Summary
Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.
Abstract
Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er 'in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.
Introduction
Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir1. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin2' ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu3' ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.
Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma4. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Atlastin 'in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir2. Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda "etiketli" lipozomlar "etiketlenmemiş" liderecede ' den alıcı çifti (Şekil 1)5. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD 'nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma8nedeniyle olacaktır.
Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece5tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA 'da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)3]3- şelasyon kompleksi6içinde DPA 'dan TB 'ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX7tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GST-DAtl-His8 arıtma
-
Protein ifadesi ve lysate hazırlığı
- BL21 (DE3) E. coli 'yi PGEX4-T32 ' de GST-Datl-His8 yapısı ile dönüştürün ve bir ampikilin plakasını seçin.
- 14 mL 'Lik bir kültür tüpünde 5 mL LB + ampisilin (5 μL 100 mg/mL ampisilin) olarak tek bir transformant seçin ve 6-8 h için 200 rpm 'de sallayarak 25 °C ' de inkük et.
Not: Sızdırmaz ifade nedeniyle, yüksek sıcaklıklarda inkübe etmek tavsiye edilmez. 25 °C ' de büyüme, bu büyüme döneminde protein toplamayı azaltır. - 5 mL kültürden 1 mL 'Lik LB + ampisilin 200 mL 'yi ınoculate ve 25 °C ' de gecede (~ 15 – 18 h) inkük edilir.
- Ertesi sabah, santrifüjleme ile hücreleri hasat (2.000 x g 10 dk) ve pelletini içinde 5 ml lb.
- Inoculate 4 L LB + ampisilin ve ölçüm OD600 (0.05 – 0.15). Titreyerek 25 °C ' de inküye.
Not: Bakteri eklemeden önce OD600 ölçümleri için boş olarak hizmet vermek için bazı medya rezerv. - Ölçüm OD600 her saat 0.4 – 0.5 arasında bir od ulaşır kadar. Bu noktada, sıcaklığı 16 °C ' ye azaltın.
- 0,2 mM ıPTG (800 μL 1 M stokta) ile birlikte, 10 dakika sonra kuluçkörü 16 °C ' ye ulaşır. Bir gecede (~ 15 – 18 saat) 16 °C ' de inküytir.
Not: Düşük sıcaklık atlastin toplama azaltarak fonksiyonel protein verimi artırır. - Ertesi sabah, 4 °C ' de 7.500 x g santrifügleme ile hücreleri hasat.
- 200 mL A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) ve 200 mM KCl) hücrelerinde yeniden resuspend.
- 11.000 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.
- (A200 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mm imidazol ve bir EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl tablet) kırma tampon 40 ml Pelet resuspend.
Not: Baloncuklar ve köpük üretme önlemek için resuspending sonra TX-100 ekleyin. - Bir 18 G iğne üzerinden geçmek ve üç kez bir hücre bozucu üzerinden hücreleri çalıştırmak ~ 10.000 psi.
- 1 saat için 125.000 x g 'de özü Santrifüjü.
Not: İsteğe bağlı olarak pelet 1:2 (w:v) 8 M Urea ve oda sıcaklığında gecede nutate çözülür. Bir denaturant olarak Urea SDS-PAGE analizi için yavaşça çözünebilir peletli protein çözünür. SDS-PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL tasarruf edin. - Bakteri ve büyük bakteriyel enkaz kaldırmak için 0,45 μm selüloz nitrat steril membran filtre aracılığıyla ekstresi filtre.
Not: Isteğe bağlı olarak, SDS PAGE ve Coomassie leke analizi için 1 μL kaydedin.
-
Benzerliği kromatografi ile protein arıtma
- Süzülmüş lysate, ni2 +ile şarj edilmiş immobilize metal benzeşimi Kromatografi (IMAC) reçine sütun üzerine yükleyin, düşük imidazol tampon ile önceden equilibrated (A100 artı 10% gliserol, 2 mm 2-mercaptoetanol, 1% TX-100, 40 mm imidazol) bir hızda 1 ml/ min 4 °C ' de.
- Sütunu 25 mL A100 artı% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazol ile 4 °C ' de 1 mL/dak hızında yıkayın. 40 mM 'den 500 mM 'ye kadar imidazol 30 mL doğrusal gradyan ile proteini elute ve 500 mM 'de son 5 mL yıkama.
- Havuz birlikte zirve fraksiyonları ve 1 h 4 °C ' de şişmiş GSH-Agarose boncuk ile, daha önce suda şişmiş ve% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA ile A100 içinde dengelenmiş.
Not: GSH-Agarose boncuklar önceki gün 50 mL su içinde şişebilir ve 4 °C ' de veya RT 'de 1 h 'de bir gecede inküte edilir. Su ve dengeleme tamponunu kaldırmak için, 500 x g 'de 1 dakika frensiz olarak sallanan kova rotorunda santrifüjler. 26 G iğne ile süpernatant aspirate. - Pellet GSH-agarose boncuk 500 x g frensiz bir sallanan kova rotor santrifüjleme ve 26 g iğne ile aspirasyon ile lysate süpernatant çıkarın.
- Boncukları 10 mL polyprep sütununa aktarın ve 5 mL Dengeleme tamponu ile beş kez yıkayın (A100% 10 gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, 0,1% Anapoe X-100 ve 1 mM EDTA), 500 X g 'de santrifüpleme yaparak .
- 10 mm azaltılmış glutatyon ile takviyalı 1 – 1,5 ml dengelemesinden tampon ile protein elute. Sıvı nitrojen içinde aliquot elüe protein ve flaş dondurulması. Protein-80 °C ' de süresiz olarak depolanabilir.
Not: 7,4 için elüsyon tampon pH ayarlayın. - Amonye siyah protein assay tarafından protein konsantrasyonu ölçmek9 ve SDS-sayfa ve Coomassie boyama tarafından saflık değerlendirmek.
2. rekombinant Atlastin lipozomlar içine reanayasası
- Ekstrüzyon yöntemiyle Liposome üretim 10 ' dan fazla
- Kloroform (10 mM toplam lipid) lipid karışımı stokları olun. Gerekli lipidler 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-phospho-L-serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-fosfoetolidin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-DPPE), ve 1, 2- Dipalmitoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (RH-dppe). Acceptor lipozomlar POPC oluşur: DOPS (85:15 molar oranı) ve POPC donör lipozomlar: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar oranı).
Not: POPC: DOPS lipid karışımları geleneksel olarak in vitro lipid karıştırma işlemleri için kullanılırken, alternatif lipid bileşimleri farklı Deneysel amaçlar için uyarlanabilir. POPC: DOPS lipozomlar çok kararlı ve sigortalı zor, bu nedenle füzyon için çok sıkı bir sistemdir. - 1 Μcı/mL L-α-Dipalmitoyl-Fosfatidilkolin (Kolin metil-3H) lipid karışımlarına, daha sonraki adımlarla sıvı scintilasyon sayımı ile lipid konsantrasyonlarını belirlemek için ekleyin. Bu stokta en az 8 μL rezerve et.
- İstenilen miktarda lipid karışımları, çakmaktaşı cam tüplere aktarın.
- Daha fazla kloroform görülene kadar N2 gazının yumuşak bir akışı altında lipid karışımların kuru.
- 30 dakika vakumlama ile bir kurutucu içinde daha fazla lipid filmi kuru.
- Yeterli sulu A100 ekleyin 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol, ve 1 mM EDTA lipid film ve 10 mM konsantrasyon geri getirmek. Oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe vortekslenir tarafından lipid filmi resuspend. Flint cam tüpler barındırabilir bir vorteks tavsiye edilir.
- Sıvı azot on kez nemlendirici lipidler dondurmak-çözüyor. Sıvı nitrojen içinde dondurulduktan sonra, solüsyonun 30 s için oda sıcaklığında oturmasına izin vererek lipozomları çözün, daha sonra daha hızlı çözme için suya aktarın. Bu donma-çözülme bisiklet çok amellar veziküller en aza indirir.
Dikkat: Onlar 0,5 mL 'den büyük birimler içeriyorsa ve doğrudan suya sıvı azot formu aktarıldığında tüpler çatlak olabilir. - Mini Extruder kullanarak 100 Nm gözenek boyutu 19 kez Polikarbonat filtreleri ile lipid geçirin.
- Skintilasyon sayımı ile lipozomların toplam lipid konsantrasyonu belirlenmesi
Not: Bazı lipid cam tüpler ve mini-Extruder geride bırakılabilir.- 3 mL scintilasyon kokteylinde 4 μL lipid stokları ve lipozomlar ekleyin.
- Stok ve lipozomlar için dakika başına ortalama sayar (CPMA) ölçün. Ve aşağıdaki formül ile lipozomlar konsantrasyonu hesaplayın:
- Lipozomları 4 °C ' de bir haftaya kadar saklayın. Lipozomlar zaman ile toplu olabilir olarak daha uzun depolama tavsiye edilmez, reanayasa verimlilikleri azalan.
- Kloroform (10 mM toplam lipid) lipid karışımı stokları olun. Gerekli lipidler 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-phospho-L-serine (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-glisey-3-fosfoetolidin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-DPPE), ve 1, 2- Dipalmitoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (RH-dppe). Acceptor lipozomlar POPC oluşur: DOPS (85:15 molar oranı) ve POPC donör lipozomlar: DOPS: RH-PE: NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molar oranı).
- Önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan destekli kuruluş ile Reconstitution
- Birlikte karıştırılacak tampon, protein, lipozomlar ve ekstra deterjan miktarını hesaplayın:
- İstenen toplam hacmi belirleyin. Bu hacim, 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 tampon oluşur. 250 μL 'den küçük birimler 0,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iyi karışmaz.
- Yaklaşık 1 mM son lipid konsantrasyonu vermek için gerekli lipozomların hacmini hesaplayın. Birim arabellek biriminden çıkarın.
- İstenen protein lipid molar oranı (genellikle 1:400) vermek için gerekli protein hacmini hesaplayın. Arabellek hacmini buna göre azaltın.
- 0.64 – 0.8 arasında etkili bir deterjan için lipid oranı (Reff) hedefleyen lipozomları doyurmak için ne kadar ekstra deterjan eklenmesi gerektiğini belirleyin. Protein ile eklenen deterjan düşünün unutmayın. (Reff
) denklem ile belirlenir dToplam toplam deterjan konsantrasyonu ve dsu MONOMERIK deterjan konsantrasyonu (0,18 mm TX-100 ve anapoe X-100 deterjan varlığında)4, 11' den itibaren.
- Çözümleri birlikte bir 0,5 mL tüpte aşağıdaki sırada karıştırın: tampon, deterjan, protein ve lipozomlar. Hızla lipozomlar ekleyin ve karışımı homojenize 5 s için hemen girdap.
- 4 °C ' de 1 h için bir çatlak içinde reaksiyonu kuluçsa.
- Su içinde 0,2 g/ml apolar polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun.
Not: Adım 2.2.3 yılında önceki 1 h inkübasyon sırasında polistiren adsorban boncuk "bulamaç" olun. - Polistiren adsorban boncuk 0,2 g tartmak ve bir mikrosantrifüj tüp transfer.
- Tüp ve karışımı 1 dk için metanol 1 mL ekleyerek boncuklar Degas. gaz edilmiş boncuk batırılır.
- Metanol aspirate ve boncuk su ekleyin. Boncuk 5 dakika su ile karıştırın, sonra su Aspire edelim. Dört kez tekrarlayın, sonra su ile 1 ml hacmine polistiren adsorban boncuk "bulamaç" getirmek ve 0,2 g/ml son konsantrasyon.
Not: Boncuklar hala tüpün altına yerleşmeli. Yoksa, tekrar Degas. Boncuk metanol ve su Aspire için 21 G veya daha yüksek iğne kullanın. - Her numunenin tüm deterjan absorbe etmek için gerekli polistiren adsorban boncuk miktarını hesaplayın. 1 gr polistiren adsorban boncuklar 70 mg TX-100 emer. Her reaksiyon için gerekli polistiren adsorban boncuk Bulamaç hacmi hesaplamak için, reaksiyonda toplam deterjan Böl (adım 2.2.1.4) tarafından 70 mg, ve sonra boncuk Bulamaç konsantrasyonu (0,2 g/ml (adım 2.2.7).
- Transfer hesaplanan miktarı polistiren adsorban boncuk Bulamaç için bir 0,5 ml tüp ve Aspire su.
Not: Boncukları aktarmak için 20 – 200 μL ucunun sonunu kesip, boruyu pipetleme işleminden hemen önce yerleştirerek yerleşmiş boncuklar yeniden pelletini. - Örnekleri eklemek 0,5 ml tüp polistiren adsorban boncuklar içeren ve örnek nutating için 1 h 4 °c ' de kuluçkmak.
- Tekrar iki kez eski boncuk geride bırakarak ve taze boncuklar için örnek transfer tekrarlayın.
- Numuneyi taze boncuklarla dördüncü bir tüpe ekleyin ve gece (~ 15 – 18 saat) 4 °C ' de inküye yapın.
- Birlikte karıştırılacak tampon, protein, lipozomlar ve ekstra deterjan miktarını hesaplayın:
- Sabah, 4 °c ' de 16.000 x g 'de 10 dakika santrifüpleme yapılarak polystyren adsorban boncuk ve Pelet çözünmez protein topaklardan numuneyi çıkarın.
- Süpernatant kurtarmak ve sıvı scintıtma sayma ile son lipid konsantrasyonu belirlemek (adım 2.1.9.2 bakın). İsteğe bağlı olarak, protein konsantrasyonu, siyah protein assay tarafından belirlenebilir9.
Not: Proteoliposomes atlastin için, enzimatik asdalar taze lipozomlar ile yapılmalıdır. 4 °C ' de uzun depolama veya donma, atlastin aktivitesinde önemli bir kaybına yol açar.
) denklem ile belirlenir dToplam toplam deterjan konsantrasyonu ve dsu MONOMERIK deterjan konsantrasyonu (0,18 mm TX-100 ve anapoe X-100 deterjan varlığında)4, 11' den itibaren.3. lipid karıştırma Assays
- % 10 gliserol, 2 mM β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA ve 5 mM MgCl2ile her biri A100 'de 0,15 mm konsantrasyonuna donör ve alıcı proteoliposomları getirin. Her reaksiyon (50 μL) floresans okumaları için uygun düz beyaz 96 iyi plaka bir kuyu eklenmesi gerekir. Bir triplicate ve No-GTP negatif kontrol dahil olmak üzere en az 4 reaksiyonlar hazırlayın.
- Plakayı 37 °C ' de önceden ısıtılmış bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ölçüm NBD floresans (Excitation 460 nm ve emisyon 535 Nm) için 5 dk her dk.
- 5 mM GTP (5 μL 50 mM GTP) ekleyerek füzyon yaratın.
- 1 saat için her dakika NBD floresans ölçmek.
- Proteoliposomları çözmek ve maksimum NBD floresans ölçmek için 5 μL 2,5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside ekleyin. NBD floresans her dakika 15 dakika okuyun.
4. ıohexol diskontinü gradyan12 Liposome floatation
- isteğe bağlı 13. floatasyon ile reanayasanın verimliliğini analiz edin.
- 10% gliserol, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile A100 'de% 80 ve% 30 w/v iohexol hazırlayın. Iohexol kolayca çözülür, bu yüzden bu gece 4 °C ' de nutating bir gün önce hazırlanmalıdır.
- 80% iohexol ile 150 μL proteoliposomes numunesi ile 150 μL 'i iyice karıştırın ve% 40 iohexol 'e getirin. Bu Ekle 5 x 41 mm2 Ultra-Clear tüp kaçınarak kabarcıklar.
- Layer 250 μL% 30 iohexol stok yavaşça numunenin üstünde bir orta tabaka yapmak için. Herhangi bir kabarcıklar kaçının ve alt katman rahatsız. Orta tabakanın üst kısmında, 2 mM 2-mercaptoetanol ve 1 mM EDTA ile yavaşça 50 μL A100 ekleyin.
- 220.000 x g 'de 4 °c ' de yavaş ivme ve mola olmadan sallanan kova rotorunda gradyan Santrifüjü.
- Gradyan katmanları hasat ve SDS-PAGE ve Coomassie leke tarafından analiz, ölçüme densitometri tarafından yapılabilir. Reconstituted protein üst katmana yüzer, protein ve lipid agregaları alt veya Orta katmanda tortu olacak iken.
5. Trombin proteolizi ile yeniden şekillendirilmiş proteinin oryantasyonu Analizi
Not: Burada bildirilen atlastin yapısı, N-terminal GST etiketinin sonu ve atlastin başlangıcı arasında bir Trombin kesim sitesi vardır. Doğru yönde atlastin bu kesim sitesi proteaz erişilebilir olacak, yanlış yönde protein lipid bilayer tarafından korunacaktır iken.
- Proteoliposome oryantasyon atlastin tahlil için, en az 8 μL taze reconstituted proteoliposomes rezerv.
- 8 μL proteoliposomes ve 1 μL 1 U/μL Trombin ekleyin. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.
- 1 μL 5 mg/mL EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ile proteaz giderin ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye yapın.
- SDS-PAGE ve Coomassie lekesi ile numuneyi analiz edin. Kırpılmış ve uncleaved protein oranı densitometri ile belirlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Atlastin reanayasasının verimliliği Şekil 2' de sunulmuştur. Reconstituted proteoliposomes bir ıohexol kesintisiz gradyan içinde süzülmüştü. Unıncorporated protein alt katmanda (B) veya Orta katmanda (M) posalı oldu. Reconstituted protein üst katmanda (T) yüzer. Gradyan örnekleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama tarafından hasat edilmiş ve analiz edilmiştir. Jelin densitometri ile ölçülmesi, ihmal edilebilir kaybeder ile reanayasanın çok yüksek bir verimliliğini gösterir; Toplam proteinin% 96 ' i üst katmana (T) kaydırılan proteoliposomes olarak bulundu. Proteinin% 1 ' inden azı reconstituted ve orta tabakada (M) bulundu ve sadece% 3 ' ü alt katmana (B) reconstituted veya toplanmış ve sedimlenmiş.
Reanayasanın kapsamını tanımlamanın yanı sıra, reanayasa sonrası atlastin yönünü analiz etmek, Trombin bölünmesiyle14' e göre ölçülebilir. Reconstituted protein potansiyel yanlış yönde olabilir, yani, Liposome boşluğu uzaya bakan. Protein yanlış yönde lipid bilayer tarafından proteoliz korunmalıdır. Bir Trombin bölünme sitesi N-terminal GST etiketi ve atlastin başlangıcı arasında kodlanmış. Yüzer proteoliposomes, 37 °C ' de 1 h için Trombin ile inkübe edildi ve ardından EDTA-Free proteaz inhibitörü ile 30 dk inaktivasyonu izledi. Numuneler SDS-PAGE ve Coomassie lekesi tarafından incelendi ve densitometri Şekil 3ile ölçülebilir. Negatif bir kontrol olarak, tedavi edilmemiş proteoliposomes bir örnek sol şeritte gösterilir. Deterjan çözünen proteoliposomes (sağ şerit) pozitif bir kontrol olarak hizmet ve Trombin bölünme kapsamını göstermek için, sadece% 1 sol un-cleaved. Tüm, bu tahlil reconstituted protein çoğu proteaz (orta şerit) korunmakta sadece% 7 ile parçalanabilen olduğunu gösterir. Bu kesilmemiş protein geri kalanı kesilmiş site erişilebilir olmayabilir reconstituted protein agrega bir sonucu olabilir dikkati çekiyor. Tüm bu sonuçlar, atlastin reconstituting için sağlam bir sistem açıklanmaktadır.
Kinetik ve atlastin-aracılı proteoliposome füzyon kapsamı lipid karıştırma analizleri ile incelenmiştir (Şekil 1). Şekil 4' te bir atlastin füzyon kinetiği ve ölçüme numunesi gösterilir. Tam kinetik çalışma Şekil 4A'da tasvir edilir. Sıfır timepoint ve sonra 1 h, n-Dodecyl β-D-maltoside proteoliposomes çözündürürler ve maksimum fret serbest almak için eklenen bir 5 dk inkübasyon, GTP ile Fusion inducing önce yapıldı. Koşuma maksimum füzyon maksimum floresans% 11 oldu (Şekil 4B, C). İndüklenmiş (No GTP) denetimleri, arka plan temelini belirlemek için kullanılabilir.
Şekil 1: lipozom Fusion Fusion tahlil modeli. Florasan etiketlenmiş floresan donör lipidler NBD-fosfatidiltenolin (yeşil küreler olarak temsil) ve Acceptor Rhodamine-fosfatidiltenolin (kırmızı küreler olarak temsil) ile etiketli lipozomların bir nüfus etiketlenmemiş bir ile karıştırılır lipozomların Havuzu. Fusion önce, NBD 's floresans, alıcı fluorophore, Rhodamine yakınlığı nedeniyle düşüktür. Etiketlenmemiş lipozomlar ile füzyon üzerine bir yüzey alanı artışı probların seyreltme yol açar ve NBD bir FRET serbest ölçülebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: reanayasa verimliliği flotasyon tarafından incelendi. Atlastin reanayasa verimliliği bir ıohexol kesintisiz gradyan proteoliposomes flotasyon ile ölçülebilir. Reconstituted protein üst katmanda (T) proteoliposomes olarak yüzen olmalıdır, trammies ve toplanan protein alt katmanda (B) veya orta tabaka (M) tortu gerekir. Bir Coomassie-lekeli SDS-sayfa jel densitometri tarafından nicelleşmiş ve% 96 ölçülebilir kaybı ile proteoliposomes olarak yüzen toplam protein ölçülen (~ 4%).
Şekil 3: proteaz sindirim ile proteoliposomes reconstituted atlastinin analizi. Rekombinant atlastin bir N-terminal GST etiketi ve ardından bir Trombin kesme dizisi vardır. Rekombinant atlastin proteoliposomes lipid bilayer açısından reconstituted protein yönünü analiz etmek için serin proteaz Trombin ile tedavi edildi. Trombin tedavisinden sonra proteaz engellenir ve numuneler SDS-PAGE, Coomassie lekesi ve densitometri ile ölçülebilir. Sunulan proteoliposomes, sadece% 4 ' ü sindirilmemiş (orta şerit) olarak kalan, korunan proteinlerin düşük bir oranına sahiptir. Olumlu bir kontrol olarak bazı proteoliposomes deterjan ile çözünen (0,5% TX100) (sağ şerit); negatif kontrol, tedavi edilmemiş proteoliposomes, (Sol Lane) parçalanabilen değildi.
Şekil 4: atlastin proteoliposomların lipid karıştırma asdları. (A) 0 dakika içinde GTP ile füzyon inducing önce 5 dk kuluçdak zaman ile füzyon reaksiyon örnek kinetik iz. 1 saat çalıştırıldıktan sonra, NBD 'nin maksimum FRET sürümünü belirlemek için deterjan çözünme (siyah ok) kullanılmıştır. (B) Izleme görünümünde yakınlaştırılmış timepoint 0 ile 1 h ile ve (C) ortalama Fusion (n = 3)% 11,3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin 'in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmayacaktır. Reanayasa verimliliği, burada tarif edilen floatasyon analizine göre isteğe bağlı olarak analiz edilebilir (Şekil 2). Lipozomların floatasyon asdlarının avantajlarından biri, lipid bilayers13ile ilişkilendirmek çözünür proteinlerin analiz etmek için uzatılabilir olmasıdır. Ayrıca, yeniden oluşturulmuş protein yönü de proteaz sindirim tarafından analiz edilebilir14, ancak, bu yanlış yönde reconstituted yanlış veya toplanan protein veya reanayasa arasında ayrım olmayabilir (Şekil 3 ). Bu yöntemle geliştirilen proteoliposomes, Fusion için veya bir model lipid bilayer içinde atlastin çalışmaları için tahlil uygulanabilir. Reanayasa prosedürünü yaparken nispeten basit, optimum deterjan ve lipid konsantrasyonlarındaki küçük sapmalar reanayasanın verimliliğini azaltabilir. Örneğin, aşırı miktarda deterjan lipozom çözünme neden olabilir.
Lipid karıştırma, donör ve alıcı lipozomlar için bir havuz gerektirir (Şekil 1). Bu yöntem, her adımda lipid konsantrasyonunun ölçülmesini için tritiated lipid tarafından radyoaktivite kullanır. Ancak, donör lipozomların içsel floresans ve dansyl-fosfoetolin ile alıcı lipozomlar kullanılarak alternatif ölçme yöntemleri bildirilmiştir15,16. Polikarbonat membran gözenek boyutu buna göre ayarlanabilir gibi lipozomların boyutlandırma da ekstrüzyon sırasında değiştirilebilir.
Lipid karıştırma, Fusion analizi için etkili bir yol olmakla beraber, füzyon ve hemifüzyon arasında ayrım yapamaz. Elektron mikroskobu ile füzyon sonrası proteoliposomları görselleştirerek çeşitli çalışmalar15 ve lipid floresans tarafından16,17 daha fazla destek tam füzyon atlastin. Ancak, belirli atlastin mutantlar veya diğer füzyon proteinleri analiz ederken, tam füzyon sağlamak için ilgi. Bu sorunların giderilmesi için ek adımlar, dış broşürün ditionit ile bastırılarak ve iç broşür lipid karıştırılmasını ölçerek yapılabilir. Bunun için iç sulu içerik karıştırma gibi alternatif füzyon desteği, ancak, ek adımlar ve lipozomların diyaliz gerekli olacaktır.
Bu yöntemin, model lipid bilayerlerinde proteinlerin in vitro çalışmaları için diğer membran proteinlerine uygulanabilecek olması ilgidir. Diğer membran proteinlerinin bu yöntemle yeniden oluşturduğu bildirildi16,17. Bu yöntem, bu nedenle çeşitli membran ve füzyon proteinlerine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Dr. Michael Stern ve laboratuvarına, atlastin ile ilgili projelerdeki görüşleri ve geribildirimlerine teşekkür ederiz. Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [R01GM101377] ve nörolojik bozukluklar ve Inme Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
