Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att berika endogena RNA bindningsställen eller "fotavtryck" av RNA: protein (RNP) komplex från däggdjursceller. Detta tillvägagångssätt innebär två immunoprecipitations av RNP subenheter och är därför dubbat RNA immunoprecipitation i tandem (ripit).
Abstract
RNA-immunoprecipitation i tandem (RIPiT) är en metod för att berika RNA-fotavtryck av ett par proteiner inom ett RNA: protein (RNP)-komplex. RIPiT sysselsätter två reningssteg. Första, immunoprecipitation av en taggad RNP subenhet följs av mild RNase matsmältning och efterföljande icke-denaturering samhörighet eluering. En andra immunoprecipitation av en annan RNP subenhet möjliggör berikning av ett definierat komplex. Efter en denaturerande eluering av RNAs och proteiner omvandlas RNA-fotavtryck till högpresterande DNA-sekvenserings bibliotek. Till skillnad från den mer populära ultraviolett (UV) tvärbindning följt av immunoprecipitation (CLIP) metod för att berika RBP bindningsställen, är RIPiT UV-crosslinking oberoende. Därför RIPiT kan appliceras på många proteiner som finns i RNA interactome och därefter som är viktiga för RNA-reglering men inte direkt kontakta RNA eller UV-Crosslink dåligt till RNA. De två reningsstegen i RIPiT ger en ytterligare fördel av att identifiera bindnings platser där ett protein av intresse agerar i partnerskap med en annan kofaktor. Den dubbla renings strategin tjänar också till att förbättra signalen genom att begränsa bakgrunden. Här ger vi ett steg-Wise förfarande för att utföra RIPiT och generera hög dataflöde sekvensering bibliotek från isolerade RNA fotavtryck. Vi skisserar också RIPiT fördelar och tillämpningar och diskutera några av dess begränsningar.
Introduction
Inom celler finns RNA i komplex med proteiner för att bilda RNA: proteinkomplex (RNPs). RNPs monteras runt RNA bindande proteiner (RBPs, de som binder direkt RNA) men också bestå av icke-RBPs (de som binder RBPs men inte RNA), och är ofta dynamiska i naturen. RBPs och deras kofaktorer fungerar kollektivt inom RNPs för att utföra reglerande funktioner. Till exempel, i den nonsens-medierade mRNA Decay (NMD) vägen, UPF proteiner (UPF1, UPF2, och UPF3b) erkänna förtida avslutad Ribosomen. Var och en av UPF proteiner kan binda till RNA, men det är först när de samlas ihop att ett aktivt NMD-komplex börjar bildas. Inom detta komplex, UPF1 aktiveras ytterligare genom fosforylering av en icke-RBP SMG1, och sådana UPF1 aktivering så småningom leder till rekrytering av mRNA förfall inducerande faktorer1,2. I det här exemplet kräver RBPs icke-RBP kofaktorer för rekrytering och aktivering av RNP-komplexet som utlöser NMD. Ännu en annan egenskap hos RNPs är deras sammansättning heterogenitet. Betrakta spliceosome, som finns i distinkta E, A, B eller C komplex. Olika spliceosome komplex har överlappande och distinkta proteiner3. För att studera RNP-funktioner är det viktigt att belysa vilka RNAs som är bundna av en RBP och dess associerade proteiner. Många metoder finns för att åstadkomma detta, med varje strategi med sina distinkta fördelar och nackdelar4,5,6,7.
De mycket populära metoder för att identifiera RBP bindningsställen-crosslinking följt av immunoprecipitation (CLIP) och dess olika variationer-förlita sig på ultraviolett (UV) ljus för att Crosslink en RBP till RNA8. Detta är dock inte en effektiv metod för icke-RBPs inom RNPs, som inte kontakta RNA direkt. Här beskriver vi en alternativ metod som är tillämplig på RBPs och icke-RBPs, för att isolera och identifiera deras RNA-bindnings platser. Detta tillvägagångssätt kallas RNA immunoprecipitation i tandem (ripit) består av två immunoprecipitation steg, som bidrar till att uppnå högre specificitet jämfört med en enda rening (figur 1)9,10. Eftersom de enskilda immunoprecipitation (IP) steg kan utföras vid en lägre stränghet jämfört med CLIP, är RIPiT inte beroende av tillgången på antikroppar som tål förekomst av starka rengöringsmedel under immunoprecipitation. Den mest unika fördelen med RIPiT är förmågan att rikta in två olika proteiner i två reningssteg; Detta ger ett kraftfullt sätt att berika en sammansättning distinkt RNP komplex från andra liknande komplex11.
Små variationer i RIPiT-proceduren kan ytterligare förstärka RNP-berikningen. Till exempel, vissa RNA-protein eller protein-protein interaktioner inom RNPs är övergående och det kan vara svårt att effektivt rena fotspår av sådana komplex. För att stabilisera sådana interaktioner kan RNPs tvärbunden i celler med formaldehyd före celllys och RIPiT. Till exempel har vi konstaterat att en svag interaktion mellan exon Junction Complex (EJC) Core Factor, EIF4AIII och EJC demontering faktorn, PYM12 kan stabiliseras med formaldehyd behandling så att fler RNA-fotavtryck är berikade (data inte visas). Innan cell skörd och RIPiT, celler kan också behandlas med läkemedel för att stabilisera eller berika RNPs i ett visst tillstånd. Till exempel, när man studerar proteiner som avlägsnas från mRNA under översättningen (t. ex. EJCUPF1),kan behandling med översättnings hämmare som puromycin, cykloheximid eller harringtonin leda till ökad beläggning av proteiner på RNAs.
Mängden RNA som återvinns från RIPiT är vanligtvis låg (0.5-10 pmoles, dvs, 10-250 ng RNA med tanke på en genomsnittlig RNA-längd på 75 NT). Den främsta orsaken till detta är att endast en liten del av ett givet protein finns i komplex med andra proteiner inom RNPs (alla "fria" protein Ip' ed i det första steget går förlorad under den andra UNDERSÖKNINGSPERIODEN). För att generera RNA-SEQ-bibliotek från detta RNA, skisserar vi också här en anpassning av tidigare publicerade protokoll som lämpar sig för så låga RNA-ingångar15,16 (figur 2), vilket ger hög genomströmning sekvensering redo prover i 3 Dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. upprättande av stabila HEK293 cellinjer uttrycker tetracyklin-inducerbara flagga-märkt protein av intresse (POI)
- Seed HEK293 celler med ett stabilt integrerat FLP rekombination mål (FRT) plats med en densitet av 10 x 104 celler/ml i odlingssubstrat (Dulbecco modifierade Eagle ' s medium [DMEM] + 10% foster bovint serum [FBS] + 1% penicillin-streptomycin [Penn/STREP]) i 6- Bra tallrikar. Låt cellerna växa över natten i en Befuktad inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 (standard tillväxtvillkor för alla efterföljande steg).
- Nästa dag, celler bör vara ~ 70% confluent. Enligt transfection reagens Protocol, transfect den FRT plats som innehåller HEK293 celler med en 9:1 förhållandet pcDNA5-TETO-FLAG-POI: pOG44.
Anmärkning: FLAGGAN taggen har sekvensen motiv DYKDDDDK (D = asparaginsyra, Y = tyrosin, och K = lysin). - Efter 24 h, börja antibiotikum urval. Ta bort media och tillsätt nytt odlingssubstrat kompletterat med 100 μg/mL hygromycin. Inom 72 h, untransfected celler bör börja dö.
- Varje 48-72 h, ändra tillväxt medier och komplettera med färska hygromycin.
- Efter ~ 2 veckors urval, diskreta kolonier av stabilt transfekterade celler kommer att börja dyka upp. När kolonier är synliga för blotta ögat, tillsätt 1 mL trypsin till plattan och inkubera i 5 min vid 37 ° c. Omsuspendera celler i DMEM, överför celler till en ny 10 cm plåt och justera volymen till 10 mL nytt odlingsmedium kompletterat med 100 μg/mL hygromycin. Låt plattan att nå ~ 80% confluency för att ytterligare expandera celler för att förbereda permanenta bestånd.
- Bestäm hur mycket tetracyklin (tet) som krävs för att uppnå den optimala nivån av flagg-POI-uttryck för experimentet. Odla celler i 12-well format och genomföra en titrering av tet mellan 0-1000 ng/ml intervall för 16-24 h. utför västerländska blotting på titrerproverna med antikropp mot sevärdheten.
Anmärkning: För proteiner upp till ~ 60 kDa, flagg-märkta och endogena kopian av proteinet kan lösas på natriumdodecyl sulfat-polyakrylamid gel elektrofores (SDS-sida) att jämföra uttrycks nivåer av flagg-POI till dess endogena motsvarighet. För större proteiner kan signalintensiteten i tet-inducerad prover jämföras med oinducerad prov. Den tetracyklin stamlösning kan förberedas på 1 mg/mL i 100% etanol. Spädningar av beståndet för cellodling arbete bör vara i sterilt vatten eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tetracyklin lager bör förberedas färskt en gång varje månad.
2. odling celler för tetracyklin induktion och RIPiT förfarande
- Seed stabilt integrerad flagga-POI HEK293 vid en densitet av 3 x 105 celler/ml i odlingsmedium i 15 cm plattor. Låt cellerna växa vid 37 ° c och 5% CO2.
Anmärkning: I allmänhet, tre till 5 15 cm plattor kommer att ge ~ 2-20 pmol av RNA-fotavtryck beroende på överflödet av RNP av intresse. Om RNPs kommer att formaldehyd tvärbunden och renas under stränga villkor, sedan dubbelt så mycket input kan krävas. - Tillsätt tetracyklin till förutbestämd optimal koncentration till media för att inducera uttrycket av flaggan-POI (se steg 1,6) 16-24 h innan cellerna kommer att skördas.
Anmärkning: Det är inte nödvändigt att ändra odlingsmedium. Celler bör vara redo att skörda ca 72 h efter sådd eller när plattorna är ~ 80% confluent. Det är viktigt att undvika att celler blir konfluenta.
3. cell skörd, Formaldehydbehandling och Celllys
- Tvätta enskiktslager-cellerna försiktigt med 15 ml kyld PBS för varje 15 cm plåt. Skrapa sedan bort cellerna i 30 mL PBS. Om celler behandlades med läkemedel före skörd, komplettera PBS med drogen. Samla alla celler i 50 mL koniskt rör.
Anmärkning: För att bevara svaga interaktioner, celler kan tvärbunden med formaldehyd: Tillsätt formaldehyd till cellsuspensionen från steg 3,1 till en slutlig koncentration av 0,1% och inkubera på en rocker vid rumstemperatur i 10 min. Tillsätt 3 mL av kylbufferten (tabell 1 ) och Rock i ytterligare 5 minuter. - Pellets celler vid 400 x g i 10 min vid 4 ° c och Kassera supernatanten.
- Lyse-celler i 4 mL iskall hypotonisk lyseringsbuffert (HLB; Tabell 1). Använd en P1000 pipett för att Omsuspendera celler. Överför till en 5 mL tub och inkubera lysat på is under 10 min.
- Placera lysate i ett isbad och Sonikera vid 10% amplitud för 30 s med 1 s pulser med 2 s pauser. Justera sedan salt koncentrationen till 150 mM genom att lägga till 108 μL 5 M NaCl.
Anmärkning: Formaldehyd tvärbunden prover kan vara föremål för strängare Lys och rening genom att inkludera 0,1% vardera av SDS och natriumdeoxycholat i lyseringsbufferten. - Rensa lysatet genom centrifugering på 21 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Samla in 20 μL supernatanten (cell extrakt) i ett märkt rör för Western blot-analys av proteinnivåer i input (se figur 3a).
Anmärkning: Medan lysate är i Centrifugera, kan flagg Agros pärlor tvättas (se steg 4,1). FLAGG agaros pärlor bör förtvättas 3x i 4 mL iskall isoton tvättbuffert (IsoWB, tabell 1).
4. flagga immunoprecipitation
- Applicera resterande supernatanten från steg 3,5 till 750 μL pre-tvättad flagg Agros pärlor i en 5 mL tub (Bed volym av tvättad flagg aguppstod pärlor kommer att vara 375 μL). Inkubera flagga agaros pärlor och cell extrakt för 1-3 h vid 4 ° c med mild blandning.
Anmärkning: Denna volym av flagg Agam pärlor bör vara tillräckligt för ett brett spektrum av proteiner, men kan optimeras, om det behövs. - Pellets flagga aguppstod pärlor genom centrifugering vid 400 x g för 1 min vid 4 ° c. Samla 20 μL av supernatanten i en märkt tub för Western blot-analys av proteinnivåer i utarmat cell extrakt (se figur 3a). Kassera återstående supernatanten.
- För att tvätta flagg agaros pärlor, tillsätt 4 mL IsoWB och Omsuspendera. Pellets pärlor vid 400 x g i 1 min vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten. Upprepa 4x.
Anmärkning: För stränga tvättar av formaldehyd tvärbunden IPs, 0,1% vardera av SDS och natriumdeoxycholat kan ingå i tvättbuffert för de första två tvätta steg.
5. RNase I matsmältning
- Späd RNase I till 0,002-0,01 enheter/mL i 750 μL IsoWB (lämplig koncentration för önskad storlek på fotavtryck måste bestämmas empiriskt). Tillsätt IsoWB-RNase I till tvättad flagg agaros pärlor och inkubera med mild blandning vid 4 ° c I 10 min.
- Pellets pärlor vid 400 x g i 1 min vid 4 ° c. Samla 20 μL supernatanten (RNase I eluering) i en märkt tub för Western blot-analys. Kassera IsoWB-RNase I och tvätta flaggan aguppstod pärlor 4x med IsoWB som beskrivs i steg 4,3.
6. affinitet eluering
- Förbered ett lager av elutionsbuffert (flagga peptid vid 250 ng/mL i IsoWB). Applicera 375 μL av elutionsbufferten för att flagga agaros pärlor och skaka försiktigt vid 4 ° c för 1-2 h. Pelletflaggan aguppstod pärlor och samla en 15 μL alikvot av elueringen för västra blot av proteiner i flagg-IP (se figur 3a).
Anmärkning: När affinitetselueringen pågår kan avsnitt 7 utföras.
7. magnetisk pärla-antikropps konjugering
- Tvätta 50 μL magnetiska pärlor (dvs. Dynabeads; Tabell över material) 3x i 1 mL IsoWB i 1,5 mL tub. Omsuspendera magnetiska pärlor i 100 μL konjugeringsbuffert. Tillsätt lämplig mängd antikroppar (exakt mängden antikroppar som ska användas för IP måste bestämmas empiriskt för varje antikropp).
Anmärkning: Protein en magnetisk pärlor är optimala för antikroppar som produceras på kanin medan protein G magnetiska pärlor är mer lämpade för musantikroppar. Magnetiska pärlor Kompatibilitetsdiagram finns på leverantörens webbplats för att välja pärlor lämpliga för varje antikropp. - Tvätta magnetiska pärlor 2x i konjugering buffert (tabell 1). Inkubera blandningen i rumstemperatur i minst 10 min. Omsuspendera magnetiska pärlor i 375 μL av RIPiT utspädnings buffert. Förvara på is tills nästa steg.
8. andra immunoprecipitation
- Applicera återstående flagg tillhörighet eluering från steg 6,1 till magnetiska pärlor kopplade till antikroppar mot proteinet av intresse. Inkubera med mild blandning vid 4 ° c för 1-2 h. fånga magnetiska pärlor på en magnet och samla 15 μL av supernatanten för analys av obundna proteiner via Western blot. Tvätta magnetiska pärlor 7X med 1 mL IsoWB.
9. denaturering av elueringsmedel
- Tillsätt 100 μL klar provbuffert (tabell 1) till magnetiska pärlor och Omsuspendera med en P200-pipett. Inkubera på isen i 10 min. svep försiktigt för att Omsuspendera pärlor regelbundet.
- Fånga magnetiska pärlor på en magnet och samla in 15 μL eluering för analys av proteiner i RIPiT eluering via Western blot (se figur 3a). Överför resterande eluering till en ny märkt 1,5 mL tub.
Anmärkning: Om proverna var formaldehyd tvärbunden, då proverna måste inkuberas vid 65 ° c för 1 h att vända tvärbindning. - Utför västerländska blotting på prover som samlats in i olika steg (input, flagga IP utarmning, flagga IP, andra IP utarmning, andra IP eluering). Blot med antikroppar mot de två bete proteiner, deras andra interactmedlemmar om kända, och minst en icke-samverkande RBP som en negativ kontroll (figur 3a).
10. RNA-extraktion och härdning
- Till RIPiT eluering, tillsätt 320 μL av RNase-fri ddH2O, 400 μl fenol-kloroform isoamylalkohol (PCIAA, pH 4,5), och Vortex för 30 s och snurra i rumstemperatur på 12 000 x g för 5 min. samla 350 μl vattenfas i ett separat rör. Tillsätt 35 μL 3 M natriumacetat, 1 μL 1 M MgCl2, 10 μg glykogen och 1 ml 100% etanol. Inkubera över natten vid-20 ° c.
- Till pelletrna, Centrifugera vid 12 000 x g i 30 min vid 4 ° c. Tvätta RNA i 70% etanol.
- För att ta bort 3 ' fosfat kvar på RNA efter RNase jag klyvning, Omsuspendera RNA pellet i 17 μl av RNase-fri DDH2O, och tillsätt 2 μl av 10X T4 inbegripet Kinas (pnk) buffert (tabell över material) och 1 μl T4 pnk. Inkubera vid 37 ° c i 30 min.
Anmärkning: Den 3 ' phosphatase aktivitet av T4 PNK har optimal aktivitet vid pH 617. PNK-reaktionsbufferten är optimerad för 5 ' Kinas aktivitet av T4 PNK och har ett pH på 7,6. Medan justering av pH i slutet härdnings reaktion har försökt, kan detta steg optimeras ytterligare. - Tillsätt 380 μL av RNase-fritt ddH2O och 400 μl av PCIAA pH 4,5 till röret. Vortex för 30 s, Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min. samla vattenfas och tillsätt 35 μl av 3 M natriumacetat, 1 μl 1 M mgcl2, 10 μg glykogen och 1 ml 100% etanol.
- Inkubera över natten vid-20 ° c. Pellets och tvätta RNA med 70% etanol enligt ovan. Omsuspendera RNA i 4,5 μL av RNase-fritt vatten.
11. uppskattning av RNA-fotavtryck storlek och överflöd
-
En lyckad RIPiT förväntas ge 1 pmol eller mer av RNA-fragment. För att kvantifiera faktisk avkastning, överför 0,7 μL av RIPiT RNA (~ 1/6 av total avkastning) till ett nytt rör. Tillsätt 2 μL 10X T4 PNK-buffert, 1 μL 1 mM ATP, 40 μCi γ32P-ATP (0,5 − 1,0 μl av beståndet) och 1 μl T4 pnk. Justera volymen till 10 μL och inkubera vid 37 ° c i 30 minuter.
- Vid parallella PNK-reaktioner, märk en DNA-stege med låg räckvidd och 0,1 pmol av ett syntetiskt RNA eller DNA oligo (20-40 NT) för att använda en storleks-och kvantitetsstandard.
- Lös märkt RNA/DNA på 26% urea-PAGE gel (20 x 27 x 0,45 mm3). Gel måste Pre-Run för 30 min vid 35 W. Spola brunnar före Pre-Run och innan lastning prover och kör på 35 W tills Bromofenolblåttlösning Blue Dye fronten har nästan nått slutet av gelen.
- Försiktigt bort gel från glasplattor på en bit av 8 x 11 tum filterpapper. Med gel ovanpå papper, placera i gel torkapparat och täck med en bit plastfolie. Torr gel vid 80 ° c i 1 h med vakuum.
- Exponera torkad gel till en fosfoscreen över natten eller tills adekvat signal upptäcks. Bildfosfoscreen. God kvalitet RNA från en RIPiT bör visas som ett utstryk i körfältet, med minimala framträdande band (figur 3B). För att kvantifiera RNA, jämför signalintensitet av önskad storlek RNA fragment i RIPiT Lane till signalen från 0,1 pmol av märkta syntetiska oligo.
Anmärkning: Alternativt kan RNA-fotavtryck storlek och belopp verifieras med hjälp av en hög känslighet bioanalyzer (figur 3C).
12. adapter ligering
- Förbered RIPiT RNA så att minst 3 pmol av RNA löses i 3,8 μL vatten.
- I en 0,2 mL polymeras kedjereaktion (PCR) rör, kombinera 3,8 μL av RNA, 1 μL av miR-CAT-33 pre-adenylated adapter (7 μM) (tabell över material). Inkubera blandningen på en termisk apparat vid 65 ° c i 10 min, 16 ° c i 5 min, håll sedan vid 4 ° c.
Anmärkning: Den pre-adenylerade länkaren kan antingen beställas från oligo syntes service, eller en anpassad unadenylerad DNA oligo från någon oligo syntes tjänst kan adenyleras med hjälp av MTH RNA Ligase (tabell över material) och gel renas. - Till samma rör, tillsätt 1,5 μl av 10X T4 RNA Ligase buffert, 7,5 μl av 50% polyetylenglykol 8000 (PEG-8000), 0,75 μl av 20 mm Ditiotreitol (dTT), och 0,45 μl av T4 RNL2 tr. K227Q (tabell över material).
Anmärkning: 50% PEG-8000 levereras med RNA Ligase och buffert köpt. PEG-8000-lösningarna är trögflytande och bör pipetteras långsamt. - Inkubera reaktionen i värmecyklaren vid 30 ° c i 6 timmar, Värm upp ligasen vid 65 ° c i 10 min och håll sedan i 4 ° c.
13. omvänd Transkription
- Till röret med ligationsblandningen från steg 12,4, tillsätt 11,25 μL 4x deoxynukleotidtrifosfat (dNTP) blandning, som innehåller en blandning av regelbundna och biotinylerade dNTPs (se tabell 1), 1,0 μl av 10 μm RT primers (tabell över material), och 6,8 μl av RNase-fritt vatten. Inkubera vid 65 ° c i 5 min, håll sedan vid 4 ° c.
- Överför rören till is och tillsätt 9,0 μL 5x första-Strands (FS) buffert utan MgCl2 (tabell 1), 2,25 μl av 100 mM DTT, 1,2 μl omvänt transkriptasenzym till en slutlig volym på 45 μl (tabell över material).
- Inkubera i en termisk apparat vid 55 ° c för 30-60 min. Värm avaktivera omvänd transkriptas vid 70 ° c i 15 min och håll provet vid 4 ° c.
14. rening av RT-produkter
- Tillsätt 45 μL 2x urea-lastbuffert (tabell 1) till RT-reaktion. Späd 1 μg av en DNA-stege med låg räckvidd i 45 μL och tillsätt 45 μL 2x urea-lastbuffert.
- Förbered 10% urea-PAGE gel (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabell 1) med 8-well kam. Med hjälp av spruta eller pipet, spola brunnar med 0,5 x Tris/borate/EDTA (TBE) buffert.
Anmärkning: De hemgjorda geler ovan erbjuder bättre upplösning i att separera den utökade RT produkten från den oförlängda RT primer. Som ett alternativ, pre-Cast urea-PAGE Gels kan också användas (tabell över material). Som pre-Cast Gels tillåta mindre maximala volymer per brunn, så prover kommer att behöva delas upp i flera brunnar. Pre-Cast Gels bör köras vid 150 − 200 V. - Pre-Run gelen på 35 w för 30 min. Spola brunnar igen, lastprover och kör gel på 35 W tills Bromofenolblåttlösning blå färgämne fronten har migrerat till ca 1 tum från slutet av gelen.
Anmärkning: Använd metall kylfläns under Pre-Run och den sista körningen för att förhindra att gelen överhettas. - Fläcken gelen i 5 min i 1x guld nukleinsyra gel fläck lösning beredd i 0.5 x TBE. Detta färgämne är ljuskänsligt, så undvik ljus exponering.
- Image gel på fluorescerande scanner för dokumentationsändamål med 520 Nm excitation och 580 nm emissions filter. Om en fluorescerande skanner inte är tillgänglig, Använd en blå ljus transilluminator. RT-produkten ska visas som ett utstryk som börjar ovanför den ej utökade RT-primern (figur 4).
Anmärkning: Även om guld nukleinsyra gel färgning färgämne är lätt visualiseras på en gel doc med UV-ljuskälla, är det viktigt att inte utsätta den värdefulla RT produkten till UV för att förhindra skador. - Visualisera gelen på en blå ljus transilluminator och accis RT produkten från gelen. Det rekommenderas att skära DNA med förlängningar som sträcker sig från 30-200 NT (figur 4). Placera de exciderade gel bitarna på en ren yta och finhacka segmentet i små bitar för att öka ytans yta. Överför försiktigt till ett 1,5 mL-rör och tillsätt 800 μL DNA-elutionsbuffert (tabell 1).
- Inkubera gel bitarna med skonsam blandning med DNA-elutionsbuffert över natten vid rumstemperatur.
- Separera elutionsbufferten från gelen genom att passera flytgödsel genom en cellulosaacetatfilterkolonn (tabell över material) placerad i ett 2 ml samlingsrör.
- I 1,5 ml tub, tvätta 10 μl konjugerat magnetiska pärlor med 500 μl konjugerat pärla tvättbuffert (tabell 1). Upprepa för tre totala tvättningar. Låt inte pärlorna torka ut. Omsuspendera pärlor i 10 μL DNA-elutionsbuffert (tabell 1).
- Överför elueringbufferten separerad från gel bitarna i steg 14,8 till röret som innehåller de tvättade konjugerat magnetiska pärlor.
- Inkubera med skonsam blandning i minst 8 h vid rumstemperatur. Fånga pärlor på en magnet, ta bort supernatanten och Omsuspendera magnetiska pärlor i 10 μL av RNase-fritt vatten och överför till ett 0,2 mL PCR-rör.
15. cirkularisering av RT-produkten
- RT produkter fångas på konjugerat pärlor är cirkulariserad medan bunden på pärlor. Till den magnetiska pärla slurry, tillsätt 2,0 μL av 10X circularization reaktion buffert, 1,0 μL av 1 mM ATP, 1,0 μL av 50 mM MnCl2, 4,0 μl av 5 M betain, 1,0 μl av ssDNA Ligase I (tabell över material), och 1,0 μl av RNase-fritt vatten.
- Inkubera den circularization reaktionen på en termisk apparat på 60 ° c för 4 h. Värm inaktivera ssDNA Ligase i genom upphettning vid 80 ° c i 10 min sedan hålla vid 4 ° c.
16. test-PCR
- Innan du fortsätter till en storskalig PCR, Använd en del av circularized produkt för att bestämma det ideala antalet amplifikationscykler för varje prov. Detta steg hjälper till att förhindra överamplifiering och begränsa PCR-artefakter som PCR-reaktionskomponenter blir begränsande vid högre PCR-cykler.
- Bered en 45 μL PCR-reaktion med 4,0-6,0 μL av den cirkulariserade produkten från steg 15,2, 9,0 μL 5x reaktionsbuffert, 0,9 μL 10 M dNTPs, 2,25 μL av 10 μM PE 1.0-primer (tabell över material), 2,25 μl av 10 μm PE 2.0-primer (tabell över material) , och 0,045 μL av HiFi-DNA-polymeras (tabell över material) och vatten.
- Blanda reaktions brunnen och dela upp i 3 15 μL-reaktioner. Var och en av dessa tre reaktioner kommer att genomgå ett varierande antal PCR-cykler. Det ideala antalet cykler förväntas vara mellan 7 och 14. Så utför test PCRs för 8, 11, och 14 cykler.
- Använd följande PCR-villkor: 98 ° c-30 s; 98 ° c-5 s; 65 ° c-10 s; 72 ° c-15 s; 72 ° c-2 min; 12 ° c-håll.
- Tillsätt 3 μL 6x gel lastning färgämne och lösa på 10% infödda sida gel tills blå färgämne fronten har migrerat 3/4 av gelen. Fläcken gelen med hjälp av guld nukleinsyra gel fläck och bild som i steg 14,4 och 14,5 (figur 5).
- För att välja det ideala antalet PCR-cykler, jämför PCR-produkter från ökande antal cykler. Välj det cykel nummer som ger den största mängden av produkten av förväntad storlek utan överamplifiering artefakter (t. ex., DNA smeta mycket större än förväntat produkt, och där ingen märkbar utarmning av PE 1.0 och PE 2.0 primers ses (se röd pil i Figur 5).
17. storskalig PCR
- Bered en 45 μL PCR-reaktion, som i steg 16,2 och upprepa PCR. Lösa PCR på 10% infödda sida vid 150 V, fläcken med 1x guld nukleinsyra gel fläck och bild på en blå ljus transilluminator.
- Punktskatten på PCR-produkten från gelen och överför till en 3 mL spruta. Använd sprutan för att krossa gelen och extrudera i ett 1,5 mL-rör.
Anmärkning: Den oförlängda RT-produkten på circularization avkastningar PCR-produkt av 151 BP. Således, i detta steg en bör storlek välja produkter som är större än 151 BP (figur 6). - Tillsätt 900 μL DNA-elutionsbuffert och inkubera vid rumstemperatur över natten med skonsam blandning.
- Överför gel flytgödsel till en cellulosa acetat filter kolumn placerad i ett 2 ml uppsamlings rör. Snurra på 12 000 x g i 3 min, samla supernatanten i en fräsch tub.
- Tillsätt ytterligare 400 μL DNA-elutionsbuffert till den krossade gelen och överför till ett 1,5 mL-rör. Inkubera med mild blandning i ytterligare 4 timmar för en andra eluering.
- Pool alla elutioner och delas upp i 3 rör med 400 μL vardera. Fällas DNA genom tillsats av 1 mL 100% etanol och 10 μg glykogen. Virvel och inkubera minst 2 h vid-20 ° c.
- Pelletdna vid 12 000 x g i 30 min vid 4 ° c. Tvätta DNA-pelleten med 70% etanol.
- Ta försiktigt bort all etanol genom att Pipettera och snabbt Omsuspendera DNA-pelleten i 20 μL vatten.
Anmärkning: I detta skede är det viktigt att inte låta DNA-pelleten bli torr, som torkning DNA ut kan denaturera den. - Använd en liten del av DNA-provet för att bestämma storlek och koncentration av PCR-produkten via fluorometer och hög känslighet DNA bioanalyzer. Exempel kan nu skickas för sekvensering på en av plattformarna.
- De sekvenserade läsningarna kan bearbetas (t. ex. borttagning av kort, trimning för att hålla sekvenser > 30 Phred score), justerade till referensgenomet och visualiseras på en webbläsare som UCSC Genome browser (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik RIPiT kommer att resultera i immunoprecipitation av både proteiner av intresse och andra kända samverkande proteiner, och avsaknaden av icke-interagerande proteiner. Som framgår av figur 3Aupptäcktes både magoh och EIF4AIII i ripit-ELUERINGEN, men HNRNPA1 var inte (Lane 6). Samtidigt detekterades RNA-fotavtryck som har samrenat med RNP-komplexen via autoradiografi (figur 3B) eller bioanalyzer (figur 3C). Puromycin behandling förväntas öka EJC beläggning på RNA, och en starkare RNA fotavtryck signal observerades i puromycin behandlade RIPiT i figur 3B (jämför körfält 2 och 3). Generera prover för djupsekvensering kräver ligating en adapter till RNA, och sedan omvänd transkribera RNA till DNA med hjälp av en primer som glöden till adaptersekvensen. Den omvända transkription steg innehåller en nukleotider, för rening av omvänd Transkription produkt. Efter omvänd Transkription måste produkten separeras från den icke utökade adaptern genom urea-sidan (figur 4). Omvänd Transkription produkten är sedan cirkulariserad och PCR Amplified. Det lämpliga antalet PCR-cykler får inte överamplifiera den cirkulariserade produkten. Överamplifiering kommer att resultera i primer utarmning och avvikande PCR-produkt (se figur 5, Lane 4). Antalet cykler med den största amplifieringen utan tecken på överamplifiering är lämpligast att använda för en storskalig PCR (figur 5 Lane 3 och figur 6).
Figur 1 : Schematisk beskriver de viktigaste stegen i RIPiT. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk skildrar arbetsflödet för omvandling av RIPiT RNA i bibliotek för hög dataflöde sekvensering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Uppskattning av RNA och protein avkastning från RIPiT. (A) västra blot av proteinerna renas från varje större steg i ripit förfarandet. (B) autoradiograph bild av RNA-fotavtryck från en flagga-magoh: EIF4AIII ripit jämföra puromycin behandlade och obehandlade celler. Röd ruta anger RNA-fotavtryck storlek som i slutändan kommer att konverteras till sekvenserings bibliotek. C) profilen för RNA som elueras från ripit som i Lane 2 i panel B när den visualiseras med hjälp av en bioanalyzer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Omvänd Transkription (RT) produkt lösas på en 10% urea-Page gel och färgas med guld nukleinsyra gel fläck. Röd ruta indikerar gel region censurerade för gel rening av Extended RT produkter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Test PCR löst på 8% icke-denaturing sida. Observera de avvikande stora PCR-produkterna som uppträder vid 14 cykler (röd ruta) och parallell utarmning av primers (röd pil) som indikerar överamplifiering. För detta prov valdes 11 cykler för den storskaliga PCR (Blue Box). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Storskalig PCR löst på 8% icke-denaturing sida. Röd ruta indikerar gel biten som är exciserad för gel rening. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Arvsmassa webbläsare skärmdump av MAPK1 genen som visar fördelningen av flagga-MAGOH: EIF4AIII Footprints som representativa resultat från en RIPiT. Röda pilar betecknar de förväntade kanoniska EJC bindnings platser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Pbs | 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM na2HPO4· 7h2O KH2Po4 pH 7,4 |
|
| Quenching buffert | 2,5 M glycin 2,5 mM Tris-bas |
|
| Hypotonisk lysis buffert (HLB) | 20 mM Tris-HCl pH 7,5 15 mM NaCl 10 mM EDTA 0,5% IGEPAL 0,1% Triton-X-100 1x aprotinin * 1x Leupeptin * 1x Pepstatin * 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) * |
* måste läggas färskt varje gång |
| Isoton tvättbuffert (IsoWB) | 20 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 0,1% IGEPAL |
|
| Konjugering buffert | 0,02% polysorbat-20 1x PBS |
|
| Rensa Exempelbufferten | 100 mM Tris-HCl pH 6,8 4% SDS 10 mM EDTA |
|
| 4xdNTPmix | 0,25 mM dGTP 0,25 mM dTTP 0,175 mM dATP 0,1625 mM dCTP 0,075 mM biotin-dATP 0,0875 mM biotin-dCTP |
|
| 5x första-strand buffert w/o MgCl2 | 250 mM Tris-HCl pH 8 375 mM KCl |
|
| RIPiT utspädnings buffert (1 mL) | 1 mL IsoWB 5 μL 200x BSA 20 μL 10% Triton-X-100 20 μL 0,5 M EDTA 1x aprotinin * 1x Leupeptin * 1x Pepstatin * 1 mM PMSF * |
* måste läggas färskt varje gång |
| 2x denaturing Lastbuffert | 3 mL 5x TBE 1,8 g Ficoll typ 400 6,3 g urea 3 mg bromofenol blå 3 mg xylen cyanol Justera volymen till 15 mL ddH2O |
För att komma in i lösningen, placera röret i vatten i en bägare och koka på värmeplattan i 10 – 15 min. Tillsätt färgämnen efter justering av volymen till 15 mL |
| Urea-PAGE gel | 6 M urea Akrylamid: bisacrylamid (40% [w/v]) till lämplig procentsats 0.5 x TBE 0,01% TEMED |
|
| DNA-Elueringbuffert | 300 mM NaCl 1 mM EDTA |
|
| Streptavidin pärla tvättbuffert | 0,5 M NaOH 20 mM Tris-HCl pH 7,5 1 mM EDTA |
Tabell 1: buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi diskuterar här några viktiga överväganden för att framgångsrikt utföra RIPiT. Främst måste enskilda IP-adresser optimeras för att uppnå högsta möjliga effektivitet vid varje steg. Mängden flagg-Agreste pärlor för inmatnings antalet celler som beskrivs här har visat sig vara robust för ett brett spektrum av proteiner vi har testat. Eftersom endast en bråkdel av partner proteiner är co-immunoprecierade med flagg proteinet, är den mängd antikroppar som behövs för effektiv andra IP vanligtvis låg (mindre än 10 μg). Småskaliga RIPiT (från 1 10 cm plattan) följt av Western blot verifiering av proteiner i varje fraktion under de två immunoprecipitation stegen visar sig vara mycket användbart för att bedöma effektiviteten och specificiteten av förfarandet innan skala upp. Både riktade proteiner och andra förväntade samverkande proteiner i komplexet bör detekteras i elueringen. Det är också fördelaktigt att assay för proteiner i de utarmade celllysat (obunden till flagg-Agreste eller magnetiska pärlor) att ha en bra uppskattning av immunoprecipitation effektivitet och andelen proteiner som monteras i ett komplex. Vidare, denna analys informerar också om RNase digestionsförhållanden är tillräckliga för att separera RNA-beroende interaktioner från RNA-oberoende interaktioner inom en RNP. Därför är det lika viktigt att inkludera en negativ kontroll, helst en RBP med anknytning till RNP av intresse. Till exempel, i figur 3A, HNRNPA1 är närvarande i ingången men inte detekteras i ripit eluering. HNRNPA1 är en RBP som inte direkt interagerar med EJC men interagerar indirekt med EJC när EJC och HNRNPA1 är bundna till samma RNA-molekyl. Detektion av det negativa kontroll proteinet i elueringen indikerar antingen dålig Ristolspecificitet eller otillräckligt RNA-fottryck. I ett sådant fall kommer de RNA-fotavtryck som erhålls inte att helt återspegla det protein som intresserar. Fotavtryck av storlek 50-200 NT rekommenderas för efterföljande RNA-SEQ. varaktigheten av RNase I behandling eller mängden enzym som används kan optimeras för att få önskad storlek fotavtryck. Observera att det bästa scenariot kommer att vara att få bra signal i önskad storlek intervall, och det är oundvikligt att ha längre och kortare RNAs även i de mest optimala förhållanden. RIPiT kan också användas för att få bindningsställen för en enda RBP. I ett sådant fall kan samma protein immunoprecipitated med två olika antikroppar, först med en antikropp mot en affinitet tagg och sedan med antikroppar mot proteinet själv18. Slutligen kan en negativ kontroll RIPiT utföras parallellt från celler som uttrycker en flagga-märkt kontroll protein (t. ex., grönt fluorescerande protein) i kombination med antikropp mot ett protein mot en icke-närstående protein under den andra UNDERSÖKNINGSPERIODEN.
Trots sina många fördelar, det är viktigt att överväga vissa begränsningar av RIPiT tillvägagångssätt, och möjliga åtgärder. Kravet på affinitet eluering efter den första rening kräver den biologiska källan för att uttrycka ett märkt protein. Om ett platsspecifikt återkombinations system inte finns tillgängligt i den cell linje eller organism av intresse, en kort affinitet tagg såsom en flagga tagg (8 aminosyror) kan införas på endogena genen Locus med CRISPR/CAS-baserade genom redigering metod19. FLAGGAN taggen är en idealisk epitop för detta tillvägagångssätt, eftersom flagg antikroppen är väl lämpad för affinitet eluering och tål höga Joniska styrkor och milda denaturerande förhållanden som kan användas i kombination med formaldehyd crosslinking. En annan begränsning av RIPiT-metoden är kravet på en stor insats av cellulära material. Detta kan förbli oundvikligt i viss utsträckning som endast en liten andel av en RBP sannolikt interagerar med andra proteiner i RNP. Ännu bättre bibliotek förberedelse metoder kan bidra till att få ner stora ingångs krav. Möjliga idéer för att ytterligare effektivisera dessa steg inkluderar att utföra RNA 3 '-End Defosforylering och adapter ligering på de magnetiska pärlorna omedelbart efter andra IP tvättar och före den slutliga elueringen av RNP. Ett sådant tillvägagångssätt genomförs framgångsrikt i nuvarande CLIP-SEQ-procedurer och i en nyligen beskriven variant av RIPiT20. Sådana förändringar kommer också att ta bort flera tidskrävande RNA reningssteg från de tidiga faserna av bibliotekets förberedelse förfarande. Vidare, till skillnad från CLIP, som ger en nukleotid nivå upplösning av crosslinking plats av en RBP på RNA, upplösning av RIPiT Footprints kommer att förbli på nivån av tiotals nucleotides. Slutligen, eftersom RNPs kan omfatta flera RBPs, den RIPiT berikade RNA-platser inkluderar en blandning av bindningsställen i många RBPs. Som konsensus sekvenser bundna av enskilda RBPs håller på att avslöjas i en snabbt ökande takt och är nu lätt tillgängliga21,22,23, kan denna information utnyttjas för att deconvolve sortimentet av RBP webbplatser Berikad med RIPiT-utgångar. Trots dessa utmaningar, är ripit-SEQ ett effektivt förfarande för att fånga RNA-fotavtryck av dynamiska, heterogena och till och med övergående RNP-komplex, som kan ge unika insikter i det inre arbetet i RNA-maskiner som styr cellulära Funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant GM120209 (GS). Författarna tackar OSUCCC Genomics Shared Resources Core för sina tjänster (CCC stöd Grant NCI P30 CA16058).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1,000 U | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
