Summary
Vi demonstrerer en metode til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning på grundlag af sædcelle morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning ved hjælp af et epifluorescens mikroskop.
Abstract
Blomstrende planter har en unik seksuel reproduktion system kaldet ' dobbelt befrugtning ', hvor hver af sædcellerne præcist sikringer med en ægcelle eller en central celle. Således to uafhængige befrugtning begivenheder finder sted næsten samtidig. Den befrugtede ægcelle og central cellen udvikler sig til henholdsvis zygote og endosperm. Derfor er præcis kontrol af dobbelt befrugtning afgørende for den efterfølgende frøudvikling. Dobbelt befrugtning forekommer i den kvindelige gametofhyte (embryo SAC), som er dybt skjult og dækket med tyk ovule og ovarie væv. Dette tissuevæv konstruktion gør observation og analyse af dobbelt befrugtning ganske vanskeligt og har skabt den nuværende situation, hvor mange spørgsmål vedrørende mekanismen for dobbelt befrugtning forbliver ubesvarede. For den funktionelle evaluering af en potentiel kandidat til befrugtning regulator, fænotypiske analyse af befrugtning er vigtig. At bedømme færdiggørelsen af befrugtning i Arabidopsis thaliana, formerne af fluorescens signaler mærkning sædkerner anvendes som indikatorer. En sædcelle, der undlader at gøde, er indikeret med et kondenseret fluorescens signal uden for de kvindelige kønsceller, hvorimod en sædcelle, der med held befrugte, er indikeret af et dekoncentreret signal på grund af efter med de kvindelige gameter ' Nucleus. Den beskrevne metode giver et værktøj til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning under in vivo betingelser.
Introduction
Blomstrende planter producerer frø gennem dobbelt befrugtning, en proces, der er direkte kontrolleret af interaktioner mellem proteiner lokaliseret på gamet plasma membran1,2. Blomstrende plante mandlige gameter, et par sædceller, udvikle i pollen. Et pollen rør, der vokser efter bestøvning leverer et par sædceller til kvindelige gameter, en ægcelle og en central celle, der udvikler sig i en embryo SAC. Efter det mandlige og kvindelige mælke herfra mødes, fremmer proteiner på gamet overfladen genkendelse, fastgørelse og fusion for at fuldføre dobbelt befrugtning. I tidligere undersøgelser blev de mandlige gamet membran proteiner generative celle specifikke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 og gamet udtrykt 2 (GEX2)5 identificeret som befrugtning regulatorer involveret i gamet fusion og vedhæftet fil. Vi har for nylig identificeret en mandlig gamet-specifikke membran protein, DUF679 Domain membran protein 9 (DMP9), som en befrugtning regulator involveret i gamet interaktion. Vi konstaterede, at et fald i DMP9 ekspression resulterer i signifikant hæmning af ægcelle befrugtning under dobbelt befrugtning i en. thaliana6.
Som dobbelt gødskning forekommer i en embryo SAC, som er indlejret i en ovule, der er yderligere pakket med ovarie væv, er det vanskeligt at observere og analysere de stater, dobbelt gødskning processer. Af denne grund er der stadig mange uklare punkter, der hindrer en fuldstændig forståelse af hele mekanismen for dobbelt befrugtning kontrol. Etableringen af observations teknikker til at spore mælke herfra opførsel under dobbelt befrugtning under in vivo-betingelser er uundværlig for den funktionelle analyse af potentielle kandidater til gødskning regulerende myndigheder. Nylige undersøgelser har givet markør linjer, hvor gamet subcellulære strukturer er mærket med fluorescerende proteiner. I denne artikel viser vi en enkel og hurtig protokol til observation af dobbelt befrugtning, som er forekommet i et embryon, der er afledt af kunstigt bestøverede pisken. Brug sædcelle Nucleus markør linje HTR10-mrfp7, gødskning tilstand af hver kvindelig gamet kan blive diskrimineret på grundlag af sædceller nukleare signal morfologi. Vores protokol med fokus på en sådan morfologisk ændring af sædkerner ved befrugtning kan effektivt opnå en tilstrækkelig mængde data til statistisk bevis. En DMP9-Knockdown-linje med HTR10-mrfp-baggrund (DMP9Kd/HTR10-mrfp) blev brugt som mandlige planter til at vise et enkelt befrugtnings mønster. Protokollen er også velegnet til funktionel analyse af andre gødskning regulerende myndigheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstig bestøvning
Bemærk: Før du starter processen, kræves et par 5-pincet.
- Vokse en. thaliana (Col-0) ved 22 °c under en 16-h lys/8-h mørk cyklus i et vækstkammer.
Bemærk: Skær og fjern den første udviklede blomst stilk med en saks for at fremme udviklingen af axillær knopper. Kraftigt voksende planter (2-3 uger efter opskæring af den første stilk; Plant højde ca. 25 cm) er egnet til analyse. - Til emasculate, Fjern sepal (figur 1b), kronblad (figur 1c), og støvdrager (figur 1d) af blomsterknopper på stadie 118 (figur 1a) ved hjælp af No. 5 pincet. Knop med bits af kronblade set på toppen er bedst.
Bemærk: Brug en egnet kvindelig gamet markør linje. I denne protokol brugte vi en vildtype plante som den kvindelige forælder. - Femten til atten timer efter emasculation, tag støvdrager af en DMP9Kd/HTR10-mrfp blomst på etape 138 ved at klemme glødetråden med tang.
- For at bestøve, forsigtigt Pat stigmatiseringen af en udglødet pitil flere gange med en dehiscent anther.
2. fremstilling af ovule til observation
Bemærk: Følgende elementer kræves: et slide glas med dobbeltklæbende tape påsat, No. 5 pincet, en 27 G kanyle og et dissekere mikroskop.
- 7 til 8 h efter bestøvning (HAP), indsamle fiskene og placere det på den dobbeltsidet tape, tryk derefter forsigtigt med tang til at fastsætte den piske på båndet (figur 2a, A ').
Bemærk: De fleste ægler i en fisk får mindst ét pollen rør 10 HAP9. Hvis begge eller en af de sædceller fra den første pollen rør undlader at gøde, en anden pollen tube ville blive tiltrukket af ovule på grund af gødskning opsving system10. For at analysere sædcellerne morfologi fra den første pollen tube, anbefales det at fuldføre ovule forberedelse af 10 HAP senest. - Afskårne de øvre og nedre ender af æggestokkene ved hjælp af en kanyle under et dissekere mikroskop (figur 2b, B ').
- Slids ovarie væggen langs begge sider af replum (figur 2c, C ') ved at flytte spidsen af kanylen.
Bemærk: Indsæt injektionsnål for at forhindre ægdeling fra septum. - Ovarie væggen ved hjælp af kanylen (figur 2D, D ').
- Klem bunden af septum, som æganlæggene er forbundet med, og løft den forsigtigt med pincet (figur 2E).
- Overfør ovlerne til en dråbe vand på et glas, og dæk forsigtigt med et dækglas til observation under et fluorescens mikroskop (figur 2E, E ').
3. mikroskopi
Bemærk: I denne protokol brugte vi et epifluorescens mikroskop udstyret med en fluorescens filter kube (Se tabel over materialer), et digitalt kamera og den medfølgende software.
- Erhverve billeder af ægler indeholdende sædkerner mærket med mRFP ved hjælp af en 20x eller 40x objektiv linse og udstyret digital kamera.
- Bekræft antallet af mRFP-mærkede sædkerner i et embryo-SAC.
Bemærk: Ovules, der indeholder to mRFP-mærkede sædkerner, kan inkluderes i populationsstørrelsen til statistisk analyse. - Bekræft formen og positionen af hver enkelt mRFP-mærket sædcelle i et embryon.
Bemærk: Umiddelbart efter at være blevet frigivet fra et pollen rør, er et par kondenserede mRFP-mærkede sædkerner lokaliseret mellem ægget og den centrale celle. En dekomprimeret mRFP-mærket sperm kerne detekteret ved siden af chalazal end indikerer central celle befrugtning, for eksempel. Ved hjælp af en egnet kvindelig gamet membran markør linje, som vist i supplerende figur 1, uanset om sædcellen undergår plasmogamy (efter membran fusion, men før karyogamy) kan overvåges tydeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ægler fra en fisk, der er pollineret med DMP9Kd/HTR10-mrfp , blev indsamlet ved 7-8 Hap og observeret.
De fleste æganlæggene indeholdt to dekomprimeret mrfp-mærkede sædkerner ved ægcellen (micropylar side) og central celle (charazal end side) Nucleus positioner (figur 3a), hvilket indikerer vellykket dobbelt befrugtning. Desuden blev der observeret ægler indeholdende en dekomprimeret mRFP-mærket sædkerne ved den centrale cellekerne plus en kondenseret sædcelle i mRFP uden for ægcellen (figur 3b), hvilket indikerer enkelt befrugtning. I tilfælde af mislykket dobbelt befrugtning blev to kondenserede mRFP-mærkede sædkerner observeret ved grænsen af ægcellen og den centrale celle (figur 3c), som i gcs1 mutant sædceller (figur 3D)3,4 .
I analysen ved hjælp af DMP9Kd/HTR10-mrfp pollen blev ægler, der indeholder en enkelt kondenseret sædcelle mærket med Mrfp (figur 4a) eller tre eller flere Mrfp-mærkede sædkerner (figur 4b), sjældent observeret.
Figur 1: blomsterknopper egnet til emasculation. (A) en blomsterknop på etape 11, der viser stumper af kronbladene øverst. (B-D) En blomst knop, hvor blev fjernet sepalerne (B) og kronblade (C), og det blev derefter udglødet helt (D). Den anther dehiscens har ikke fundet sted endnu. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: flow af prøveforberedelse af ovule. Fremgangsmåderne er vist ved illustrationer (a-e) og fotografier (a '-e '). (a, a ') En fisket er placeret på dobbeltsidet tape fastgjort til et dias glas, og dens øvre og nedre ender er afskåret med en kanyle. (b, b ') Ovarie væggen indsnit langs begge sider af replum. (c, c ') Begge sider af æggestokkene åbnes, everted, og presses på båndet til fastgørelse. (d, d ') Septum, hvor æganlæggene er forbundet i arrays er udsat. (e, e ') Den ene ende af septum er klemt og løftet op med pincet. Septum med forbindende æganlæggene overføres til en dråbe vand på et glas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: befrugtning fænotyper bedømt af sperm nukleare signal morfologi i ovule. A) vellykket dobbelt befrugtning indikeret af to dekomprimeret mrfp-mærkede sædkerner (arrowheads). B) enkelt befrugtning af DMP9Kd/HTR10-mrfp -sædceller indikeret af en dekomprimeret mrfp-mærket sædcelle (Arrowhead) og en kondenseret mrfp-mærket sædcelle (pil). C) mislykket dobbelt befrugtning af DMP9Kd/HTR10-mrfp -sædceller indikeret af to kondenserede mrfp-mærkede sædkerner (pile). (D) et eksempel på mislykket dobbelt befrugtning af Gcs1HTR10-mrfp sædceller. En markør linje, hvor ægcelle kernen (EN) er mærket med RFP, blev anvendt. To kondenserede mRFP-mærkede sædkerner (pile) arresteres uden befrugtning ved 18 HAP. E) skematisk illustration af en ovule. EC = ægcelle, CC = central celle, SC = synergiske celler, ES = embryo SAC, MP = Micropyle, CHZ = chalazal ende. Skala stænger = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: andre muligheder befrugtning fænotyper. Ægler fra en fisk, der er pollineret med DMP9Kd/HTR10-mrfp , indeholder sjældent en enkelt kondenseret sædcelle (a), eller tre eller flere kondenserede mrfp-mærkede sædkerner (B) (pile). Skala stænger = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: kondenserede sædkerner ved plasmogamy under befrugtning, bedømt ved kombination med en kvindelig plasma membran markør linje. Pfwa:: gfp-PIP hvor den centrale celle plasma membran visualiseret blev brugt som kvindelig forælder (gfp). GFP-PIP mærker også endo membraner12. Ovule indeholder to kondenserede mRFP-mærkede sædkerner (pile; RFP). RFP-signalet på charazal-slutsiden (pil) vises i den centrale celle (Flet), hvilket indikerer, at sædkernen er i plasmogamy (efter gamet membran fusion, men før karyogamy). Panelet til højre er en forstørrelse af området omgivet af stiplede linjer i det fusionerede billede. Et tomt område markeret med en asterisk svarer til positionen af den centrale cellekerne. Den stiplede linje angiver omridset af den centrale celle, som vender mod ægcellen. Skala bjælke = 20 μm. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mrfp-etiketter faderlige kromatin (dvs. visualiserer sædcelle kerner), og dynamikken i dobbelt befrugtning er blevet rapporteret7. Umiddelbart efter frigivelse fra et pollen rør, er HTR10-mRFP-mærket sædkerner stadig kondenseret. Men hver af sædkerner er dekomprimeret ved sammenlægning med en befrugtet kvindelig gamet kerne i efter tre til fire timer efter gamet membran fusion7. Ikke-befrugtede sædceller forbliver kondenserede, som vist i et embryon, hvor gcs1 sædceller arresteres uden befrugtning (figur 3D). Normalt, når den frugtbare HTR10-mRFP anvendes som pollen forælder, 57,9% ± 17,8% (gennemsnit ± s.d.; n = 16 pisker) af ægler i en sur til 7-8 HAP indeholder to mRFP-mærkede sperm kerner signaler, og næsten alle de signaler (97,2%) er dekomprimeret, hvilket afspejler vellykket dobbelt befrugtning (et lignende signal mønster er vist i figur 3a). I tilfælde af DMP9Kd/HTR10-mrfpblev ovler, der indeholder to mrfp-mærkede sædkerner, observeret med samme hyppighed som HTR10-mrfp, men 17,6% af dem viste enkelt befrugtning6. Vi vedtog HTR10-mRFP dynamik til observation af et stort antal ovler under in vivo betingelser ved hjælp af et epifluorescens mikroskop. Protokollen er enkel og hurtig, hvilket gør det muligt at indsamle tilstrækkelige data til statistisk dokumentation. Ved hjælp af denne protokol som første instans, betydningen af enkelt befrugtning af den centrale celle ved DMP9Kd/HTR10-mrfp sædceller blev vist6.
Baseret på de morfologiske forskelle på HTR10-mRFP-mærket sædkerner afledt af et pollen rør, er gødskning mønstre klassificeret i tre fænotyper: (1) vellykket dobbelt befrugtning, som er karakteriseret ved to dedensed HTR10-mRFP-mærket sædkerner (figur 3a); (2) enkelt befrugtning, som har en kondenseret HTR10-mRFP-mærket sædkerne og en dekoncentreret HTR10-mRFP-mærket sædkerne (figur 3b); og (3) mislykket dobbelt befrugtning, som har to kondenserede HTR10-mRFP-mærket sædkerner (figur 3c).
Andre potentielle årsager til fænotyper (2) og (3) bør overvejes. Det er blevet rapporteret, at sædceller henholdsvis begynder plasmogamy med en ægcelle eller central celle flere minutter efter at være blevet frigivet til et embryo-SAC under semi-in vitro-kulturforhold11. Desuden er der en tidsforskydning på et par minutter mellem den første og anden befrugtning, selv om det ikke er præference for rækkefølgen af gødskning af ægcellen og den centrale celle11. Derfor kan et par kondenserede og dekomprimeret sædkerner i fænotype (2) indikere en tidsforskydning mellem gødingerne i stedet for en enkelt befrugtning. For at bekræfte forekomsten af enkelt befrugtning med en signifikant hyppighed i fænotype (2) bør der undersøges en række prøver, der er tilstrækkelige til statistisk analyse. Fænotype (3), som har to kondenserede sædkerner (figur 3c), kunne afspejle en periode med immobilitet af sædceller før plasma membran fusion12 eller perioden mellem plasmogamy og karyogamy. Derfor afspejler to kondenserede sædkerner ved 7-8 HAP ikke fuldt ud "svigt" af dobbelt befrugtning, og det er nødvendigt at observere æglerne på et senere tidspunkt efter bestøvning for at vurdere succesen eller svigt af dobbelt befrugtning. I denne henseende, ovule observation på 16-18 Hap anbefales, fordi de fleste af æganlæggene ville have afsluttet dobbelt befrugtning med sædceller leveret af den første pollen tube, og HTR10-mrfp signaler af ubefrugtede sperm kerner ville forblive indtil den næste dag af bestøvning, som vist i figur 3D.
Et mønster af enkelt kondenseret HTR10-mrfp-mærket sperm kerne (figur 4a) blev sjældent påvist, hvilket var sandsynligt på grund af den hurtige forsvinden af en anden faderlige HTR10-mrfp signal i den befrugtede kvindelige gamet som følge af en enkelt befrugtning. I denne analyse blev tre eller flere HTR10-mRFP-mærkede sædkerner også detekteret som et sjældent tilfælde (figur 4b), på grund af anden pollen tube accept af befrugtning opsving system10. I denne protokol blev disse sager udelukket fra data, fordi sporing af opførsel af to sædceller afledt af et pollen rør er afgørende for nøjagtig vurdering.
Da polaritet for de kvindelige mælke herfra positioner i et embryon er velreguleret (dvs. ægcellen og den centrale celle differentieres ved henholdsvis micropylar og den chalazale side), som kvindelige gamet gøder, kan bedømmes af den relative positioner af de mRFP-mærkede sædkerner. Der er dog en begrænsning i at skelne mellem ubefrugtede og plasmogamy stater, fordi begge stater er angivet med kondenseret sperm kerner signal. For at vurdere præcist, om plasmogamy efter gamet membran fusion er forekommet eller ej, når sædkerner er kondenseret, er det nødvendigt at bruge kvindelige gamet membran markør linjer, som rapporteret af Takahashi et al. (2018)6. For eksempel, når en Pfwa:: GFP-PIP plante12 , hvor den centrale celle plasma membran blev visualiseret blev brugt som en kvindelig forælder, det er klart, at en sædcelle smeltet sammen med den centrale celle var i plasmogamy (supplerende figur 1 ).
Sammenfattende kan vores protokol, der er beskrevet her, bruges til statistisk vurdering af succes eller svigt af befrugtning i hver kvindelig gamete. Selv om ansættelse af den kvindelige plasma membran markør er forpligtet til at bedømme plasmogamy, vores metode er nyttig til funktionel analyse af gødskning regulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra det strategiske prioriterede forsknings fremmende program på fytokemiske plante molekyle videnskaber, Chiba University (Japan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
