Summary
在这里,我们提出了免疫表征表表征和细胞因子诱导分化脐带血衍生CD34-造血干细胞和祖细胞到四个骨髓系的方案。该协议的应用包括研究骨髓疾病突变或小分子对CD34+细胞骨髓分化的影响。
Abstract
人类造血干细胞的体外分化是研究造血干细胞的一个广泛应用的模型。此处描述的方案用于细胞因子诱导的CD34分化 -造血干细胞和祖细胞到四个骨髓体体细胞。CD34–细胞从人类脐带血中分离出来,在细胞因子存在的情况下与MS-5基质细胞共同培养。描述了干细胞和祖细胞的免疫表征特征,以及分化的骨髓体系细胞。使用该协议,CD34+细胞可以用小分子孵育,或用慢病毒转导,以表达骨髓疾病突变,以研究其对骨髓分化的影响。
Introduction
造血干细胞(HSCs)的正常分化对于维持所有血细胞系的生理水平至关重要。在分化期间,在协调响应细胞外线索(包括生长因子和细胞因子)时,HSCs 首先产生具有淋巴-骨髓电位1、2、3 的多能祖细胞 (MPP) 细胞 ,4 (图 1)。MpP 产生常见的骨髓祖体 (CmPs) 和常见的淋巴原代后代 (CLP) 受血统限制。CLP分化成由B、T和自然杀伤细胞组成的淋巴状谱系。CmPs 通过两个更受限的祖体群体(巨核细胞红细胞祖(MEPs)和粒细胞单细胞原代 (GMPs) 生成骨髓系。MEP产生巨核细胞和红细胞,而GMP产生粒细胞和单核细胞。除了通过CmPs产生,兆核细胞也报告直接产生于HC或早期的MpPs通过非规范途径5,6。
造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的特点是表面标记CD34和缺乏系系特异性标记(Lin-)。其他通常用于区分 HSC 和骨髓祖体群体的表面标记包括 CD38、CD45RA 和 CD123 2(图1)。HSC 和 Mp 分别为林-/CD34+/CD38-和林-/CD34+/CD38+。骨髓已提交祖细胞群体由CD45RA和CD123的存在或不存在区分。CmP 是林-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123 lo,GMP 是林-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo,MEP是林-/CD34|/CD38=/CD45RA-/CD123-.
CD34+干细胞和祖细胞的总数可以从人类脐带血 (UCB)、骨髓和外周血获得。CD34–细胞占人类UCB中单核细胞总数的0.02%至1.46%,而骨髓中细胞的百分比在0.5%至5.3%之间,在外周血7、8、9中,其比例要低得多,为±0.01%.UCB衍生CD34+细胞的增殖能力和分化潜力明显高于骨髓或外周血细胞1、10,为获得足够的材料用于分子分析,结合在分化期间对细胞进行免疫表征和形态表征。
脐带血衍生CD34+HSPCs的体外分化是研究正常造血和造血病机制的一种广泛应用模型。当用适当的细胞因子培养时,UCB CD34+ HSPC 可诱导沿骨髓或淋巴体谱11、12、13、14、15进行分化,16.在这里,我们描述了CD34和HSPCs从人类UCB分离和免疫表征表表征,以及它们分化为骨髓体代细胞的协议。这种培养系统基于在MS-5基质细胞存在的情况下,以细胞因子诱导的HSPCs分化,以模拟骨髓中的微环境。培养条件导致CD34+细胞的初始扩张,随后分化为表达四个骨髓系细胞标记的细胞,即粒细胞(CD66b)、单核细胞(CD14)、巨核细胞(CD41)和红细胞(CD235a)。CD34®细胞分化协议的应用包括控制造血的分子机制研究,以及研究骨髓疾病相关突变和小分子对自我更新和HSPC的差异化。
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Protocol
用于实验的人类脐带血是由健康人捐赠后,知情同意马里科帕综合卫生系统(MIHS),凤凰城。被除名的单位是通过MIHS和亚利桑那大学之间的材料转移协议获得的。
1. 试剂和缓冲液
注:在无菌条件下在生物安全柜中制备所有试剂和缓冲液。
- 通过加入7.2 mL的无菌35%牛血清白蛋白(BSA;使用无菌组织培养等级35%BSA)和5 mL无菌0.5M乙烯二胺四乙酸(EDTA)至487.8 mL无菌Dulbecco的磷酸盐缓冲液,制备无菌PBS-BSA-EDTA(PBE)缓冲液盐水 (DPBS)。过滤器将过滤器固定在生物安全柜中,将过滤器附在真空中至少2小时,从而对缓冲液进行灭菌和脱气。
- 准备 1x 汉克斯平衡盐溶液 (1x HBSS)。在 900 mL 的无菌蒸馏水中稀释 100 mL 的 100 mL HBSS 库存,使 1 L 的 1x HBSS,并将 pHH 调整到 7.2。过滤器在使用前对1x HBSS进行消毒。
- 在98 mL蒸馏水中加入2 mL的冰川醋酸,制备2%醋酸溶液。
- 在1xPBS中制备20纳克/mL重组人纤维素片段溶液。每 48 孔板生产 10 mL。
- 准备 2% BSA。至100 mL 1x PBS,在使用前加入2克BSA分数V.过滤器消毒。
- 将 DMEM 粉末、3.7 gm 碳酸氢钠、100 mL 胎儿牛血清 (FBS) 和 5 mL 青霉素-链霉素 (PS) 添加到 800 mL 的无菌蒸馏水中,制成完整的 Dulbeco 改性鹰培养基 (DMEM)。混合和将体积混入1L,并在使用前过滤消毒。
- 通过混合 90 mL 的 FBS 和 10 mL 的无菌二甲基亚硫酸盐 (DMSO) 制备冷冻介质。
- 准备刺激培养基。在无血清介质中,将L-谷氨酰胺添加到2 mM,将细胞因子添加到干细胞因子(SCF)、血栓波霉素(TPO)和Fms类酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的最终浓度为50纳克/mL(参见材料表)用于制备细胞因子库存溶液)。每 48 孔板生产 5 mL。
- 准备1x骨髓分化培养基。要完成DMEM,将细胞因子添加到SCF、Flt3L和IL3的最终浓度5纳克/mL中,为TPO添加50纳克/mL,为红细胞生成素(EPO)添加4单位/mL。每 48 孔板生产 5 mL。
- 准备2x骨髓分化培养基。要完成 DMEM,将细胞因子添加到 SCF、Flt3L 和 IL3 的最终浓度 10 纳克/mL 中,为 TPO 添加 100 纳克/mL,为 EPO 添加 8 个单位/mL。每 48 孔板生产 5 mL。
- 准备流式细胞学缓冲液。到 1 l 的 1x PBS 中,添加 10 g BSA 分数 V。
- 在 1x PBS 中制备 1% 的甲醛(详情请参阅材料表)。
- 通过将 500 μL 的 10 mg/mL 多L-莱辛添加到 49.5 mL 的 1x PBS 中制备聚L-莱辛溶液。
2. 从脐带血分离单核细胞
注:对于下述协议,使用90至100 mL的脐带血量。CD34+细胞的分离必须在生物安全柜的无菌条件下进行。
- 用 70% 乙醇喷洒含有 UCB 的袋子,在将其引入生物安全柜之前对外表面进行消毒。将 UCB 转移到无菌 250 mL 塑料瓶中,并通过添加同等体积的室温 (RT) 1x HBSS 将其稀释 1:1。
- 将15 mL的MNC分馏介质(MFM;见材料表)放入大约6个无菌50 mL锥形管中。用 MFM 倾斜管,将 30 mL 的稀释 UCB 轻轻倒入 MFM 层,而不会干扰它。
- 在 RT 下,在 400 x g下将管离心 30 分钟,速度缓慢且无制动器。
- 离心后,在MNC层上方的等离子体15-20 mL之间吸气。用移液器轻轻收集 MN,并转移到新的 50 mL 锥形管中。
注:MNIC在血浆和MFM的界面上沉积为白色布漆层,而红细胞(RBCs)沉积在锥形管的底部。 - 池 MNIC 从 2-3 管收集在一起。使用冷PBE缓冲液将每根管的体积组成至50 mL。
- 在 4°C 下将管在 300 x g下离心 10 分钟,制动器处于低位。
- 吸气上清液,轻轻敲击管以松开细胞颗粒。
- 在5 mL的冰冷PBE缓冲液中重新悬浮颗粒细胞。使用相同的5 mL的重新悬浮细胞从其他管收集细胞。将3至4个管的细胞结合在一个50 mL锥形管中。
- 要收集任何剩余的细胞,用5 mL的冷PBE缓冲液清洗所有管,并加入50 mL锥形管。
- 通过将 10 μL 的细胞悬浮液稀释到 490 μL 醋酸溶液中,对 MMC 进行计数。
注:醋酸可使任何污染的RBC都发生,从而更容易地计算MN。 - 使用冰冷的PBE缓冲液将电池悬浮液的体积组成为50 mL。在 4°C 下以 300 x g将细胞离心 10 分钟,制动器处于低位。
注:MNC 悬浮液可立即处理,以便分离 CD34+细胞,或为以后的应用进行冷冻。 - 要冻结 MNIC,请去除上清液,并在RT的冷冻培养基中以2 x 107细胞/mL的密度重新悬浮。
- 在-80°C的细胞冷冻容器中过夜,然后将其转移到液氮中。
3. CD34的分离+从单核细胞中分离的细胞
- 如果使用新隔离的跨国公司,则直接转到步骤 3.3。
- 如果使用冷冻MNC,在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞,并转移到50 mL锥形管中。用1 mL的冰冷的PBE缓冲液收集小瓶中剩余的任何细胞,并转移到50 mL锥形管中。
- 使用冷PBE缓冲液将MNC悬浮液的体积组成至50 mL,并在4°C下以600 x g离心5分钟。
- 取出上清液,轻轻敲击管以松开细胞颗粒。在300μL的冰冷的PBE缓冲液中,将MMC重新悬浮到1 x 108个细胞。
- 从磁性活细胞分拣 (MACS) 人 CD34 微珠试剂盒中每 1 x 108 MNC 加入 100 μL FcR 阻断试剂,并轻轻混合。
注:这阻止与CD34微珠的非特异性结合。 - 每1 x108细胞加入100μL的CD34微珠。轻轻混合,在4°C下在冰箱中孵育30分钟。不要在冰上孵育。
- 孵化时,在MACS分离器磁场中放置LS柱和预分离滤波器。将 2 mL 直接添加到柱中,在预分离滤波器中将 2 mL 直接添加到柱中,用冰冷的 PBE 缓冲液对柱进行平衡。允许柱排入 15 mL 锥形管中,并丢弃流过。
- 从 4°C 中取出 MMC,加入冰冷的 PBE 缓冲液,将体积补至 15 mL,并在 4°C 下以 300 x g将细胞离心 10 分钟,制动器处于低位。
- 吸出上清液,在1mL的冰冷的PBE缓冲液中重新悬浮细胞。
- 将电池悬浮液添加到放置在 LS 列上的预分离过滤器。
注:预分离过滤器将删除任何可能阻塞列的大型单元聚合。 - 用 3 mL 的冷型 PBE 缓冲液冲洗管,并将其添加到放置在 LS 柱上的预分离过滤器中。在此之后,丢弃预分离过滤器。
- 通过添加 3 mL 的冷型 PBE 缓冲液,将 LS 柱洗涤四次,使该柱每次排空。
注:CD34+单元格将保持绑定到列,未标记的单元格将流经该列。 - 最后洗涤后,从 MACS 分离器磁场中取出柱,并将其放入新的 15 mL 锥形管中,远离磁铁。
- 向柱塞添加 5 mL 冷冷 PBE 缓冲液,并通过在柱塞中用力推出绑定的 CD34+细胞。
- 或者,将从第一列分离的 CD34+单元通过另一个 LS 列,使用上述预分离滤波器(步骤 3.10_3.13)。
- 计数分离的CD34+具有锥蓝色(10 μL细胞和10μL的试青)的细胞,以确定活细胞的总数。
注:在此阶段,分离的CD34+细胞可冷冻供日后使用,或可直接处理,通过流式细胞测定(第4节)或用于对骨髓谱系细胞的分化(第5节)分析HSPCs。 - 在 RT 下将电池悬架在 600 x g下离心 5 分钟,制动器处于低位。
- 要冻结CD34+细胞,吸出上清液,在1mL的冷冻培养基中重新悬浮至5 x 106个细胞,并如上文所述冻结(步骤2.13)。否则,继续执行第 4 或第 5 节。
4. 通过流动细胞测定测定干细胞和祖细胞种群
- 要确定新鲜分离的CD34+ HSPC中茎和祖体群的分量,将其在600 x g下离心5分钟,并在50μL流式细胞学缓冲液中重新悬浮1 x 106个细胞。
- 至 1 x 106 CD34+细胞,向系界线标记(CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19 和 CD235a ) 添加抗体(用于稀释的材料表) - 所有 FITC 标签)、CD34(APC-Cy7)、CD38(PE)、CD45RA (PE-Cy7)、CD123 (APC) 和 7氨基霉素D(7-AAD;作为活/死污渍),并组成总体积至100μL。在黑暗中在冰上孵育20分钟。
注:分析可使用少于 1 x 106 CD34+细胞。如果染色较少的细胞,总体积和添加的抗体量应相应减少。对于流式细胞学分析,应使用无染色和单染色 MFC 作为控制,用于为每个荧光团设置正极和负极。 - 孵育后,用1mL流动细胞学缓冲液清洗细胞,并在600 x g下离心5分钟。
- 可选择在 RT 的黑暗中将染色细胞固定在 0.5 mL 的 1% 甲醛溶液中 10 分钟。
- 在 600 x g下离心 5 分钟,吸出上清液。
- 用1 mL的流式细胞测量缓冲液清洗固定/染色细胞,在600 x g下在4°C下离心5分钟。
- 吸出上清液,在500μL的流式细胞测定缓冲液中重新悬浮细胞,并通过流动细胞仪(材料表)进行分析。
5. CD34的骨髓分化–造血干细胞和祖细胞
注:为了将CD34+HSPCs与骨髓体系细胞区分开来,首先在重组的人类纤维素片段涂层板中刺激它们,然后在骨髓分化培养基培养基培养基的MS-5基质细胞层上播种。根据四系骨髓系特有的细胞表面标记的表达,每周可以监测分化3周。在刺激和分化期间,所有孵育在37°C和5%CO2在加湿室中进行。所有步骤都应在生物安全柜中执行。
- 在 RT 处将 200 μL/孔重组人纤维素溶液加入 1x PBS 2 小时,在无涂层 48 孔板中涂覆孔。
- 2小时后,小心地取出重组的人类纤维化溶液并丢弃。
- 在 RT 处用 200 μL/2% BSA 的井块井 30 分钟。
- 吸气BSA溶液,用500μL无菌1xPBS洗井两次。
注:纤维素片段涂层板可在4°C下储存长达2周。 - 要刺激CD34+ HSPCs,在1 x 105细胞/200μL或5 x 105细胞/mL的温热1x刺激培养基的密度下,重新悬浮新分离的细胞(从步骤3.17开始)。
- 如果使用冷冻CD34+细胞,快速解冻,并将细胞转移到含有温暖完整的DMEM的15 mL锥形管中。在 600 x g下离心 5 分钟,然后重新悬浮步骤 5.5 中所述的细胞。
- CD34的板200 μL=纤维素片段每孔细胞悬浮液涂覆48孔板,孵育48小时。
- 第二天,种子15,000 MS-5基质细胞在200μL的完整DMEM每孔48孔组织培养处理板和孵育在37°C24小时。
- 经过48小时的刺激后,通过温和的移液收集CD34+细胞。用500 μL的温DMEM清洗水井,用细胞悬架清洗水池。
- 用锥蓝色计算单元格。将悬浮液在600 x g下离心5分钟,并在密度为5,000细胞/200μL的1x骨髓分化培养基下重新悬浮。
- 从48孔组织培养板播种与MS-5基质细胞,轻轻地吸出培养基,而不会干扰细胞。CD34 的200μL层(5,000个细胞)= 板每孔细胞悬浮液,在37°C下孵育。
注:MS-5细胞的培养可以在完整的DMEM中保持。在CD34+细胞播种的当天,MS-5细胞必须处于均匀的层(80-90%汇合)。建议在CD34+细胞播种前至少24小时对MS-5细胞进行镀层。 如果在CD34+细胞播种前,MS-5细胞要镀48小时或72小时,则应相应地调整细胞密度。还建议48孔板的外围井留空或填充200μL的无菌水,以避免边缘效应。 - 每 3⁄4 天执行半介质变化,从每口井顶部轻轻去除 100 μL 的介质,并用每口井 100 μL 的 2x 骨髓分化介质替换。
- 在第21天,收获细胞,通过流细胞测定分析骨髓谱系标记表达。在不干扰 MS-5 层的情况下,轻轻移液介质并将细胞转移到 5 mL 管中。
注:对于染色和流式细胞学分析,1-2口井的细胞就足够了。第 1 天、第 7 天和第 14 天也可能监测差异。如果在多日内进行免疫分体,则应相应地计算分析所需的井数。 - 染色5 x105细胞,抗体对CD34(APC-Cy7)、CD66b(PE-Cy7)、CD14(PE)、CD41(PerCP-Cy5.5)和CD235a(APC),总体积为50μL。在黑暗中在冰上孵育20分钟。包括未染色和单染色的MNIC作为设置控制每个荧光酸的正门和负门,以及7-AAD作为活/死染色,从分析中消除死细胞。
- 如上所述,清洗和修复(可选)染色细胞(步骤 4.3-4.6)。
- 在500μL的流式细胞测量缓冲液中重新悬浮细胞,并通过流式细胞仪进行分析。
6. 细胞形态评估
- 通过喷洒乙醇和擦拭,直到吱吱作响,清洁显微镜滑动。
- 将清洁幻灯片浸入聚L-流酶溶液中,在RT下浸泡5分钟,在RT干燥1小时。
- 在10μL流式细胞学缓冲液中从步骤3.14中重新悬浮HSPC和从步骤5.13中分化的细胞。
- 将电池悬架转移到涂布的幻灯片上,使其待风干燥。
注:从第 1 天和第 21 天的幻灯片可以同时存储在 RT 上并染色。 - 在幻灯片上倒入 0.5 mL 的赖特-吉姆萨污渍,并在 RT 处站立 3 分钟。
- 加入相等体积的去离子水,并在RT上再站10分钟。
- 在去离子水中清洗幻灯片。
- 用显微镜以60倍或100倍的放大倍率可视化染色细胞。
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Representative Results
应用上述协议可产生 5.6 (± 0.5) x 108 MDC 和 1 (± 0.3) x 106 CD34+来自脐带血单位 ±100 mL 的细胞。CD34+细胞总数的百分比在 80-90% 之间 (图 2A,B)。Manz等人描述方案的免疫表位分析表明,CD34+细胞通常由+20%的HSC和+72%的MpPs组成,即林-/CD34+/CD38-和林-/CD34|/CD38=分别 (图 1和图2A)。在 MPP 人群中,CmP 的百分比 (林-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA-), GMP (林-/CD34+/CD38=/CD123lo/CD45RA=)和 MEP(Lin-/CD34+/CD38+/CD123-/CD45RA-) 分别为约 25%、15% 和 56%(图 1和图 2B)。
在骨髓分化条件下分离的HSPCs的孵育期间,CD34标记物逐渐丧失。免疫分量显示CD34+ 细胞的百分比从隔离时+90%(图2A)下降到第21天的+23%(图3B)。对CD34-总体的分析表明,表达成熟骨髓系标记的细胞百分比也同时上升。单核细胞(CD34-/CD14+/CD66b-) 粒细胞 (CD34-/CD14-/CD66b+) 的平均百分比从 1.3% 增加到 12%, 从 1.3% 到 5.3%巨核细胞 (CD34-/CD41+/CD235a-) 从 1.8% 到 8%, 和红细胞 (CD34-/CD41-/CD235a+) 从 0.7% 到 11% (图 3C)。对赖特-吉姆萨染色细胞的检查表明,第1天和第21天细胞的形态特征是截然不同的。未分化的细胞有较大的圆形核,并且细胞质很少。另一方面,来自分化培养物的细胞表现出系状细胞的特征,包括成熟的单核细胞、粒细胞和红细胞(图4)。因此,该协议中描述的培养条件促进UCB CD34+细胞分化为骨髓体介量细胞。
图 1:造血分化原理图。多能造血干细胞(HSC)分化成多能祖细胞(MPP),产生常见的骨髓祖细胞(CMP)和普通淋巴原代细胞(CLP)。CmPs 生成另外两个骨髓前体,即粒细胞单细胞前体 (GMP) 和兆核细胞红细胞前体 (MEPs)。颗粒细胞和单核细胞产生于GMP,红细胞和巨核细胞产生于MEP。CLP 产生自然杀手、B 和 T 细胞。指示用于描述该协议中细胞群的细胞表面标记。这个数字已由巴帕特等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:造血干细胞和祖细胞的免疫造血性分析。(A) 细胞被封闭在正向和侧散射上,以选择单个细胞群。死细胞和系系阳性细胞通过染色7-AAD和抗体对CD3,CD7,CD10,CD11b,CD19和CD235a(所有FITC染色)来消除。用CD34(APC-Cy7)、CD38(PE)、CD123(APC)和CD45RA(PE-Cy7)抗体对林细胞/活细胞进行了分析。祖细胞与CD34+/CD38+细胞不同。CmP 是 CD123lo/CD45RA-, GMP 是 CD123lo/CD45RA+和 MEP 是 CD123-/CD45RA-。显示了实验中的代表性散点图。(B) 在脐带血中占HSP总数(CD34+细胞总数)、CmPs、GMP和MEP的百分比。提供的数据是至少三个独立实验中的标准误差平均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:骨髓系细胞免疫体分析。单个单元基于正向和侧散射进行封闭。CD34-细胞通过与CD34(APC-Cy7)的抗体染色而选择。CD34 中的骨髓谱系在第1 天 (A ) 和第 21 天 (B ) 用抗体对 CD14 (PE)、CD66b (PE-Cy7)、CD41 (PerCP-Cy5.5)和 CD235a (APC) 进行抗体分析。单核细胞是CD14+/CD66b-,粒细胞是CD14-/CD66b=,巨核细胞是CD41+/CD235a-和红细胞是CD41-/CD235a=。显示了实验中的代表性散点图。CD34 中单核细胞、粒细胞、巨核细胞和红细胞的分数-第 1 天和第 21 天的人口表示 (C)。提供的数据是至少三个独立实验中的标准误差平均值。这个数字已由巴帕特等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:HSPC和分化细胞的代表性图像。CD34– HSPCs (A) 和来自骨髓培养物的细胞在第21天 (B) 被染色的赖特-吉姆萨染色.显示与粒细胞(黑色箭头)、单核细胞(蓝色箭头)和红细胞(红色箭头)对应的细胞。刻度条表示 10 mm。这个数字已由巴帕特等人11日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处所述的协议适用于 UCB 衍生 CD34和HSPC 到四个骨髓谱系的体外分化。由SCF、TPO、Flt3L和IL3组成的细胞因子混合物的初始孵育刺激CD34+细胞。随后,通过SCF、IL3、Flt3L、EPO和TPO的混合物实现了差异化。在此组合中,SCF、IL3 和 Flt3L 对 CD34+ HSC 的生存和增殖非常重要。 EPO 和 TPO 分别促进对红细胞和巨核细胞的分化,IL3 促进早期粒细胞单细胞的分化前体和成熟细胞13,17,18。这种方法的一个警告是观察到分化细胞百分比的变化。这可能是由于CD34的能力不同——从不同的捐赠者中分离出来的HSPCs产生血统细胞。
MS-5细胞层对于CD34+HSPC的有效分化至关重要。根据我们的经验,MS-5细胞需要在CD34+细胞播种前至少24小时进行镀层。将MS-5细胞的汇合保持在80-90%非常重要。过度康康MS-5细胞倾向于分离,而较低的汇合率会导致分化降低。在孵育过程中,CD34+细胞扩张约50倍。它们在14日变成汇流体,需要收获并分解成新板上含有MS-5细胞的额外井。
介质变化的频率对于有效分化也至关重要,必须每 3-4 天执行一次,以保持最佳的细胞因子浓度。更少的介质变化和更低的细胞因子浓度,都会导致CD34+ HSPCs的增殖和分化减少。这种对大量细胞因子的要求会大大增加成本,因此,这是该协议的一个限制。大规模实验的另一个限制是从脐带血单位获得的CD34+细胞数量。通常,一个新的UCB单位+100 mL产生约100万CD34+细胞。超过 24 小时的存储会大大降低产量。CD34–细胞的纯度进一步下降可能发生在柱洗步骤中,这对去除任何未标记的污染细胞非常重要。如果列在洗涤步骤期间堵塞,建议对堵塞柱的绑定细胞进行洗净,并重新加载到新列上,以获得纯 CD34+细胞群。
在文献中,不同的细胞因子组合被报道,促进分化到大核细胞,红细胞,或粒细胞单细胞谱系19,20,21,22.该协议的一个优点是,它允许沿所有四个骨髓群,即单核细胞,粒细胞,巨核细胞和红细胞分化。因此,它可用于研究正常的骨髓分化和研究骨髓疾病(骨髓增生综合征、急性骨髓性白血病、骨髓增殖性肿瘤和其他)相关点突变的影响,CD34+细胞11、12、23、24、25的增殖和分化期间分子和细胞表型的染色体易位。该协议也可用于检查抗炎和亲炎细胞因子的影响,以及潜在的治疗药物对骨髓分化26,27,28的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢温迪·巴雷特、雷切尔·卡瓦列罗和马里科帕综合卫生系统的加布里埃拉·鲁伊斯为脱认和捐献脐带血单位,姆利纳利尼·卡拉为流动细胞学提供帮助,盖伊·克鲁克斯和克里斯托弗·西特关于前体骨髓分化的建议。这项工作得到了美国国家卫生研究院(R21CA170786和R01GM127464)和美国癌症协会(机构研究补助金74-001-34-IRG)的资助。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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