subtraktion som beskrivs i steg 6.2.4. (B-D) Den oblandade autofluorescence, GCaMP och nukleära etikett bilder som genereras med (A) som biblioteket. E) de korrigerade rena spektra som härrör från enetikettkontroller i mycket autofluorescent glatta muskelceller efter skalad subtraktion. (F-H) Den oblandade autofluorescence, GCaMP, och nukleära etikett bilder som genereras med (E) som biblioteket. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Medelintensitet (AU)
Passande montering Underfitting Overfitting
Autofluorescence 187 299 164
GCaMP 139 - 140
Mitokondriell etikett 246 318 248
Kärn märkning - - 26
RMS-fel 53 126 43
Standard avvikelse (AU)
Passande montering Underfitting Overfitting
Autofluorescence 362 442 315
GCaMP 168 168
Mitokondriell etikett 344 388 345
Kärn märkning - - 93
RMS-fel 62 126 44
Maximal intensitet (AU)
Passande montering Underfitting Overfitting
Autofluorescence 6738 7409 6738
GCaMP 1336 - 1336
Mitokondriell etikett 5098 5194 5098
Kärn märkning - - 1257
RMS-fel 1050 1286 910
% av den totala fluorescensen
Passande montering Underfitting Overfitting
Autofluorescence 30 40% 26
GCaMP 22 43% 23
Mitokondriell etikett 39% - 40%
Kärn märkning - - 4
RMS-fel 8 17 7

Tabell 1: En tabell som jämför medelvärdet, standardavvikelsen och högsta värden för oblandad mängd intensitet per oblandat överflöd bild från ett korrekt spektralbibliotek och från underdefinierade eller överdefinierade spektrala bibliotek, liksom den procentandel av den totala fluorescensen per oblandat överflöd bild (minsta oblandade överflöd intensitet för varje bild var alltid noll). Data som hämtats från figur 7, figur 8och figur 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den optimala användningen av excitation-scanning Hyperspektrala Imaging set-up börjar med byggandet av ljusbanan. I synnerhet val av ljuskälla, filter (tunable och Dichroic), filter växling metod och kamera bestämma tillgängliga spektralområdet, möjlig skanningshastighet, detektor känslighet, och rumsliga provtagning. Mercury Arc-lampor erbjuder många excitation våglängd toppar men ger inte en platt spektralutgång och kommer att kräva betydande signal reducering vid utgången toppar för att korrigera spektrala bilddata tillbaka till en NIST-spårbart svar38. Alternativa ljuskällor, såsom XE Arc-lampor och vitt ljus superkontinuum lasrar, kan ge en mer enhetlig spektralutgång som är bättre lämpad för excitation-scanning Hyperspektrala Imaging38,39,40. Val av ljuskälla, avstämbara filter och Dichroic filter bestämma det tillgängliga spektralområdet. Detta intervall bör väljas med noggrann hänsyn till den önskade spektrala informationen i experiment provet.

Dessutom bör hänsyn tas till växelmekanismen som används för de avstämbara filtren, liksom olika kamera faktorer såsom kvanteffektivitet, pixelstorlek och tillgängliga bildrutehastigheter, eftersom dessa faktorer kommer att påverka potentiella samplingsfrekvenser41 ,42,43. Men alla andra faktorer är konstanta, utnyttjande av excitation-scanning tillvägagångssätt bör ge ökad känslighet och möjlighet till snabbare avbildning, jämfört med de flesta utsläpp-scanning spektrala avbildning närmar21.

Som nämnts i inledningen, Hyperspektrala Imaging här hänvisar till sammanhängande och spektralt överlappande karaktär av förvärvade data. Som sådan, funktionerna i systemet måste kunna samla in data med mellanrum av excitation centrum våglängder mindre än halva avståndet av FWHM av filtren. Som rapporterats tidigare, en noggrant utvald array av thin-film avstämbara filter tillåter datainsamling med centrum våglängder fördelade 5 NM isär, ett avstånd som är tillräckligt för att översampla excitation spektrum ges filter med FWHM på mellan 14-20 nm. Ett sådant avstånd ger liten redundans i spektraldata insamling med sannolikt ökar noggrannheten i unmixing processen. Övervägande av både spektralområden och nödvändigt minsta antal våglängdskanaler för noggrann unmixing har diskuterats tidigare44,45,46. För detta ändamål, med tanke på bandbredden hos dessa filter, bör magnetiseringsområdet väljas för att avsluta vid en våglängd som är något lägre (5-10 nm lägre) än cut-off våglängd av Dichroic beamsplitter. Detta kommer att säkerställa att hela bandbredden för excitation belysningen är under cutoff våglängd av Dichroic beamsplitter (t. ex., 360-485 Nm för 495 Dichroic filter) för att undvika excitation-utsläpp Cross-Talk.

Programvara för att självständigt kontrollera varje komponent i hårdvaran för att uppnå snabba spektrala Imaging skanningar krävs. Programvaran bör kunna använda slutaren, välja excitation våglängder, och förvärva bilder med tillräckligt höga hastigheter för att uppfylla experimentella förhållanden (exakta samplingshastigheten krav kommer att variera experiment, men ett exempel mål kan vara att förvärva fyra fullständiga spektrala bild stackar per minut). Mer komplexa experiment kan utnyttja flera DICHROIC speglar, mål eller XYZ platser. Det finns ett antal mjukvarupaket tillgängliga för datainsamling47,48. Micro-Manager är en fri öppen källkod för Mikroskop Automation som erbjuder en mängd olika anpassningsalternativ. Dessutom innehåller Micro-Manager en skript panel för ytterligare anpassning som inte finns i huvudanvändargränssnittet. Till exempel är det möjligt att använda ett anpassat skript för att minska 250 ms fördröjning av den avstämbara filterväxlaren till 10 ms vid alla excitation våglängder utom våglängd övergångar där filter hjulet roterar till ett nytt avstämbart filter, minska den effektiva avbildning tid med 240 MS per våglängd för de flesta våglängder. Denna anpassning har gjort det möjligt att förvärva upp till 30 våglängder på under 4 s. Slutligen kan Micro-Manager användas tillsammans med andra miljöer, såsom MATLAB, för att ytterligare anpassa mikroskopet enhetskontroll.

Bestämning av rätt spektralexcitation intervall, förvärvs tid, och inledande våglängd för prov visning och efterföljande datainsamling är mycket viktigt. Felaktig användning av enskilda komponenter i systemet kan dock kräva ytterligare felsökning. Varje komponent i den optiska banan bidrar till de bilddata som förvärvas. Därför är det viktigt att kontrollera spektralrespons och optisk överföring av optiska komponenter inom ljusbanan, särskilt om man försöker optimera övergripande system svar. Ljuskällor har ofta varierande intensitet inställningar och kan ha minskad effekt under livslängden på glödlampan40. Om ett prov visas svagt, kan orsaken minskas utdata från ljuskällan. Autoslutaren funktion i Micro-Manager, enligt vår erfarenhet, inte fungerar 100% av tiden. Signal brist kan tyda på en sluten slutare. Den initiala excitation våglängd sparas i mikro-chefens konfigurationsfil kan standard till en våglängd med liten eller ingen spektralutgång, såsom 340 nm exempel som visas i figur 1.

Dessutom är det inte ovanligt att av misstag välja en excitation våglängd som ligger över cutoff våglängd av lång pass Dichroic beamsplitter, vilket resulterar i ytterligare Cross-Talk och/eller excitation ljus som Skys direkt till kameran som kan kan skada kamerasensorn. På samma sätt kan justering av ljusbanan för överföring Imaging resultera i förlust av signalen till kameran, beroende på konfigurationen av mikroskopet. Vidare kan, såsom anges i figur 2, val av initial exciteringsvåglängd och exponeringstid för prov visning vara lämpliga men i själva verket resultera i övermättade pixlar vid andra excitation våglängder. Detta faktum kommer inte att vara uppenbart om pixelmättnad kontrolleras för varje bild, så det är ofta klokt att utföra en test bild stack på ett område av provet som verkar innehålla den mest intensiva fluorescens.

Det är också värt att notera att varierande intensiteter kan förekomma i bilder som valts för bakgrundsområden. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa att dessa regioner faktiskt inte innehåller relevanta bilddata, eftersom efterföljande data korrigerings steg sedan subtraherar denna signal från de bilddata som erhållits i andra regioner i urvalet. Det är ibland nödvändigt att använda överföringsinställningarna och/eller drastiskt öka exponeringstiden för att kontrollera att den region som valts för att mäta prov bakgrund verkligen inte innehåller något prov. På samma sätt kan oblandade bilder förekomma med mörka fläckar eller hål i autofluorescensbilden. Detta kan bero på ett olämpligt bibliotek som orsakas av autofluorescence "kontaminering" av "rena" spektrala signaler från enmärkta celler. Detta beror på att alla "rena" spektrala signaler som samlats in från ett prov som innehåller autofluorescence kommer alltid att innehålla några av de autofluorescence spektra själv, även om i spårmängder. Försiktighet bör iakttas för att ta bort autofluorescens signaler från enkelmärkta kontroller för att säkerställa ett korrekt spektralbibliotek, vilket beskrivs vid flera tillfällen av Mansfield et al.28,29,30, 31,32

Även om det inte visas i denna artikel, excitation-scanning spektrala avbildnings systemet kan också användas för Time-lapse Imaging och Imaging över flera XY platser (eller ett stort synfält på grund av bild sömnad) i flera fokalplan. Om dessa alternativ önskas för ett enda experiment, bör noggrann tanke ägnas åt vikten av förvärvs ordning och potentiella effekter av photoblekning. Det är också värt att notera att om den faktiska tid som tas överskrider den beräknade tiden (t. ex. en bildstapel tar 11 s att förvärva snarare än uppskattningsvis 10 s), kommer mikro-Manager fortsätta att förvärva det valda antalet tidpunkter och/eller positioner. Denna felberäkning kan sammansatta med flera tidspunkter och ändra Beräknad temporala provtagning, potentiellt skevra eventuella slutsatser från data.

Detta exempel visar förmågan att separera tre källor av fluorescens inom ett 145 Nm excitation skanningsområde. Tidigare experiment med detta system har kunnat separera upp till fem källor av fluorescens inom samma område. Den tid som krävs för detta bild förvärv är mindre än 1 min, vilket är betydligt snabbare än de flesta utsläpp-scanning spektrala avbildningssystem. Förbättringar i ljusbanan, såsom högre hastighet excitation våglängd tuning, kan ytterligare avancera denna avbildning teknik till hastigheter som är tillräckliga för video-Rate spektrala avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

DRS. Leavesley och Rich avslöja ekonomiskt intresse i ett nystartade företag, SpectraCyte LLC, som grundades för att kommersialisera spektralavbildning teknik.

Acknowledgments

Författarna skulle vilja erkänna stöd från NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, och Abraham Mitchell cancer Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Airway Smooth Muscle Cells National Disease Research Interchange (NDRI) Isolated from human lung tissues obtained from NDRI Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter Thorlabs Inc. SHB1 Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage Prior Scientific H177P1T4 Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY) Prior Scientific Proscan III (H31XYZE-US) For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer Made in-house Made in-house 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber, A7816 Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters Semrock Inc. TBP01-378/16 Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
Semrock Inc. TBP01-402/16 Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-449/15 Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
Semrock Inc. TBP01-501/15 Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
Semrock Inc. TBP01-561/14 Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter Semrock Inc. FF495-Di03 Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter Semrock Inc. FF01 496/LP-25 Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe Addgene G-CaMP3; Plasmid #22692 A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope Nikon Instruments TE2000 Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM ThermoFisher Scientific M7514 Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein ThermoFisher Scientific F36915 For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 Labels cell nuclei
Objective (10X) Nikon Instruments Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 Useful for large fields of view
Objective (20X) Nikon Instruments Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 Most often used for tissue samples
Objective (60X) Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 Most often used for cell samples
sCMOS Camera Photometrics Prime 95B (Rev A8-062802018) For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer Sutter Instrument Lambda VF-5 Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp Sunoptic Technologies Titan 300HP Lightsource Light source with relatively uniform spectral output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

Tags

Teknik Hyperspektrala spektroskopi excitation fluorescens mikroskopi autofluorescence Imaging avstämbart filter thin film
Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi att effektivt diskriminera fluorescens signaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deal, J., Britain, A., Rich, T.,… More

Deal, J., Britain, A., Rich, T., Leavesley, S. Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals. J. Vis. Exp. (150), e59448, doi:10.3791/59448 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter