Summary
Descritto qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro.
Abstract
I microrganismi intestinali umani sono recentemente diventati un importante obiettivo di ricerca nella promozione della salute umana e nella prevenzione delle malattie. Di conseguenza, le indagini sulle interazioni tra endobiotici (ad esempio, farmaci e prebiotici) e microbiota intestinali sono diventate un importante argomento di ricerca. Tuttavia, gli esperimenti in vivo con volontari umani non sono ideali per tali studi a causa della bioetica e dei vincoli economici. Di conseguenza, sono stati utilizzati modelli animali per valutare queste interazioni in vivo. Tuttavia, gli studi sui modelli animali sono ancora limitati da considerazioni bioetica, oltre a diverse composizioni e diversità di microbiota negli animali rispetto all'uomo. Una strategia di ricerca alternativa è l'uso di esperimenti di fermentazione in batch che consentono di valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale in vitro. Per valutare questa strategia, gli esocriteri bifidobatterici (Bif) sono stati utilizzati come xenobiotici rappresentativi. Poi, le interazioni tra Bif EPS e microbiota intestinale umano sono state studiate utilizzando diversi metodi come la cromatografia a strato sottile (TLC), l'analisi compositiva della comunità batterica con il sequenziamento ad alto valore del gene rRNA 16S e la cromatografia a gas di acidi grassi a catena corta (SCFA). Presentato qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro. È importante sottolineare che questo protocollo può anche essere modificato per studiare le interazioni generali tra altri endobiotici e microbiota intestinali.
Introduction
Il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nel funzionamento dell'intestino umano e nella salute dell'ospite. Di conseguenza, il microbiota intestinale è recentemente diventato un importante obiettivo per la prevenzione delle malattie e la terapia1. Inoltre, i batteri intestinali interagiscono con le cellule intestinali dell'ospite e regolano i processi fondamentali dell'ospite, comprese le attività metaboliche, le disponibilità dei nutrienti, la modulazione del sistema immunitario e persino la funzione cerebrale e il processo decisionale2,3 . Gli endobiotici hanno un notevole potenziale per influenzare la composizione batterica e la diversità del microbiota intestinale. Così, le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano hanno attirato l'attenzione crescente della ricerca4,5,6,7,8,9.
È difficile valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani in vivo a causa della bioetica e dei vincoli economici. Ad esempio, gli esperimenti che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani non possono essere eseguiti senza il permesso della Food and Drug Administration, e il reclutamento di volontari è costoso. Di conseguenza, i modelli animali sono spesso utilizzati per tali indagini. Tuttavia, l'uso di modelli animali è limitato a causa di diverse composizioni di microbiota e diversità nelle comunità animali contro umane. Un metodo alternativo in vitro per esplorare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano è attraverso l'uso di esperimenti di coltura batch.
Gli esopolioaccaridi (EPS) sono prebiotici che contribuiscono in modo significativo al mantenimento della salute umana10. EPS distinti che consistono in diverse composizioni monosaccoridi e strutture possono presentare funzioni distinte. Le analisi precedenti hanno determinato la composizione degli EPS Bif, che sono la xenobiotica rappresentativa mirata nell'attuale studio11. Tuttavia, gli effetti metabolici associati all'ospite non sono stati considerati per quanto riguarda la composizione e la diversità dell'EPS.
Il protocollo qui descritto utilizza il microbiota fecale di 12 volontari per fermentare gli EPS Bif. La cromatografia a strato sottile (TLC), il sequenziamento ad alta velocità a livello rRNA 16S e la cromatografia a gas (GC) vengono quindi utilizzati in combinazione per studiare le interazioni tra EPS e microbiota intestinale umano. I vantaggi distinti di questo protocollo rispetto agli esperimenti in vivo sono il suo basso costo ed evitare gli effetti interferenti dal metabolismo dell'ospite. Inoltre, il protocollo descritto può essere utilizzato in altri studi che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico dell'Università di Scienza e Ingegneria dell'Università Hunan (Hunan, Cina), e dell'Università di Gongshang dello zhejiang.
1. Preparazione di batteri
- Preparazione del brodo medio bifidobacterium
- Unire i seguenti componenti in 950 mL di acqua distillata: estratto di carne, 5 g/L; estratto di lievito, 5 g/L; peptone di caseina, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucosio, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; soluzione sale, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); e resazurina, 0,4 mL (2,5 mg/L). Regolare il pH a 6,8 con 2 M NaOH.
- Autoclave a 121 gradi centigradi per 15 min e lasciare raffreddare il brodo a temperatura ambiente (RT) in condizioni anaerobiche (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Aggiungere cisteina-HCl sterilizzata dal filtro (0,5 g/L) e mupirocina (5 mg/L) al mezzo.
- Aggiungere un strato di Bifidobacterium longum congelato in un tubo di coltura con 5 mL di brodo medio bifidobacterium in condizioni anaerobiche, quindi coltura in un'incubatrice anaerobica per 24 h a 37 .
2. Preparazione di EPPS bifidobatterici
- Preparazione del PYG agar medium
- Combinare quanto segue: peptone, 20 g/L; estratto di lievito, 10 g/L; glucosio, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Regolare il pH a 7,2 utilizzando 10 M NaOH.
- Autoclave il supporto a 121 gradi centigradi per 15 min e raffreddare a 50 gradi centigradi. Quindi, per 1 L di media, aggiungere 0,5 mL di vitamina K1 soluzione sterilizzata a filtro (1 g di vitamina K1 disciolta in 99 mL del 99% di etanolo), 5 mL di soluzione di ememina (0,5 g di ememina sciolta in 1 mL di 1 mol/L NaOH , poi portato fino a 100 mL con acqua distillata), e 0,5 g di cisteina-HCl.
- Prima di versare le piastre PYG, aggiungere 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-3-d-galactopyranoside (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) e mupirocina (5 mg/L) al mezzo.
NOTA: X-Gal e LiCl.3H2O consentono l'identificazione di colonie B. longum su piastre tramite cambi di colorazione.
- Inoculare 20 l di ceppi B. longum (fase 1,2) a piastre di PAPAG e collocate in un'incubatrice anaerobica a 37 gradi centigradi per 72 h.
- Raccogli colonie batteriche mucoidi dalle placche PYG usando un misurino di pesatura, quindi risospendi completamente in 10 mL di salina tampone di fosfato (PBS) utilizzando un oscillatore di vortice.
NOTA: Le miscele batteriche ed EPS devono essere risospese completamente vortice o pipettando su e giù ripetutamente fino a quando le fibre non saranno completamente dissolte in PBS. - Centrifugare la sospensione a 6.000 x g per 5 min.
- Trasferire con attenzione i supernatanti in un nuovo tubo di centrifuga e mescolare completamente con tre volumi di etanolo freddo 99% per inversione ripetuta e miscelazione.
- Centrifugare la miscela a 6.000 x g per 5 min e rimuovere completamente i supernatanti.
- Rimuovere i precipitati dai tubi di centrifuga raschiando e asciugando gli estratti EPS durante la notte utilizzando un vuoto di velocità.
3. Preparazione del mezzo di fermentazione
- Preparazione della cultura di base medio VI
- Combinare quanto segue: peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; estratto di lievito, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; sali biliari n. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2s6H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4x 7H2O, 3,0 g/L; MnCl2x 4H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO4x 7H2O, 0,18 g/L; CaCl2x 2H2O, 0,1 g/L; NSO4X7H2O, 0,18 g/L; CuSO4X5H2O, 0,01 g/L; e NiCl2x 6H2O, 0,092 g/L. Regolare il pH a 6,5 con 1 M HCl.
- Preparare l'ememin e la cisteina come fatto nella sezione 2.1 e aggiungere dopo l'autoclaving e il raffreddamento.
- Preparare i mezzi di coltura che contengono diverse fonti di carbonio con un supporto di base VI. Prima di autoclaving, aggiungere 8 g/L di fibre EPS Bif al VI medio, comprendente il gruppo VI_Bif. Inoltre, aggiungete 8 g/L di amido al vi medio per rappresentare il gruppo VI_Starch. Infine, il VI medio senza aggiunta di una fonte di carbonio viene utilizzato come controllo (gruppo VI).
NOTA: Bif EPS e amido vengono prima sciolti in acqua calda utilizzando un agitatore magnetico, quindi mescolati con un mezzo VI preparato. - Autoclave tutti i supporti a 121 gradi centigradi per 15 min e lasciare raffreddare a RT.
- Trasferire un sottocampione (5 mL) di ciascun mezzo ai tubi di coltura in un'incubatrice anaerobica, e conservare i supporti rimanenti a 4 gradi centigradi.
4. Preparazione del campione fecale umano
- Raccogliere campioni fecali freschi immediatamente dopo la defecazione fresca da volontari umani adulti sani utilizzando contenitori feci, e successivamente utilizzare per la preparazione di liquami.
NOTA: Prima della raccolta dei campioni, tutti i volontari devono essere sottoposti a screening per garantire che non si rilevi la ricezione di antibiotici, probiotici o trattamenti prebiotici per almeno 3 mesi prima della donazione di campioni. Inoltre, tutti i donatori devono fornire un consenso scritto informato. - Trasferire un campione fecale fresco (1 g) a 10 mL di 0,1 M anaerobic a PBS (pH 7.0) in becher di vetro, quindi utilizzare aste di vetro per preparare un liquame 10% (w/v).
- Utilizzare un setaccio di 0,4 mM per filtrare i liquami fecali. Quindi, utilizzare un sottocampione del liquame filtrato per inoculare gli esperimenti di fermentazione della coltura batch e conservare il resto a -80 gradi centigradi per ulteriori analisi.
NOTA: i passaggi da 4.2 a 4.3 sono condotti in una camera anaerobica.
5. Fermentazione in vitro
- Aggiungere i liquami fecali filtrati (500) al mezzo di fermentazione preparato al punto 3.2 all'interno di una camera anaerobica, quindi incubare a 37 gradi centigradi.
- Raccogliere 2 mL di campioni fermentati a 24 h e 48 h nella camera anaerobica e quindi centrificare all'esterno della camera a 6.000 x g per 3 min.
- Trasferire con attenzione i supernatanti in un nuovo tubo di centrifuga che verrà utilizzato per l'analisi della degradazione del polisaccaride e le misurazioni degli acidi grassi a catena corta (SCFA).
- Conservare i pellet di centrifugazione a -80 gradi centigradi e successivamente utilizzare per l'estrazione del DNA genomico batterico.
6. Degradazione dell'EPS da microbiota fecale umano
- Caricare 0,2 l di supernatanti fermentati su piastre di alluminio in alluminio di silice gel-60 TLC pre-rivestite, quindi asciugare con un essiccatore di capelli.
- Sviluppare le piastre in 20 mL di una soluzione formica acid/n-butanol/water (6:4:1, v:v:v) e asciugare con un essiccatore di capelli.
- Immergere le piastre nel reagente orcinolo a colorare, quindi asciugare con un essiccatore di capelli.
- Preparare i reagenti orcinoli sciogliendo 900 mg di Lichenol in 25 mL di acqua distillata e aggiungendo quindi 375 mL di etanolo. Successivamente, l'acido solforico concentrato deve essere aggiunto lentamente e la soluzione deve essere accuratamente mescolata.
- Riscaldare le piastre a 120 gradi centigradi per 3 minuti in un forno da forno e valutare la degradazione dell'EPS misurando le bande TLC.
7. Effetti dell'EPS sul microbiota intestinale umano
- Congelare i campioni fecali originali preparati al punto 4.3 e i campioni fermentati preparati al punto 5.4.
- Estrarre il DNA genomico batterico (gDNA) da tutti i campioni utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico batterico delle feci seguendo le istruzioni del produttore.
- Determinare le concentrazioni, le integrazioni e le distribuzioni delle dimensioni del DNA utilizzando un micro-spettrofotometro e un'elettroforesi gel di agar.
- Condurre LA PCR dei geni di rRNA batterici 16S dal gDNA estratto utilizzando i seguenti primer forward e reverse precedentemente descritti12:
Primer -forward (primer con codice a barre 338F): ACTCCTACGGGCAGCA
-primer inverso (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Utilizzare le seguenti condizioni del ciclore termico:- 94 gradi centigradi per 5 min.
- 94 gradi centigradi per 30 s.
- 55 gradi centigradi per 30 s.
- 72 gradi centigradi per 1 min.
- Ripetere 2–4 per 35 cicli
- 72 gradi centigradi per 5 min.
- 4 C tenere fino alla rimozione dal ciclore termico.
- Condurre il sequenziamento ad alta velocità di produzione dei prodotti PCR presso un'azienda di sequenziamento del DNA utilizzando l'analisi della comunità microbica ad altissima produttività.
- Ottenere sequenze pulite e di alta qualità utilizzando il Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) sequence analysis pipeline13.
- Definire unità tassonomiche operative (OTU) per sequenze geniche di rRNA 16S con una somiglianza nucleotide superiore al 97% utilizzando strumenti bioinformatici come la suite software Mothur14.
- Scegliere una sequenza rappresentativa da ogni OTU e utilizzare il classificatore RDP insieme al database tassonomico SILVA per classificare le sequenze rappresentative15.
- Calcolare la copertura di Good, le metriche sulla diversità alfa (tra cui l'indice Simpson e Shannon) e la ricchezza (numero osservato di OCU) utilizzando gli strumenti bioinformatici16.
8. Effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA da microbiota intestinale umano
- Aggiungere i supernatanti fermentati (1 mL) preparati al punto da 5,3 a 2 mL dei tubi di centrifuga.
- Aggiungere 0,2 mL di 25% (w/v) acido metafosoreo a ciascuno dei campioni e mescolare accuratamente le soluzioni vortice.
- Centrifugare le miscele a 13.000 x g per 20 min e trasferire i supernatanti a tubi freschi.
- Concomitante, preparare soluzioni di 120 mM acetici, propionici, butirici, isobutirici, valerico e acidi isovalerici. Quindi, aggiungere 1 mL di ogni acido preparato a 1,2 mL di 25% (w/v) acido metafosorica e utilizzare come cocktail standard.
- Filtrare i campioni utilizzando una membrana di 0,22 M.
- Rilevare le concentrazioni di SCFA utilizzando la cromatografia a gas ad alte prestazioni secondo i protocolli descritti in precedenza11,17.
NOTA: una colonna InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 M) viene utilizzata per la cromatografia a gas (GC). Le concentrazioni di SCFA vengono quindi quantificate in base alle aree di picco utilizzando il metodo standard interno a punto singolo nel pacchetto software GC Solution.
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Representative Results
La produzione di Mucoid EPS potrebbe essere osservata nelle colture B. longum su piastre PYG dopo l'incubazione anaerobica per 72 h (Figura 1A). La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita da precipitazioni enole e essiccazione, ha portato alla raccolta di EPS simili alla cellulosa (Figura 1B). L'EPS essiccato e l'amido solubile sono stati poi utilizzati come fonti di carbonio per le colture di fermentazione. TLC è stato utilizzato per l'analisi di separazione e purezza dell'oligosaccaride grazie al suo basso costo e ai rapidi risultati di turnaround18. Sebbene il tasso di degradazione dell'amido da microbiota fecale umano fosse più veloce di quello di Bif EPS (Figura 2), la degradazione dell'EPS Bif è stata chiaramente osservata per alcuni campioni inoculati dall'EPS.
È stata quindi eseguita un'analisi compositiva comunitaria tramite il sequenziamento ad alto contenuto di velocità rRNA 16S e l'analisi delle coordinate principali (PCoA) per studiare gli effetti dell'ePS Bif sul microbiota intestinale umano. Campioni dei gruppi VI_Bif e VI_Starch raggruppati separatamente l'uno dall'altro nell'analisi PCoA (Figura3A), che indicano che l'EPS e la disponibilità dell'amido modellano in modo differenziale le comunità batteriche fecali umane. La dimensione dell'effetto di analisi discriminante lineare (LEfSe) è stata ulteriormente utilizzata per distinguere i taxa batterici specifici che differivano tra i trattamenti VI_Bif e VI_Starch. I generi Collinsella, Coprococcus, Parabacteroidese Rhodopseudomonas erano significativamente più abbondanti nei campioni VI_Bif rispetto ai campioni vi_Starch (Figura 3B). Inoltre, sono state effettuate misurazioni GC per diversi SCFA per valutare la loro produzione dopo l'aggiunta di diverse fonti di carbonio. Gli SCFA misurati dalle colture di fermentazione includevano acidi acetici, propionici, isobutirici, butirici, isovalerici e valerici. Dopo la fermentazione per 24 h e 48 h, cinque delle sei concentrazioni di SCFA di cui sopra erano simili tra i trattamenti e non statisticamente diverse tra i gruppi VI_Bif, VI_Starch e VI. Tuttavia, le concentrazioni di acidi propionici erano significativamente più elevate nel gruppo VI_Bif che nel gruppo VI_Starch (Figura 4).
Figura 1: EPS prodotto da B. longum.
Il congelato B. longum è stato restaurato nel brodo medio Bifidobacterium e poi striato sulle piastre PYG, seguito da incubazione anaerobica a 37 gradi centigradi per 72 h (A). L'EPS prodotto dalle colture batteriche è stato raschiato da colture di placche, precipitato con etanolo e asciugato durante la notte utilizzando un vuoto di velocità (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi TLC di EPS in vitro e degradazione dell'amido da microbiota intestinale umana.
L'analisi TLC è stata condotta su campioni di 0,2 ll raccolti a 24 h e 48 h da ogni coltura di fermentazione coltivata in condizioni anaerobiche. VI, VI_Starch, e VI_Bif indicano VI media, VI media - supplemento di amido, e VI media - supplemento EPS, rispettivamente. I numeri da 1 a 12 indicano campioni batterici fecali dei 12 volontari che sono stati utilizzati per inoculare gli esperimenti di fermentazione. Il gruppo di controllo rappresenta il trattamento senza integratori di carbonio aggiuntivi. Questa cifra è stata modificata da Yin et al. 11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti della disponibilità di EPS Bif sulle comunità di microbiota intestinali umani.
(A) Trama PCoA di dissimilizzali comunitari del microbiota intestinale in base alla metrica UniFrac non ponderata. (B) Analisi LEfSE di taxa batterici differenzialmente abbondanti tra i gruppi di trattamento. È stato utilizzato un limite di p < 0,05 per valutare la significatività statistica delle differenze tassonomiche batteriche tra i gruppi. Ori indica il microbiota intestinale dei campioni fecali volontari. VI_Bif e VI_Starch indicano il microbiota intestinale da campioni di fermentazione utilizzando supporti VI con EPS e amido come substrati di carbonio, rispettivamente. VI rappresenta il gruppo di controllo con fermentazioni inoculate in microbiota intestinale nei supporti VI senza completamento di altri carboidrati. Questa cifra è stata modificata da Yin et al. 11 Del sistema di Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti della disponibilità di EPS sulla produzione di SCFA dopo 24 h e 48 h di fermentazione.
Gli acidi aacetici, propionici, isobutici, butirici, isovalerici e valerici sono stati rilevati utilizzando la cromatografia a gas. VI_Bif, VI_Starch e VI indicano i campioni raccolti dopo la coltivazione utilizzando rispettivamente i supporti VI, EPS, VI media e VI. Tutti i campioni sono stati misurati in triplice copia. Le cifre sono state generate utilizzando GraphPad Prism Version 5.01. I pannelli rappresentano le concentrazioni di acido organico all'interno di ogni campione fermentato per A, acido acetico; B, acido propionico; C, acido isobutyrico; D, acido butilico; E, acido isovalerico; e F, acido valerico. Questa cifra è stata modificata da Yin et al.11Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sono stati compiuti progressi significativi verso la comprensione della composizione e delle attività del microbiota intestinale umano nell'ultimo decennio. Come conseguenza di questi studi, è emerso il concetto olobionte, che rappresenta le interazioni tra gli ospiti e le comunità microbiche associate, come tra gli esseri umani e il loro microbiota intestinale19,20. Inoltre, gli esseri umani sono ancora ora considerati come superorganismi21, in cui il microbiota intestinale sono stati riconosciuti come uno degli organi funzionali in esseri umani22,23. Il corpo umano ospita un complesso ecosistema microbico, costituito da circa 1013 cellule microbiche24. Inoltre, i genomi del microbiota intestinale sono considerati genomi ausiliari provenienti dagli esseri umani che codificano numerosi geni metabolici correlati che espandono le capacità metaboliche dell'ospite4. Tuttavia, gli xenobiotici, compresi i farmaci terapeutici e i composti bioattivi derivati dalla dieta, possono potenzialmente alterare la struttura della comunità del microbioma intestinale e le funzioni associate5. Un numero crescente di studi ha indicato che le interazioni tra microbiota intestinale e xenobiotica svolgono un ruolo importante nel mediare la tossicità chimica e causare, o altrimenti esacerbare, malattie umane6,7. Pertanto, le indagini sulle interazioni tra xenobiotici e microbiota intestinale umano hanno recentemente raccolto un'attenzione significativa nella ricerca.
I modelli murini sono stati i metodi più utilizzati per studiare le interazioni tra microbiota e ospiti. Tuttavia, le differenze nella composizione e nelle attività tra il microbiota intestinale degli esseri umani e dei topi25 possono portare a una modellazione inadeguata delle interazioni umane attraverso studi sui topi. Tuttavia, considerazioni di bioetica richiedono un uso minimo dei topi. Un'alternativa ai modelli in vivo di cui sopra è la fermentazione in batch, che può essere utilizzata per simulare il microbiota intestinale umano in vitro26. Di conseguenza, sono stati utilizzati esperimenti di fermentazione per studiare le interazioni tra xenobiotici e microbiota intestinale umano. Ad esempio, Yin et al. 17 hanno utilizzato esperimenti di fermentazione in batch per studiare le interazioni tra polisaccarides e microbiota intestinale umana. I risultati di questo studio indicano che alcuni polisaccauri possono essere metabolizzati dal microbiota intestinale umano, e che i polisacaridi modulano la comunità batterica umana e i metaboliti che producono in vitro, tra cui i SCFA. Tuttavia, alcune considerazioni metodologiche sono fondamentali per l'uso di questo protocollo. Ad esempio, i campioni fecali devono essere raccolti il prima possibile e dovrebbe essere utilizzata una camera anaerobica per garantire la crescita degli anaerobi obbligati. Quest'ultima considerazione è particolarmente critica, perché l'esposizione all'ossigeno può portare alla morte di alcune popolazioni batteriche intestinali e quindi, alterazione della comunità batterica. Inoltre, gli xenbiotici sono metabolizzati nel sistema digestivo superiore. Di conseguenza, modellare le interazioni tra xenobiotici e microbiota del sistema digestivo inferiore è una considerazione importante per la modellazione in vivo.
Gli esperimenti di fermentazione in lotti hanno chiari vantaggi rispetto agli studi sugli esseri umani e sugli animali in vivo perché sono più fattibili e convenienti dal punto di vista economico. Inoltre, possono essere utilizzati per studiare la variazione interindividuale delle risposte del microbiota intestinale umano all'esposizione xenobiotica. Inoltre, la fermentazione in batch può essere facilmente applicata per manipolare le comunità di microbiota e valutare le loro funzioni metaboliche associate. Tuttavia, i sistemi di fermentazione in batch soffrono della limitazione della dinamica dello stato statico. Le indagini future potrebbero implementare chemostati bioreattori che consentono la modulazione dinamica di pH, temperatura e peristalsi, pur mantenendo un apporto costante di nutrienti e la continua rimozione dei rifiuti. Tali attività consentirebbero agli esperimenti di imitare meglio i tratti intestinali in vivo e fornirebbe nuove informazioni per integrare quelli degli esperimenti di fermentazione in batch. Un'ulteriore limitazione degli esperimenti di fermentazione in batch è che rimuovono tutte le interazioni tra microbioma e tessuto ospite. Questa potrebbe essere una considerazione particolarmente importante, poiché alcuni xenbiotici (ad esempio, la metanfetamina) possono essere co-metabolizzati dalle cellule umane e dal microbiota intestinale27. Inoltre, studi recenti hanno indicato che il metagenome intestinale (GM) può disciplinare indirettamente il metabolismo xenobiotico regolando la regolazione dell'espressione genica dell'ospite8.
Anche se gli sviluppi dei sistemi di fermentazione in batch sono ancora necessari, questi sistemi possono essere ampiamente utilizzati per un'elevata produttività e uno screening rapido delle interazioni tra xenobiotici e microbiota intestinale umano. La spiegazione dei meccanismi alla base della resistenza xenoritica e del metabolismo nei microbiomi intestinali umani attivi fornirà importanti informazioni sulla variazione inspiegabile paziente-paziente dell'efficacia e della tossicità dei farmaci8,9. Inoltre, una comprensione più dettagliata di come le diete e i componenti alimentari specifici alterano il metabolismo microbico e di conseguenza effetto sulla salute dell'ospite è il primo passo verso la realizzazione dell'obiettivo della medicina personalizzata tramite la modulazione del microbiota.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Le cifre sono state citate in Yin et al. 11.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalla National Nature Science Foundation of China (n. 31741109), dalla Hunan Natural Science Foundation (n. 2018JJ3200), e dal programma di costruzione di disciplina caratteristica applicata presso l'Università Hunan di Scienza e Ingegneria. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
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