Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera svår TBI med den laterala vätskan slagverk skada (FPI) modell i vuxen, manliga Wistar råttor. Vi visar också användningen av ett trådlöst telemetrisystem för att samla in kontinuerliga video-EEG inspelningar och övervaka för epileptiform utsläpp överensstämmer med posttraumatisk epileptogenesis.
Abstract
Den laterala vätske slag verks skada (FPI) modellen är väl etablerad och har använts för att studera TBI och posttraumatisk epilepsi (PTE). Dock har betydande variationer rapporter ATS för de specifika parametrar som används i olika studier som har använt denna modell, vilket gör det svårt att harmonisera och tolka resultaten mellan laboratorier. Till exempel, variation har rapporter ATS om storleken och placeringen av kraniektomi, hur Luer lås navet placeras i förhållande till kraniektomi, atmosfärstryck appliceras på Dura och varaktigheten av tryck pulsen. Var och en av dessa parametrar kan påverka skadans allvarlighets grad, som direkt korrelerar med incidensen av PTE. Detta har manifesteras som ett brett spektrum av dödlighet, rätande reflex tider och förekomst av kramp anfall rapporterade. Här ger vi ett detaljerat protokoll för den metod vi har använt för att under lätta harmoniseringen mellan studierna. Vi använde FPI i kombination med ett trådlöst EEG telemetri system för att kontinuerligt övervaka för elektrografiska förändringar och upptäcka beslag aktivitet. FPI induceras genom att skapa en 5 mm craniectomy över den vänstra hjärn halvan, mellan Bregma och lambda och intill den laterala åsen. En Luer lås navet är säkrad på skallen över kraniektomi. Denna hubb är ansluten till FPI-enheten, och en 20-millisekunders tryck puls levereras direkt till den intakta Dura genom tryck slangen ansluten till hubben via en twist lock-kontakt. Efter återhämtning, råttor är re-anesthetized att ta bort navet. Fem 0,5 mm, rost fritt stål EEG-elektrod skruvar är placerade i kontakt med Dura genom skallen och fungera som fyra inspelnings elektroder och en referens elektrod. Elektrod kablarna samlas i en piedestal kontakt som säkras på plats med ben cement. Kontinuerlig video/EEG-inspelningar samlas upp i upp till 4 veckor efter TBI.
Introduction
I en 2015 rapport till kongressen, Centers för sjukdoms kontroll rapporterade att cirka 2 500 000 personer per år lider traumatisk hjärn skada (TBI) i USA1. Det uppskattas att TBI orsakar 20% av symptomatiska Epilepsier och 5% av alla Epilepsier2,3,4. Dessutom utvecklar cirka 20% av TBI-patienterna posttraumatisk epilepsi5. Viktigt, kroniska, återkommande anfall som uppstår som en följd av TBI är ofta farmakoresistenta, vilket ökar bördan av sjukdomen6. De exakta mekanismerna som leder till posttraumatisk epilepsi (PTE) är fortfarande oklara. Flera viktiga epidemiologiska studier har dock undersökt incidensen och den potentiella risken för utveckling av posttraumatisk epilepsi (PTE)2,4,7,8,9 ,10,11. Dessa epidemiologiska studier varje förstärkt sambandet mellan skada allvarlighets grad med risk för epileptogenesis.
Nuvarande metoder som har använts i stor utsträckning för att identifiera nya anti-epilepsi terapier har förlitat sig på modeller som använder chemo-Convulsants eller elektrisk tändved att inducera epilepsi12. Med tanke på den höga förekomsten av farmako-resistens mot läkemedel som utvecklats i dessa modeller av TBI patienter, vi hypotes om att TBI-inducerad kramper kan skilja sig från kemokonvulsiva eller Kindling-inducerad kramper och kan innebära olika vägar eller processer av epileptogenes. Därför kan en TBI-modell vara bättre lämpad för utveckling av behandlingar som är mer effektiva för att förhindra posttraumatisk epileptogenes.
TBI: s modell för vätske slag verks skada (FPI) har använts i årtionden och är en väletablerad metod för att undersöka både TBI och Pte13,14,15,16,17, 18. som vi nyligen granskade finns det dock en hög grad av variation i de FPI-metoder som rapporter ATS mellan laboratorierna19,20. Denna brist på enhetlighet mellan laboratorier förhindrar reproducerbarhet av prekliniska fynd och gör tolkningen av resultaten till en utmaning. Som en följd av detta har ökat intresse och ansträngningar tillämpats för att skapa en större harmonisering för dessa typer av studier21,22,23,24.
I ett försök att ytterligare öka samstämmigheten och harmoniseringen mellan laboratorier som fokuserar på att studera posttraumatisk epileptogenes ger vi här en detaljerad metod för vår strategi. Vi har tidigare rapporterat en 60% incidens av kramp anfall inom sex veckor efter svår TBI20. Vi använder nu denna metod för att övervaka råttor börjar dagen för skadan och kontinuerligt följa dem 24 timmar om dygnet i upp till 4 veckor. Vi har valt att använda ett trådlöst telemetrisystem som ger flera fördelar. Först, råttor kan fritt röra sig om sin bur, och därmed minskar stressen. Andra en minskning av signal brus som råtta fungerar som marken. Dessutom använder vårt nuvarande system en accelerometer som detekterar snabb rörelse i alla tre plan (X, Y och Z) och kan vara till hjälp för att identifiera kramp anfall händelser. Slutligen, det trådlösa telemetrisystemet möjliggör enklare hantering av råttor såsom kompletterande saltlösning injektioner, vägning och genomföra neurologiska svårighets grad poäng, vilket är komplicerat när råttor är knutna till en tjuder. Men detta tillvägagångs sätt har också flera begränsningar. Första, den initial kostnad av en system till protokollföra från upp till åtta råtta samtidig kanna bli inne om spänna av $60 000. För det andra begränsas strömmen av en batteri källa. Detta kräver daglig övervakning och byte av batterier. Den tid som krävs mellan batteri byten kan påverkas av samplings frekvensen. Men för en samplings frekvens på 1000 Hz byts batterierna normalt en gång i veckan. Den begränsade strömförsörjningen begränsar också systemet till inspelning från endast fyra EEG-signaler. Slutligen är signal avhopp begränsad men förekommer ibland. Emellertid, detta tillvägagångs sätt ger en konsekvent och pålitlig metod för att övervaka posttraumatisk epileptogenes och kan stöd i identifieringen av nya terapeutiska behandlingar.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av och följs rikt linjer av universitetet vid Buffalo institutionella djur vård och användning kommitté.
1. vätske slag verks skada
- Använd en labbrock eller kirurgisk klänning, kirurgisk mask, kirurgiska handskar, och huvud beläggning och sterilisera alla verktyg och material som kontaktar Operations området.
- Anesthetize en 10-12-vecka-gammal, hane, Wistar råtta (350-400 g) med 3% isofluran och 1 L/min syre i en induktions kammare av lämplig storlek för råttor. Ta bort råttan från induktions kammaren och flytta den till prep-området när den är medvetslös. Lägg den sterila oftalmiska salva i båda ögonen.
- Raka håret på råttans huvud med elektriska Clippers med en #40 blad från strax ovanför ögonen till stjärtfenan basen av öronen för att producera tillräckligt kirurgiskt fält. Ta bort alla lösa, klippt hår från platsen.
- Rengör Operations stället genom att applicera 2% klorohexidinskrubb i den rakade hår botten följt av 70% etanol. Börja i centrum och flytta utåt i koncentriska cirklar bort från snitt platsen. Upprepa denna process 3 gånger. Applicera Betadine lösning på platsen på samma sätt och får torka.
- Placera bedövande råtta i den stereotaktisk ramen och underhålla anestesi på 2-3% isofluran-1 L/min syre via Nosecone. Kontrol lera om förlust av abstinens reflex av hindlem och förlust av palpebrala reflex för att säkerställa att råttan är i ett kirurgiskt plan för anestesi.
- Övervaka andnings frekvens, hjärt frekvens, kropps temperatur och syremättnad under hela operationen. Behåll hjärt frekvensen mellan 300-400 BPM och SpO2 över 90%.
Obs: en pulsoximeter som fästs vid en bakre fot kan användas för att ge konstant avläsning av hjärt frekvens och SpO2. En hjärt frekvens över 400 BPM indikerar att råttan inte är tillräckligt bedövad. En själv reglerande uppvärmningen pad, kopplad till en rektal termometer, inställd på 37 ° c, kan placeras under råtta under hela operationen för att bibehålla kropps temperaturen. En stereo mikroskopet med en ljus källa i kombination med en optisk fiber lampa är till hjälp för visualisering av förfarandet. - Använd en 23 g nål för att injicera 0,5% bupivakain hydroklorid intradermalt i hår botten vid snitt platsen för lokal analgesi 10-15 minuter innan du gör ett snitt.
- Gör en 1.5-2.5 cm mitt linje snitt genom huden och musklerna i hår botten med hjälp av en #10 skalpell blad. Dra tillbaka huden och muskeln för att exponera skallen och ge ett tydligt kirurgiskt fält. Reflektera den underliggande fascian och fett vävnad bort från benet med sterila bomullsvabbar.
Obs: en elektrisk diatermi enhet är användbar för att uppnå snabb hemostas. - Raka ner den laterala åsen av den vänstra parietala benet med hjälp av en kirurgisk kyrett att producera en slät plan yta så att basen av den kvinnliga-kvinnliga Luer lås navet kan vila jämnhöjd med skallen.
- Skölj skallen ytan och omgivande vävnader med 2,0 mg/mL gentamicin lösning i steril saltlösning. Blot överflödig lösning med en steril kompresser.
- Applicera 3% väteperoxid på skallen för att torka benet.
Anmärkning: om benet inte är tillräckligt torrt kommer tand cement inte att fastna ordentligt och bilda en solid tätning. - Skapa en 5 mm diameter craniektomi plats genom vänster parietala benet.
Obs: en trefin bit placeras i en borrmaskin ansluten till stereotaktiska ram kan vara till hjälp för att initiera kraniektomi. Använd en hand borr med en 5 mm diameter trephine att långsamt avsluta craniectomy genom resterande ben. När nära att slutföra kraniektomi, rotera trephine i omvänd för att förhindra bristning av den underliggande dura mater. Det kommer att bli en gallring av skallen runt omkretsen av disken och skalle luckan kommer att känna sig lös när pressas lätt. - Ta bort ben luckan med kirurgisk kyrett och slät vävnad pincett.
Obs: vissa blödningar kan inträffa, men hemostas kan snabbt uppnås genom att tillämpa lätt tryck med sterila bomullsvabbar. - Använd en stereo mikroskopet och belysning för att visuellt inspektera Dura för eventuella tecken på bristning. En tunn fälg av ben kommer att förbli runt omkretsen av craniektomi webbplats. Försiktigt bort denna fälg med slät vävnad pincett noga med att inte brista Dura.
- Svinga skallen med 70% etanol för att avlägsna eventuellt bendamm och för att torka skallen.
- Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat gel lim runt nedre kanten av Luer lås navet och säkra den till skallen över kraniektomi utan att hindra öppningen. Var försiktig så att du inte tar med dig limmet i kontakt med Dura. Ytterligare, täta Luer låset på plats med ett extra tunt lager av lim runt utsidan basen av navet.
- Förbered en flyt gödsel av tand cement. Applicera cement på ytan av skallen runt och över basen av Luer lås navet för att säkra den på plats.
- Fyll Luer lås navet med en steril konserverings medel fri konstgjord Cereberal spinal vätska (CSF) lösning (pH 7,4) med hjälp av en spruta och nål så att en konvex bolus av saltlösning kan ses ovanför toppen av fälgen.
Obs: lösningen kommer att hålla Dura fuktig som tand cement torkar samt fungerar som en indikation på integriteten av tätningen. Om lösnings nivån sjunker alls, är det en indikation på en läcka i systemet och Luerlåset måste avlägsnas och bytas ut. - När tand cement är helt botad, avbryta gas anestesi och ta bort råtta från stereotaktisk ram.
- Placera råttan på en plattform bredvid FPI-enheten.
- FPI-enheten har en böjd metall spets som sträcker sig från tryck givaren i slutet av vätske behållaren. Säkra en 12 cm längd av tryckslangar till slutet av den böjda spetsen med motsatt ände avslutas i en 2 cm hane Luer lås twist kontakt. Säkra råttan till FPI-anordningen genom att ansluta den kvinnliga änden av navet på råttans skalle till hankontakten.
Se till att anslutningen är ordentligt säkrad och att alla luft bubblor har avlägsnats från systemet. - Placera djuret i Sternal liggande ställning och upprepade gånger kontrol lera för återgång av abstinens reflex. Så snart råttan återfår abstinens reflex men är fortfarande sedated, släpp pendeln av FPI enheten för att orsaka en enda 20 MS tryck puls och framkalla skada.
Obs: det är viktigt att inte inducera skadan medan djuret är djupt sövda eftersom detta tenderar att orsaka ökad dödlighet på grund av neurogena-inducerad lungödem. Alla enheter uppvisar variationer. Men på den enhet som används för detta experiment, en 17 ° vinkel placering av hammaren producerar en 2,2-2,3 atmosfäriskt tryck puls. Oskadade, simulerade djur genomgår alla samma procedurer med undantag för den faktiska vätske pulsen till inducera skadan. - Omedelbart koppla från råtta från FPI enheten efter skada, placera den i Sternal recumbency, och ge extra syre (1 L/min) via en näsa kon tills spontan andning avkastning. Apné är en förväntad följd av skadan. Vid behov, ge periodiska manuella andetag via en påse ventil mask tills råtta börjar spontant andas på egen hand.
Vanligt vis varar apné mindre än 2 min. En övergående snabb ökning av hjärt frekvensen (> 500 BPM) observeras omedelbart efter administrering av tryck pulsen på grund av en Katekolamin burst. Detta kan övervakas med en pulsoximeter fäst vid råttans fot och kan fungera som en möjlig indikator på att en allvarlig skada har inträffat. - Övervaka råtta kontinuerligt och registrera tiden för återlämnande av rätande reflex (stabil rörlighet på alla fyra armar och ben).
- Storleken på atmosfärstrycket för varje råtta bör vara inom ± 0,05 atmosfärer av varandra. Kontrol lera att varje tryck puls ger en jämn signal på oscilloskopet med jämn amplitud och varaktighet.
Obs: en bullrig signal kan indikera luft bubblor i systemet som måste avlägsnas innan du levererar skade pulsen. Atmosfärstryck pulser som ger en allvarlig skada, i detta experiment, är de som vanligt vis resulterar i djurens rätande tider på 30-60 min. Detta spänner av att rätande tider associeras med en dödlighet klassar av ungefärligt 40-50%). - Administrera 10 mL förvärmda saltlösning subkutant som en stödjande behandling.
- Returnera råttan till dess hemburen och låt den återhämta sig i minst 4 h.
Anmärkning: ökad dödlighet har observerats när råttorna placeras omedelbart tillbaka under anestesi.
2. implantation av kortikala EEG-elektroder och video-EEG-inspelning
- Vid 4 h efter skada, bedöva råtta som tidigare beskrivits och placera tillbaka den i stereotaktiska ramen för att ta bort Luer lås navet och tand cement.
Obs: navet och cement snäpper enkelt av med måttligt tryck. När du tar bort navet, kontrol lera noga för eventuella bristning eller skador på Dura. Immediatly euthanize alla djur med skador på Dura. - Applicera en liten droppe 0,5% bupivakain hydroklorid i skallen på var och en av de platser där 5 pilothål ska borras (se figur 1).
- Borra pilothål genom skallen med en handhållen 0,1 mm borr.
- Säkra en rostfri elektrod skruv i varje pilot hål på följande platser: en referens skruv placeras stjärtfenan till lambda över lillhjärnan. Inspelnings elektroder placeras: 1) över halvklotet ipsilaterala och rostralt till kraniektomi; 2) över halvklotet ipsilaterala och stjärtfenan till kraniektomi; 3) över halvklotet kontralaterala och rostralt till kraniektomi; 4) över halvklotet kontralaterala och stjärtfenan till kraniektomi.
- Svinga skallen med 70% etanol för att avlägsna eventuellt bendamm.
- Täck craniektomi plats med ett tunt lager av sterila benvax för att täcka exponerade Dura.
- Anslut en elektrod array till 5 EEG-elektroderna genom att Linda den exponerade änden av en färgkodad elektrod tråd tätt runt dess utsedda elektrod skruv av rost fritt stål.
Anmärkning: de motsatta ändarna av varje elektrod tråd är placerade i en specifik, utsedd plats inom sockeln kontakten. - Förbered en flyt gödsel av ben cement.
- Samla elektrod trådarna i en spole under piedestalen och säkra ledningarna och piedestal på plats med ben cement. Håll sockeln på plats tills ben cementen har härdat.
Anmärkning: benet måste vara särskilt torrt och ogiltigt av restblod för att uppnå korrekt vidhäftning och förhindra för tidig borttagning av sändaren. - Anslut den trådlösa sändaren med nya batterier till sockeln innan du tar bort djuret från den stereotaktiska ramen.
- Placera djuret i sin hemmabur och placera buren i närheten av mottagaren och med tanke på en utsedd video kamera. Initiera video/EEG-inspelning.
3. insamling av video-EEG inspelningar
- Innan du samlar in EEG-signaler, gör en frekvens svep i rummet där råttor kommer att inrymmas för EEG insamling för att identifiera eventuella potentiella störande frekvenser för att förhindra insamling av EEG-inspelning med någon frekvens som har bakgrunds ljud.
- Ställ in alla sändare på specifika frekvenser som är störnings fria.
- Ställ in samplings frekvensen och inmatnings området för varje programmerbar sändare.
Obs: detta kan göras med hjälp av ett smart verktyg som tillhandahålls av system tillverkaren. Sändare kan ta prov med en maximal hastighet på 1000 Hz och ett maximalt inmatnings område på ± 10 mV. I detta experiment analyserades EEG-inspelningar mellan 0,5 Hz och 30 Hz. Därför fastställdes samplings frekvensen till 250 Hz. Vi observerar normalt amplituder på mindre än 1 mV. Därför var det inställda inmatnings området på ± 2 mV. - Använd EEG-programvara som tillhandahålls av tillverkaren för att kontinuerligt spela in video-EEG börjar på dagen för skada som förbinder varje trådlös sändare via en unik frekvens till en specifik mottagare.
Obs: varje sändare mottagare par kan övervaka 4 monopolära EEG-kanaler, och acceleration i X, Y och Z plan. EEG-data kan skrivas till en lagrings server. Video data ska sparas på en NAS-enhet som är länkad till lagrings servern. EEG-Analysprogramvaran synkroniserar video och EEG-inspelning baserat på den tid som upprätthålls av lagrings servern. - Använd video samling program vara för att spela in video av varje råtta med sin egen 2 MP upplösning kamera (1920 x 1080) konfigurerad för att spela in på 30 bilder/s.
Obs: varje kamera har sin egen infraröd belysning för video samling på natten. - Konfigurera systemet för att automatiskt spara alla video-och EEG-inspelningar till en lagrings server var 24 h. Videorna producerar ganska stora filer.
4. video/EEG-analys
- Synkronisera videon med varje EEG-inspelning på 1/10 s upplösning. Gör detta genom att använda system tillverkarna video/EEG analys program vara som skapar en metafil med stämpeln för den exakta tiden för både EEG och videon.
- Manuellt skärm genom EEG-inspelningar för att identifiera index händelser som definierar beslag aktivitet.
- Använda video/EEG analys program vara och index EEG händelser, skapa en konfigurations fil som använder nyckel parametrar (dvs. makt i specifika frekvens band, förhållandet mellan frekvens band till den totala effekten, acceleration tröskel, etc.) för att definiera egenskaper potentiella kramp händelser.
- Kör EEG analys program vara för att identifiera potentiella regioner av EEG-inspelning som kvalificerar baserat på de parametrar som valts i konfigurations filen.
Anmärkning: EEG analys program vara möjliggör automatisk beslag upptäckt och belyser regioner av intresse för EEG-signaler och ger FFT effekt spektrum analys över signalen. - Bekräfta potentiella kramp anfall genom att använda videoinspelningar som samlats in under förvärvet, vilka synkroniseras med varje råttans respektive EEG-inspelningar.
Representative Results
Med denna modell, vi inducerad svår TBI till vuxna, manliga, Wistar råttor. Under de förhållanden vi beskriver här, vi vanligt vis Observera dödlighet på 40-50%, och rätande reflex gånger 30-60 min som tidigare beskrivits20. Vi kunde samla in video/EEG inspelningar 24 h/dag börjar på dagen för skadan. Ett diagram som visar placeringen av fyra monopolära EEG-elektroder och en enda referens elektrod visas i figur 1a. Bilder som visar placeringen och utseendet på de TBI-lesioner som förväntas med de villkor som beskrivs här visas i figur 1B-D. Under de villkor som beskrivs här, vi konsekvent Observera delta bromsa inom de första tre dagarna post TBI. Mindre allvarligt skadade råttor uppvisar ensidiga, intermittent delta saktar (figurerna 2C-D). Däremot observeras kontinuerlig, bilateral delta långsammare efter allvarligare skador (figur 3C-D). En viss grad av delta långsammare observerades genomgående i alla TBI råttor men upptäcktes inte i någon simulerad (craniectomy endast) kontroll råttor (figurerna 2a-b; 3a-b). Omfattande delta långsammare observerades genomgående under de första tre dagarna efter skada i de flesta TBI råttor. Intressant, råtta typiskt utställning uttalat vikt förlust under den första tre dag post skada. Icke-konvulsiva anfall observeras ibland inom den första veckan efter TBI (figur 4 C-D). Kliniska anfall, som presenterar som Spike kluster i samband med uppfödning och fallande samt underarm Klonus kan observeras efter 1-vecka efter TBI (figur 5C-D). Slutligen visar figur 6 representativa bilder av enstaka intermittent signal bortfall och förlust av signal på grund av batteri fel.
Figur 1 . Placering av craniektomi, elektrod placering och lesion. (A) visar ett Schematiskt diagram över rått skallen med placeringen av kraniektomi (grå cirkel i vänster hjärn halva), fyra monopolära elektroder (svarta prickar; 1, 2, 3, 4) som ligger mellan Bregma och lambda och en referens elektrod (Black dot, R) placerad mitt linjen, posteriort om lambda; (B) visar koronalt post-mortem T2 MRI-skanningar med placeringen av den lesion som identifierats av en röd cirkel; (C) visar en 2D-karta över cortex där lesionen är identifierad (blå region). (D) visar en Nissl färgade koronala avsnitt med lesionen boxed, lesion är 100x förstorade i bilden till höger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Ensidig, intermittent delta långsammare samlas på dagen för en måttlig TBI. (A) visar en 90 s EEG spår från en simulerad, oskadad kontroll råtta på Operations dagen. Alla fyra kanalerna presenteras. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera bas linjen EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. B) FFT-analys av 2048 MS valt EPOC från det oskadade simulerade djuret på Operations dagen. (C) visar en 90 s EEG trace, som visar intermittent, unilaterala delta bromsa mönster av ett måttligt skadat djur på dagen för skadan. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera delta bromsa EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. (D) FFT-analys av 2048 MS vald EPOC från det MODERATA TBI-djuret på skade dagen. 90 s EEG tracings, uppifrån och ned är biopotentialer 1, 2, 3, 4, motsvarande deras platser runt kraniektomi området som visas i figur 1. Grå vertikala märken definierar 1 s intervall på EEG-spår. Alla EEG-spår visas på en skala (± 500 μV). Inom FFT analys grafer, totalt analyserade frekvens området var 0.5-30 Hz. Detta var ytterligare uppdelad i 4 separata frekvens band av delta (gul, 0.5-4 Hz), theta (lila, 4-8 Hz), alpha (röd, 8-12 Hz), och beta (grön, 12-30 Hz). % (Effekt) diagrammet som visas i FFT analys berättar hur stor andel av den totala effekten i den analyserade EPOC kommer från varje tidigare specificerat frekvens band, vilket möjliggör ytterligare matematisk karakterisering av EEG vågform mönster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Bilateral, kontinuerlig delta sakta samlas på dagen för en svår TBI. (A) visar en 90 s EEG spår från en simulerad, oskadad kontroll råtta på Operations dagen. Alla fyra kanalerna presenteras. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera bas linjen EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. B) FFT-analys av 2048 MS valt EPOC från det oskadade simulerade djuret på Operations dagen. (C) visar en 90 s EEG trace, som visar den kontinuerliga, bilaterala delta bromsa mönstret av ett allvarligt skadat djur på dagen för skadan. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera delta bromsa EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. (D) FFT-analys av 2048 MS vald EPOC från det allvarliga TBI-djuret på skade dagen. 90 s EEG tracings, uppifrån och ned är biopotentialer 1, 2, 3, 4, motsvarande deras platser runt kraniektomi området som visas i figur 1. Grå vertikala märken definierar 1 s intervall på EEG-spår. Alla EEG-spår visas på en skala (± 500 μV). Inom FFT analys grafer, totalt analyserade frekvens området var 0.5-30 Hz. Detta var ytterligare uppdelad i 4 separata frekvens band av delta (gul, 0.5-4 Hz), theta (lila, 4-8 Hz), alpha (röd, 8-12 Hz), och beta (grön, 12-30 Hz). % (Effekt) diagrammet som visas i FFT analys berättar hur stor andel av den totala effekten i den analyserade EPOC kommer från varje tidigare specificerat frekvens band, vilket möjliggör ytterligare matematisk karakterisering av EEG vågform mönster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Nonconvulsive elektrographic beslag samlades 3 dagar efter svår TBI. (A) visar en 90 s EEG spår från en simulerad drivs, oskadad kontroll råtta 3 dagar25 efter operationen. Alla fyra kanalerna presenteras. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera bas linjen EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. (B) FFT-analys av 2048 MS vald EPOC från det oskadade simulerade djuret på dagen tre25 efter operationen. (C) visar en 90 s EEG spår tre 25 dagar efter allvarlig skada. Denna show byggnad, snabbt spetsig mönster närvarande bilateralt och över alla 4 samlar kanaler. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera det tillsatta EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. (D) FFT-analys av 2048 MS vald EPOC från det allvarliga TBI-djuret på skade dagen. 90 s EEG tracings, uppifrån och ned är biopotentialer 1, 2, 3, 4, motsvarande deras platser runt kraniektomi området som visas i figur 1. Grå vertikala märken definierar 1 s intervall på EEG-spår. Alla EEG-spår visas på en skala (± 500 μV). Inom FFT analys grafer, totalt analyserade frekvens området var 0.5-30 Hz. Detta var ytterligare uppdelad i 4 separata frekvens band av delta (gul, 0.5-4 Hz), theta (lila, 4-8 Hz), alpha (röd, 8-12 Hz), och beta (grön, 12-30 Hz). % (Effekt) diagrammet som visas i FFT analys berättar hur stor andel av den totala effekten i den analyserade EPOC kommer från varje tidigare specificerat frekvens band, vilket möjliggör ytterligare matematisk karakterisering av EEG vågform mönster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Konvulsiva elektrografiska beslag samlades 9 dagar efter TBI. (A) visar en 90 s EEG spår från en simulerad opererade, oskadad kontroll råtta nio (9) dagar efter operationen. Alla fyra kanalerna presenteras. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera bas linjen EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. B) FFT-analys av 2048 MS valda EPOC från det oskadade simulerade djuret den dag nio (9) efter operationen. (C) visar en 90 s EEG spår nio (9) dagar efter allvarlig skada. Denna show byggnad, snabbt spetsig mönster närvarande bilateralt och över alla 4 samlar kanaler. En 10 s lång spår (tagen från boxed regionen) extraherades från 3: e kanalen för att bättre visualisera det tillsatta EEG mönster. En 2048 MS EPOC-sektion av detta valdes sedan ut för att analyseras i motsvarande FFT. (D) FFT analys av 2048 MS valda EPOC från svår TBI djur nio (9) dagar efter skada. 90 s EEG tracings, uppifrån och ned är biopotentialer 1, 2, 3, 4, motsvarande deras platser runt kraniektomi området som visas i figur 1. Grå vertikala märken definierar 1 s intervall på EEG-spår. Alla EEG-spår visas på en skala (± 500 μV). Inom FFT analys grafer, totalt analyserade frekvens området var 0.5-30 Hz. Detta var ytterligare uppdelad i 4 separata frekvens band av delta (gul, 0.5-4 Hz), theta (lila, 4-8 Hz), alpha (röd, 8-12 Hz), och beta (grön, 12-30 Hz). % (Effekt) diagrammet som visas i FFT analys berättar hur stor andel av den totala effekten i den analyserade EPOC kommer från varje tidigare specificerat frekvens band, vilket möjliggör ytterligare matematisk karakterisering av EEG vågform mönster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Signal släpp ut. Dessa är 3 separata exempel på vad signal släppa ut på grund av sändare eller mottagare frågor visas som på EEG-inspelning. (A) Detta är ett exempel på intermittent BORTFALL av EEG-signalen på en inspelning. (B) Detta är ett exempel på avhopp på grund av batteri fel under kontinuerlig trådlös telemetri visas som på en EEG-spårning. (C) inom den inringade regionen kan man se att när signal kvaliteten (QoS) sjunker från 100 till 0, blir EEG-spårningen tillplattad och stillastående vid 0 μV. Grå vertikala märken definierar 1 s intervall på EEG-spår. Alla EEG-spår visas på en skala (± 500 μV). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Betydande variationer har rapporter ATS mellan laboratorier avseende de specifika parametrar och metoder som används för FPI TBI modell 14,26,27,28. Dessa inkonsekvenser har resulterat i motstridiga resultat och gör det svårt att harmonisera insatserna och resultaten mellan labbarna. Här har vi presenterat en detaljerad metodik som beskriver vårt förhållnings sätt till långsiktig, kontinuerlig inspelning av video/EEG för att övervaka posttraumatisk epileptiform-aktivitet. Ett antal steg är avgörande för att generera reproducerbara resultat med den beskrivna metoden.
Först, med tanke på att incidensen av posttraumatisk epilepsi korrelerar med skada allvarlighets grad, tillämpa villkor som leder till den allvarligaste TBI. Specifikt, Använd en 5 mm craniektomi för att säkerställa att ett tillräckligt stort område av Dura exponeras. Dessutom, säkra en hona-hona Luer lås anordning på ytan av skallen, med öppningen placerad direkt över kraniektomi. Detta skiljer sig från andra laboratorier som har använt en mindre kraniectomy (3 mm) och/eller placerade en modifierad nål navet inuti kraniektomi, vilket effektivt minskar öppnings storleken. Genom att placera Luer lås utanför craniectomy, den 5mm öppningen bibehålls. Dessa specifika parametrar påverkar den totala kraften som appliceras på Dura. Atmosfärstryck som appliceras på Dura har också en stor inverkan på svårighets graden av den observerade skadan. Tyvärr, atmosfärstryck är mycket varierande och verkar vara enhets beroende. Vissa laboratorier har rapporterat att tillämpa en tryck puls på 8-10 MS18. Den metod som beskrivs här resulterar däremot i en 20 MS tryck puls. Detta är förenligt med andra laboratorier som verkar för att generera mer allvarliga skador 14,28. Det är tydligt att den skada-inducerande tryck pulsen är en parameter som visar betydande variationer mellan laboratorier och måste vara empiriskt definierade. Skadans svårighets grad kan dock bestämmas på grund val av en kombination av dödlighet (40-50%), rätande reflex tider (> 30 min)26. Det är också viktigt att endast djur med intakt Dura inkluderas i studien. Dessutom, om kraniektomi är ockluded av något lim eller cement så att en del av Dura under kraniektomi inte utsätts för den fulla kraften av vätske tryck puls, då djuret bör elimineras från studien. Dessutom kan överflödigt lim under Luer låset följa Dura och ta bort den med cement locket även efter en lyckad skada. Slutligen ger den släta formen av tryck puls kurvan på oscilloskopets spår en indikation på att det inte finns några luft bubblor i vätske kammaren och indikerar att kolven rör sig utan impedans.
Anestesi är en annan kritisk faktor som måste kontrol leras. Isofluran exponeringen bör hållas till lägsta möjliga nivå för att upprätthålla en kirurgisk plan anestesi. Råttor som utsätts för högre halter av isofluran eller under långa perioder är mer benägna att utveckla neurogent-inducerad lungödem. Beredning av skallen representerar en annan kritisk aspekt av metoden. Särskilt torkar skallen och ta bort något ben damm hjälper till att förhindra att råttor från att ta bort sändaren i förtid.
Placeringen av skruvar och anslutning av EEG-ledningar är uppenbarligen avgörande för att producera konsekvent reproducerbara inspelningar. Det är viktigt att skruvarna inte placeras för djupt för att framkalla en lesion på hjärnan. Benet luckan återvinnas från kraniektomi av vuxna (12 veckor gamla) manliga Wistar råttor är genomgående 2 mm tjock. Använd EEG-elektrod skruvar med en 2,5 mm skaft. Det är bra att använda tips av böjda mygga hemostatiska pincett som en spacer för att säkerställa att skruvarna bara sträcker sig till basen av benet och inte sticker ut i hjärnan.
Den strategi som presenteras här har vissa begränsningar. Batterierna måste bytas regelbundet. Hur ofta batteri byten varierar beror på samplings frekvensen. Batterierna byts vanligt vis en gång i veckan för en samplings frekvens på 1000 Hz. Denna tidsram kan för längas genom att minska samplings frekvensen. Systemet är också begränsat till inspelning från fyra monopolära EEG-elektroder. Emellertid, detta ger två kanaler per halvklotet och kan skilja mellan fokal och generaliserade händelser och kan skilja mellan främre och bakre förändringar. Trots dessa begränsningar, detta tillvägagångs sätt ger en rimlig metod för att genomföra kontinuerlig video/EEG övervakning och upptäckt av epileptiform förändringar efter svår TBI.
Den metod som beskrivs här resulterar i både elektrografiska och kramp anfall inom en månad efter TBI. Därför ger denna metod en rimlig tidsram för att studera potentiella terapeutiska för att förhindra epileptogenes efter svår TBI. Detta tillvägagångs sätt ger också en metod för att undersöka de molekyl ära mekanismerna i samband med PTE och kan leda till identifiering av potentiella bio markörer som kan användas för att identifiera patienter som är mest i risk zonen för att utveckla PTE.
Disclosures
Chelasea R Richardson är anställd av Emka Scientific, leverantören av detta trådlösa telemetrisystem beskrivs.
Acknowledgments
Vi vill tacka Paul Dressel för hans ovärderliga stöd i grafisk design och förberedelse av figurer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
| 3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
| 4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
| 5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
| Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
| Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
| Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
| Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
| GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
| Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
| IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
| IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
| Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
| Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
| Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | ||
| Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
| Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
| Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
| Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
| Synology Assistant | Synology Inc. | ||
| Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
| Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
| Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
| Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
| Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
| Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |
References
- Flanagan, S. R. Invited Commentary on Centers for Disease Control and Prevention Report to Congress: Traumatic Brain Injury in the United States: Epidemiology and Rehabilitation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96, 1753-1755 (2015).
- Annegers, J. F., Coan, S. P., Hauser, W. A., Leestma, J., Duffell, W., Tarver, B. Epilepsy, vagal nerve stimulation by the NCP system, mortality, and sudden, unexpected, unexplained death. Epilepsia. 39, 206-212 (1998).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, Suppl 2 4-9 (2009).
- Englander, J., et al. Analyzing risk factors for late posttraumatic seizures: a prospective, multicenter investigation. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 84, 365-373 (2003).
- Faul, M. X. L., Wald, M. M., Coronado, V. G. Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths 2002-2006. Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , Atlanta (GA). (2010).
- Herman, S. T. Epilepsy after brain insult: targeting epileptogenesis. Neurology. 59, 21-26 (2002).
- Annegers, J. F., Coan, S. P. The risks of epilepsy after traumatic brain injury. Seizure. 9, 453-457 (2000).
- Christensen, J., Pedersen, M. G., Pedersen, C. B., Sidenius, P., Olsen, J., Vestergaard, M. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373, 1105-1110 (2009).
- Webb, T. S., Whitehead, C. R., Wells, T. S., Gore, R. K., Otte, C. N. Neurologically-related sequelae associated with mild traumatic brain injury. Brain Injury. 29, 430-437 (2015).
- Mahler, B., Carlsson, S., Andersson, T., Adelow, C., Ahlbom, A., Tomson, T. Unprovoked seizures after traumatic brain injury: A population-based case-control study. Epilepsia. 56, 1438-1444 (2015).
- Wang, H., et al. Post-traumatic seizures--a prospective, multicenter, large case study after head injury in China. Epilepsy Research. 107, 272-278 (2013).
- Simonato, M., French, J. A., Galanopoulou, A. S., O'Brien, T. J. Issues for new antiepilepsy drug development. Current Opinion in Neurology. 26, 195-200 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienc. 140, 685-697 (2006).
- McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Curia, G., Eastman, C. L., Miller, J. W., D'Ambrosio, R. Modeling Post-Traumatic Epilepsy for Therapy Development. Translational Research in Traumatic Brain Injury. Laskowitz, D., Grant, G. , Boca Raton (FL). (2016).
- D'Ambrosio, R., Fairbanks, J. P., Fender, J. S., Born, D. E., Doyle, D. L., Miller, J. W. Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain. 127, 304-314 (2004).
- Saatman, K. E., et al. Classification of traumatic brain injury for targeted therapies. Journal of Neurotrauma. 25, 719-738 (2008).
- Smith, D., Brooke, D., Wohlgehagen, E., Rau, T., Poulsen, D. Temporal and Spatial Changes in the Pattern of Iba1 and CD68 Staining in the Rat Brain Following Severe Traumatic Brain Injury. Modern Research in Inflammation. 4, 9-23 (2015).
- Ndode-Ekane, X. E., et al. Harmonization of lateral fluid-percussion injury model production and post-injury monitoring in a preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 151, 7-16 (2019).
- Ciszek, R., et al. Informatics tools to assess the success of procedural harmonization in preclinical multicenter biomarker discovery study on post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 17-26 (2019).
- Immonen, R., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter MRI biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 150, 46-57 (2019).
- Kamnaksh, A., et al. Harmonization of pipeline for preclinical multicenter plasma protein and miRNA biomarker discovery in a rat model of post-traumatic epileptogenesis. Epilepsy Research. 149, 92-101 (2019).
- Redell, J. B., Moore, A. N., Ward, N. H., Hergenroeder, G. W., Dash, P. K. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. Journal of Neurotrauma. 27, 2147-2156 (2010).
- Smith, D., et al. Convulsive seizures and EEG spikes after lateral fluid-percussion injury in the rat. Epilepsy Research. 147, 87-94 (2018).
- Eastman, C. L., Fender, J. S., Temkin, N. R., D'Ambrosio, R. Optimized methods for epilepsy therapy development using an etiologically realistic model of focal epilepsy in the rat. Experimental Neurology. 264, 150-162 (2015).
- Shultz, S. R., et al. Can structural or functional changes following traumatic brain injury in the rat predict epileptic outcome. Epilepsia. 54, 1240-1250 (2013).
