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Genetics

कृत्रिम आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय विस्तार परिसर को-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रोसेसिंग इवेंट्स को अलग करने के लिए

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59497
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

Summary

यहाँ, हम आरएनए पॉलिमरेज II (पोल II) दीर्घीकरण परिसरों की असेंबली का वर्णन करते हैं जिसमें केवल कम कृत्रिम डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और शुद्ध पोल II की आवश्यकता होती है। ये परिसर पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसर के साथ जुड़े प्रतिलिपिके सह-लेखनीय प्रसंस्करण अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं।

Abstract

यूकैरियोटिक एमआरएनए संश्लेषण एक जटिल जैव रासायनिक प्रक्रिया है जिसमें बहु-सबयूनिट एंजाइम आरएनए पॉलिमरेज II और सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग और पूर्ववर्ती आरएनए के एप्लिकेशन द्वारा एक पूर्ववर्ती आरएनए में डीएनए टेम्पलेट के प्रतिलेखन की आवश्यकता होती है ताकि परिपक्व एमआरएनए का निर्माण किया जा सके। MRNA संश्लेषण के दौरान, आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसर प्रतिलेखन कारकों का एक बड़ा संग्रह है कि अपनी उत्प्रेरक गतिविधि को नियंत्रित द्वारा विनियमन के लिए एक लक्ष्य है, साथ ही कैपिंग, splicing, और 3' प्रसंस्करण एंजाइमों कि परिपक्व MRNA बनाने. MRNA संश्लेषण के अंतर्निहित जटिलता के कारण, सरल प्रयोगात्मक प्रणालियों अलगाव को सक्षम करने और इसके विभिन्न सह-transcriptional चरणों की जांच महान उपयोगिता है.

इस अनुच्छेद में, हम एक ऐसे सरल प्रयोगात्मक सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग की जांच के लिए उपयुक्त प्रणाली का वर्णन. यह प्रणाली शुद्ध पॉलिमरेज और कृत्रिम प्रतिलेखन बुलबुले से इकट्ठे परिभाषित आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों पर निर्भर करता है। जब biotinylated डीएनए के माध्यम से स्थिर, इन आरएनए polymerase द्वितीय बढ़ाव परिसरों सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कैपिंग और तंत्र जिसके द्वारा बढ़ाव जटिल रंगरूटों और को नियंत्रित करता है कैपिंग एंजाइम विच्छेदन के लिए एक आसानी से manipulable उपकरण प्रदान करते हैं सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कैपिंग। हम आशा करते हैं कि इस प्रणाली को भर्ती और/या प्रोटीन परिसरों के संयोजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें आरएनए परिपक्वता के अन्य चरणों में भूमिकाओं के साथ आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसर में जोड़ा जा सकता है।

Introduction

यूकैरियोटिक दूत आरएनए (एमआरएनए) संश्लेषण एक विस्तृत जैव रासायनिक प्रक्रिया है जिसमें आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय द्वारा एक अप्रसंस्कृत अग्रदूत आरएनए का संश्लेषण और परिपक्व एमआरएनए को उत्पन्न करने के लिए पूर्ववर्ती आरएनए के प्रसंस्करण शामिल है। कैपिंग, स्पेलिंग, और पॉलीएडेनिलेशन के आरएनए प्रसंस्करण चरणों को काफी हद तक सह-प्रतिलेखन किया जाता है। पोल द्वितीय बढ़ाना परिसर एक पाड़ है कि भर्ती और आरएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के कई की गतिविधियों आर्केस्ट्रा के रूप में कार्य करता है. नतीजतन, कैसे परिपक्व यूकैरियोटिक mRNAs उत्पन्न कर रहे हैं की हमारी अंतिम समझ प्रयोगात्मक प्रणालियों के विकास पर भारी निर्भर करेगा बढ़ाव परिसर में भर्ती अंतर्निहित जैव रासायनिक तंत्र के विच्छेदन की अनुमति और सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग, स्पेलिंग, और पॉलीडेनिलेशन के लिए जिम्मेदार एंजाइमों का विनियमन।

आश्चर्य नहीं कि ऐसी प्रयोगात्मक प्रणालियों का विकास कठिन रहा है। एक प्रमुख बाधा पोल द्वितीय प्रतिलेखन की उल्लेखनीय जटिलता ही किया गया है, जहां बस इन विट्रो में पोल द्वितीय द्वारा बेसल प्रतिलेखन पुनर्गठन पांच सामान्य प्रतिलेखन दीक्षा कारकों की एक न्यूनतम सेट की आवश्यकता है: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, और TFIIH 1. इसके अलावा, विट्रो में विनियमित पोल द्वितीय प्रतिलेखन के किसी भी प्रकार के पुनर्गठन के लिए प्रतिलेखन कारकों और coregulators का एक भी बड़ा सेट की आवश्यकता है. इस प्रकार, एक प्रमुख लक्ष्य सक्रिय पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों पोल द्वितीय प्रतिलेखन और आरएनए प्रसंस्करण के कार्यात्मक युग्मन की जांच के लिए उपयुक्त के पुनर्गठन की अनुमति सरल प्रयोगात्मक प्रणालियों को विकसित करने के लिए किया गया है।

सक्रिय पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के पुनर्गठन के लिए एक ऐसी सरल विधि लम्बी पोल द्वितीय के संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो गया है और, और हाल ही में, सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रसंस्करण की जांच के लिए2,3 ,4,5. इस लेख में, हम बताते हैं कि कैसे पोल द्वितीय बढ़ाव जटिल शुद्ध पोल द्वितीय और सिंथेटिक प्रतिलेखन बुलबुले से तैयार प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है नवजात पोल द्वितीय प्रतिलिपि के सह-प्रतिलेखन कैपिंग अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए.

कैपिंग नवजात पोल द्वितीय प्रतिलिपि के 5'-triphosphate अंत करने के लिए एक 5'-guanosine "कैप" के सहसंयोजक जोड़ को संदर्भित करता है। यह टोपी एम आर एन ए परिपक्वता, परिवहन, अनुवाद तथा अन्य प्रक्रियाओं6,7 के बाद के चरणों के लिए महत्वपूर्णहै। टोपी एक एंजाइम कैपिंग एंजाइम के रूप में संदर्भित द्वारा पोल द्वितीय प्रतिलिपि करने के लिए सह-transcriptionally जोड़ा जाता है. स्तनधारी कोशिकाओं में, आरएनए 5'-ट्राइफॉस्फेटेज और कैपिंग एंजाइम की गुएनिल ट्रांसफरेज गतिविधियों के लिए जिम्मेदार सक्रिय साइटें एक पॉलीपेप्टाइड8के भीतर निहित होती हैं। कैपिंग एंजाइम पोल द्वितीय शरीर पर अभी तक परिभाषित सतहों के साथ बातचीत के माध्यम से पोल द्वितीय बढ़ाव परिसर में भर्ती किया जाता है और इसके हेप्टापटाइड के Ser5 पर Rb1 carboxy-टर्मिनल डोमेन (CTD) फॉस्फोरिलेटेड5दोहराता है। दीर्घीकरण परिसर में, कैपिंग एंजाइम एक 5'-गुआनोसाइन टोपी के अलावा उत्प्रेरक एक बार नवजात प्रतिलिपि कम से कम 18 न्यूक्लिओटाइड की लंबाई तक पहुँच जाता है और polymerase आरएनए निकास चैनल से उभरा है। कैपिंग प्रतिक्रिया के पहले चरण में, ट्राइफॉस्फेट hydrolyzes आरएनए 5'-ट्राइफॉस्फेट एक 5'-diphosphate उपज करने के लिए। दूसरे चरण में, GTP एक GMP कैपिंग एंजाइम मध्यवर्ती बनाने, guanylyl transferase द्वारा जीएमपी के लिए hydrolyzed है. अंत में, guanylyl transferase टोपी का उत्पादन करने के लिए नवजात प्रतिलिपि के 5'-diphosphate अंत करने के लिए जीएमपी स्थानान्तरण।

कैपिंग प्रतिक्रिया की एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग (यानी, कार्यात्मक पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के साथ जुड़े प्रतिलिपियों की कैपिंग) मुक्त आरएनए5,9की कैपिंग की तुलना में अधिक कुशल है। इस प्रकार, क्षेत्र में एक बड़ा सवाल यह रहा है कि कैसे कैपिंग के इस नाटकीय सक्रियण पोल द्वितीय बढ़ाना परिसर के साथ कैपिंग एंजाइम की बातचीत के माध्यम से हासिल की है. इस प्रोटोकॉल में हम केवल शुद्ध आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय और कृत्रिम प्रतिलेखन बुलबुले का उपयोग कर सक्रिय आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों की विधानसभा का वर्णन करते हैं। इन विधियों को परिभाषित लंबाई और अनुक्रम की प्रतिलिपि के साथ आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय दीर्घीकरण परिसरों के निर्माण की अनुमति देते हैं। हाल ही में किए गए एक अध्ययन में हमने इन परिभाषित आरएनए पॉलिमरेज II दीर्घीकरण परिसरों का प्रयोग आरएनए कैपिंग5के तंत्र के पहलुओं की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया है। विशेष रूप से, हमने यह दिखाया कि (i) इन दीर्घीकरण परिसरों से संबद्ध आरएनए की कैपिंग मुक्त आरएनए को कैपिंग की तुलना में 100 गुना अधिक कुशल थी और (पप) पोल II सीटीडी के टीएफआईएच-निर्भर फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रेरित किया गया था। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सिद्धांत रूप में पोल द्वितीय दीर्घीकरण परिसर से जुड़े अन्य सह-प्रतिलेखन आरएनए प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए substrates उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल की धारा 1 में, कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों एक सिंथेटिक टेम्पलेट किनारा डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड एक आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के लिए annealing द्वारा बनाई गई हैं कि इसके 3'अंत में पूरक है टेम्पलेट किनारा डीएनए के लगभग 9 न्यूक्लिओटाइड. पोल द्वितीय तो डीएनए पर भरी हुई है: RNA डुप्लेक्स. इसके बाद दीर्घीकरण परिसर आंशिक रूप से पूरक, गैर-टेम्पलेट किनारा डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के अतिरिक्त पूर्ण होता है जिसे बायोटिन के साथ इसके 3'-end में लेबल किया जाता है (चित्र 1 और चित्र 2A)। आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड को पोल II द्वारा इन दीर्घीकरण परिसरों में विस्तारित किया जाता है ताकि रेडियोलेबल न्यूक्लिओटाइड के उपयुक्त संयोजनों के अतिरिक्त परिभाषित लंबाई और अनुक्रम की रेडियोलेबल प्रतिलिपि बनाने के लिए। इसके अलावा, unincorporated न्यूक्लिओटाइड को दूर करने के लिए washes के संयोजन का उपयोग कर और न्यूक्लिओटाइड के विभिन्न संयोजनों के आगे इसके अलावा, एक डीएनए टेम्पलेट के साथ विभिन्न पदों के लिए पोल द्वितीय "चल" कर सकते हैं और परिभाषित लंबाई के आरएनए संश्लेषित. आरएनए को तब शुद्ध किया जाता है और यूरिया-पेज जैल में इलेक्ट्रोफोरोसिस के अधीन किया जाता है। प्रोटोकॉल के अनुभाग 2 में, कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों का उपयोग सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। उदाहरण प्रस्तुत उपाय ों TFIIH-निर्भर फॉस्फोरिलेशन के प्रभाव पर पोल द्वितीय CTD सह-प्रतिलेखन आरएनए कैपिंग पर. इस प्रयोग में, हम एंजाइम सांद्रता (5, 15 और 45 एनजी प्रति प्रतिक्रिया) और समय (1, 2 और 4 मिनट) कैपिंग के एक समारोह के रूप में सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग की सीमा को मापते हैं।

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Protocol

1. कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों और पोल द्वितीय चलने की विधानसभा

  1. चुंबकीय मोती पर एक 3' बायोटिन अणु युक्त गैर-टेम्पलेट डीएनए ओलिगो के 1 nmol immobilize.
    नोट:     निम्नलिखित चरणों अग्रिम में भविष्य के प्रयोगों के लिए तैयार करने के लिए किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी अल्पाधिकार अनुक्रम सारणी 1में उपलब्ध कराए गए हैं। आरएनए ओलिगोस 5'-ट्राइफॉस्फेट संशोधनों के साथ संश्लेषित कर रहे हैं।
    1. एक कम प्रोटीन बाध्यकारी 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए चुंबकीय मोती (10 मिलीग्राम/एमएल) के 200 डिग्री एल जोड़ें, और फिर 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है।
    2. जबकि ट्यूब चुंबकीय रैक पर है, मोती परेशान किए बिना ट्यूब से तरल हटा दें. मोती धोने के लिए, रैक से ट्यूब को हटाने, 5 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 0.5 एमएम EDTA, 1 एम NaCl, रैक करने के लिए ट्यूब वापस, और 2 मिनट के बाद धोने समाधान हटाने के 1 एमएल जोड़ें।
    3. एक ही बफर के 200 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके 2 बार washes दोहराएँ।
    4. चुंबकीय मोती को 10 एमएम त्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 1 एमएम एड्टा, 2 एम एनसीएल, बफर के 400 डिग्री एल में पुन: स्फूर्तिबद्ध करें। फिर एच2ओ के 380 डिग्री एल और 10 डिग्री एम गैर-टेम्पलेट बायोटिनलेट डीएनए ओलिगो के 20 डिग्री एल के साथ मिश्रण। ट्यूब को एक नटेटर पर रखें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. धो स्थिर गैर-टेम्पलेट डीएनए ओलिगो 5 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 0.5 एमएम EDTA, 1 M NaCl, और उसके बाद 3 बार के साथ 3 बार 20 एमएम HEPES-NaOH पीएच 7.9, 20% ग्लिसरॉल, 100 एमएम केसीएल, 1 mM/
    6. बीएसए के साथ अवरुद्ध मोती खत्म करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूब छोड़ दें।
    7. अगले दिन, चुंबकीय रैक में ट्यूब जगह, हटाने और तरल त्यागें, और 20 m HEPES-NaOH पीएच 7.9, 20% ग्लिसरॉल, 100 एम एम KCl, 1 एमएम EDTA, 0.5 मिलीग्राम / एमएल गोवन सीरम अल्बुमिन और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण के 200 $L में मोती resuspend. इस डीएनए टेम्पलेट के लिए, अंतिम सांद्रता लगभग 5 डिग्री सेल्सियस है।
      नोट: इनक्यूबेशन समय और ओलिगो एकाग्रता को प्रत्येक बायोटिनलेट डीएनए ओलिगो के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। इस टेम्पलेट 200 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त प्रदान करना चाहिए, और पिछले कम से कम 6 महीने जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
  2. डीएनए प्राप्त करने के लिए Anneal आरएनए और डीएनए टेम्पलेट किनारा ओलिगोन्यूक्लिओटाइड ओलिगोस 2:1 मोलर अनुपात (20 और 10 पी मोल, क्रमशः) डीएनए प्राप्त करने के लिए: आरएनए डुप्लेक्स।
    1. सारणी 2में वर्णित 10 डिग्री सेल्सियस अनीलन मिश्रण सेट कीजिये।
      नोट: अनीलन मिश्रण का 10 डिग्री सेल्सियस 10 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त हैं। यदि अधिक परख का प्रदर्शन किया जाना है तो अनीलन मिश्रण को आवश्यकतानुसार बढ़ाया जा सकता है।
    2. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए एक थर्मल साइकिलर में annealing प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन: 45 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 2 मिनट प्रत्येक के 12 चक्र के बाद, 43 डिग्री सेल्सियस से शुरू करने और तापमान 2 डिग्री सेल्सियस प्रति चक्र को कम. 4 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय।
      नोट: यह एक लचीला समय बिंदु है. ऐनीलिंग $ 30 मिनट के भीतर समाप्त हो गया है, लेकिन एक लंबी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जा सकता है। प्रयोगशाला में, annealing मिश्रण प्रतिक्रिया दक्षता में किसी भी कमी को देख के बिना अप करने के लिए 4 एच के लिए बैठे छोड़ दिया गया है।
    3. जबकि टेम्पलेट किनारा डीएनए के लिए ANNEaling आरएनए, प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के लिए बफ़र्स तैयार करते हैं. प्रत्येक बफर के साथ एक ही प्रतिक्रिया के लिए प्रत्येक बफर तैयार करने के लिए आवश्यक तत्व टेबल्स 2 से 8में सूचीबद्ध हैं। [Y(X+1) + 1] के एक कारक द्वारा व्यंजनों को स्केल अप करें धोने के लिए और (X+1) अन्य सभी बफ़र्स के लिए। X - तैयार किया जा करने के लिए प्रतिक्रियाओं की संख्या; Y ] धोने के कदम की संख्या की जरूरत है (न्यूनतम 3).
      नोट: सभी बफ़र्स नए प्रयोग के दिन तैयार करें. PVA बफ़र्स में जोड़ा गया है के बाद बर्फ पर ट्यूब जगह नहीं है. उपयोग करने से ठीक पहले बफ़र्स में पोल II या न्यूक्लिओटाइड जोड़ें.
  3. डीएनए:RNA संकर पर शुद्ध आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय लोड करें।
    1. डीएनए के 1 pmol (1 डिग्री सेल्सियस) मिलाएं: पोल द्वितीय बफर के 13 डिग्री एल के साथ आरएनए डुप्लेक्स (तालिका 3से)।
    2. शुद्ध आरएनए पोल II (1 डिग्री एल) की $0.02 इकाइयां चरण 1.3.1 से मिश्रण में जोड़ें और बुलबुले को शुरू किए बिना धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपलेट करके और पाइप टिप के साथ हिलाते हुए मिश्रण करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: पर यहाँ से दिए गए वॉल्यूम एक ही प्रतिक्रिया के लिए कर रहे हैं; प्रयोग में अभिक्रियाओं की संख्या के लिए आवश्यकतानुसार मापनी. आरएनए पोल द्वितीय चूहे जिगर से शुद्ध के रूप में वर्णित10 इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता है; तथापि, आरएनए पोल II सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं या खमीर सहित अन्य स्रोतों से शुद्ध भी3,4,5,11,12,13का इस्तेमाल किया जा सकता है .
  4. biotinylated गैर-टेम्पलेट डीएनए के अलावा दीर्घीकरण परिसर को पूरा करें।
    1. गैर-टेम्पलेट डीएनए ओलिगो के 5 पी मोल (1 डिग्री एल) को गैर-टेम्पलेट डीएनए बफर (तालिका 4से) के 14 डिग्री सेल्सियस तक जोड़ें, चरण 1.3.2 से ट्यूब में जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. चुंबकीय रैक में नमूने को 2 मिनट के लिए रखें. वॉश 1x 30 डिग्री सेल्सियस वॉश बफर (तालिका 7से ) के साथ unincorporated पोल द्वितीय और oligos को दूर करने के लिए।
  5. रेडियोलेबल आरएनए 23mers युक्त दीर्घीकरण परिसरों उत्पन्न करें।
    1. सभी आगे ऊष्मायन 30 डिग्री सेल्सियस पर कार्य करें। 15 डिग्री सेल्सियस एटीपी का 1 $L और 10 [सीआई (1 [L) [-32पी] यूटीपी (3,000 Ci/mmol) को पल्स बफर के 23 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें और इसका उपयोग धोया चुंबकीय मोतियों को पुन: निलंबित करने के लिए करें।
      चेतावनी: रेडियोधर्मी सामग्री खतरनाक है। उचित सुरक्षात्मक उपकरण पहनने के लिए और सुरक्षित उपयोग और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के लिए सभी प्रयोगशाला दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: रेडियो लेबल वाले UTP को 15 $M UTP के साथ बदलें जब रेडियो लेबल वाले आरएनए की आवश्यकता नहीं है, जैसे कि पश्चिमी दाग प्रयोगों के लिए।
    2. रेडियो लेबल वाले 23mers के संश्लेषण की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    3. 100 डिग्री सेल्सियस एटीपी और 100 डिग्री एम यूटीपी मिश्रण वाले समाधान के 1.5 डिग्री एल जोड़ें, पीछा बफर के 3.5 डिग्री एल के लिए, preassembled दीर्घीकरण परिसरों युक्त ट्यूब में जोड़ें, और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट 23mers में सभी नवजात प्रतिलिपि का पीछा करने के लिए।
    4. 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में नमूना प्लेस, supernatant को दूर, धोने बफर के 30 डिग्री सेल्सियस के साथ एक बार धोने के लिए unincorporated न्यूक्लिओटाइड को दूर करने के लिए, और धोने बफर के 30 डिग्री एल में resuspend.
    5. प्रतिक्रियाओं को समाप्त करने के लिए या अनुभाग 1.6 पर जाने के लिए प्रोटीनेस K और ग्लाइकोजन (तालिका 9) के साथ 94 डिग्री स्टॉप मिश्रण जोड़ें या कैपिंग परख करने के लिए लंबे समय तक प्रतिलिपि या अनुभाग 2 के साथ दीर्घीकरण परिसरों को उत्पन्न करने के लिए अनुभाग 1.6 पर आगे बढ़ें।
  6. (वैकल्पिक) वॉक पोल द्वितीय 23, 25, और 29 न्यूक्लिओटाइड प्रतिलिपि बनाने के लिए
    1. 1.2.1 से 1.5.4 के माध्यम से वर्णित प्रक्रिया का पालन करें रेडियो लेबल वाले 23mers युक्त दीर्घीकरण परिसरों को तैयार करने के लिए. धोया दीर्घीकरण परिसरों, जो 4 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त परिसरों है की 120 डिग्री सेल्सियस उत्पन्न करने के लिए 4 गुना ऊपर स्केल करें।
    2. लेबल 3 नए ट्यूब "23mer", "25mer" और "29mer". "23mer" ट्यूब के लिए धोया दीर्घीकरण परिसरों के 30 डिग्री एल स्थानांतरण और प्रोटीने जोंग के साथ रोक मिश्रण के 94 डिग्री एल जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में धोया दीर्घीकरण परिसरों के शेष 90 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब प्लेस, supernatant को हटा दें, और बीटीबी के 90 डिग्री एल में मोती resuspend 1.5 एमएम एटीपी और 1.5 एमएम एटीपी के प्रत्येक के साथ पूरक. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    4. एक बार धोने बफर के 90 डिग्री सेल्सियस के साथ धोने के बाद और धोने बफर के 90 डिग्री एल में resssinssके रूप में कदम 1.5.4 में वर्णित, "25mer" ट्यूब के लिए दीर्घीकरण परिसरों के 30 डिग्री एल हस्तांतरण और प्रोटीनके साथ बंद मिश्रण के 94 $L जोड़ें और ग्लाइकोजन.
    5. 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में बढ़ाना परिसरों के शेष 60 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब प्लेस, supernatant को हटा दें, और बीटीबी के 60 डिग्री एल में मोती resuspend 1.5 एमएम एटीपी और 1.5 एमएम एटीपी के प्रत्येक के साथ पूरक 0.8 $L प्रत्येक.
    6. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट, धारा 1.5.5 के रूप में धोने बफर के 60 डिग्री सेल्सियस के साथ एक बार धोने, और धोने बफर के 60 डिग्री एल में फिर से निलंबित।
    7. स्थानांतरण 30 डिग्री सेल्सियस से 2x नमूना करने के लिए "29mer" ट्यूब और या तो प्रोटीन के साथ रोक मिश्रण के 94 डिग्री एल जोड़ने के लिए और ग्लाइकोजन या अनुभाग 2 के लिए आगे बढ़ने कैपिंग परख प्रदर्शन करने के लिए.
    8. आरएनए शुद्धि और विश्लेषण (धारा 3) के लिए आगे बढ़ें।

2. परख Cotranscriptional कैपिंग के लिए कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों का उपयोग

  1. 1.5.5 13 गुना के माध्यम से चरण 1.2.1 में वर्णित प्रक्रिया स्केलिंग द्वारा 23mers युक्त धोया दीर्घीकरण परिसरों उत्पन्न करें। यह 12 प्रतिक्रियाओं + 1 अतिरिक्त के लिए पर्याप्त है.
  2. पोल द्वितीय सीटीडी फॉस्फोरिलेशन
    1. 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में धोया दीर्घीकरण परिसरों युक्त ट्यूब प्लेस, supernatant को हटा दें, और बीटीबी के 377 $L में मोती resuspend 1.5 एमएम एटीपी के 13 $L के साथ पूरक.
    2. क्रमशः दो नए ट्यूब तैयार करें, जिन्हें क्रमशः +H और -H लेबल किया गया है। लेबल किए गए ट्यूब +H में 3 डिग्री सेल्सियस की एल जोड़ना, और लेबल किए गए ट्यूब में -एच 20 एमएम HEPES-NaOH pH 7.9, 20% ग्लिसरॉल, 100 एमएम केसीएल, 1 एम ईडीटीए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल गोविन सीरम एल्बुमिन जोड़ें।
      नोट: हम आम तौर पर चूहे जिगर से शुद्ध TFIIH का उपयोग करें, लेकिन हम इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया है का उपयोग कर $0.6 g/ जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    3. धोए गए दीर्घीकरण संकुलों के 87 डिग्री सेल्सियस को चरण 2.2.1 से ट्यूब में जोड़ें जिसका लेबल +H और 270 डिग्री सेल्सियस धोया हुआ दीर्घीकरण संकुल है, जिसका लेबल -एच इनक्यूबेट 10 मिनट 30 डिग्री सेल्सियस पर है।
    4. 2 मिनट के लिए चुंबकीय रैक में नमूना रखें. अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड और असीमित प्रोटीन को हटाने के लिए, क्रमशः 90 डिग्री सेल्सियल या 270 डिग्री सेल्सियस के साथ -एच प्रतिक्रियाओं में दीर्घीकरण परिसरों को धोएं।
  3. आरएनए कैपिंग
    1. कैपिंग मिश्रण के 87 डिग्री एल में लेबल किए गए ट्यूब +H में दीर्घीकरण परिसरों को पुन: निलंबित करें (बीटीबी 50 डिग्री सेल्सियस जीटीपी (सारणी 10) के साथ पूरक है। कैपिंग मिश्रण के 261 डिग्री एल में लेबल ट्यूब -एच में दीर्घीकरण परिसरों को पुन: निलंबित करें।
    2. तैयार 4 नए ट्यूबलेबल 5 एनजी CE +H, 5 एनजी CE, 15 एनजी CE, 45 एनजी CE. डिल्यूकैपिंग एंजाइम (सीई) 20 एमएम HEPES-NaOH पीएच 7.9, 20% ग्लिसरॉल, 100 एमएम केसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन में 5 एनजी सीईएल, 15 एनजी सीई/जेडएल, या 45 एनजी सीईएल, या 45 एनजी/सीईएल के 3-एल समाधान से युक्त समाधान तैयार करने के लिए।
    3. स्टॉप बफर (2.1.1) के 94 डिग्री एल के साथ 12 नए ट्यूब तैयार प्रत्येक के लिए जोड़ा.
    4. TFIIH के साथ इलाज किया दीर्घीकरण जटिल के 87 डिग्री एल जोड़कर प्रत्येक कैपिंग प्रतिक्रिया शुरू या कैपिंग एंजाइम युक्त ट्यूब लेबल करने के लिए नहीं। एक गर्मी ब्लॉक में 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. 1, 2, या 4 मिनट के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के 30 डिग्री सेल्सियस को 94 डिग्री एल स्टॉप बफर युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करके प्रतिक्रियाओं को रोकें। शुद्ध और धारा 3 में वर्णित के रूप में प्रतिक्रिया उत्पादों का विश्लेषण।

3. आरएनए शुद्धि और विश्लेषण

  1. आरएनए को शुद्ध करें
    1. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए स्टॉप बफर में इनक्यूबेट प्रतिक्रिया उत्पादों।
      नोट: रोक बिंदु. इस बफर में नमूने आरएनए की हानि या गिरावट के बिना 4 एच तक के लिए बनाए रखा गया है।
    2. फीनॉल के 124 डिग्री सेल्सियस के साथ एक बार निकालें:क्लोरोफॉर्म:आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1) और एक बार क्लोरोफॉर्म के साथ:आइसोमिल अल्कोहल (24:1)।
      चेतावनी: फेनोल अत्यंत विषाक्त है और तेजी से त्वचा द्वारा अवशोषित कर लेता है. उचित सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।
      नोट: निष्कर्षण के दौरान आरएनए की वसूली को अधिकतम करने के लिए, एक उच्च घनत्व जेल, जो जलीय और कार्बनिक चरणों के बीच एक स्थिर बाधा रूपों युक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूबों का उपयोग करें। चर्चा और सामग्री की तालिकादेखें |
    3. जलीय चरण (शीर्ष परत) को 3 एम सोडियम ऐसीटेट पीएच 5.2 के 12.4 डिग्री एल युक्त नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  2. इथेनॉल वर्षा
    1. 100% इथेनॉल के 350 $L जोड़ें और उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
    2. सूखी बर्फ पर कम से कम 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: रोक बिंदु. सुविधा के लिए, एक यहाँ बंद करो और अगले दिन प्रक्रिया को पूरा कर सकते हैं; हालांकि, यह सीधे कदम 3.3 के लिए आगे बढ़ना है और एक ही दिन जेल चलाने के लिए संभव है. आरएनए को आगे के प्रसंस्करण से पहले कुछ दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है, लेकिन अधिक समय के लिए न छोड़ें।
  3. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के लिए आरएनए नमूने की तैयारी
    1. नमूनों को 2-3 बार उलटा करके मिश्रण करने की अनुमति दें, और 21,000 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, एक टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में। इस बीच, डेनेटिंग जेल मिश्रण (अनुभाग 3.4.1) की स्थापना की।
    2. ध्यान से परेशान गोली के बिना नमूनों से इथेनॉल हटा दें।
    3. 70% इथेनॉल के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, गोली धोने के लिए कई बार ट्यूब को उलटा करें, और फिर या तो कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 21,000 x g पर फिर से अपकेंद्रित्र।
    4. जितना संभव हो सके इथेनॉल निकालें और एक टेबल टॉप अपकेंद्रण में ट्यूबों की एक त्वरित स्पिन (5-10 एस) करते हैं। फिर, एक जेल लोड टिप के साथ, इथेनॉल के अंतिम शेष मात्रा को हटा दें.
    5. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए हवा सूखी गोली।
    6. प्रत्येक गोली के शीर्ष पर ब्2व् के 4 डिग्री ल को जोड़कर आरएनए को भंग करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट इनक्यूबेट।
    7. मिश्रण करने के लिए 2x आरएनए डाई के 4 डिग्री एल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें), और फिर पूरी तरह से आरएनए को पुन: निलंबित करने के लिए सेकंड के एक जोड़े के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर।
      नोट: आरएनए डाई जिसमें यूरिया के बजाय फॉर्मामाइड होता है, की सिफारिश की जाती है, क्योंकि बाद में कम तापमान पर वेग होता है।
    8. ट्यूबों को त्वरित-स्पिन करें, और फिर उन्हें गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. जेल पर लोड करने के लिए तैयार जब तक सूखी बर्फ पर ट्यूब स्टोर.
      नोट:       सूखी बर्फ पर आरएनए रखते हुए लचीलापन अन्य प्रयोगों पर काम करने के लिए अनुमति देता है, जबकि जेल बहुलक है. नमूने thawing के बाद फिर से गरम करने की जरूरत नहीं है. हालांकि, आरएनए सीधे हीटिंग के बाद लोड किया जा सकता है अगर जेल चलाने के लिए तैयार है.
  4. यूरिया-पेज जेल की तैयारी
    1. 40 एमएल जेल मिश्रण के लिए, एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में गठबंधन: 16.7 ग्राम यूरिया, 40% बिस के 15 एमएल:acrylamide समाधान (19:1 अनुपात), 10x TBE के 4 एमएल (1 एम Tris-HCl, 1 एम सोडियम बोरेट, 20 एमएम EDTA), और एच2के 8 एमएल। यह मात्रा 1.0 मिमी स्पेसर्स के साथ एक मानक आकार जेल (18 सेमी ऊंचाई x 16 सेमी चौड़ाई) के लिए पर्याप्त है।
      चेतावनी: ऐक्रिलमाइड अत्यंत विषाक्त है। जबकि वहाँ कोई साँस लेना जोखिम है जब यह समाधान में है, हमेशा प्रयोगशाला कोट, दस्ताने पहनते हैं, और सुरक्षा चश्मा जबकि हैंडलिंग.
      नोट: यह मिश्रण 15% पॉलीऐक्रिलमाइड जेल को एक denaturing के लिए है, जो आसानी से 15-50 nt के बीच आरएनए को हल करता है। विभिन्न लंबाई के विभिन्न आरएनए प्रतिलिपियों को हल करने के लिए आवश्यक के रूप में बिस/acrylamide की एकाग्रता बदलें।
    2. यूरिया पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक एक nutator पर जेल मिश्रण युक्त बंद ट्यूब प्लेस.
    3. कांच की प्लेटों, 1 मिमी स्पेसर्स और 15-वेल कंघी के साथ जेल-कास्टिंग स्टेशन स्थापित करें।
    4. तेजी से काम करते हुए, टीईएमईडी के 40 डिग्री एल और 10% अमोनियम पर्सुलफेट समाधान के 400 डिग्री एल को जेल समाधान में जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करें। एक 25 एमएल पाइप का उपयोग करना, प्लेटों के बीच जेल समाधान डालना, कंघी डालने, और जेल कम से कम 2 ज के लिए बहुलक की अनुमति दें.
      नोट: यदि जेल उपयोग से पहले 2 से अधिक एच डाला जाता है, एक बार यह बहुलक है यह नम कागज तौलिया के साथ कवर (स्थान में कंघी छोड़) और प्लास्टिक की चादर के साथ लपेट इसे बाहर सुखाने से रोकने के लिए.
  5. डेनिंग जेल आरएनए इलेक्ट्रोफोरोसिस
    1. बहुलकीकरण के बाद, टैंक चलाने के लिए जेल स्थानांतरण और 15-30 मिनट के लिए 1x TBE में 20 लेकिन पर इसे चलाने के पूर्व।
    2. इस बीच, thaw नमूने (यदि जमे हुए), भंवर, और उन्हें 2,000 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए स्पिन.
    3. जब तैयार हो, बिजली की आपूर्ति बंद कर देते हैं, और ध्यान से एक सिरिंज का उपयोग कर 1x TBE के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला.
    4. जेल पर नमूने लोड करने के लिए जेल-लोडिंग युक्तियों का उपयोग करें।
    5. के बारे में 2 एच के लिए एक निरंतर 20-30 लेकिन पर जेल चलाने के लिए या जब तक कम डाई (xylene cyanol एफएफ) जेल के नीचे तक पहुँचता है.
  6. जेल निकालें, यह शोषक कागज के एक टुकड़े पर जगह है, और प्लास्टिक की चादर के साथ लपेटो.
  7. एक फॉस्फोरस्क्रीन के लिए radiolabeled जेल का पर्दाफाश.
  8. फॉस्फोरस्क्रीन को फॉस्फोरइमेजर का उपयोग करके स्कैन करें और प्रतिबिंब का विश्लेषण करें।

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Representative Results

आंकड़े 2 और 3 दिखाने के प्रतिनिधि परिणाम प्रतिक्रियाओं का विस्तार या विभिन्न स्रोतों से पोल द्वितीय द्वारा विभिन्न लंबाई की प्रतिलिपि युक्त कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। चित्र 4 में दर्शाया गया है कि इन दीर्घीकरण परिसरों का उपयोग सह-ट्रांसक्रिप्शनल सीटीडी फॉस्फोरिलेशन-निर्भर आरएनए कैपिंग पर परख लगाने के लिए कैसे किया जा सकता है।

चित्र 2क कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों में डीएनए और आरएनए अणुओं का आरेख है। चित्र 2ख प्रोटोकॉल 1 में वर्णित ठीक वैसा ही अभिक्रियाओं में उत्पन्न विभिन्न लंबाई की प्रतिलिपि दर्शाता है, जिसमें 20 nt के कृत्रिम आरएनए ओलिगो का उपयोग करके प्रारंभिक कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों को तैयार किया गया था (चित्र 2क में गहरा नीला ; RNA$20mer, तालिका 1). चूंकि हम प्रारंभिक आरएनए लंबाई और डीएनए टेम्पलेट अनुक्रम जानते हैं, इसलिए हम न्यूक्लियोटाइड्स-एटीपी, सीटीपी, जी.टी.पी, या यूटीपी के सबसेट को टेम्पलेट के साथ एक निर्धारित स्थिति में पोल II पर चलने के लिए आवश्यक निर्धारित कर सकते हैं। नए संश्लेषित न्यूक्लिओटाइड की संख्या अंतिम अपेक्षित लंबाई निर्धारित करने के लिए आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राइमर के प्रारंभिक आकार में जोड़ा जाता है (RNA ओलिगो आकार + न्यूक्लिओटाइड की संख्या जोड़ा)। एटीपी और यूटीपी की उपस्थिति में, पोल II 20 एन टी आरएनए ओलिगो को 23मेर आरएनए युक्त दीर्घीकरण परिसरों को उत्पन्न करने के लिए 3 एन टी जोड़ सकता है। यदि एक unincorporated एटीपी और यूटीपी दूर washes और फिर एटीपी और CTP कहते हैं, 20 nt oligo द्वारा बढ़ाया जाता है 2 nt एक 25mer बनाने के लिए, और अगर एक तो फिर से unincorporated nucleotides दूर washes और एटीपी और GTP कहते हैं, प्रतिलिपि एक अतिरिक्त 4 nt एक 29mer. Sinin बनाने के लिए बढ़ाया है से नव उत्पन्न प्रतिलिपि अपेक्षित आरएनए आकार के अनुरूप हैं और के बाद से लगभग सभी radiolabeled 23mers मात्रात्मक अब उत्पादों में पीछा किया जा सकता है, एक जानता है कि इस विधि का उपयोग कर (i) आरएनए ओलिगो सही ढंग से पोल द्वितीय निकास पर तैनात है एसेम्बली के दौरान चैनल और (ii) रेडियोलेबल आरएनए सक्रिय पोल II दीर्घीकरण परिसरों से जुड़े हुए हैं।

चित्र 2C प्रोटोकॉल की एक भिन्नता को दर्शाता है, जिसमें प्रारंभिक दीर्घीकरण परिसरों को एक ही डीएनए टेम्पलेट और गैर-टेम्पलेट किनारा ओलिगो और एक आरएनए ओलिगो (RNA $29mer, तालिका 1) का उपयोग करके तैयार किया गया था जिसमें अतिरिक्त 9 न्यूक्लिओटाइड होते हैं। इसके 5'-अंत लेकिन अन्यथा 20 nt आरएनए ओलिगो के अनुक्रम में समान है. क्योंकि प्रारंभिक आरएनए लंबाई इस मामले में 29 nt है, 32mer, 34mer, और 38mer प्रतिलिपि युक्त दीर्घीकरण परिसरों एक ही पोल द्वितीय ऊपर वर्णित कदम चलने का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है.

विश्लेषण के दायरे के आधार पर, इस विधि पोल द्वितीय के स्रोत में लचीलापन की अनुमति देता है. चित्र 3 में हम विभिन्न स्रोतों से पोल II का उपयोग करके अभिक्रियाओं की तुलना करते हैं। पहले 4 गलियों में दिखाया प्रतिक्रियाओं में, कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों अंतर्जात के साथ इकट्ठे हुए थे, जंगली प्रकार पोल द्वितीय या तो चूहे जिगर या विखंडन खमीर से शुद्ध और 23mers या 25mers उत्पन्न करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में चला गया. चूहा और विखंडन खमीर पोल IIs इन प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया कई क्रोमैटोग्राफी चरणों का उपयोग कर के पास एकरूपता के लिए शुद्ध किया गया.

विधि भी एक सरल, एक कदम शुद्धि विधि का उपयोग कर तैयार जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पोल द्वितीय युक्त कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आंकड़ा शो में पिछले दो गलियों मानव पोल द्वितीय के एक उत्परिवर्ती रूप है कि अपने Rpb1 subunit में सीटीडी का अभाव है, जो पोल द्वितीय उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन आरएनए कैपिंग के लिए कुछ प्रतिलेखन में मदद करता है का उपयोग कर प्रदर्शन किया. इन परखों में प्रयुक्त सीटीडी-कम पोल II को मानव कोशिका रेखा से एंटी-फ्लैग इम्यूनो-शुद्धि द्वारा शुद्ध किया गया था जिसमें Rpb1 के FLAG एपिटोप टैग किए गए संस्करण को व्यक्त किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सक्रिय पोल द्वितीय की एकाग्रता तैयारी से तैयारी करने के लिए अलग अलग होंगे. इस प्रकार, प्रारंभिक प्रयोग करना आवश्यक है जिसमें अभिक्रियाओं में प्रयुक्त पोल II की मात्रा वांछित क्रियाकलाप प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए भिन्न होती है।

चित्र 4 में कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों से संबद्ध रेडियोलेबल लिप्स की तुलना करने वाले परख का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाया गया है, जिसमें पोल II को फॉस्फोरिलेट या अनफॉस्फोरिलेटाड सीटीडी से युक्त किया गया है। इन परख के लिए, एक 5'-triphosphate अंत के साथ 23 न्यूक्लिओटाइड प्रतिलिपि युक्त दीर्घीकरण परिसरों प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में तैयार किए गए थे.

कैपिंग एंजाइम के साथ दीर्घीकरण परिसरों के इनक्यूबेशन से लगभग 1 एन टी की गतिशीलता में बदलाव होता है, जो 5 की टोपी14,15के अतिरिक्त को दर्शाता है। कैपिंग प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक कैपिंग दक्षता निर्धारित करता है, आरएनए के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया है कि छाया हुआ है. कैपिंग दक्षता, कुल आरएनए में कैप्ड आरएनए का अनुपात होता है, जिसे अधिकतम प्राप्य कैपिंग द्वारा विभाजित किया जाता है। हमारे परखों में हम पाते हैं कि वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त आरएनए ओलिगो की अधिकतम प्राप्य कैपिंग $85% है, जो संश्लेषी आरएनए के अपूर्ण त्रिफॉस्फोरिलेशन के कारण होने की संभावना है।

पहले 3 लेन में दिखाए गए प्रतिक्रियाओं में, दीर्घीकरण परिसरों को कैपिंग से पहले पोल II सीटीडी को फॉस्फोरिलेट करने के लिए सामान्य प्रतिलेखन कारक टीएफआईएच और सह-कारक एटीपी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इन अभिक्रियाओं में, अधिकतम कैपिंग के निकट 5 एनजी कैपिंग एंजाइम के अतिरिक्त 1 मिनट के बाद देखा गया। जब परख लंबे समय तक परिसरों कि TFIIH के साथ incubated नहीं कर रहे हैं और इसलिए unphosphorylated पोल द्वितीय होते हैं का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया, यह लगभग 10 गुना के रूप में ज्यादा कैपिंग एंजाइम कैपिंग के समान स्तर का निरीक्षण करने के लिए ले लिया. चित्रा 4 के अंतिम दो लेन उन अभिक्रियाओं के उत्पादों को दर्शाते हैं जिनमें टीएफआईएच की उपस्थिति में दीर्घीकरण परिसरों को एंजाइम को कैपिंग के साथ या उसके बिना इनक्यूबेट किया गया था। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस आंकड़े में प्रदर्शित सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों की TFIIH-निर्भरता बहुत अधिक जटिल एंजाइम प्रणालियों में एक प्रमोटर पर प्रतिलेखन शुरू किया था कि दीर्घीकरण परिसरों में मनाया के समान है 5.

Figure 1
चित्र 1: कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों की विधानसभा। (ए) 20 एन टी के आरएनए ओलिगो (अंधेरे नीले) को 9 एन टी (बी) आरएनए पॉलिमरेज II (पोल II) के पूरक अनुक्रम के माध्यम से डीएनए टेम्पलेट किनारा (हरा) में annealed किया जाता है, जिसे अनेलीड डीएनए:आरएनए संकर के साथ मिलाया जाता है ताकि पोल II उत्प्रेरक स्थल पर आरएनए 3'-end को स्थान दिया जा सके। (ग) 3' बायोटिनलेट्ड गैर-टेम्पलेट किनारा डीएनए ओलिगो (हल्के नीले) की एक मोलर अतिरिक्त को दीर्घीकरण परिसर को संलग्न करने और आगे स्थिर करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है। (घ) गतिहीन दीर्घीकरण परिसरों को अतिरिक्त ओलिगो को हटाने के लिए धोया जाता है और न्यूक्लिओटाइडके के उपयुक्त संयोजनों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है ताकि पोल II को आरएनए ओलिगो को वांछित लंबाई तक बढ़ाने की अनुमति मिल सके। आरएनए के नए संश्लेषित भाग पीले रंग में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पोल द्वितीय विभिन्न लंबाई के आरएनए ओलिगो का उपयोग कर चल रहा है। (क) कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों का आरेख, जो सैर के दौरान न्यूक्लिओटाइडों को दर्शाता है। गैर-टेम्पलेट किनारा और टेम्पलेट किनारा डीएनए क्रमशः हल्के नीले और हरे रंग में दिखाए जाते हैं। 20 एन टी आरएनए ओलिगो गहरे नीले रंग में दिखाया गया है। इसके अलावा दिखाया गया है न्यूक्लिओटाइड लगातार चलता है के दौरान जोड़ा 23mer आरएनए (नारंगी), 25mer आरएनए (भूरे रंग), और 29mer आरएनए (magenta) उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। (ख) पोल II चलने के बाद प्राप्त परिभाषित लंबाई के आरएनए को दिखाते हुए जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस को 20 एन टी आर एन ए प्राइमर का उपयोग करते हुए, जैसा कि प्रोटोकॉल 1 में वर्णित है। प्रोटोकॉल के प्रत्येक अनुक्रमिक चलने के चरण के दौरान जोड़ा Nucleotides रंग कोडित नारंगी (23mer), भूरे (25mer), और मैजंटा (29mer) कर रहे हैं।  (ग) पोल II एक 29 nt आरएनए प्राइमर के साथ शुरू चल रहा है, लेकिन अन्यथा बिल्कुल के रूप में है कि बी (बी और सी) में दिखाया गया है एक ही जेल के भागों को दिखाने के लिए, लेकिन उदाहरण प्रयोजनों के लिए अलग कर रहे थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Transcripts जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पोल द्वितीय युक्त कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों द्वारा संश्लेषित। कृत्रिम बढ़ाव परिसरों 20 nt आरएनए प्राइमर और चूहे जिगर या विखंडन खमीर या FLAG इम्यूनोप्यूरिफियड पोल द्वितीय से अत्यधिक शुद्ध अंतर्जात पोल द्वितीय का उपयोग कर इकट्ठा किए गए थे Hela कोशिकाओं से Rpb1 की कमी (F:Rpb1-CTD). प्रत्येक परिसर में आरएनए आगे 23 nt या 25 nt करने के लिए बढ़ा दिया गया था. विवरण के लिए पाठ देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए कैपिंग के फॉस्फोरिलेशन-निर्भर सक्रियण। कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों चूहे जिगर पोल द्वितीय और radiolabeled 23mer आरएनए युक्त एटीपी और सामान्य प्रतिलेखन कारक TFIIH या बफर के साथ incubated थे 10 मिनट के लिए फॉस्फोरिलेट पोल द्वितीय सीटीडी. धोने के बाद, दीर्घीकरण परिसरों को 1, 2 या 4 मिनट के लिए स्तनधारी कैपिंग एंजाइम के 5 एनजी, 15 एनजी, या 45 एनजी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। कैप्ड और अनकप्ड 23mers को एक डेनेरिंग जेल (ऊपर, पहले 12 लेन) में हल किया गया था और % छाया हुआ आरएनए परिमाणित और प्लॉट किया गया था (नीचे)। आंकड़ा का यह हिस्सा मूल रूप से ref 5में प्रकाशित किया गया था, जो एक CC-BY लाइसेंस के तहत एक खुला पहुँच लेख के रूप में प्रकाशित किया गया था. पिछले दो लेन, जो एक अलग प्रयोग से आते हैं, प्रतिक्रियाओं के उत्पादों को वर्णन करते हैं जिसमें टीएफआईएच की उपस्थिति में, एंजाइम को कैपिंग के साथ या बिना किडम्शन परिसरों को इनक्यूबेट किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुक्रम टिप्पणियाँ
आरएनए$20मेर ACUCAUGUGUGUAUGCUUA 5' ट्राइफॉस्फेट संशोधन; पेज और आरपी-एचपीएलसी शुद्ध
आरएनए$29मेर एकूणयुगाच्या एकूण गुदाघरी 5' ट्राइफॉस्फेट संशोधन; पेज और आरपी-एचपीएलसी शुद्ध
टेम्पलेट स्ट्रैंड डीएनए सीटीएजीजीटीएजीसीटीएसीजीटीसीटीजीए
TTAAGCATCATGG		 दोहरी पेज और HPLC शुद्ध
गैर-टेम्पलेट स्ट्रैंड डीएनए अटागाआतगगटगगटगट्टाकगटगगगगगगगगगगटगगटगगटगगटगगटगगटगगटगगटगगगगगगगट 5' TEG-बायोटिनीलेट; एचपीएलसी शुद्ध

तालिका 1: डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स

अंतिम एकाग्रता आयतन
ट्रास एचसीएल पीएच 7.5 12 एमएम*
50 एमएम एमजीसीएल2 5 एम.एम. 1 $L
300 एमएम केसीएल 50mm 1.67 डिग्री सेल्सियस
10 डिग्री मीटर टेम्पलेट स्ट्रैंड डीएनए ओलिगो में 100 एम एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5 1 $M 1 $L
10 डिग्री एम आरएनए ओलिगो
में 10 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5		 2 $M 2 $L
पानी 4.33 डिग्री सेल्सियस
10 जेडएल
* सभी Tris-HCl डीएनए और आरएनए ओलिगो समाधान से आता है

तालिका 2: annealing डीएनए और आरएनए ओलिगोस के लिए कॉकटेल

पोल द्वितीय बफर अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 4.52 $L
50 एमएम एमजीसीएल2 $4.67 एम एम 1.40 $एल
250 एमएम ट्राइस एचसीएल, पीएच 7.5 $23 एम एम 1.40 $एल
300 एमएम केसीएल * 27 एमएम 1.33 $L
50% ग्लिसरोल 3% 0.9 $L
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.38 डिग्री सेल्सियस
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.08 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 3 $L
13 डिग्री सेल्सियस
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
Annealed टेम्पलेट किनारा डीएनए:RNA (तालिका 1 से) 1 $L
आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय 1 $L
* मिश्रण में अंतिम केसीएल एकाग्रता अतिरिक्त केसीएल पोल द्वितीय से आने के साथ, $ 50 एम है
[अंतिम MgCl2 और Tris HCl सांद्रता क्रमशः 5 एमएम और 25 एमएम हैं,
अतिरिक्त MgCl2 और Tris HCl annealed डीएनए से आते हैं: RNA उत्पाद.

तालिका 3: पोल द्वितीय मिश्रण

गैर-टेम्पलेट डीएनए बफर अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 4.48 डिग्री सेल्सियस
300 एमएम केसीएल * 43.33 मीटर 2.17 डिग्री सेल्सियस
50 एमएम एमजीसीएल2 5 एम.एम. 1.50 $एल
250 एमएम ट्राइस एचसीएल, पीएच 7.5 25 एमएम 1.50 $एल
50% ग्लिसरोल 3% 0.9 $L
20 mg/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.38 डिग्री सेल्सियस
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.08 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 3 $L
14 जेडएल
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
5 डिग्री एम बायोटिनलेट्ड गैर-टेम्पलेट डीएनए ओलिगो 1 $L
* मिश्रण में अंतिम KCl एकाग्रता अतिरिक्त KCl गैर-टेम्पलेट डीएनए ओलिगो बफर से आने के साथ, 50 एम.

तालिका 4: गैर-टेम्पलेट डीएनए मिश्रण

पल्स लेबलिंग बफर अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 9.98 $L
300 एमएम केसीएल 60 एमएम 5 $L
50% ग्लिसरोल 3% 1.5 $एल
20 mg/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.63 डिग्री सेल्सियस
500 एमएम एमजीसीएल2 8 एम.एम. 0.4 जेडएल
1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.9 * 12 एमएम 0.3 जेडएल
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.13 डिग्री सेल्सियस
1 M HEPES-NaOH, पीएच 7.9 3 एम.एम. 0.08 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 5 $L
23 जेडएल
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
15 डिग्री एम एटीपी 0.6 डिग्री सेल्सियस 1 $L
3.3 $M [-32P]UTP 0.13 डिग्री मी 1 $L
* अंतिम Tris HCl एकाग्रता 20m है, अतिरिक्त Tris HCl न्यूक्लिओटाइड बफर से आने के साथ.

तालिका 5: पल्स लेबलिंग NTP मिश्रण

चेस बफर अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
ट्राइस एचसीएल, पीएच 7.5 * 30 एमएम
300 एमएम केसीएल 60 एमएम 1 $L
पानी 0.6 $L
50% ग्लिसरोल 3% 0.3 जेडएल
10 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.25 डिग्री सेल्सियस
100 m HEPES-NaOH, पीएच 7.9 3 एम.एम. 0.15 डिग्री सेल्सियस
20 mg/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.13 डिग्री सेल्सियस
500 एमएम एमजीसीएल2 8 एम.एम. 0.08 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 1 $L
3.5 $एल
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
100 $M यूटीपी, 100 $M एटीपी पतला में पतला 100 m Tris-HCl, पीएच 7.5 5 $M 1.5 $एल
* सभी Tris HCl न्यूक्लिओटाइड बफर से आता है

तालिका 6: चेस NTP मिश्रण

अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 24.21 डिग्री सेल्सियस
1 एम केसीएल 60 एमएम 1.8 $एल
50% ग्लिसरोल 3% 1.8 $एल
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/एमएल 0.75 डिग्री सेल्सियस
1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.9 20 एमएम 0.6 $L
10% पीवीए 0.2% 0.6 $L
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.15 डिग्री सेल्सियस
1 M HEPES-NaOH, पीएच 7.9 3 एम.एम. 0.09 डिग्री सेल्सियस
30 डिग्री सेल्सियस

तालिका 7: धो बफ़र

अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 14.13 डिग्री सेल्सियस
300 एमएम केसीएल 60 एमएम 6 $L
50% ग्लिसरोल 3% 1.8 $एल
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.75 डिग्री सेल्सियस
1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.9 20 एमएम 0.6 $L
500 एमएम एमजीसीएल2 8 एम.एम. 0.48 डिग्री सेल्सियस
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.15 डिग्री सेल्सियस
1 M HEPES-NaOH, पीएच 7.9 3 एम.एम. 0.09 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 6 $L
30 डिग्री सेल्सियस

तालिका 8: बेस ट्रांसक्रिप्शन बफ़र (BTB)

बफ़र रोकें अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 55.74 $L
1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.5 10 एमएम 0.6 $L
5 एम NaCl 300 एमएम नैक्ल 3.6 $L
500 एमएम EDTA 0.5 एमएम ईटीए 0.06 डिग्री सेल्सियस
10% एसडीएस 0.2% एसडीएस 1.2 $एल
60 जेडएल
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
15 mg/एमएल ग्लाइकोजन 2 $L
20 mg/mL प्रोटीनाज कश्मीर 2 $L
पानी 30 डिग्री सेल्सियस

तालिका 9: मिश्रण बंद करो

अंतिम एकाग्रता वॉल्यूम/प्रतिक्रिया
पानी 11.9 $L
300 एमएम केसीएल * 53.33 मीटर 5.33 $L
50% ग्लिसरोल 3% 1.8 $एल
1.5 $M GTP 100 एमएम Tris HCl, पीएच 7.5 में पतला 50 डिग्री मी. 1 $L
100 यूनिट्स/एमएल अकार्बनिक पायरोफॉस्फेटस, खमीर 0.1 इकाइयां/ 1 $L
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.5 मिलीग्राम/ 0.75 डिग्री सेल्सियस
1 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.9 $16.67 MM 0.5 $एल
500 एमएम एमजीसीएल2 8 एम.एम. 0.48 डिग्री सेल्सियस
100 एमएम डीटीटी 0.5 एम.एम. 0.15 डिग्री सेल्सियस
1 M HEPES-NaOH, पीएच 7.9 3 एम.एम. 0.09 डिग्री सेल्सियस
10% पीवीए 2% 6 $L
29 जेडएल
बफ़र ऐड का उपयोग करने से ठीक पहले:
कैपिंग एंजाइम 1 $L
* मिश्रण में अंतिम केसीएल एकाग्रता $ 60 एम है, अतिरिक्त केसीएल कैपिंग एंजाइम और पायरोफॉस्फेटेस से आने के साथ
[अंतिम Tris HCl एकाग्रता 20 m है, अतिरिक्त Tris HCl न्यूक्लिओटाइड बफर से आने के साथ

तालिका 10: कैपिंग मिश्रण

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Discussion

अध्ययन है कि इस तरह के आरएनए प्रसंस्करण और प्रतिलिपि बढ़ाव के विनियमन के रूप में पोल द्वितीय बढ़ाव परिसर के लिए युग्मित घटनाओं विच्छेदन की तलाश में बहुत एक अत्यधिक शुद्ध एंजाइम प्रणाली के उपयोग से सुविधा जनक जा सकता है. इस तरह के एंजाइम सिस्टम की स्थापना चुनौतीपूर्ण हो सकती है। पोल II द्वारा प्रवर्तक-निर्भर प्रतिलेखन के लिए कम से कम पांच सामान्य प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है. इन कारकों की तैयारी और संग्रहण में महीनों लग सकते हैं; इसलिए, इस प्रक्रिया में दर-सीमा कदम अक्सर केवल परीक्षण ट्यूब में बेसल प्रतिलेखन का पुनर्गठन करने के लिए आवश्यक ट्रांसक्रिप्शन कारकों के संवर्ग को तैयार कर रहा है।

इस अनुच्छेद में, हम कृत्रिम प्रतिलेखन दीर्घीकरण परिसरों2पैदाकरने के लिए पहले से विकसित तरीकों के एक अनुकूलन का वर्णन,3 केवल शुद्ध पोल द्वितीय और सिंथेटिक डीएनए और आरएनए oligonucleotides का उपयोग कर. परिणामस्वरूप दीर्घीकरण परिसर प्रतिलेखनात्मक रूप से सक्रिय होते हैं और पोल II प्रतिलेखन और आरएनए कैपिंग5के युग्मन की जांच करने में उपयोग के लिए उपयुक्त होते हैं . यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि प्रतिलेखन और आरएनए कैपिंग क्रोमैटिन और कई अन्य प्रोटीन के संदर्भ में विवो में होते हैं जो इस परिभाषित एंजाइम प्रणाली में मौजूद नहीं हैं; इसलिए, इस प्रणाली के लिए कई recapitulate की उम्मीद है, लेकिन सभी नहीं, प्रतिक्रियाओं की विशेषताएं है कि विवो में पाए जाते हैं. प्रोटोकॉल हम चुंबकीय मोती के लिए बाध्य biotinylated डीएनए के माध्यम से कृत्रिम बढ़ाव परिसरों immobilizing द्वारा पिछले तरीकों पर बनाता है का वर्णन है, शोधकर्ता आसानी से प्रतिक्रिया की स्थिति को बदलने के लिए अनुमति देता है और / परख के विभिन्न चरणों के दौरान. महत्वपूर्ण बात यह है कि, क्योंकि दीर्घीकरण परिसरों को स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाने वाला टैग डीएनए के गैर-टेम्पलेट किनारा के एक छोर पर है न कि पोल II पर या टेम्पलेट किनारा पर, केवल उन पोल IIs को पूर्ण दीर्घीकरण परिसरों से संबद्ध किया जाएगा मोती पर बनाए रखा जाएगा।

क्योंकि नवजात प्रतिलिपि एक होना चाहिए 5'-triphosphate अंत क्रम में एंजाइम कैपिंग द्वारा संशोधित किया जा करने के लिए, सिंथेटिक आरएनए oligonucleotides कैपिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया 5'-triphosphate टर्मिनी के साथ खरीदा जाता है. हालांकि, असंशोधित आरएनए ओलिगो का उपयोग अन्य अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें अन्य सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रसंस्करण घटनाओं के अध्ययन या पोल II दीर्घीकरण को विनियमित करने वाले प्रतिलेखन कारकों की गतिविधियों शामिल हैं। डाउनस्ट्रीम आवेदन के बावजूद, हम अत्यधिक शुद्ध डीएनए और आरएनए ओलिगो के साथ दीर्घीकरण परिसरों को इकट्ठा करने की सलाह देते हैं। विशेष रूप से, biotinylated डीएनए oligos HPLC द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए, और अन्य डीएनए और आरएनए oligos polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और / तथापि, एंजाइमी गतिविधियों की शुद्धता का निर्धारण मामला-आधार पर करना होगा और यह प्रत्येक प्रयोग के दायरे पर निर्भर करेगा।

विधानसभा के अंतिम चरण में गैर-टेम्पलेट biotinylated डीएनए ओलिगो जोड़ना, सिद्धांत रूप में, एक त्रिअंगी परिसर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हालांकि, हम हमेशा पोल द्वितीय की पुष्टि करने के लिए कम से कम एक "चल" कदम शामिल न्यूक्लियोटाइडकी की सही संख्या को शामिल किया गया है: यदि प्रयोग का लक्ष्य सह-ट्रांसक्रिप्शनल कैपिंग या अन्य आरएनए प्रसंस्करण चरणों के लिए substrates उत्पन्न करने के लिए है या पोल द्वितीय का पालन करें बढ़ाना, हम हमेशा प्रारंभिक "चल" में एक 32पी लेबल ribonucleotide शामिल है ताकि प्रतिलिपि कल्पना की जा सकती है और बाद में चलने के चरणों के लिए unlabeled "ठंडा" न्यूक्लिओटाइड का उपयोग करें तो विभिन्न लंबाई की प्रतिलिपि की विशिष्ट गतिविधि स्थिर रहता है. हालांकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि नवजात प्रतिलिपि कल्पना करने के लिए 32पी लेबल न्यूक्लिओटाइड का उपयोग करता है, फ्लोरोसेंट आधारित परख आरएनए लेबलिंग को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब यह रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करने के लिए संभव नहीं है. हालांकि, यह ध्यान दें कि इस तरह के assays की संवेदनशीलता आम तौर पर रेडियोधर्मी लेबल का उपयोग कर उन लोगों की तुलना में बहुत कम है महत्वपूर्ण है, और वे आम तौर पर एंजाइम की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है.

पुन: उत्पादनीय प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम फीनॉल के दौरान अच्छा आरएनए वसूली है:क्लोरोफॉर्म:आइसोमाइल निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा। हमने पाया है कि उच्च घनत्व जैल युक्त microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग कर (सामग्री की तालिकादेखें) phenol के लिए:क्लोरोफॉर्म:isoamyl निष्कर्षण reproducibility और इस कदम से न्यूक्लिक एसिड की उपज बढ़ जाती है. इसके अलावा, रंगीन ग्लाइकोजन का उपयोग (सामग्री की तालिकादेखें) इथेनॉल वर्षा के दौरान वाहक के रूप में यह आसान छोटे न्यूक्लिक एसिड छर्रों को देखने के लिए बनाता है, यह कम संभावना है कि एक अनजाने में इसे हटाने के दौरान यह aspirating द्वारा गोली खो देता है इथेनॉल अधिनातं.

कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न उन हम वर्णन करने के लिए भी प्रोटीन प्रोटीन या प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत पोल द्वितीय दीर्घीकरण जटिल और कारकों है कि प्रतिलिपि को विनियमित के बीच को मापने के लिए उपयोगी होना चाहिए दीर्घीकरण या आरएनए प्रसंस्करण घटनाओं को बढ़ाना से जुड़ा हुआ है। इस मामले में, धोने के बाद कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों के लिए बाध्य रहने वाले प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पाए जाते हैं; रेडियोलेबलिंग आरएनए आवश्यक नहीं है और हम केवल "ठंडा" न्यूक्लियोटाइड के साथ सभी प्रतिलेखन कदम करते हैं।

अंत में, इस विधि प्रतिलेखन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयोग की जा सकती है. वास्तव में, संबंधित तरीकों खमीर और स्तनधारी एंजाइमों के साथ क्रायो-ईएम अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है कैपिंग एंजाइम-पोल द्वितीय बातचीत13, और अन्य प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों के साथ पोल द्वितीय की बातचीत के दौरान आगे बढ़ने के दौरान12, 16,17और हाल ही में , न्यूक्लिओसोम18से बाध्य होना . इस विधि का उपयोग करउत्पन्न प्रतिलेखन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक संभावित जटिलता जटिल से बायोटिन/चुंबकीय मोती को हटाने की आवश्यकता है; हालांकि, यह डीएनए oligos विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा मान्यता प्राप्त साइटों में शामिल करके या biotin linkers कि यूवी रे उपचार19के बाद बंद कर रहे हैं का उपयोग करके हल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम स्तनधारी कैपिंग एंजाइम cDNA प्रदान करने के लिए एस S. Shuman धन्यवाद. इस काम के भाग में ग्रेटर कैनसस सिटी सामुदायिक फाउंडेशन में हेलेन नेल्सन चिकित्सा अनुसंधान कोष से चिकित्सा अनुसंधान के लिए Stowers संस्थान के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.  इस पांडुलिपि अंतर्निहित मूल डेटा http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 पर Stowers मूल डेटा भंडार से पहुँचा जा सकता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi Perkin Elmer NEG007H001MC For radiolabeling RNA
2x RNA loading dye New England Biolabs B0363S Highly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solution Biorad 1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) New England Biolabs B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg Millipore Sigma 14-476 Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotides IDT See Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies Invitrogen 65001 We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) Life Technologies Invitrogen AM9516 Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb Hoefer SE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL) Qiagen 129046 Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20 mg/mL) Life Technologies Invitrogen 25530049
RNA oligonucleotides Trilink See Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) New England Biolabs NEBM2403S Required only during capping reactions

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References

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

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जेनेटिक्स अंक 147 एमआरएनए संश्लेषण आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय प्रतिलेखन दीर्घीकरण कैपिंग एंजाइम सीटीडी काइनेज सिंथेटिक प्रतिलेखन बुलबुले कृत्रिम दीर्घीकरण परिसरों टीएफआईएच सह-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रसंस्करण
कृत्रिम आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय विस्तार परिसर को-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रोसेसिंग इवेंट्स को अलग करने के लिए
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Noe Gonzalez, M., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events. J. Vis. Exp. (147), e59497, doi:10.3791/59497 (2019).

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