Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra menneskelige navlestreng blod-avledet CD34+ celler ved hjelp av Valproic Acid

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Her beskriver vi ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra CD34+ cellene stammer fra navlestrengsblod behandlet med en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA. Denne metoden fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer.

Abstract

Navlestreng blod (UCB) enheter gir en alternativ kilde for menneskelig blodkreft stamceller (HSCs) for pasienter som trenger allogene benmarg transplantasjon. Mens UCB har flere unike fordeler, begrenser begrenset antall HSCs innenfor hver UCB enhet deres bruk i regenerativ medisin og HSC transplantasjon hos voksne. Effektiv utvidelse av funksjonell menneskelige HSCs oppnås ved ex vivo dyrking av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandles med en deacetylase hemmer, valproic acid (VPA). Protokollen detaljert her beskriver oppdrettsforholdene og metodikk raskt isolere CD34+ celler og utvide til en høy grad en pool av primitive HSCs. De utvidede HSCs er i stand til å etablere både kortsiktige og langsiktige engraftment og kan gi opphav til alle typer differensiert blodkreft cellene. Denne metoden også har potensial for klinisk anvendelse i autologous HSC genterapi og gir en attraktiv tilnærming for å overvinne tap av funksjonelle HSCs forbundet med gene redigering.

Introduction

Ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller (HSCs) fra navlestrengsblod (UCB) enheter har store løftet for HSC programmer i regenerativ medisin og transplantasjon behandling. Transplantasjon med UCB enheter har flere unike fordeler som lett samling, høy tilgjengelighet, minimal risiko for infeksjon, lav risiko for sykdom tilbakefall, og lav frekvens av graft versus host sykdom (GVHD). Større ulempene av deres bruk i klinisk er imidlertid begrenset antall HSCs stede i hver UCB enhet1. Utilstrekkelig antall HSCs resulterer i forsinket engraftment og blodkreft utvinning, risiko for pode avvisning og avvikende immune rekonstituering.

Foreløpig har ulike metoder og strategier blitt utviklet for å ex vivo utvide begrenset antall HSCs fra UCBs. Kombinasjoner av ulike cytokin cocktailer med små molekyler eller forbindelser i ex vivo kulturer føre til ulike grader av ekspansjon i HSC tall2,3,4,5,6, 7,8. Viktigere, ex vivo kultur indusere vilkår stress, fører til rask celle spredning, økt metabolsk aktivitet og tap av arter som definerer primære HSCs. Derfor er utvikle protokoller som fører til utvidelse av et stort antall funksjonelle HSCs med egenskaper som ligner primære primitive HSCs nødvendig.

Serum-free kulturer av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandlet med valproic acid (VPA) resultere i utvidelsen av store antall primitive HSCs4,9,10. HSC utvidelsen er ikke utelukkende på grunn av spredning av de eksisterende HSCs avledet fra UCBs. I stedet skyldes denne utvidelsen kjøpet av en primitiv fenotypen kombinert med et begrenset antall celledelinger og spredning9. Innen de første 24-48 timer med inkubering med en kombinasjon av cytokiner og VPA, CD34+ cellene erverver en transcriptomic og fenotypiske profil som karakteriserer langsiktige HSCs. Den betydelige økningen i andelen HSCs er ledsaget av en rask økning i antall HSCs (63 fold økning innen 24 timer av VPA behandling)9. Spesielt utvider VPA-ex vivo ekspansjonsstrategi HSCs med lav metabolsk aktivitet, som ytterligere understreker deres arter.

Metoden beskrevet her gir forhold og behandlinger som fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer. Denne ex vivo ekspansjonsstrategi bruker en cytokin cocktail kombinert med VPA behandling. VPA er en FDA godkjent narkotika for behandling av bipolar lidelser og andre nevrologiske sykdommer. HSC utvidelse med VPA er rask og oppstår innen 7 dager, minimere både av manipulasjon og fare for angrep. Viktigere, lar denne protokollen for kjøp av langsiktige HSC fenotypiske markører som CD90 og CD49f innen 24-48 timer etter behandling med VPA9. Utvidet HSC grafts opprettet med denne protokollen har kapasitet til å regenerere blodkreft systemet siden de kan skille ut alle blodkreft celle overleveringslinjer og etablere langsiktig engraftment etter transplantasjon i myeloablated NSG mus modeller4. Dessuten, denne protokollen er svært reproduserbar og gir effektiv og rask isolering av levedyktig CD34+ celler fra UCBs, som er avgjørende for industrialisering av denne prosedyren.

VPA ex vivo ekspansjon protokollen har potensial til å overvinne betydelige tap av HSCs som oppstår under genet redigering11. Gene redigering krever eksponering for cytokiner, som er nødvendig for sykling celler og aktivering av DNA-reparasjon mekanismer. På grunn av rask effekten av VPA behandling, kan denne metoden være gunstig for generering av et større antall genmodifiserte celler innenfor en periode som er relevante for utnyttet genet modifikasjon protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HSC ex vivo ekspansjon protokollen følger retningslinjene for etikk for forskning på Mount Sinai School of Medicine.

1. buffer og Media

  1. Forberede separasjon buffer 24 timer før isolering av CD34+ celler fra UBCs ved å legge til 2 mL av 0,5 M etylen Diamine Tetra-eddiksyre (EDTA) og 33 mL 7,5% Bovine Serum Albumin (BSA) til 465 mL bufret saltvann (1 x PBS). Bland forsiktig og vedlikeholde bufferen overnatting på 4 ° C.
  2. Varm media ved romtemperatur ved rensing.

2. isolering av mononukleære celler (MNCs) fra UCB enhet

  1. Dispensere det hele UCB enheten i en 75 cm2 kolbe. Fortynne og bland forsiktig av UCB med en lik mengde PBS ved romtemperatur.
  2. Bestemme antall rør kreves for behandling hele UCB enheten (en 50 mL konisk rør kan brukes til å behandle 35 mL utvannet UCB). Legg til 15 mL tetthet gradert media (se Tabell of Materials) til hver tube og dispensere utvannet UCB på tetthet gradert media oppretter to lag.
    Merk: Dispensere utvannet UCB veldig sakte mens du holder røret i 45° vinkel å hindre blanding av tetthet gradert media laget med UCB.
  3. Sentrifuge 400 x g i 30 min med en lav akselerasjon og retardasjon hastighet. Etter sentrifugering Finn MNCs i det hvite laget (buffy pels) mellom plasma og tetthet gradert media laget.
  4. Sakte Sug opp 2/3 av plasma uten å forstyrre buffy pels laget. Nøye overføre buffy pels laget til en ny 50 mL tube. Samle alle MNCs fra samme UCB enhet i en 50 mL tube fram 25 mL. Bruk en ny tube Hvis volumet av samlet MNCs overstiger 25 mL.
  5. Legg til 25 mL kaldt PBS inn i røret som inneholder 25 mL MNCs og bland godt. Sentrifuger 400 x g i 10 min på 4 ° C.
    Merk: Kalde PBS er viktig å forebygge capping av antistoffer på cellens overflate og redusere uspesifisert merking.
  6. Nøye Sug opp nedbryting og forsiktig å avbryte celle pellet 50 mL kaldt PBS.
  7. Fjerne 20 μL celle suspensjon for opptelling. Telle hvor cellen med Akridin oransje/propidium iodide flekker ved å bruke en automatisert celle teller. Beregne antall MNCs.
    Merk: Celletall kan også utføres av trypan blå utelukkelse metoden bruker en hemocytometer.
  8. Sentrifuger 400 x g i 15 min på 4 ° C.
    Merk: Hvis det ikke kreves umiddelbart, kan MNCs fryses på dette stadiet.

3. isolering av CD34+ celler fra UCBs

  1. Forberede CD34+ antistoff kombinert med magnetiske perler løsning for isolering av CD34+ celler fra MNCs. Mix 300 µL av separasjon buffer med 100 µL av menneskelig FcR menneskelige IgG (blokkerer reagens) og 100 µL av CD34 magnetiske perler for isolering av CD34 + celler fra hver 108 MNCs. For isolering av mange CD34+ celler fra (> 108) MNCs, skalere opp reagenser tilsvarende.
  2. Nøye Sug opp nedbryting fra tuben sentrifugeres på trinn 2.8. Resuspend pellet i CD34 magnetiske perler løsningen i trinn 3.1 (bruk 500 µL løsning per 108 celler).
  3. Bland forsiktig og ruge på 4 ° C i 30 min.
    Merk: Klargjør celle skilletegn enheten (se Tabell for materiale) under inkubasjonstiden. Erstatte lagringsløsningen med arbeider bufferen som indikert av produsentens instruksjoner og kjøre en vask program etterfulgt av et skyllingsprosess program.
  4. Legge til kalde celle skilletegn kjører buffer til røret som inneholder cellen blandingen før røret er fullt fylt. Sentrifuger 400 x g i 15 min på 4 ° C.
  5. Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i kalde celle skilletegn kjører buffer (2 mL/108 celler). Overfør det 2 mL av cellen suspensjon blanding til 15 mL rør.
  6. Plasser 3 sett med 15 mL rør i cellen skilletegn stativet prechilled på 4 ° C. Ett sett av rør inneholder MNCs, det andre settet av rør brukes til å samle negative delen og det tredje settet med rør brukes til å samle renset CD34+ celler.
  7. Last stativet inn i cellen skilletegn enheten og kjøre programmet posseld2 forhåndsinnstilte.
    Merk: En alternativ metode som benytter manuell magnetiske skilletegn kan brukes til å erstatte de celle skilletegn enhet12 .
  8. Sentrifuger rør med positiv brøken på 400 x g i 15 min på 4 ° C. Sug opp nedbryting og resuspend renset CD34+ celler i 1 mL av serum-frie medier.
  9. Telle celler med Akridin oransje/propidium iodide bruker en automatisert celle teller.
    Merk: Hvis det ikke kreves umiddelbart, renset CD34+ celler kan fryses på dette stadiet.

4. VPA Ex Vivo utvidelse av renset UCB-CD34+ celler

  1. Forbered tilstrekkelig antall medier til plate renset CD34+ celler i en tetthet 3,3 x 104 celler/mL. Kultur medier sammensetningen er serum fri kultur medium (se Tabell for materiale) supplert med 10 µL/mL penn/strep, 150 ng/mL stamcelleforskningen faktor (SCF), 100 ng/mL fms-lignende tyrosin kinase reseptor 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), og 50 ng/mL interleukin 3 (IL-3).
  2. Plate renset CD34+ celler i en 12-vel plate (5 x 104 CD34+ celler / 1,5 mL av media / godt) og kultur på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
  3. Vurdere renheten av isolerte CD34+ celler og celle sammensetning av FACS analyse som beskrevet nedenfor i trinn 6.3.
  4. Legge VPA på en siste konsentrasjon av 1 mM i kulturer av cellene behandlet for 16 h med cytokin cocktail.
  5. Kultur cellene for ytterligere 7 dager på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
    Merk: Media uendret i løpet av varigheten av ex vivo ekspansjon.

5. antistoff flekker for flyt cytometri analyse

  1. Forberede antistoff-flekk løsning på flekken 2 x 104–6 x 104 celler og isotype løsningen til å avgjøre FACS gating strategi og bestemme nivået av ikke-spesifikk binding. Fortynne antistoffer (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) og de respektive isotypes i 50 µL av separasjon buffer (sammensetning av separasjon bufferen er definert i trinn 1.1).
    Merk: Utfør enkelt farging av celler med hver antistoff for en FMO gating strategi. Totalt antistoff kompensasjon perle kit kan (se Tabell for materiale) brukes for kompensasjonsoppsett.
  2. Homogenize i cellekultur av pipettering flere ganger. Telle celler og Pipetter 5 x 104 celler i en 1,5 mL tube.
  3. Legge 1 mL av separasjon buffer og sentrifuger på 400 x g i 15 min ved romtemperatur.
  4. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 50 µL av flekker løsningen. Inkuber celler for 30 min ved romtemperatur.
  5. Legge til 450 µL av separasjon buffer og sentrifuger 400 x g i 15 min ved romtemperatur.
  6. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 100 µL av separasjon buffer. Holde celler på is minst 5 min til FACS analyse. Legg 1 µL av 7-AAD til gate levedyktige cellers.
  7. Last farget celle prøven på FACS maskinen og skaffe cellene på laveste flow rate.
  8. For hver fluorophore, analysere isotype kontrollene og farget enkeltceller definere gating for FITC (CD90), APC (CD34) og PerCP/Cy5.5 (7-AAD) flekker.
  9. Gate PerCP/Cy5.5 negative brøk og tomten APC vs FITC å bestemme prosent av levedyktig CD34+, CD90+, og CD34+CD90+ celler som definerer befolkningen HSPC/HSC i kulturen.

6. antistoff flekker for flyt cytometri celle sortering

  1. Resuspend utvidet cellene av pipettering flere ganger. Antall cellen og overføre hele kulturen i en 15 mL eller 50 mL tube.
  2. Fylle opp røret med kaldt separasjon buffer
  3. Sentrifuger 400 x g i 15 min på 4 ° C.
  4. Forberede antistoff-flekk løsning stain 5 x 105– 2 x 106 celler og isotype løsning å flekken 1 x 105 celler og bestemme FACS gating. Fortynne 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) antistoffer og den tilsvarende isotypes til 500 µL av separasjon buffer per hver betingelse.
  5. Tilbered enkelt farge kompensasjon kontrollene med en total antistoff kompensasjon perle kit i henhold til produsentens instruksjoner.
  6. Overføre nedbryting fra trinn 5.2 til en ny tube og holde det på 37 ° C. Denne kultur medier vil bli gjenbrukt for å kultur sorterte cellene.
  7. Resuspend celle pellet i kalde separasjon buffer for å skaffe en konsentrasjon av 5 x 105 celler / mL. Overføre 1 x 105 celler i 1,5 mL rør for isotype flekker og gjenværende cellene som skal sorteres i andre 1,5 mL rør.
  8. Sentrifuge rørene på 400 x g i 15 min på 4 ° C.
  9. Forkast nedbryting og resuspend pellets celleområde i isotype flekker løsning og pellets celler som vil bli sortert i antistoffer flekker løsning.
  10. Inkuber i 30 min på 4 ° C.
  11. Legge til 450 µL av separasjon buffer og sentrifuger 400 x g i 15 min på 4 ° C.
  12. Resuspend pellets med 2 mL kaldt separasjon buffer.
  13. For å forhindre tresko, filtrere prøver gjennom en 40 μm celle sil og sted på is inntil FACS.
  14. Sette opp cellen sorter for sortering med riktige parametre.
  15. Kjøre isotype prøver å sette spenning og få frem og siden scatter og identifisere negativ fluorescens populasjoner.
  16. Kjøre én fargekontroller for å angi kompensasjon koeffisienter og bruke kompensert parameteren samling-protokollen.
  17. Kjør en liten aliquot på (Ab) utvalget (~ 50.000 hendelser) å etablere gating strategien.
  18. Definere typen beslutninger å samle CD34+ CD90- celle brøkdel.
  19. Sortere celler inn i samling rør belagt med 2 mL separasjon buffer.
  20. Etter sortering, forteller cellene og sentrifuge dem på 400 x g i 15 min på 4 ° C.
  21. Forkast nedbryting og resuspend pellet i media utvinnes i trinn 5.5 å nå en siste konsentrasjon av 3 x 104 celler/mL.
  22. Plate CD34+ CD90- renset celler i 12-vel plater med 1,5 mL medium/godt (5 x 104 CD34+ CD90- celler/1.5 mL media/vel).
  23. Vurdere renheten av FACS analyse med 50 µL av media som inneholder celler.
  24. Behandle kulturer av CD34+CD90- -celler med VPA på 1mM endelige konsentrasjon.
  25. Ruge på 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ex vivo protokoll beskrevet her øker antallet primitive HSCs generert fra CD34+ celler isolert fra UCBs (figur 1). Grunning av CD34+ celler for 16 h med et cytokin cocktail, etterfulgt av behandling med VPA for ytterligere 7 dager, fører til en stor grad av HSC ekspansjon. Bemerkelsesverdig, pool av utvidet celler er høyanriket for HSCs, som er svært definert av CD34+CD90+ markører. Totalt antall kjerne celler (transnasjonale selskaper) i kulturer behandlet med cytokin cocktail alene er betydelig høyere enn antall celler i kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA (figur 2A). Til tross for høyere antall transnasjonale selskaper, nummeret av HSCs i kulturer mottar cytokin cocktail alene forblir lavt i hele ekspansjon perioden sammenlignet kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA (figur 2B). Flest HSCs genereres i kulturer behandlet med en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA (figur 2B). Spesielt er den største utvidelsen i antall HSCs nådd etter 5-7 dager etter VPA behandling (figur 2B). Det økte antallet HSCs samsvarer med en rask økning i andelen HSCs, er et kjent innen 24 timer av VPA behandling (figur 2C). Mens økningen i andelen HSCs er høy og vedlikeholdt i løpet av første 4 dager ex vivo kultur, synker den stadig etter 5-7 dager behandling med VPA (figur 2C). Men korrelert denne nedgangen omvendt med en økning i absolutte antallet HSCs.

Viktigere, skyldes den raske økningen i andelen HSCs observert i VPA behandlet kulturer oppkjøpet av CD90 fenotypen. CD34+ celler uttrykke CD90 fenotypiske markør når nesten 40-45% av celler utvidet ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA i 4 dager (figur 2C,D). Oppkjøpet av CD90 fenotypen blir ytterligere bekreftet av ex vivo utvidelse av den høyt renset CD34+ celler mangel uttrykket av CD90 merket. Innen 24 timer av VPA behandling, nesten 75% av ex vivo utvidet celler i kulturer med sorterte CD34+CD90- -celler uttrykke CD90 i motsetning til 0% av cellene i kulturer som inneholder cytokin cocktail alene (figur 2E). Viktigere, beholdes svært CD90 fenotypen under første 4 dager i ex vivo kulturer behandlet med VPA (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: skjematisk presentasjon av ex vivo ekspansjon kultur. Renset CD34+ celler fra UCBs er primet for 16 h i ex vivo kultur med en kombinasjon av den angitte cytokiner. Kulturer er behandlet med VPA (1mM) for ytterligere 7 dager. Den ex vivo utvidet celler kan deretter bli transplanted i myoablated NSG mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: VPA behandling utløser oppkjøpet av CD90 som resulterer i utvidelsen av et stort antall HSCs. (A) absolutt antall totale levedyktig kjerne celler utvidet ex vivo kulturer9. Renset CD34+ celler fra UCBs beskrevet i del 3 behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA som beskrevet i Seksjon 4 ble regnet av Akridin oransje/propidium iodide flekker (n = 16). Tall betegne dagers behandling med VPA, mens PC betegner den primære uncultured CD34+ celler isolert fra UCBs. (B, C) Absolutt antall og prosentandel av CD34+CD90+ celler utvidet gjennom 7 dager ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA (n = 21). Andelen CD34+CD90+ celler bestemmes av flyt cytometri analyse av celler farget som beskrevet i Seksjon 4. (D) fenotypiske analyse av sortert CD34+ celler fra UCBs (trinn 5.3) utvidet ex vivo kulturer behandlet som angitt i 4 dager. Informasjonsvinduet angir gating strategien med isotype flekker mens andre paneler angir farget celler utvidet i kulturer som inneholder cytokin cocktail alene eller en kombinasjon av cytokin cocktail med VPA. Tall betegne prosentandelen av CD34-CD90+ celler, CD34+CD90- celler og CD34+CD90+ celler. (E) prosent av CD34+CD90+ celler i kulturer med sortert CD34+CD90- celler fra UBCs og behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA for den angitt dager. Prosentandelen er bestemt av flyt cytometri analyse (n = 4). N: antall biologiske gjentak. Feilfelt med SEM; p ≤ 0,0001 som bestemmes av negative binomiske modeller for A og B, Beta modeller for D og 2-veis VARIANSANALYSE panel E. paneler-vekselstrøm og E er endret fra Papa et al.9Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å raskt utvide betydelig antall funksjonell menneskelige HSCs fra UCBs. Pilot og kinetisk studier bruker denne protokollen indikerer at den ex vivo utvidet cellene raskt skaffe og beholde uttrykk for flere HSC fenotypiske indikatorer inkludert CD90 samt primitive HSC metabolske egenskaper9.

Dette ex vivo ekspansjon protokollen er relativt enkel og pålitelig. Rensing av CD34+ celler med cellen skilletegn enheten (se Tabell for materiale) er reproduserbare og svært rask, slik at for rask gjenoppretting av isolerte celler. Denne metoden gir en høy avkastning av renset CD34+ celler (> 90%) i motsetning til manuell immunomagnetic separasjon. Videre krever dette ex vivo ekspansjon protokollen ikke spesiell og komplekse enheter eller matet batch kultur systemer som trenger kontinuerlig tilførsel av store mengder frisk media med cytokiner3,13. Derfor begrenser denne metoden kostnader. Viktigere, tillater denne protokollen utvidelsen av HSC innen kort tid, som er en viktig begrensende faktor for forurensning frekvens.

Flere punkter bør vurderes for å oppnå primitive HSCs fra CD34+ celler bruker denne protokollen. CD34+ celler utvidet 4 dager i kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA føre til generering av en pool av primitive langsiktige HSCs. Disse HSCs er preget ikke bare av høy uttrykk nivåer av CD34, CD90 og CD49f, men også av en svært primitiv metabolske profil, som er overveiende avhengig Glykolysen9. Under mer langvarig inkubasjon med VPA for 7 dager, utvidet kulturer men er stadig mer uensartet og inneholder et større antall både langsiktige og kortsiktige samt differensierte celler i motsetning til celler utvidet for 4 dager. Dette resultatet skyldes i hovedsak at konsumpsjon av VPA kultur og økt antall celledelinger9. Derfor denne protokollen kan brukes til å oppnå utvidelse av to ulike bassenger av celler: 4-dagers og 7-dagers utvidet celler. 7-dagers utvidelse produktet kan brukes for allogene HSC transplantasjon der raskere så vel som vedvarende multilineage engraftment kreves. 4-dagers ekspansjon protokollen kan være best egnet for genetisk modifisering strategier som er rettet mot langsiktige repopulation celler. Er det også sannsynlig at denne kombinasjonen av VPA og cytokin cocktail kan utvide utvalget av HSCs fra CD34+ celler på samme grad eller høyere når du bruker andre medier enn media (se Tabell for materiale) brukes i denne protokollen.

Gjeldende genet redigering prosedyrer er knyttet til betydelige tap av HSCs, som begrenser deres klinisk anvendelse. Av primitive HSCs oppnådd innen 2-4 dager etter VPA behandling i ex vivo kulturer har potensial til å overvinne dette tapet i HSC tall. Dermed kan denne protokollen være gunstig for å forbedre eksisterende genet redigere protokoller og aktiverer korrigering av genetiske mutasjoner i HSC transplantasjon-basert behandling for β-talassemi og sigdcelleanemi. Videre kan det brukes til å vedlikeholde av HSCs under genet manipulasjoner for studier fokuserte på utviklingen av genet funksjoner i HSCs og hematopoiesis.

Avslutningsvis metoden beskrevet her kan brukes for ex vivo utvidelse av både menneskelige og murine HSCs og kan tilpasses bestemte kliniske applikasjoner så vel som et bredt spekter undersøkelser i grunnleggende forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NYSTEM gi C030136 til R.H. Vi vil gjerne takke Bartek Jablonski for hans tilbakemeldinger og revisjon av manuskriptet

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Tags

Medisin problemet 146 navlestrengsblod CD34+ celler ex vivo kultur VPA HSCs ex vivo ekspansjon transplantasjon genterapi
Ex Vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra menneskelige navlestreng blod-avledet CD34<sup>+</sup> celler ved hjelp av Valproic Acid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter