Summary
详细描述了临床相关的结肠直肠癌肝转移(CRLM)肿瘤模型以及肝缺血再灌注(I/R)对肿瘤生长和转移的影响。该模型可以帮助更好地了解手术诱导的肝脏转移生长促进机制。
Abstract
肝缺血和再灌注(I/R)损伤是一种常见的临床挑战,仍然是一个不可避免的病理生理学过程,已被证明诱导多个组织和器官损伤。尽管最近取得了进步和治疗方法,但总体发病率仍然不能令人满意,特别是在有潜在宫腔异常的患者中。在恶性肿瘤生长和转移的背景下,手术I/R被怀疑是调节肿瘤复发的促进剂。本文旨在描述一种临床相关的肝I/R和结肠直肠肝转移模型。在此过程中,我们旨在协助其他研究者建立和完善这一模型,为他们的日常研究实践,以更好地了解肝I/R对促进肝转移的影响。
Introduction
肝脏是转移性疾病发展的最常见部位之一。死亡率几乎无一例外地归因于与肝脏肿瘤生长相关的并发症。在肝脏转移性实体肿瘤患者中,手术仍然是疾病控制和可能的治疗方法的关键干预措施。然而,绝大多数患者最终都存在复发性疾病,主要在肝脏2,3。在肝手术中,术中出血很常见,经常需要输血和控制出血的不同技术方法,包括血管夹紧方法。然而,这种措施导致肝缺血/再灌注(I/R)到肝脏组织。I/R对肝细胞功能的不利影响已有详细记载。肝脏I/R侮辱通过炎症途径4恢复血流期间点燃炎症级联。肝I/R损伤不仅导致肝功能衰竭,而且目前的证据还表明,I/R损伤刺激肿瘤细胞粘附,促进转移形成发生率和现有微转移性疾病5的生长。我们以前曾报道过,手术应激诱导免疫细胞的活化,这不仅有助于原发性肿瘤的生长,而且通过捕获循环6中的癌细胞,促进转移。
在这里,我们详细描述了建立肝转移小鼠肿瘤模型的技术。在此模型中,我们还提出了一种诱导肝缺血再灌注损伤的方法,该方法在肝切除术期间临床上对临床上存在的手术应激作用。癌症注射和肝I/R的结合方法可以成功地解释原发性肿瘤切除患者CRLM的发展。
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Protocol
所有动物协议均获得机构动物护理和使用委员会的批准,并遵守国家卫生研究院 (NIH) 指南。用于任何外科手术的仪器都经过彻底消毒。
1. 初步准备
- 在将癌细胞注射到小鼠脾脏之前,高压灭菌和消毒所有在手术过程中使用的仪器。
- 消毒和/或高压灭菌加热垫、手术手套、纱布、剪刀对、小钳子、血管扩张器、手术钳和针架。
- 准备术后镇痛药(0.1毫克/千克丁丙诺啡),在脾切除术后每12小时服用2天。
2. 细胞培养
- 使用支原体 ELISA 试剂盒,确保癌细胞无支原体污染。
- 制备Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)的500 mL溶液,培养4°C培养基,用于小鼠结肠直肠癌细胞(MC38)。培养培养基应辅以10%热灭活胎儿牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、15 mM HEPES和200 mM的L-谷氨酰胺。
- 在无脱发酶和无RNA烧瓶(75 cm2)中培养癌细胞。在含有5%CO2的细胞/组织加湿培养箱中孵育细胞培养。将温度保持在37°C。
- 一旦增殖细胞达到90-100%的汇合,吸出旧介质,用1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞,然后用1x胰蛋白酶(0.25%)处理它们从烧瓶中分离细胞。
- 在15mL锥形管中收集细胞,在700 x g下收集5分钟。
- 通过重复离心吸气吸气介质,用 1x PBS 洗涤两次。
- 继续通过染色细胞与锥蓝色染色 (0.4%) 确认细胞的生存能力。
- 在1xPBS中将细胞重新悬浮到1 x 106细胞/100μL的浓度。彻底移管细胞,以避免任何团块。注射前将癌细胞放在冰上。
3. 注射肿瘤细胞
- 使用1 mL 25 G(0.5毫米x16毫米)针头注射氯胺酮(150毫克/千克)和木拉津(12毫克/千克)内针,麻醉8~12周大雄性(C57BL6)小鼠。
- 使用剪子切割小鼠的腹部皮肤,以避免任何术后感染。
- 将鼠标放在磁性固定器回缩系统上。通过捏一脚趾或尾巴,确认小鼠完全处于麻醉作用下。
- 在眼睛中加入盐水滴,以避免在手术过程中干燥。
- 擦洗性多酮碘溶液 (7.5%)到被割过的腹壁,在进行手术切口之前对皮肤进行消毒。
- 最初用齿钳抬起皮肤,并在手术剪刀的帮助下进行中线切口。然后,抬起腹部肌肉和腹膜,创建一个约3厘米长的中线切口(腹中到西风叶过程,以暴露腹部内容物。小心不要将切口延伸到西波德过程之外,以避免大量出血。
- 将节位放在切口的两侧和西波德工艺下。向下拉尾巴并绑住腹部,伸展腹部。使用 6 英寸无菌棉尖施用器将脾脏从胰腺脂肪组织中分离出来并暴露。
- 在注射到脾脏之前,涡旋癌细胞以避免任何细胞团块。
- 使用 0.5 mL 28 G (0.36 mm x 13 mm) 胰岛素注射器进行注射。避免气泡。
- 缓慢而小心地将100μL的细胞注射到脾脏的尖端。放置棉尖,并添加温和的压力,以避免回流到腹部区域。通过识别注射期间肝脏颜色的变化,可以观察到成功的注射。
- 用 1x PBS 润湿无菌纱布,并将其放置在解剖区域。
- 将小鼠转移到加热垫上15分钟,使癌细胞在系统内循环。
- 要继续手术缺血和再灌注损伤,请按照步骤5.3-5.10进行。
注:本程序旨在研究I/R诱导建立转移性病灶的效果。
4. 胸腔切除术
- 要进行切除,请使用手持式烧灼装置。小心地用光滑的钳子抬起脾脏,并烧灼脾血管,以避免过度出血。通过在烧焦部分的容器进行切除,切除脾脏。
- 立即遵循该过程,关闭在双层模式的切口,首先缝合肌肉层,然后皮肤。对腹壁和皮肤使用4-0聚丙烯缝合线。
- 在在另一种动物身上重复该程序之前,通过喷洒70%异丙醇或将其插入珠浴中来消毒所有仪器。
- 将老鼠放回原来的笼子里,寻找痛苦和手术后疼痛的迹象。
- 每12小时注射术后镇痛药(布丙诺啡0.1毫克/千克),2天,避免术后疼痛。
5. 缺血再灌注损伤
- 在第一次腹腔切除术后5天,使用1 mL 25 G(0.5毫米x16毫米)针头注射氯胺酮(150毫克/千克)和木兰素(12毫克/千克)对小鼠进行麻醉。按照步骤 3.3_3.4 操作。
- 擦洗性多酮碘溶液 (7.5%)在小鼠的被子腹部进行消毒,并执行中线腹腔切除术,如步骤 3.6 中所述。
- 使用两个湿润棉尖,轻轻地将肠道从腔中移入,以暴露相关结构,包括入口静脉。解剖肝脏,使周围组织无。
- 提起中间和左侧侧叶对隔膜。使用操作显微镜用弹簧剪刀解剖肝斜瓣,使四叶从左侧侧叶分离,以便清晰地看到入口三合结构。
- 在中位叶和右侧叶之间放置一个小湿棉拭子,以创造足够的夹紧空间。使用容器扩张器钳,小心地通过 10 厘米螺纹(4.0 聚丙烯缝合线)以提升入口三重体。使用带锁的微血管夹子放置微血管夹,将入口三重体(肝动脉、入口静脉和胆管)中的所有结构遮挡到左和中位肝叶。
- 如果叶未显示明显的发白,则通过拆卸和重新涂抹来重新调整夹子。
注:如果在重新调整夹子后,肝脏没有立即发白,请仔细考虑是否继续使用 I/R。 - 取出放置在中间和右侧侧叶之间的小棉签。轻轻地将肠道更换到腹腔中。用潮湿的纱布盖住腹壁(用1x PBS浸泡),用塑料包装盖住,以尽量减少蒸发损失。
- 将鼠标放在加热垫上,将夹子涂抹 60 分钟。
- 在整个缺血间隔期间,通过可视化右内侧和左内侧叶和侧叶的苍白发白来寻找缺血损伤的证据。
- 在 60 分钟周期后拆下夹子,启动再灌注。
注:通过中位和左侧叶的即时颜色变化,可以观察到再灌注的证据。 - 在重新灌注后,首先缝合肌肉层,然后缝合皮肤,用双层缝合图案关闭切口。在针架的帮助下使用 4-0 聚丙烯缝合线关闭腹壁和皮肤。
- 在在另一种动物身上重复该程序之前,请对所有仪器进行消毒,要么喷洒70%异丙醇,要么将它们插入加热的珠浴中。
- 将老鼠放回原来的笼子里,寻找痛苦和手术后疼痛的迹象。
- 每12小时注射术后镇痛药(0.1毫克/千克丁丙诺啡),2天,避免术后疼痛。
- 对于肝I/R假小鼠,进行腹腔切除术、腹腔切除和腹部缝合。
注:手术应力影响肝转移的建立的作用可以通过两种不同的实验设计来研究。上述方案(模型-1)用于建立微转移性肝病,并研究肝I/R对其生长的影响(图1A)。或者,肝I/R和肿瘤注射可以同时进行(模型-2),以研究I/R损伤在建立新的转移性发病中的影响(图1B)。为此,如上述,将癌细胞注入脾脏,使其循环15分钟。在循环期后进行肝I/R或假手术60分钟。60分钟后进行侧侧切除,然后关闭腹腔切除术切口。
6. 对操作小鼠的评估
- 在手术过程中,通过进行胸膜和角膜反射测试,确保小鼠处于III期麻醉的影响之下。额外的麻醉剂量必须给予反射的迹象。
- 手术后提供术后镇痛药(布丙诺啡0.1mg/kg),每12小时2天,以避免手术后疼痛。
- 让小鼠从麻醉中恢复时间30-60分钟。不断监测小鼠,在完全恢复之前不要让它们无人看管。
- 寻找痛苦的迹象,如驼背,闭眼,缓慢移动,和未能梳理。相应地处理,直到小鼠恢复正常活动。
- 提供包括液体、热量、木黄素逆转剂、软纸巾床上用品(避免吸入)在内的护理,在手术后应提供,以改善恢复期。
7. 肝缺血再灌注损伤的评估
- 应用夹子后,确保中位叶和左侧叶的苍白发白与乳酸叶和四叶相比发生。
- 通过测量血清丙氨酸转氨酶(sALT)、血清阿斯巴酸转氨酶(sAST)和血清乳酸脱氢酶(sLDH)水平,评估肝缺血损伤。血液可以从面部静脉中提取血清3-6小时后开始再灌注。执行肝脏信息学分析缺血叶内肿瘤面积百分比。
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Representative Results
使用上述方案,所有野生型(C57BL6)小鼠(n = 20)均接受肝脏转移模型。所有注射的小鼠有或没有缺血性再灌注损伤,直到牺牲日期。癌症注射肝脏的示意图图图图 1A说明了导致部分肝缺血(70%) 的入口三重体(肝动脉、入口静脉和胆管)的夹紧侮辱对中位数和左侧叶。在缺血再灌注损伤后2-3周内,可观察到肝转移次数的增加。注射MC38癌细胞的小鼠被随机分为假和I/R组。如图1B所示,第一组小鼠在癌症注射后15分钟进行切除。肝缺血再灌注手术在注射后5天进行。该模型允许循环癌细胞 (CC) 在器官内建立。图2A显示,手术压力显著增加肝脏内预先建立的微转移的量。第二组 (图 1C) 在癌症注射后 15 分钟进行手术 I/R.在施用后60分钟取出微血管夹,诱导再灌注。手术应激的并发影响(图2B)导致最近注射的癌细胞在肝脏内捕获,从而建立微转移性中心。这大大增加了肝脏中转移结节的数量。
图 1:实验设计的示意图表示。(A) 癌症注射肝脏的示意图说明了诱导部分(70%) 的门户三重(肝动脉、入口静脉和胆管)的夹紧肝缺血性侮辱对中位数和左侧叶。在重新灌注后的2-3周内,在缺血叶中观察到肝转移次数的增加。最初,小鼠在肿瘤捕获 (B ) 和肿瘤生长 (C) 模型中接受MC38 结肠直肠癌的静脉内注射.沙姆小鼠也进行腹腔切除术,没有应用微血管夹。I/R 后两到三周,小鼠被牺牲,肝脏组织被收获。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:注射鼠癌的小鼠代表性图像。(A) 肿瘤生长模型(模型-1)的代表性肝转移图像显示,与非I/R组相比,诱导肝I/R组后肝脏表面的肿瘤结节毛明显增加。(B) 同样,在肿瘤捕获模型(模型-2)的设置中,与非I/R组相比,在I/R组2周后,肝I/R显示肿瘤结节明显增加。*, P < 0.05.结果表示为均值 = 标准差。使用学生 t 测试 (n = 5/组) 进行组比较。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本手稿中描述的动物模型基于两种主要方法。第一是识别癌细胞在肝叶中局部化和增殖的能力。二是研究肝缺血再灌注损伤对肿瘤生长和转移的影响。该模型允许在免疫能力小鼠没有继发转移的情况下对肝脏转移进行相关研究。该模型有助于解决转移效率问题,如细胞存活外溢和增殖。
在第一个模型中,首先注射癌细胞,允许微转移性疾病形成。随后,5天后进行肝I/R。该模型在研究手术对已经确立的微转移性疾病的影响时非常重要。虽然成像在过去十年中有了显著改善,但仍有可能出现微转移性疾病,这种病可能无法通过成像检测,在计划进行肝脏切除后留下,以治愈治疗。这种残留的微观疾病受伴随手术的炎症变化的影响,特别是肝脏I/R,并且生长呈指数级增加。另一方面,在第二模型肝I/R和肿瘤注射同时进行。该模型侧重于肝I/R对循环癌细胞的影响和新的转移性病灶的建立。在肝脏手术过程中,肿瘤的操纵会释放肿瘤细胞进入循环。虽然大多数循环细胞由宿主的免疫监测处理,但一些细胞可以建立转移性中心。第二个模型旨在研究这一现象。
动物模型,如正交肝注射7和尾静脉注射8,在解剖学上可能不可行,这种研究。已经表明,尾静脉注射通常导致与肝脏相比,肺转移增加。正交注射癌模型增加了肝损伤的风险,影响肿瘤生长的微观环境。作为肿瘤脾水注射的替代方法,也可用于门户静脉。门户静脉注射在研究肝转移9,10,11中,已经是一个成熟的转移模型。与上述模型相比,通过门户静脉注射癌细胞不会损害脾脏的切除。这确实可以避免免疫后果。然而,在门户三合形液应用微血管夹期间或之后,门户静脉注射增加因静脉撕裂(在注射部位)和血栓形成而导致出血过度的风险。当肿瘤注射和夹紧在同一天进行时,这些风险呈指数级增加。我们小组已经执行了这两种方法,我们取得了类似的结果9,12。我们承认,门户静脉注射要求更高的技术技能,当同时进行夹紧,并与更高的并发症相关。这两种方法对研究肝脏转移都有效。
在整个过程之前和过程中,需要考虑许多重要方面。在注射前,将重新使用具有相同物种背景的癌细胞。在这项研究中,细胞数量也很重要,因为少量的细胞可能不足以在短时间内(3周)完成研究。应该避免增加癌细胞的数量,因为它可能导致栓塞效应,导致血栓形成和啮齿动物死亡。本手稿中描述的细胞浓度为 1 x 106的模型特定于 MC38 细胞系,使我们能够观察到手术缺血再灌注损伤刺激的肿瘤生长的显著差异。我们强烈建议根据所需的癌细胞兴趣线的特定实验尝试不同浓度的癌细胞。同样,在很多转移研究中,对癌细胞进行标记可能非常有用。这将提供有关能够播种和增殖的细胞的百分比的想法。此外,正确应用门夹诱导肝缺血损伤在模型中也非常重要。不能完全阻断血液流动可能导致对癌细胞的影响较小或没有影响。如方法所述,请务必确保在应用微血管夹后出现肝叶的发白。最后,通过烧灼正确凝固血管对于避免内出血至关重要。根据我们的经验,特别是使用电灼热,从脾床出血是极其罕见的,因为我们进行重复腹腔切除术后,只有5天后的第一次手术,粘附量是最小的。但是,如果遇到出血,这可能会导致更困难的第二次手术。如果出血确实发生在切除后,这可能表明循环癌细胞可能也植入了围肠腔,从而可能影响实验的结果。建议在处理此问题时谨慎使用,因为它可能会影响实验和结果。必须仔细考虑,以确定是否继续在这些小鼠的I/R。
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Disclosures
作者没有透露与这项工作有关的利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢萨拉·米内迈尔和亚历山大·科默奇对语言的修正。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
Cautry | Bovie | AA01 | |
Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
Clipper | Oster | 559A | |
Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
Ketamine | Putney | #056344 | |
Xylazine | NADA | #139-236 | |
ALT strip | Heska | 15809554 | |
AST strip | Heska | 15809542 | |
LDH strip | Heska | 15809607 |
References
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