Summary
在这里,我们提出了一个协议,诱导严重的TBI与横向流体打击伤害(FPI)模型在成年,男性威斯塔大鼠。我们还演示了使用无线遥测系统来收集连续的视频-EEG记录,并监测与创伤后癫痫发作一致的癫痫体放电。
Abstract
横向流体打击伤害(FPI)模型已经建立,并已用于研究TBI和创伤后癫痫(PTE)。然而,据报告,采用该模型的不同研究中使用的具体参数差异很大,因此难以在实验室之间协调和解释结果。例如,在颅骨切除术的大小和位置、Luer 锁轮毂相对于颅骨切除的放置方式、施加在 Dura 上的大气压力以及压力脉冲的持续时间等方面,都报告了可变性。每个参数都会影响损伤严重程度,这与 PTE 的发生率直接相关。这表现在广泛的死亡率,正确的反射时间和报告的惊厥发作的发生率。在这里,我们为用于帮助促进研究间协调的方法提供了详细的协议。我们将 FPI 与无线 EEG 遥测系统结合使用,以持续监控电图变化并检测癫痫发作活动。 FPI是通过在左半球、布雷格马和兰姆达之间和毗邻侧脊的左半球上建立5毫米颅切除术引起的。一个Luer锁轮毂被固定在颅骨切除术的头骨上。此集线器连接到 FPI 设备,通过扭锁连接器通过连接到集线器的压力管将 20 毫秒的压力脉冲直接传送到完整的 Dura。恢复后,对大鼠进行重新麻醉以移除集线器。五个 0.5 mm 的不锈钢 EEG 电极螺钉通过头骨与 Dura 接触,用作四个记录电极和一个参考电极。电极导线被收集到一个基座连接器中,用骨水泥固定到位。连续视频/EEG 录音在 TBI 后最多收集 4 周。
Introduction
在2015年提交国会的一份报告中,疾病控制中心报告说,美国每年约有250万人遭受创伤性脑损伤(TBI)。据估计,TBI导致20%的症状性癫痫和5%的所有癫痫2,3,4。此外,约20%的TBI患者发展创伤后癫痫5。重要的是,由于TBI而发生的慢性、复发性发作通常具有药物耐药性,增加了疾病6的负担。导致创伤后癫痫(PTE)的确切机制仍不清楚。然而,一些关键的流行病学研究已经检查了发展创伤后癫痫(PTE)2、4、7、8、9的发生率和潜在风险,10,11.这些流行病学研究都加强了损伤严重程度与癫痫发生风险的相关性。
目前被广泛用于识别新型抗癫痫疗法的方法,在很大程度上依赖于使用化学抽搐或电点燃诱导癫痫的模型。鉴于TBI患者在这些模型中开发的药物耐药性发生率很高,我们假设TBI引起的癫痫发作可能与化疗性惊厥或点燃引起的癫痫发作不同,并且可能涉及不同的途径或过程。癫痫发生。因此,TBI模型可能更适合开发更有效的治疗,以防止创伤后癫痫发作。
TBI的流体打击伤害(FPI)模型已经使用了几十年,是研究TBI和PTE13、14、15、16、17的既定方法。18.然而,正如我们最近所检讨的,在实验室19、20中所报道的FPI方法有高度的变异性。实验室之间缺乏一致性,阻碍了临床前结果的可重复性,使结果的解释成为一项挑战。因此,对这类研究21、22、23、24的更大兴趣和努力进行了更大的协调。
为了进一步提高专注于研究创伤后癫痫发作的实验室之间的一致性和协调性,我们在此提供了我们的方法的详细方法。我们先前曾报告,在严重TBI20后六个星期内,抽搐发作的发生率为60%。现在,我们使用这种方法来监测开始受伤的大鼠,并持续跟踪它们,每天24小时长达4周。我们选择使用无线遥测系统,它具有多种优点。首先,老鼠能够自由移动他们的笼子,从而减少压力。第二,当老鼠充当地面时,信号噪声降低。此外,我们当前的系统采用加速度计,可检测所有三个平面(X、Y 和 Z)的快速运动,并有助于识别惊厥发作事件。最后,无线遥测系统允许更容易地管理大鼠,如补充盐水注射,称量和进行神经严重性评分,当大鼠被绑在系绳上时,这很复杂。但是,此方法也有几个限制。首先,一个同时记录多达8只大鼠的系统的初始成本可以在60,000美元左右。其次,电源受电池源的限制。这需要每天监控和更换电池。电池更换之间的所需时间可能受采样率的影响。但是,对于 1000 Hz 采样速率,电池通常每周更换一次。有限的电源还限制系统仅从四个 EEG 信号进行录制。最后,信号丢弃是有限的,但偶尔会发生。然而,这种方法提供了一个一致和可靠的方法来监测创伤后癫痫发作,并有助于确定新的治疗方法。
Protocol
所有程序都得到布法罗大学机构动物护理和使用委员会的批准并遵循其指导方针。
1. 流体打击伤害
- 穿实验室外套或手术服、外科口罩、手术手套、头部覆盖物,并消毒与手术部位接触的所有工具和材料。
- 麻醉10-12周大,雄性,威斯塔大鼠(350-400克),3%的旋脱剂和1L/min氧气在适合大鼠大小的感应室。将大鼠从感应室中取出,一旦它失去知觉,将其移到准备区域。将无菌的眼科膏放入两只眼睛。
- 用电动剪子将毛发剪在老鼠头上,用#40刀片从眼睛上方到耳朵的刀底,以产生足够的手术场。从现场去除任何松散的、剪短的头发。
- 通过在剃光头皮上涂抹 2% 氯西丁砂洗,然后加入 70% 乙醇,清洁手术部位。从中心开始,在远离切口部位的同心圆中向外移动。重复此过程 3 次。以同样的方式将 Betadine 溶液应用到现场,并允许干燥。
- 将麻醉大鼠放入立体框架中,通过鼻塞酮将麻醉保持在2-3%异构-1 L/min氧气中。检查后肢的戒断反射损失和苍白反射的损失,以确保大鼠在麻醉的手术平面上。
- 在整个手术过程中监测呼吸速率、心率、体温和氧饱和度。将心率保持在 300-400 bpm 之间,SpO2保持在 90% 以上。
注:连接到后脚的脉搏血氧仪可用于提供恒定读取的心率和SpO2。心率超过400 bpm表示大鼠没有充分麻醉。自我调节的加热垫,与直肠温度计结合,设定在37°C,可以放置在大鼠下整个手术,以保持体温。带光源的立体显微镜与光纤灯相结合,有助于可视化过程。 - 使用 23 g 针头在切口前 10 - 15 分钟将盐酸盐酸注射到局部麻醉部位的头皮中。
- 使用#10手术刀通过头皮的皮肤和肌肉进行1.5-2.5厘米的中线切口。收回皮肤和肌肉,露出头骨,并提供一个清晰的手术场。用无菌棉签反射从骨骼中消失的底层筋膜和脂肪组织。
注: 电烧灼装置可用于实现快速到基。 - 使用手术固化器将左骨的侧脊下移,以产生光滑的平面,使雌性 Luer 锁轮毂的底座可以与头骨齐平地休息。
- 用2.0mg/mL的温霉菌溶液在无菌盐水中灌溉头骨表面和周围组织。用无菌拭子吸液的布解。
- 在头骨上涂抹3%过氧化氢以干燥骨骼。
注:如果骨骼不够干燥,牙科水泥将无法正确粘附并形成固体密封。 - 通过左骨创建一个直径为 5 mm 的颅骨切除部位。
注: 放置在连接到立体定向框架的电源钻中的颤音位有助于启动颅切除术。使用直径为 5 mm 的钻头,通过剩余的骨慢慢完成颅骨切除。当接近完成颅骨切除术时,反向旋转颤音,以防止底层的杜拉母体破裂。盘盘周围会变薄,轻轻按压时,头骨皮瓣会感觉松弛。 - 用手术固化器和光滑的组织钳子去除骨瓣。
注:可能会出现一些出血,但通过用无菌棉签施加温和压力可以迅速实现止血。 - 使用立体显微镜和照明来目视检查杜拉是否有任何破裂迹象。 颅骨切除部位的周长周围会留有一层薄薄的骨头。 用光滑的组织钳轻轻去除这个边缘,注意不要破裂杜拉。
- 用70%乙醇擦拭头骨,去除任何骨尘,干燥头骨。
- 在 Luer 锁轮毂的底部边缘周围涂抹一层薄薄的氰丙烯酸凝胶胶,并将其固定在颅骨切除术上,而不会妨碍开口。小心不要将胶水与杜拉接触。此外,在轮毂外侧底座周围用另一层薄薄的胶水将 Luer 锁固定到位。
- 准备一个牙科水泥浆。将水泥涂抹在 Luer 锁轮毂底座周围和头盖的头骨表面,将其固定到位。
- 使用注射器和针头向 Luer 锁轮毂注入无菌的不含防腐剂的人工脑脊髓液 (CSF) 溶液 (pH 7.4),以便在边缘顶部上方看到凸出的盐水。
注:当牙科水泥干燥时,溶液将保持杜拉湿润,并指示密封的完整性。如果溶液水平完全下降,则表示系统存在泄漏,必须拆下并更换 Luer 锁。 - 一旦牙科水泥完全固化,停止气体麻醉,并将大鼠从立体框架中取出。
- 将大鼠放在 FPI 设备旁边的平台上。
- FPI 器件具有一个弯曲的金属尖端,从储液罐末端的压力传感器延伸。将 12 厘米长的压力管固定在弯曲尖端的末端,并在 2 厘米公禄锁扭接连接器中端接另一端。通过将大鼠头骨上的中心线母端连接到雄性连接器,将大鼠固定到 FPI 设备。
注:确保连接牢固牢固,并且所有气泡均已从系统移除。 - 将动物置于胸腔中,并反复检查退退反射的返回。一旦大鼠恢复戒断反射,但仍镇静,释放FPI装置的钟摆,导致单个20ms压力脉冲并诱发损伤。
注:在动物被深度麻醉时,不要诱发损伤,这一点很重要,因为这往往会导致由于神经原性肺水肿而增加的死亡率。所有设备都显示可变性。然而,在用于此实验的装置上,锤的 17° 角度放置会产生 2.2 - 2.3 个大气压脉冲。没有受伤的假动物接受所有相同的程序,除了实际的流体脉冲诱导伤害。 - 受伤后立即断开大鼠与FPI装置的连接,将其置于胸腔回位,并通过鼻锥提供补充氧气(1升/分钟),直到自发呼吸恢复。呼吸暂停是受伤的预期后果。如有必要,通过袋阀面罩定期进行手动呼吸,直到大鼠开始自行自发呼吸。
注:通常,呼吸暂停持续不到 2 分钟。由于儿茶酚胺爆裂,在压力脉冲被给药后,立即观察到心率的瞬时快速上升(>500 bpm)。这可以通过连接到大鼠脚的脉搏血氧仪进行监测,并可以作为已发生严重伤害的可能指示器。 - 持续监测大鼠并记录右反射返回的时间(四肢稳定。
- 每只大鼠的大气压力脉冲大小应在± 0.05大气中。确认每个压力脉冲在示波器上产生平滑信号,振幅和持续时间一致。
注: 噪音信号可能表示系统中的气泡在传递伤害脉冲之前必须拆下。在这个实验中,产生严重伤害的大气压力脉冲通常会导致动物的纠正时间为30-60分钟。这一范围的纠正时间与死亡率约40-50%有关。 - 作为支持性护理,在皮下施用10 mL的预付盐水。
- 将大鼠返回到其家笼,让它至少恢复4小时。
注:当大鼠立即被置于麻醉下时,死亡率有所上升。
2. 皮质脑电图电极的植入和视频-EEG记录
- 受伤后4小时,如前所述对大鼠进行麻醉,并将其放回立体定向框架,以拆下Luer锁轮毂和牙科水泥。
注:轮毂和水泥很容易在中等压力下脱落。拆下轮毂时,请仔细检查杜拉是否有任何破裂或损坏。对杜拉造成破坏的任何动物进行即时安乐死。 - 在要钻孔5个导孔的每个位置,对头骨施加0.5%的盐酸乙酸乙烷(见图1)。
- 使用手持式 0.1 mm 钻头在头骨上钻孔。
- 将不锈钢电极螺钉固定到以下位置的每个导孔中:将参考螺钉固定在小脑上的羔羊上。记录电极被放置在:1)在半球的侧边和罗斯尔到颅切除术;2) 在半球的边边和胆管到颅切除术;3) 在半球对侧和罗斯尔到颅切除术;4) 在半球对边和胆对颅切除术。
- 用70%乙醇擦拭头骨,去除任何骨尘。
- 用一层薄薄的无菌骨蜡覆盖颅骨切除术部位,以覆盖暴露的杜拉。
- 将电极阵列连接到 5 个 EEG 电极,将彩色编码电极导线的外露端紧密地包裹在其指定的不锈钢电极螺钉上。
注:每根电极导线的两端位于底座连接器内的特定指定位置。 - 准备一块骨水泥浆。
- 将电极导线收集到底座下方的线圈中,用骨水泥将电线和底座固定到位。将底座固定在位置,直到骨水泥固化。
注:骨骼必须特别干燥,并且有任何残留的血液无效,以便获得适当的粘附,并防止过早去除变送器。 - 在将动物从立体定向框架中取出之前,将带有新电池的无线发射器连接到底座上。
- 将动物放在其家庭笼子里,并将笼子放在靠近接收器的位置,并放置在指定的摄像机中。启动视频/EEG 录制。
3. 视频-EEG录音的收集
- 在收集 EEG 信号之前,对将容纳大鼠进行 EEG 收集的房间进行频率扫描,以识别任何潜在的干扰频率,以防止收集具有背景噪声的任何频率的 EEG 记录。
- 将所有发射机设置为不受干扰的特定频率。
- 设置每个可编程变送器的采样频率和输入范围。
注:这可以使用系统制造商提供的智能工具完成。发射机的最大采样速率为 1000 Hz,最大输入范围为 ±10 mV。在本实验中,分析了0.5Hz至30Hz之间的脑电图录音。因此,采样率设置为 250 Hz。我们通常观察到小于 1 mV 的振幅。因此,设定的输入范围为 ±2 mV。 - 使用制造商提供的 EEG 收集软件连续录制视频-EEG,从受伤当天开始,通过独特的频率将每个无线发射器连接到特定接收器。
注:每个发射机接收器对能够监控4个单极EEG通道,以及X、Y和Z平面的加速度。EEG 数据可以写入存储服务器。视频数据应保存在链接到存储服务器的 NAS 设备上。EEG 分析软件根据存储服务器维护的时间同步视频和 EEG 录制。 - 使用视频收集软件使用自己的 2 MP 分辨率摄像机 (1920 x 1080) 录制每只大鼠的视频,该摄像机配置为以 30 帧/秒的速度录制。
注:每台摄像机都有自己的红外照明,用于在夜间进行视频采集。 - 将系统配置为每 24 小时自动将所有视频和 EEG 录像保存到存储服务器。视频产生相当大的文件。
4. 视频/EEG分析
- 以 1/10 的分辨率将视频与每个 EEG 录制同步。为此,使用系统制造商的视频/EEG 分析软件创建带有 EEG 和视频精确时间的标记的元文件。
- 手动筛选脑电图记录,以识别定义癫痫活动的索引事件。
- 使用视频/EEG 分析软件和索引 EEG 事件,创建使用关键参数(即特定频段的功率、频段与总功率的比率、加速度阈值等)来定义特征的配置文件潜在的癫痫发作事件。
- 运行 EEG 分析软件,根据配置文件中选择的参数识别符合资格的 EEG 记录的潜在区域。
注:EEG分析软件允许自动捕捉检测,并突出显示脑电图信号中感兴趣的区域,并提供跨信号的FFT功率谱分析。 - 使用采集过程中收集的视频记录确认潜在的抽搐发作,这些录像与每个大鼠各自的脑电图记录同步。
Representative Results
有了这个模型,我们诱导严重的TBI到成年,雄性,威斯塔大鼠。在我们在这里描述的条件下,我们通常观察到40-50%的死亡率,正确的反射时间为30-60分钟,如前面描述的20。从受伤当天开始,我们能够收集24小时/天的视频/脑电图录音。图 1A显示了四个单极脑电图电极和单个参考电极的位置。图1B-D显示了与此处描述的条件一起预期的TBI病变的位置和外观的图像。在此描述的条件下,我们始终观察到 TBI 后头三天内增量变慢。伤势较重的老鼠表现出单方面的、间歇性的三角洲减速(图2C-D)。相比之下,在更严重的伤害之后,观察到连续的双边三角洲减速(图3C-D)。所有TBI大鼠都持续观察到某种程度的三角洲减速,但在任何假手术(仅限颅切除术)对照大鼠中未检测到(图2A-B;3A-B)。在大多数TBI大鼠受伤后的头三天,持续观察到广泛的三角洲减缓。有趣的是,大鼠通常在受伤后的前三天明显减重。在TBI之后的第一周内偶尔观察到非惊厥性发作(图4C-D)。 临床癫痫发作,呈现为与饲养和下降以及前臂节节相关的尖峰簇,可在TBI后1周(图5C-D)后观察到。最后,图6显示了偶尔间歇性信号脱落和电池故障导致信号丢失等代表性图像。
图 1.颅内切除术、电极放置和病变的位置。(A) 显示了大鼠头骨的示意图,其中颅骨切除术的位置(左半球的灰色圆圈)、四个单极电极(黑点;1,2,3,4)位于布雷格玛和兰姆达之间,以及一个参考电极(黑点,R)放在中线,后到羔羊;(B) 显示冠状验尸T2 MRI扫描,由红圈识别病变的位置;(C) 显示皮层的二维图,其中确定病变的位置和大小(蓝色区域)。(D) 显示一个 Nissl 染色冠状部分与病变盒装, 病变是 100 倍放大的图像右侧.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.在中度 TBI 当天收集的单边、间歇性增量减速。(A) 显示了手术当天一只假手术、未受伤的对照鼠的90s EEG痕迹。所有四个通道都呈现。从第三个通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化基线 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(B) FFT分析2048 ms选择EPOC从未受伤的假手术动物在手术当天。(C) 显示了 90 s EEG 轨迹,显示了受伤动物在受伤当天的间歇性、单方面增量减速模式。从第三通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化增量减速 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(D) FFT 分析 2048 ms 从受伤的当天从中度 TBI 动物中选择 EPOC。90s EEG追踪,从上到下是生物电位1,2,3,4,对应于它们的位置周围的颅骨切除部位如图1所示。灰色垂直标记在 EEG 曲线上定义 1 秒间隔。所有脑电图跟踪均以 ±500 μV 的比例显示。 在 FFT 分析图中,总体分析频率范围为 0.5-30 Hz。这进一步细分为 4 个单独的频段的 Delta (黄色, 0.5-4 Hz), Theta (紫色, 4-8 Hz), 阿尔法 (红色, 8-12 Hz) 和 Beta (绿色, 12-30 Hz). FFT 分析中显示的% (功率) 图可说明所分析的 EPOC 中总功率的百分比来自每个先前指定的频段,从而进一步实现 EEG 波形模式的数学特征。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.在严重 TBI 当天收集的双边连续增量减速。(A) 显示了手术当天一只假手术、未受伤的对照鼠的90s EEG痕迹。所有四个通道都呈现。 从第三个通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化基线 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(B) FFT分析2048 ms选择EPOC从未受伤的假手术动物在手术当天。(C) 显示了 90 s EEG 的痕迹,显示了受伤动物在受伤当天的连续、双边三角洲减速模式。 从第三通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化增量减速 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(D) FFT 分析 2048 ms 从受伤当天从严重 TBI 动物中选择 EPOC。90s EEG追踪,从上到下是生物电位1,2,3,4,对应于它们的位置周围的颅骨切除部位如图1所示。灰色垂直标记在 EEG 曲线上定义 1 秒间隔。所有脑电图跟踪均以 (± 500 μV) 的比例显示。 在 FFT 分析图中,总体分析频率范围为 0.5-30 Hz。 这进一步细分为 4 个单独的频段的 Delta (黄色, 0.5-4 Hz), Theta (紫色, 4-8 Hz), 阿尔法 (红色, 8-12 Hz) 和 Beta (绿色, 12-30 Hz).FFT 分析中显示的% (功率) 图可说明所分析的 EPOC 中总功率的百分比来自每个先前指定的频段,从而进一步实现 EEG 波形模式的数学特征。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.严重TBI后3天收集非惊厥电图发作。(A) 显示90s EEG痕迹从假手术,未受伤的控制大鼠3天25手术后。所有四个通道都呈现。从第三个通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化基线 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(B) FFT分析2048 ms选择EPOC从未受伤的假手术动物在手术后的第三天25。(C) 显示 90 s EEG 跟踪后严重受伤后25天。 这显示建筑,快速尖峰模式呈现双边和跨所有4个收集渠道。 从第三通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化尖峰 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(D) FFT 分析 2048 ms 从受伤当天从严重 TBI 动物中选择 EPOC。 90s EEG追踪,从上到下是生物电位1,2,3,4,对应于它们的位置周围的颅骨切除部位如图1所示。灰色垂直标记在 EEG 曲线上定义 1 秒间隔。所有脑电图跟踪均以 (± 500 μV) 的比例显示。 在 FFT 分析图中,总体分析频率范围为 0.5-30 Hz。 这进一步细分为 4 个单独的频段的 Delta (黄色, 0.5-4 Hz), Theta (紫色, 4-8 Hz), 阿尔法 (红色, 8-12 Hz) 和 Beta (绿色, 12-30 Hz). FFT 分析中显示的% (功率) 图可说明所分析的 EPOC 中总功率的百分比来自每个先前指定的频段,从而进一步实现 EEG 波形模式的数学特征。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.惊厥电图发作收集9天后TBI。(A) 显示90s EEG痕迹从假手术,未受伤的控制大鼠9(9)手术后9天。所有四个通道都呈现。从第三个通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化基线 EEG 模式。然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(B) FFT分析2048 ms选择EPOC从未受伤的假手术动物在手术后的第九天(9)选择EPOC。(C) 显示严重伤害后 90 s EEG 跟踪九 (9) 天。这显示建筑,快速尖峰模式呈现双边和跨所有4个收集渠道。从第三通道提取了 10 s 长的轨迹(取自盒装区域),以便更好地可视化尖峰 EEG 模式。 然后选择2048 ms EPOC 部分在相应的 FFT 中进行分析。(D) FFT 分析 2048 ms 从严重的 TBI 动物 9 (9) 受伤后选择 EPOC。90s EEG追踪,从上到下是生物电位1,2,3,4,对应于它们的位置周围的颅骨切除部位如图1所示。灰色垂直标记在 EEG 曲线上定义 1 秒间隔。所有脑电图跟踪均以 (± 500 μV) 的比例显示。在 FFT 分析图中,总体分析频率范围为 0.5-30 Hz。这进一步细分为 4 个单独的频段的 Delta (黄色, 0.5-4 Hz), Theta (紫色, 4-8 Hz), 阿尔法 (红色, 8-12 Hz) 和 Beta (绿色, 12-30 Hz). FFT 分析中显示的%(功率)图可说明所分析的 EPOC 中总功率的百分比来自每个先前指定的频段,从而进一步实现 EEG 波形模式的数学特征。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6.信号退出。这是 3 个单独的示例,说明由于发射机或接收器问题导致的信号丢弃,如 EEG 记录所示。(A) 这是录音中脑电图信号间歇性下降的例子. (B) 这是连续无线遥测期间因电池故障而退出的示例,如 EEG 跟踪所示。 (C) 在圆区域内,可以看到当信号质量 (QoS) 从 100 下降到 0 时,EEG 跟踪在 0 μV 处变得扁平和停滞。 灰色垂直标记在 EEG 曲线上定义 1 秒间隔。所有脑电图跟踪均以 (± 500 μV) 的比例显示。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
据报道,实验室之间在FPI TBI模型14、26、27、28的具体参数和方法方面差异很大。这些不一致的结果相互矛盾,使得实验室之间难以协调努力和结果。在这里,我们提出了一个详细的方法,描述了我们的方法,长期,连续记录视频/EEG,以监测创伤后癫痫形成活动。使用所述方法生成可重现结果需要执行许多步骤。
首先,鉴于创伤后癫痫的发生率与损伤严重程度相关,应用导致最严重TBI的条件。具体来说,使用5毫米颅切除术,以确保暴露足够大的杜拉面积。此外,将一个雌性Luer锁装置固定在颅骨表面,开口直接放在颅骨切除术上。这不同于其他实验室,它们使用了较小的颅骨切除术(3 mm)和/或将一个经过修改的针轮毂放在颅内切除,这有效地减小了开口尺寸。通过将 Luer 锁放在颅骨切除外,保持 5mm 开口。这些特定参数会影响应用于 dura 的整体力。施加在杜拉身上的大气压力对观察到的伤害严重程度也有重大影响。不幸的是,大气压力是高度可变的,并且似乎与设备相关。一些实验室已经报告应用了8-10毫秒的压力脉冲。相反,此处描述的方法会产生 20 ms 的压力脉冲。这与似乎产生更严重的伤害14,28的其他实验室一致。很显然,损伤诱导压力脉冲是一个参数,它显示了实验室之间的相当大的变异性,并且必须根据经验进行定义。然而,伤害的严重程度可以根据死亡率(40-50%),正确的反射时间(>30分钟)26的组合来确定。研究中只包括具有完整杜拉的动物,这一点也至关重要。此外,如果颅骨切除术被任何胶水或水泥遮挡,使颅内切除术下的杜拉部分没有暴露在流体压力脉冲的全部力下,那么动物就应该从研究中消除。 此外,Luer 锁下的多余胶水可以粘附在 Dura 上,并在成功受伤后用水泥盖将其取出。 最后,示波器曲线上压力脉冲曲线的平滑形状指示流体室中没有气泡,并指示柱塞在没有阻抗的情况下移动。
麻醉是另一个必须控制的关键因素。非二苯暴露应保持在尽可能低的水平,以保持麻醉的手术平面。暴露于较高浓度的异曲兰或持续时间长的老鼠更有可能出现神经原性肺水肿。头骨的制备是该方法的另一个关键方面。特别是,干燥头骨和去除任何骨尘有助于防止大鼠过早去除发射器。
螺钉的放置和 EEG 导线的连接显然对于生成一致可重现的录音至关重要。重要的是,螺丝不要放置得太深,以引起大脑的病变。从成年(12周大)雄性威斯塔大鼠的颅切除术中恢复的骨皮瓣一致厚2毫米。使用带 2.5 mm 轴的 EEG 电极螺钉。使用弯曲的蚊子止血钳的尖端作为垫片,以确保螺钉只延伸到骨骼底部,并且不突出到大脑,这很有帮助。
此处介绍的方法确实有一些限制。必须定期更换电池。电池更换频率取决于采样率。电池通常每周更换一次,采样速率为 1000 Hz。可以通过降低采样速率来延长此时间范围。该系统还仅限于从四个单极 EEG 电极进行录制。但是,这提供了每个半球的两个通道,可以区分焦点和广义事件,并区分前变化和后变化。尽管存在这些限制,这种方法提供了一个合理的方法来进行连续的视频/EEG监测和检测严重TBI后的癫痫形成的变化。
此处描述的方法在 TBI 后一个月内导致电图和抽搐发作。因此,这种方法提供了一个合理的时间框架,在这项研究中研究潜在的治疗方法,以防止严重的TBI后发生癫痫。这种方法还提供了一种研究与PTE相关的分子机制的方法,并可能导致潜在的生物标志物的识别,这些生物标志物可用于识别最有可能开发PTE的患者。
Disclosures
Chelasea R Richardson 是 emka Science 的一名员工,该公司是描述此无线遥测系统的供应商。
Acknowledgments
我们要感谢保罗·德雷塞尔在图形设计和数字准备方面的宝贵支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
| 3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
| 4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
| 5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
| Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
| Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
| Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
| Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
| GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
| Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
| IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
| Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
| IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
| Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
| Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
| Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
| Povidone-iodine solution | Betadine | ||
| Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
| Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
| Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
| Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
| Synology Assistant | Synology Inc. | ||
| Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
| Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
| Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
| Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
| Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
| Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |
References
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