Summary
Простая и надежная диета индуцированной грызунов животных модель безалкогольного стеатогепатит (Нэш) описывается, достигается за счет не-SPF жилья животных и администрация конкретного высокого жира диета. Мы описываем определение печени и жировой подмножеств иммунных клеток, чтобы резюмировать человеческие иммунологические условия, подвергая мышей к экологическим ростков.
Abstract
Ожирение связано с хроническим низкосортным воспалением и инсулинорезистентностью, способствуя увеличению распространенности хронических метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа и безалкогольный стеатогепатит (Нэш). Недавние исследования установили, что про-воспалительные иммунные клетки проникают ожирением гипертрофической жировой ткани и печени. Учитывая возникающим важность иммунных клеток в контексте метаболического гомеостаза, существует критическая потребность в количественной оценке и характеризуют их модификации во время развития диабета 2 типа и НЭГ. Однако, Животные модели, которые индуцируют Патофизиологические особенности, характерные для человеческого НЭША, редки.
В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выявления иммунных подмножеств клеток, изолированных от печени и жировой ткани в надежной модели мыши НАСГ, установленных жилья с высоким содержанием жиров (HФД) мышей в неспецифической без патогена (SPF) условия, не барьер не менее семи недель. Мы демонстрируем обработку мышей в не-SPF условиях, переваривание тканей и выявление макрофагов, естественных киллеров (НК) клеток, дендритных клеток, B и т-клеток подмножеств потока цитометрии. Предоставляются репрезентативные потоки тометриметрии от мышей SPF и не-SPF. Для получения надежных и интерпретируя данных, использование антител, точных и точных методов для переваривания тканей и правильного стробирования в опытах цитометрии являются важнейшими элементами.
Вмешательство для восстановления физиологических воздействия антигена у мышей на жилье их в не-SPF условиях и неспецифическое воздействие микробных антигенов может обеспечить соответствующий инструмент для исследования связи между иммунологическими изменениями, диета индуцированной Ожирение и связанных с ними долгосрочных осложнений.
Introduction
Ожирение является многофакторным расстройством и основным фактором риска развития сердечных заболеваний, инсульта, безалкогольного стеатогепатита (Нэш), диабета 2 типа (T2D) и некоторых видов рака. Распространенность ожирения стремительно возрастает во всем мире. Сегодня 2 100 000 000 человек — почти 30% населения мира — страдают ожирением или имеют избыточный вес1. Ожирение-ассоциированные инсулинорезистентность может привести к T2D, когда исчерпаны поджелудочной железы островок бета-клеток не в состоянии компенсировать повышенную потребность в инсулине для поддержания глюкозы гомеостаза2.
Жировая ткань состоит из различных типов клеток, включая адипоциты, эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки. При прогрессировании ожирения изменения количества и активности иммунных клеток могут приводить к низкосортных воспалений гипертрофической жировой ткани3,4. В частности, было установлено, что чрезмерное потребление энергии, сопровождается хронически повышенный уровень глюкозы в крови, триглицеридов и свободных жирных кислот, приводит к адипоцита гипоксии, эндоплазматический ретикулум стресс, нарушение митохондриальной функции и усиление секреции цитокинов, приводящее к активации про-воспалительных жировой иммунной клетки5,6. Прошлые исследования в основном сосредоточены на врожденный иммунитет, но в последнее время адаптивные иммунные клетки (т и в клетки) появились как важные регуляторы гомеостаза глюкозы. Они обладают воспалительными (в том числе CD8+ т-клеток, Th1 и B-клеток) или в первую очередь нормативные функции (в том числе нормативных т (TREG) клетки, Th2 клетки) и может как усугубить или защитить от инсулинорезистентности7,8 , 9. в
Кроме того, несколько механизмов было предложено объяснить, как ожирение увеличивает стеатогепатит, в том числе увеличение производства цитокинов жировой ткани10. Нэш, Прогрессивная форма безалкогольного жирных заболеваний печени и основных бремени для здоровья в развитых странах, гистологически характеризуется раздутый гепатоциты, накопление липидов, фиброз и периклеклеточного воспаления и может прогрессировать до Цирроз, стадия заболевания печени на конечной стадии или гео-клеточная карцинома. Некоторые схемы (например, метионин и холин дефицит диета11), как известно, ИНДУЦИРОВАТЬ Нэш-подобный патологии печени в не-человеческого животных моделей, но большинство из этих подходов не резюмировать человеческие условия НЭО и его метаболические последствия, поскольку они либо требуют конкретных ген нокаутом, не физиологические диетические манипуляции или отсутствие резистентности к инсулину типичный человеческий Нэш. Кроме того, наше понимание основных механизмов метаболических заболеваний в настоящее время основывается на экспериментах, проведенных с лабораторными мышами, размещенный под стандартными конкретными патогеном свободными (SPF) условиями. Эти барьерные сооружения являются аномально гигиеничными и не учитывают микробное разнообразие, с которым приходится сталкиваться людям, что может учитывать трудности в процессе перевода исследований на животных к клиническим подходам12,13 , 14-ое.
Для исследования различных иммунных подмножеств клеток в жировой ткани и печени во время развития инсулинорезистентности и Нэш в продвинутой модели мыши воспроизводства человеческих иммунологических состояний, мышей были размещены в отдельных клетках в полу стерильных условия без барьера. Мыши, размещенный под антигеном подвергается условий развитых Нэш-подобных патологии печени уже после 15 недель с высоким содержанием жиров диеты (ДФД) кормления13. По сравнению с возрастом, сопрягаемом SPF мышей они разработали макровезикулярного стеатоза, печеночной инфильтрации и активации иммунных клеток.
Эта рукопись описывает надежный анализ расхода цитометрии для определения и подсчета подмножеств иммунных клеток из жировой ткани мыши и печени в модели НЭША. Анализ расхода цитометрии позволяет обнаруживать множественные параметры отдельных клеток одновременно, в отличие от подходов РТ-ЦР или иммуногистохимии.
Таким образом, наше исследование предлагает мышь модель краткосрочного HФД для исследования развития резистентности к инсулину и Нэш и основные механизмы, которые также экспонатов верность состояния человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование проводилось в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здравоохранения и закона о защите животных под наблюдением нашего институционального Комитета по уходу за животными и использованию. Животные протоколы были проведены в соответствии с институциональными этическими руководящими принципами Шарите Берлин, Германия, и были одобрены Ландесамт-Гешюнхайт и Содиалес и соблюдать правила прибытия.
1. диета индуцированной животных модель стеатогепатит
- Передача мышей (C57Bl/6J, мужчины), не-SPF жилья в возрасте 4 недель и подвергать их непрерывно широкий спектр экологических патогенов/антигенов. Гарантировать экспозицию при ежедневном обращении с лабораторными животными, так как антигены распространяются таким образом воздушным проходом.
- Поддерживайте мышей (C57Bl/6J, мужчина, 12 недель) в открытых системах останов с обычными фильтрами на 12 h:12 h свет/темный цикл при температуре 22 ° c. Не излучать или автоклав экспериментальной диеты и постельных принадлежностей. Доступ животных жилья объекта без маски или сетки для волос. Откройте двери между животными комнатами. Не используйте воздушный душ.
- Гарантировать ежедневное обращение с лабораторными животными и переключать помещения на регулярной основе, чтобы антигены распространялись воздушным проходом. Дополнить грязное жилье ежедневным неспецифическое микробное воздействие антигенов из постельных принадлежностей млекопитающих лабораторных животных, размещенных в комнатах рядом с лабораторными мышами.
- Измерить пропорции CD44-CD62L-эффекторной памяти CD4+ и CD8+ т- клеток в крови и селезенке с использованием потока цитометрии (как описано в refefence13).
Примечание: В связи с этим мы определили увеличение на 20% эффекторной памяти CD8+ т-клеток от CD8+ т-клеток в качестве доказательства достаточной микробной экспозиции. - Начало hфд (60 KJ% от жира, 19 KJ% от белков и 21 KJ% от углеводов и потребление AD вволю воды с 6% содержанием сахарозы с 5-недельного старого C57Bl/6J мужской мышей в течение 7-15 недель. HФД должен содержать 60% kJ из жира (как описано выше), чтобы вызвать развитие инсулинорезистентности в течение эксперимента.
Примечание: Гематоксилин окрашивания должны быть выполнены и гистологических характеристик, как воздухоплавание гепатоцитов, Мэллори Денк органов, проникновение иммунной клетки и макровезикулярного стеатоз должны быть найдены, чтобы продемонстрировать Нэш-как патологии печени (как показано в ссылке 13).
2. Подготовка реагентов и растворов
- Подготовить 70% этанола, фосфатного буферного раствора (PBS, без кальция и магния), дополнить буфером лизиса с 0,5% ЗБТ и ACK (аммония-хлорида калия).
-
Окрашивание буфера
- Растворите 10 мл сыворотки из фетального теленка (ФТС) в 500 мл PBS, чтобы получить 2% ФТС PBS. Место окрашивания буфера на льду перед использованием.
- Хранить раствор в пластиковой бутылке при температуре 4 °C.
-
Коллагеназы раствор для пищеварения жировой ткани
- Растворите 2,5 г крупного рогатого скота сыворотки альбумина (БСА) в 500 мл PBS, чтобы получить 0,5% БСА/PBS.
- Растворите 74,5 g из КАГЛ2 в 10 мл 0,5% БСА/PBS, чтобы получить 10 мм раствор КАГЛ2 .
- Добавить 1 мг коллагеназы типа II (см. таблицу материалов) к каждому мл 0,5% БСА с 10 мм КАГЛ2 PBS.
- Подготовка 3 мл раствора коллагеназы дайджест на г жировой ткани образца. Подготовьте новое решение коллагеназы для каждой изоляции.
-
Коллагеназы раствор для пищеварения ткани печени
- Растворите 2,5 г БСА в 500 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (ГБСС) для получения 0,5% БСА.
- Добавить 10 мл СУО в 500 мл 0,5% БСА/ГБСС для получения 2% СУО 0,5% БСА/ГБСС.
- Добавьте 0,5 мг коллагеназы типа IV (см. таблицу материалов) каждому мл 2% фтс 0,5% БСА/ГБСС.
- Добавить 0,02 мг Дназы на мл 2% СУО 0,5% ЗБТ/ГБСС раствор коллагеназы.
- Приготовьте 13 мл раствора для переваривания коллагеназы на образец ткани печени.
- Подготовьте новое решение коллагеназы для каждой изоляции.
3. Генерация одноклеточных суспензий
-
Пищеварение жировой ткани
- Эвтаназии мышей через изофлуран анестезии следуют шейки дислокации. Спрей груди с 70% этанола. Осторожно сделать 5-6 cm центральный разрез через ангумент и брюшной стенки по всей длине грудной клетки подвергать плевральную полость и сердце.
Примечание: Не повредить основные органы и сохранить ножницы советы вверх. - Впрыснуть по крайней мере 10 мл 0,9% физиологического раствора в верхней части левого желудочка с помощью 26 G иглы.
Примечание: Успешная перфузии отмечена бланширование печени. - Откройте брюшной полости с ножницами и вырезать перигонадные жировые подушечки на каждой стороне с тонкой изогнутые ножницы. Вскрыть ткани гонадал с тонкой изогнутые ножницы и весят жировой ткани.
- Выполните механической диссоциации с помощью ножниц и вырезать жировой ткани на мелкие кусочки в чашке Петри на 4 ° c. Передача жировой ткани в 50 mL конические центрифуги и промыть чашку Петри с 1 мл 0,5% БСА/PBS.
- Добавьте 3 мл раствора дайджеста жировой ткани (как подготовлено в шаге 2,3) на грамм жировой ткани. Инкубировать раствор жировой ткани при температуре 37 ° c в течение 20 мин под нежным встряхивания (200 оборотов в минуту).
- Добавьте 5 мл 0,5% БСА/PBS на грамм жировой ткани и положите на лед. Triturate решение много раз с 10 мл серологических пипетки и передать его через стрейнер (100 мкм) с помощью поршень.
- Центрифуга при температуре 500 x g 10 мин при температуре 4 °c.
- Удалите плавающую фракцию адипоцита с помощью пипеттинга. Ресуспензируем ячейки гранул (стромальные сосудистые фракции) в 1 мл в буфер лизиса (см. таблицу материалов). Добавьте 10 мл 2% ФТС PBS.
- Центрифуга при температуре 500 x g 10 мин при температуре 4 °c.
- Decant супернатант и ресуспензируем Cell гранулы в 250 мкл 2% ФТС PBS.
- Подсчитайте количество жизнеспособных ячеек на хемоцитометер, используя синюю Трина-исключение.
- Эвтаназии мышей через изофлуран анестезии следуют шейки дислокации. Спрей груди с 70% этанола. Осторожно сделать 5-6 cm центральный разрез через ангумент и брюшной стенки по всей длине грудной клетки подвергать плевральную полость и сердце.
-
Пищеварение ткани печени
- Храните печень в конической центрифуге трубки заполнены PBS и транспорта на льду.
- Выполните механическую диссоциацию с помощью шприцев в чашке Петри при температуре 4 °C. Положите расчлененные ткани печени в 50 mL коническая центрифуга трубки, содержащие 10 мл теплого раствора дайджест печени. Промойте чашку Петри 3 мл раствора для переваривания печени.
- Инкубировать раствор ткани печени при температуре 37 ° c в течение 20 мин под нежным встряхивания (200 оборотов в минуту).
- Добавьте 20 мл ГБСС. Triturate решение много раз с 10 мл серологических пипетки и передать его через стрейнер (100 мкм) с помощью поршень.
- Центрифуга при температуре 500 x g 10 мин при температуре 4 °c. Decant супернатант и ресуспензируем ячейки гранул в 20 мл гбсс.
- Центрифуга при температуре 30 х g в течение 1 мин при комнатной температуры для удаления матрицы гепатоцитов. Выбросьте Пелле клетки.
- Центрифуга супернатант на 500 x g в течение 10 мин при температуре 4 °c. Ресуспензируем гранулы в 10 мл 33% низкой вязкостью градиент плотности среднего раствора (см. таблицу материалов) в ГБСС следуют центрифугирования (800 х г; 30 мин; комнатной температуре; без тормозов).
- Ресуспензируем гранулы в 1 мл из АК лизиса буфера и инкубировать в течение 4 мин при комнатной температуре. Затем добавьте 10 мл ГБСС.
Примечание: Чтобы отказаться от супернатант АСК супернатант с интерфазой (гепатоциты) очень осторожно с передачей пипетки (как можно больше без принятия гранул с иммунными клетками и эритроцитов). - Pass клетки через 30 мкм стрейнер в 15 mL коническая центрифуга трубки и центрифуги при 500 x g для 10 мин при 4 °c. Decant супернатант и ресуспензируем Cell гранулы в 250 мкл 2% ФТС PBS.
- Подсчитайте количество жизнеспособных ячеек на хемоцитометер, используя синюю Трина-исключение.
4. поверхностное окрашивание
- Подготовьте смесь антитела для т-клеток-подмножеств (панель 1) и врожденных иммунных клеток (панель 2), как описано в таблице 1 и таблице 2. Объемы оптимизированы для одного образца (100 мкл) в отношении концентраций антител.
Примечание: Лимфоциты и врожденные иммунные клетки присутствуют различия в аутофлуоресценции и должны анализироваться отдельно. - Используйте до 3 x 106 ячеек в 100 мкл в полистирол FACS трубки для окрашивания поверхности. Чтобы заблокировать рецепторы FC добавить 10 мкл анти-CD16/CD32 антитела (разбавленный 1:100) и инкубировать в течение 10 мин на льду. Используйте незапятнанный отрицательный образец управления, чтобы отрегулировать боковой разброс (ССК) и форвард-разброс (КФС) для определения местоположения отрицательной ячейки населения.
- Вихревые и добавить соответствующий объем антител смесь для группы 1 и группа 2. Добавьте 1 мкл красителя жизнеспособности для каждого образца, чтобы обеспечить живую и мертвую клеточную дискриминацию. Инкубировать для 20 мин при температуре 4 °C и защищен от света.
- Вымойте два раза с 2 мл 2% ФТС PBS и центрифуги на 300 x g в течение 5 минут при температуре 4 °c.
- Ресуспензируем ячейки гранулы в 300 мкл 2% ФТС PBS и хранить при температуре 4 °C до FACS анализа.
Примечание: Перед началом измерения проходят ячейки через 30 мкм сетчатый фильтр в полистирол FACS трубки и вихря. Поток цитометрии был выполнен с маркированных клеток, хранящихся в 2% ФТС PBS при температуре 4 ° c для 1-3 h. клетки должны анализироваться как можно скорее для оптимизации результатов.
5. поток цитометрии компенсация, приобретение, и стробирования
- Запустите незапятнанный отрицательный образец управления, чтобы установить КФС и ССК и корректировать напряжение тока cytometer для обнаружения лейкоцитов популяций и различать между мусором и жизнеспособных клеток. Исключить мусор и мертвые клетки.
Примечание: Жизнеспособность ячейки суспензии из печени может быть ниже, чем жизнеспособность от ячейки суспензий из перигонадал жировой ткани из-за дополнительной плотности разделения плотность. - Запустите одиночные окрашенные образцы управления для мультицветной компенсации.
Примечание: Шарики захвата антитела смогли также быть использованы для того чтобы отрегулировать для спектрального перекрытия если число клеток населенности клетки интереса слишком низко для того чтобы компенсировать использующ клетки. Для обнаружения возможных автофлуоресцентных сигналов клеток флуоресценции минус один (FMO) контроль за каждым антителом рекомендуется, но не применялись в этом протоколе. - Запустите измерение, соберите соответствующее количество событий (не менее 50 000 событий) и запишите экспериментальные данные.
- Экспортировать файлы данных ФТС для анализа и устанавливать стратегию стробирования. Ворота на CD45+ лейкоцитов для определения последующих клеточных популяций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный протокол позволяет охарактеризовать поверхностные маркеры врожденных и адаптивных иммунных клеток, изолированных от Мурина перигонадной жировой ткани и печени, в модели индуцированного диетой НЭША. В этой модели, Нэш был вызван администрацией HFD плюс сахароза (6%) в питьевой воде в течение 7 до 15 недель в C57Bl/6J мышей, как сообщалось ранее13. Важно, что мыши были размещены в полу стерильных условиях и, таким образом, подвергаются воздействию экологических антигенов на протяжении всего эксперимента. HФД кормили мышей размещены в условиях SPF и Чоу диета мышей размещается под SPF и не-SPF условия служили в качестве элементов управления. Кормление из ГХД привело к значительному увеличению массы тела уже после 7 недель в обеих группах. Существенная разница в весе тела была впервые очевидна на неделе 4 (P < 0,001) и оставался значительным в течение следующих экспериментальных недель. Однако, никаких существенных различий в весе было показано между SPF и не-SPF мышей после 7 недель13. Стромальные сосудистой фракции и иммунных клеток из перигонадной жировой ткани и печени самцов мышей кормили ХФД в течение 7 недель были изолированы коллагеназы пищеварения. Иммунные клетки были помечены фторфор-пряные первичные антитела и пропорции т-клеток, B-клеток, макрофагов, НК-клеток, дендритных клеток и гранулоцитов были количественно через поток цитометрии анализа. Стробирования для субпопуляций т-клеток, включая дискриминацию Дублет, и жизнеспособность окрашивание, в Мурина перигонадал жир иллюстрируется на рисунке 1. CD45+ лейкоциты первый закрытый для CD4 и CD8, а затем закрытый для CD44 и CD62L различать наивный, Центральная память, эффекторных памяти и эффекторных т-клеток. CD44+ клетки после этого более добавоко были охарактеризованы с CD127, KLRG1 и PD-1. Рисунок 2 обеспечивает стратегию стробирования для анализа B-клеток, ГРАНУЛОЦИТОВ, НК-клеток, макрофагов и дендритных клеток.
Репрезентативные результаты внеклеточного окрашивания т-клеток в пределах Мурина печени облученных ХДС мышей по сравнению с ХДС SPF мышей демонстрируют на рисунке 3A. В самом деле, более высокий процент эффекторной памяти CD4+ и CD8+ т клетки могут быть обнаружены в hфд воздействию мышей, в то время как интрапеченочная наивные CD4+ и CD8+ т-клетки были ОБНАРУЖЕНЫ значительно ниже в подвергается по сравнению с SPF мышей на Неделя 7 (рис. 3а).
Для подтверждения этих результатов, печеночная воспалительная реакция, связанная с воздействием антигена исследовали гематоксифлин/ээин окрашивание отделов печени 15 недель кормили мышей13. Тяжелый стеатоз, в том числе увеличение больших капель липидов в результате чего макровезикулярного стеатоза, лоблярного воспаления, геоклеточного воздухоплавания и уничтожили дольковой структуры, был найден в HФД подвергается мышей в то время как только некоторые SPF мышей отображается мягкий жир накопление в печени (Рисунок 3B). Как сообщается на рисунке 3C, процент НК-клеток был выше в перигонадал жировой ткани ВФД облученных мышей, в то время как ДФД SPF мышей показали более высокий процент дендритных клеток. Не обнаружено существенных различий для макрофагов и моноцитов. В целом, эти результаты подтверждают более тяжелый стеатоз печени в HФД подвергается мышей и незначительные различия в жировой ткани между ВФД воздействию и SPF мышей.
Таблица 1 показывает антитела, используемые в панели 1. Антитела, используемые в анализе расхода цитометрии для экстракуллярной окраски клеток B, макрофагов, НК-клеток, дендритных клеток и гранулоцитов изображены в таблице 2.
Рисунок 1 : Схематическое представление стратегии стробирования используемого в анализе потока цитометрии жировых иммунных клеток (панель 1). Во-первых, клетки закрытого типа на синглетно. Затем мусор исключается с помощью зоны Форвард-рассеивания (КФС) и боковой рассеивания (ССК-а) и выбора правильного размера. Клетки более добавок охарактеризованы выражением CD45. Жизнеспособные клетки выбираются с использованием живого/Мертвого маркера ячейки, которая является реактивной флуоресцентной краской из аминов, которая не предназначена для живых клеток, а предназначена для клеток с нарушенной мембраной. Т-клетки были разделены на цитотоксические т-клетки (CD8+) и т-вспомогательные клетки (CD4+) и подразделяются на наивные (CD44+CD62L-), Центральная память (CD44+CD62L+), эффекторный память (CD44+CD62L- ) и эффекторных (CD44-CD62L+) т-клеток. Наконец, CD44+ ячейки закрытого типа на KLRG1, CD127 и PD-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : Схематическое представление стратегии стробирования используемого в анализе потока цитометрии жировых иммунных клеток (панель 2). Стробирования дендритных клеток был основан на CD11b и CD11c выражении. Следующие другие популяции были определены: B-клетки, НК-клетки, макрофаги, моноциты и гранулоциты. Данные анализировались после приобретения с соответствующим программным обеспечением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель потока цитометрии анализ т-клеток, изолированных от Мурина перигонадал жировой ткани и печени. (A) CD4+ и CD8+ т клеток Мурина печень от 7 недели ХФД мышей поддерживается под SPF и подвергается условия были проанализированы с помощью потока цитометрии. (B) представитель окрашивание 15 неделя ФДС SPF и подвергаются мышей. Проникновение иммунных клеток и раздутый гепатоциты (наконечник стрелы) иллюстрируют Нэш. (C) процент жировых врожденных иммунных клеток в процентах от ЛЕЙКОЦИТОВ в hфд мышей поддерживается под SPF или подвергается условиям в течение 7 недель. n = 6-10 мышей на группу. Значение было определено с помощью двух способов многозначного измерения Анова. Данные представлены как среднее ± МДж. * * P < 0.01, * * * P < 0,001. Эта цифра была изменена с рефеограда13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Таблица 1: антитела, используемые в потоке цитометрии для внеклеточного окрашивания (Группа 1). Количество описанного антитела для анализа одного образца.
Таблица 2: антитела, используемые в потоке цитометрии для внеклеточного окрашивания (Группа 2). Количество описанного антитела для анализа одного образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стеатогепатит имеет сильную связь с метаболическими аномалиями, такими как ожирение, инсулинорезистентность и дислипидемия15. Многочисленные исследования показывают, что воспаление жировой ткани может стимулировать патогенез диабета типа 2, включая измененные уровни клеток как врожденной, так и адаптивной иммунной системы4,5,16,17 . В добавлении, было найдено что тучность модулирует активацию иммунных путей, которые могут вести к осложнениям печенки18. Существует растущий интерес к характеризации фенотипов иммунных клеток в жировой и печени воспалительной реакции, потому что каждая субпопуляция иммунных клеток вносит свой вклад в другой путь к развитию резистентности к инсулину и стеатогепатит.
Этот метод дает подробную информацию о том, как изолировать и количественно относительное количество иммунных клеток от перигонадал жировой ткани и печени. Кроме того, методы показывают, как сохранить ДФД кормили мышей в не-SPF условиях для того, чтобы вызвать стеатогепатит. Протокол может быть использован для изучения иммунных функций клеток и исследовать ассоциации специфических иммунных клеток между различными тканями в микробиологически нормализованной среде.
В нашем настоящем исследовании, ВФД кормления не-SPF мышей в результате развития резистентности к инсулину и стеатогепатит, в то время как ВФД SPF мышей разработали резистентность к инсулину, мягкий печеночный стеатоз, но не стеатогепатит, как это определено иммуногистохимии. Кроме того, подмножеств жировой и печени иммунных клеток значительно отличались между облученных ГХД и SPF мышей, что подтверждает наше понимание значения различных жилищных условий. В целом, мы могли бы показать, что микробные воздействия комэнсальной флоры может повлиять на иммунологические свойства C57Bl/6 мышей резко. Предыдущая работа показала, что разнообразие и функции кишечной микробиома зависит от диеты индуцированной ожирения19,20 и что кишка барьерная функция и кишечной проницаемости зависит от жилищных условий21. Мы стремимся к решению связь между кишечной колонизации и жировой и печени воспаление в предстоящем издании.
На этапе планирования предлагаемых методов необходимо рассмотреть несколько моментов. Во-первых, одноклеточные суспензии, необходимые для всех ток-цитометрии анализов и жизнеспособность клеток может быть затронута уровнем диссоциации механических тканей и длительность ферментативной ткани пищеварения. Для того, чтобы избежать уничтожения эпитопа антител и максимального выхода функционально жизнеспособных, диссоциированных клеток, тип ткани, возраст животного, генетические модификации, концентрация ферментов, температура и время инкубации должны быть приняты во внимание.
Во-вторых, наш протокол был оптимизирован, чтобы количественно определить различные фенотипы иммунных клеток от страдающих ожирением ГФД кормили мышей с воспалением жировой ткани и стеатогепатит. Как целостности тканей, количество иммунных клеток и, таким образом, качество пищеварения ткани, могут быть затронуты воспалительные процессы, протокол и коллагеназы, используемые должны быть оптимизированы для других тканей, чем печень или жировой ткани в конкретных экспериментах связанные с вскрытий методов, инкубаций раз или коллагеназы используются для переваривания ткани. В-третьих, для протокола важно, чтобы каждый день включали различные экспериментальные группы для устранения последствий из-за повседневной вариации потока цитометрии (температура, время инкубации и т.д.).
Однако, есть некоторые важные ограничения описанного метода. Для того, чтобы различать позитивные и отрицательные сигналы, чтобы правильно регулировать ворота, чтобы идентифицировать клетки, позитивные для конкретных поверхностных маркеров в экспериментальных образцах, Флуоресценция минус один (FMO) контролирует (FMO контроль содержит все флюоррохромы в следует использовать панель, за исключением той, которая измеряется). В этом эксперименте данные могли быть надлежащим образом компенсированы, и стробирования был ясен, но мы рекомендуем добавлять элементы управления FMO в экспериментальную установку, когда это возможно. Кроме того, FoxP3, который должен быть окрашенных внутриклеточно требующих проникания клеточной мембраны, должны были использоваться для количественной оценки регуляторных т-клеток, поскольку она позволяет более точное определение, чем использование CD25 и CD127 (Таблица 2). Хотя поток цитометрии позволяет количественно квантификации нескольких поверхностных маркеров одновременно, их количество ограничено до 12 на образец из-за перекрытия в спектрах излучения. Для коррекции спектрального перекрытия требуется трудоемкие компенсации флуоресценции. Для учета этого, стратегическое развитие панели или использование методов массовой цитометрии не требуется. Кроме того, трудности могут возникнуть в жилищном строительстве мышей в не-SPF условиях в отношении конкретных животных жилья руководящих принципов, но в настоящее время небольшое число исследований, не-SPF грызунов показывает, что такие исследования возможны12,21 . Например, можно было бы оценить отделенные животные объекты для SPF и не-SPF мышей. Развитие человека, как взрослый иммунная система скомпрометирована в SPF мышей12,21, в результате чего ограничения для перевода стратегий лечения от животных эксперименты в клинических исследованиях.
В заключении, мы предоставляем подробный протокол для фенотипической характеристики Мурина жировой и печеночной иммунных клеток с использованием потока цитометрии в диете индуцированной животной модели НЭША и инсулинорезистентности. Принимая во внимание сложную функцию и регулирование как врожденных, так и адаптивных клеток в контексте ожирения и регуляции обменных процессов, предлагаемые нами методы должны помочь углубить наше понимание иммунологических механизмов, чтобы сбалансировать метаболический гомеостаз и, таким образом, помогают развить человеческие терапии, которые могут восстановить противовоспалительные иммунные реакции. В целом, представленная модель животного служит быстрой и надежной моделью для оценки метаболических осложнений, связанных с ожирением и может быть применен к другим моделям заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Анке Журисч, Диана Woellner, д-р Катрин Витте и Корнелии Хекманн за помощь в экспериментальных процедурах и Бенджамин Tiburzy из Билегенда для полезные замечания по стратегии стробирования. И.С. был поддержан грантом Гельмхольца (ICEMED). Это исследование было поддержано грантами из отдела клинических исследований Берлинского института здравоохранения (БиГ), «БЭЛТ-гранта» федеральным министерством образования и исследований Германии и Фондом Эйнштейна. К.С.-Б. и H.-Д.В. финансируются FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B.
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
