Summary
Dual DNA lineal assay er udviklet til at bestemme mRNA position under ribosom translokation, som bygger på dissociations kræfterne af de dannede DNA-mRNA duplexer. Med single-nucleotid opløsning og evne til at nå begge ender af mRNA, det kan give mekanistisk indsigt for ribosom translokation og sonde andre nukleinsyre fordrivelser.
Abstract
Den ribosom translokation refererer til ribosomale bevægelse på mRNA ved præcis tre nukleotider (NT), som er det centrale skridt i proteinsyntesen. For at undersøge sin mekanisme er der to væsentlige tekniske krav. Først er en enkelt-NT opløsning, der kan løse normal translokation fra frameshifting, hvor ribosom bevæger sig med andre end 3 NT. Den anden er evnen til at sonde både indgangen og exit sider af mRNA for at belyse hele billedet af translokation. Vi rapporterer Dual DNA lineal assay, der er baseret på de kritiske dissociation kræfter af DNA-mRNA duplexer, opnået ved kraft-induceret rest magnetisering spektroskopi (virksomheder). Med 2-4 pN Force resolution er Dual lineal analysen tilstrækkelig til at skelne mellem forskellige translokation trin. Ved at implementere en lang linker på sondering DNAS, kan de nå mRNA på den modsatte side af ribosome, således at mRNA position kan bestemmes for begge sider. Derfor er Dual lineal assay unikt egnet til at undersøge ribosom translokation, og nukleinsyre bevægelse i almindelighed. Vi viser repræsentative resultater, som indikerede en loopes mRNA-konstellation og løste normal translokation fra frameshifting.
Introduction
Biomolekyler forskydning er en grundlæggende parameter i studiet af mekanismen for de relaterede biologiske funktioner. Et særligt eksempel er ribosom translokation1,2, hvor ribosom bevæger sig med præcis tre nukleotider (NT) på Messenger RNA (mRNA) normalt, og af en, to, eller andre numre af NT undtagen tre i tilfælde af frameshifting. Derfor kræves der et molekyle lineal system med en enkelt NT-opløsning for at skelne mellem de forskellige trinstørrelser. En større udfordring er at afprøve ribosom-bevægelsen på både indgangs-og udgangs siderne. Med andre ord, kun med en dual lineal system vil vi være i stand til at afsløre, om mRNA er jævnt gevind gennem ribosome, eller der er mellemliggende trin, hvor de to sider har forskellige trinstørrelser fører til en knæk eller loopes mRNA konstellation inde i ribosom.
Flere metoder er blevet udviklet for at løse den første udfordring at løse forskellige trin på exit siden af ribosom (den 3 ' ende af mRNA). Den dobbelte der-analyse løser de forskellige læse rammer ved at måle forholdet mellem de resulterende forskellige proteiner3,4. Det gælder kun for den 3 ' ende af mRNA og dermed utilstrækkelig til at give et komplet billede af translokation. Massespektrometri kan analysere de forskellige peptidfragmenter som følge af den tilsvarende kode omarrangementerne5. Men det kan ikke lokalisere, hvor mange NT ribosom bevæger sig på mRNA. Den toe-Printing assay er en anden almindelig metode, der bruger en reverse transkriptase primet på 3 '-distale ende at transskribere mRNA mod ribosom6. Men, det er ikke relevant for 5 ' ende af mRNA, der går ind i ribosome. Andre teknikker, herunder enkelt molekyle tilgange og fluorescens metoder7, er vanskelige at opnå enkelt-NT opløsning.
Vi har udviklet Dual DNA lineal assay, der entydigt kan bestemme både indgangs-og udgangspositionen for den udækkede mRNA i ribosome-mRNA-komplekser. Linealen DNAs er DNA-oligomerer, der danner duplexer af visse antal basepairs (BP) med mRNA afdækket af ribosome, uanset hvilken ende af mRNA. BP-numrene afslører derefter præcist ribosom-positionen på mRNA under translokation. Antallet af BP-numre på duplexet bestemmes af deres kritiske dissociations kræfter opnået fra kraft-induceret rest magnetiserings spektroskopi (firmaer)8. Med 2-3 pN Force usikkerhed, de kritiske kræfter er tilstrækkelige til at tilbyde single-NT opløsning. Ved at implementere et linker molekyle på DNA-linealerne, kan den sterically hindrede side af mRNA af ribosom være probed. Forskellige ribosomale forskydninger kan således løses nøjagtigt. Vi har med succes afsløret en unik loopes konstellation af mRNA fanget af antibiotika under omplacering9, og løst forskellige læse rammer, der sameksisterede på en glat mRNA sekvens10. Denne artikel beskriver detaljerne i den dobbelte lineal analyse, som omfatter fremstilling af ribosom komplekser, overfladefunktionalisering af glas diasene, immobilisering af ribosom komplekser og deres hybridisering med magnetisk mærket DNA lineal molekyler, magnetisk detektion og Force Spectrum analyse af virksomheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af ribosom komplekser
- 1.000 mL TAM10 buffer, som består af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) og 0,05% Tween20.
- De fem blandinger, der er anført i tabel 1, forberedes.
Bemærk: ribosom var fra MRE600 stamme11. EF-Tu: forlængelse af elongations faktoren Thermo unstable. EF-TS: forlængelse faktor Thermo stable. GTP: Guanosintrifosfat. PEP: phospho (enol) pyruvat. - De fem blandinger inkubates separat ved 37 °c i 25 minutter, før ribosom-komplekserne blev gjort. Forbered de fem ribosom komplekser som pr tabel 2.
Bemærk: indlæg: post-Translocation; Pre: pre-Translocation. - Tilsæt hver af de fem ribosom komplekser på en 1,1 M saccharose pude separat, med volumen forhold 1:1. Purify hver med 450.000 × g for 2 h i en ultra-centrifuge. Brug et pipet til at fjerne supernatanten og genoprette ribosom komplekser ved-80 °c efter opblanding af pellet med TAM10 buffer.
2. klargøring af biotin-belagte glas skred
- Foreløbig rensning af glas gliderne
- Placer 12 glas skred med mål 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × W × T) i en kort og bred glas skål.
- Fyld glas skålen med acetone og sonikatet i 5 min. Vask derefter slides med ultrarent vand 5 gange og fyld 3/4 af skålen med vand.
- Tilføj 10 M KOH for at fylde skålen og sonikatglasset slides i 20 min. vask gliderne med vand 5 gange.
- Tilsæt ethanol og soniker i 5 min, hæld ethanol ud og tør dem derefter separat ved 300 °C i 3 timer.
- Aminosilane belægning
- Placer de 12 rensede glider tilbage i glas skålen, der indeholder methanol. Rengør en Pegylations kolbe med methanol ved sonikering i 5 min, og fyld den derefter med 25 mL methanol, 1,25 mL vand, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-Aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- Udskift straks methanol i glas skålen med den forberedte AMEO opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Skyl gliderne med vand flere gange, og tør dem derefter med nitrogen rensning. Placer de tørrede slides i rene glas retter.
- PEGlation
- NaHCO3 -opløsningen (8,4 mg/ml) og Pegylations buffer (37,5 mg peg, 6 mg biotinyleret pind, 150 ΜL NaHCO3 -opløsning) forberedes. Bland dem godt ved at spinne ved 6.000 rpm i 1 min.
- Placer 25 μL PIND opløsning på hver slide. Dæk det med den anden slide på toppen. Sørg for, at der ikke er bobler mellem de to slides. Placer diasene i et tomt pipet-spids felt. Sørg for, at boksen er jævnet med jorden og Placer den i en mørk skuffe i ca. 3 timer.
- Skyl gliderne med vand og tør igen. Opbevar de tørrede slides ved stuetemperatur under vakuum i op til 2 uger.
3. prøveforberedelse forud for magnetiske og kraft målinger
- Maskine en plastik prøve godt med dimensioner 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D). Lim et stykke biotin-belagt glas (ca. 5 mm langt, skåret fra de 60 mm lange slides, der er fremstillet i punkt 2) på den nederste overflade ved hjælp af epoxy.
- 20 μL 0,25 mg/mL streptavidin vandig opløsning tilsættes til prøvebrønden og inkubates ved stuetemperatur i 40 min. Skyl derefter prøven godt to gange med TAM10 buffer.
- Immobiliserer ribosom komplekser.
- Uden antibiotika: Brug en pipette til at fjerne buffer fra prøven godt, og tilsæt derefter 20 μl 0,1 μM ribosom-kompleks (MF-præ eller MF-post) i prøvebrønden. Ribosom-komplekset binder sig til streptavidin på overfladen via 5 '-enden biotin på mRNA. Inkuber ved 37 °C i 1 time og skyl derefter én gang med TAM10 buffer.
- For forsøget med både neomycin og Fusidinsyre: inkuberes MF-pre-komplekset med neomycin ved 37 °C i 10 min; Der inkuberes ved EF-G med Fusidinsyre ved 37 °c i 20 min. Koncentrationerne er som følger: 0,1 μm ribosom kompleks, 2 μm EF-G, 4 mm GTP, 4 mm PEP, 0,02 mg/ml pyruvatkinase, 0,2 mm neomycin og 0,25 mm Fusidinsyre.
- Udføre de andre antibiotika eksperimenter på samme måde. Koncentrationerne er som følger: 0,2 mM viomycin, 0,4 mM hygromycin B og 0,25 mM Fusidinsyre.
- For frameshifting Study, Gentag ovenstående trin for MFNF-præ og MFNF-post komplekser, der involverer det glatte motiv U6A. Brug antibiotika Fusidinsyre plus neomycin, og Fusidinsyre alene.
- Fjern bufferen fra prøven godt, og tilsæt derefter 20 μl 1 μM biotinyleret sondering-DNA-streng, og Inkuber ved stuetemperatur natten over. Skyl den dannede DNA-mRNA duplex én gang med TAM10 buffer.
- Fjern bufferen fra prøven godt. Tilsæt derefter 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin-belagte magnetiske perler i prøvebrønden og Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer.
- Stikprøven forsigtigt ind i en holder, og anbring den i en centrifuge. Fjern de frie magnetiske partikler fra overfladen ved at centrifuger ved 84 x g i 5 min.
4. magnetiske og kraft målinger
- Tænd for laseren
- Tænd for laseren ved hjælp af tasten. Tryk derefter på afbryderknappen.
- Justér følsomheden af lock-in forstærker 1 (LIA1) til 500 mV og vent ca. 2 timer til at varme op og stabilisere det atomare magnetometer.
- Opsætning af Atomic magnetometer
- Kør instrument styringssoftwaren, og Konfigurer måle parametrene. Nogle parametre kan variere lidt i hver måling.
Bemærk: Atomic magnetometer består af en laser (beskrevet ovenfor), en SR830 lock-in forstærker (omtalt som LIA1), en SR530 lock-in forstærker (omtalt som LIA2), DS345 (omtalt som FG1) og ATF20B (kaldet FG2) funktion generatorer, en høj opløsning motor og en computer. Alle disse bør være tændt på dette trin i protokollen. - Indstil motorens bevægelses tilstand til støj og standard position til 0. Tryk på Lås på frontpanelet, Juster følsomheden af LIA1 tilbage til 200 mv.
- Juster laserens strøm og spænding og Find den korrekte resonans spids og signal-til-støjniveau. Tryk på Sweep på frontpanelet. Bemærk amplitude/bredde ratio bør være over 0,5 og fase værdi bør være mindre end 5 grad. Hvis ikke, skal du udføre feje trinnet igen.
- Plug-in output af LIA2 til feedback af laseren til at låse sin frekvens. Denne forstærker måler den optiske rotation af en hjælpe-cæsium celle for at opretholde laser frekvensen på resonans12. Staten forbliver indtil udgangen af målingen.
- Plug-in-funktion generator FG2 at indtaste en firkantet bølge (500 mVpp, 100 mHz) som referencesignal. Den firkantede bølge svarer til 100 pT og bruges til at konvertere den aktuelle udgang af forstærkeren til magnetisk signal. Træk funktions generatoren ud.
- Indstil motorens bevægelses tilstand til tovejs- og standard position til 260 mm. Kontroller status for temperaturregulatoren for at sikre den korrekte temperatur (~ 37 °c) af den atomare sensor.
- Kontroller stabiliteten af hele systemet ved at måle signalerne fra den tomme prøveholder to gange. Vurder stabilitet og støjniveau efter at have subtrahere de to spor. Typisk støjniveau og udsving bør være ± 2 pT ved 30 MS integrationstid.
- Kør instrument styringssoftwaren, og Konfigurer måle parametrene. Nogle parametre kan variere lidt i hver måling.
- Magnetisering af prøven
- Placer forsigtigt prøven på magnetiserings stationen og lad den blive i 2 min.
Bemærk: magnetiserings stationen består af en permanent magnet (~ 0,5 T) og en plastik spacer. - Sæt prøven tilbage i prøveholderen. Brug 335,4 × g centrifugalkraft til at fjerne de ikke-specifikt bundne magnetiske partikler.
- Placer forsigtigt prøven på magnetiserings stationen og lad den blive i 2 min.
- Magnetiske målinger efter anvendelse af kræfter
- Brug pincet til at indlæse prøven på motoren. Klik på Lås på frontpanelet for at køre programmet. Brug i mellemtiden pincet til at indlæse den anden prøve i holderen og anbring den i centrifugen. Bemærk, at den coatede glas side skal vende midten af centrifugen.
Bemærk: teknikken med Force-induceret rest magnetiserings spektroskopi (firmaer) anvendes, som bruger et atomisk magnetometer til at måle det magnetiske signal af prøven efter påføring af mekanisk kraft på molekylære interaktioner i prøven. Her er de molekylære interaktioner mellem DNA-lineal molekyler og mRNA i ribosom-komplekset. Kraften øges trinvise ved at øge centrifugalhastigheden. Efter påføring af hver kraft, motoren oversætter prøven til den atomare sensor og derefter bevæger sig tilbage. Derfor opnås to magnetiske felt profiler, en under den fremadrettede scanning og den anden under baglæns scanning13. Vi bruger kun sidstnævnte til at udtrække spids højden på grund af dens bedre signal-støj-forhold. Spids højden i strøm (nA) konverteres til magnetisk signal amplitude (pT) baseret på kalibrerings kvadrat bølgen. - Hver måling varer ca. 5 min. Når motoren kommer tilbage til 0, skal du klikke på Gem på frontpanelet. Brug forsigtigt pincet til at tage prøver fra motor og centrifuge. Brug begyndelseshastigheden svarende til 335,4 × g (2000 rpm, omdrejning pr. minut for den centrifuge, der er anført i tabellen over materialer).
- Udveksle de to prøver og anvende en stærkere kraft ved at øge centrifugalhastigheden med 100 rpm eller lignende trin størrelse. Proces skiftevis for gradvist at øge kraften; et komplet kraft spektrum opnås efter 10-12 datapunkter.
- Brug pincet til at indlæse prøven på motoren. Klik på Lås på frontpanelet for at køre programmet. Brug i mellemtiden pincet til at indlæse den anden prøve i holderen og anbring den i centrifugen. Bemærk, at den coatede glas side skal vende midten af centrifugen.
- Afslutning af eksperimentet
- Når alle planlagte eksperimenter er færdige, skal du slukke for udstyret og fortsætte i modsat rækkefølge, når det er slået til.
- Fjern prøverne fra holderen og sænk dem i ethanol til rengøring og fremtidig brug. Rengør prøveholderen med acetone i tilfælde af kontaminering af magnetiske perler.
- Data analyse
- Åbn Python-analyse scriptet, og Indtast alle eksperimentelle data. Klik på Indlæs firkant for at indtaste kvadrat bølgen som reference. Klik derefter på Indlæs Oprindelig plan for at indtaste resterende magnetisk signal som baggrund.
- Definer det samlede magnetiske signal fald som B0. Normaliserer hvert magnetisk signal fald b til b0 og udtrykker det som en procentdel. Afbild procentdelen (B/B0) versus centrifugalkraft for at opnå virksomhedernes spektrum.
Bemærk: centrifugal kraften F er beregnet ud fra den kraftige masse af de magnetiske perler m (4,6 × 10− 15 kg), centrifugal hastighed w og radius af centrifuge r (7,5 cm her) via ligning F = mw 2 r. den typiske kraft opløsning er 2-4 PN og Force range er 15-95 PN i dette arbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser detekterings ordningen og fotografier af de vigtigste komponenter. Magnetisk detektion opnås ved et atomisk magnetometer ved hjælp af scannings skemaet (figur 1A)13. Prøven anbringes på en stang monteret på en lineær motor. Motoren transporterer prøven til den atomare sensor inde i et magnetisk skjold, derefter tilbage til det oprindelige sted for losning. Atomic magnetometer detekterer det magnetiske signal under prøve scanningen og producerede et signal spor med det maksimale signal, når prøven er tættest på sensoren. Figur 1 B viser billedet af det samlede instrument. Figur 1C, D viser fotos af magnetiserings stationen og centrifugen, der anvendes til henholdsvis Force Application.
Princippet om dual DNA-lineal analysen er vist i figur 2. Ribosom-komplekset er immobiliseret på overfladen via 5 ' enden af mRNA. To DNA-linealer er designet til at sonde den nøjagtige position af ribosome, en for hver side af mRNA. Den nuværende immobilisering ordning gør 3 ' side let tilgængelige for sondering DNA herskere. Derfor kan DNA-oligomerer konjugeret med magnetiske perler danne duplexer med den udækkede mRNA. Den 5 ' side, dog, er sterically hæmmet af ribosom og overfladen. En linker molekyle er derfor nødvendigt for DNA til at nå den udækkede mRNA på denne side. Ved at variere linker længde, har vi besluttet, at når linker er længere end 50 T, vi kan detektere et stærkt magnetisk signal, som indikerer en vellykket dannelse af DNA-mRNA duplexer (figur 2B). Sammenhængen mellem dissociations kraften og duplexlængden opnås ved at variere antallet af NT på DNA'ET, der supplerer mRNA. Figur 2c,D viser korrelationen for henholdsvis 3 '-og 5 '-siderne. Da kraft forskellen mellem duplex'er af fortløbende længder typisk er 12-20 pN, og kraft opløsningen typisk er 2-4 pN, opnår vi rutinemæssigt enkelt-NT-opløsning for længden af DNA-mRNA-duplexer baseret på deres dissociations kræfter.
Figur 3 præsenterer resultaterne af normal translokation i fravær og tilstedeværelse af forskellige antibiotika. Translokationen er fra MF-pre til MF-post (figur 3A). Justerings indikerer, at MF-pre bærer den ledige tRNAfmet og MF-tRNAPhe på henholdsvis P-og A-sites. MF-post bærer tRNAFmet og MF-tRNAPhe på henholdsvis E-og P-stederne med en ledig a-site. Figur 3 B viser, at uden antibiotika, ribosom bevæger sig med 3 NT på begge sider (bevæger sig mod 3 '-ende). Dette er på grund af følgende årsager: (i) DNA-mRNA-duplexet på 5 ' side udviser 12 BP og 15 BP bindende kræfter i henholdsvis MF-præ og MF-post. II) i 3-enden udviser duplexer en omvendt ændring fra 15 til 12 BP (figur 3C). Men når både Fusidinsyre og neomycin er til stede, viser Force Spectra, at ribosom kun bevæger sig med 1 NT ved 5 ' siden, men 2 NT ved 3 ' siden (figur 3D, E). Dette resultat indikerer, at ribosom omplaceres via en trinvis mekanisme, resulterende en loopes mRNA konstellation, der har en ekstra NT inde i ribosom, som ikke er blevet eksperimentelt afsløret før. Dette er i overensstemmelse med den rapporterede teoretiske simulering14. Alternativt kan ribosom strækkes til at dække 28 NT mRNA, i stedet for de sædvanlige 27 NT15. Efter vask væk antibiotika, normal translokation opstår, som det fremgår af 3 NT bevægelser fra både 5 'og 3 'sider (lilla spor i figur 3D, E). Den loopede konstellation dannes ikke, når der kun anvendes Fusidinsyre. Force Spectra er i overensstemmelse med ribosom bevægelsen på 3 NT på begge sider, svarende til situationen for normal translokation (figur 3F, G). Dual lineal analysen afslører også, at viomycin fuldstændigt hæmmede translokation, som vist ved 0 NT bevægelse på begge sider (figur 3H, I).
Vi har også undersøgt, om denne loopes konstellation kan danne på "-1" frameshifting motiver. Her finder translokation fra MFNF-præ og MFNF-post komplekser sted på ' U6A ' motivet, som er blevet fundet at være en del af '-1 ' frameshifting MOTIV i hiv16. Figur 4a, B viser, at i Mfnf-post FORKORTES DNA-mRNA-duplex med enten 2 eller 3 NT ved 3 '-enden; duplexlængden forøges med enten 2 eller 3 NT ved de 5 'ender. Resultaterne antyder sameksistensen af både normal translokation og "-1" frameshifting, med den tidligere korrelation med 3-NT bevægelsen og sidstnævnte korrelation med 2-NT bevægelse. Den dobbelte lineal assay er i stand til klart at løse de to populationer. Med både neomycin og Fusidinsyre, bemærker vi, at ribosom bevæger sig med 2 NT ved 3 '-enden, men kun 1 NT ved henholdsvis 5-enden (figur 4C, D). Derfor finder den loopede mRNA-konstellation også sted på den glatte sekvens. Når der kun er Fusidinsyre til stede for MFNF-pre (figur 4E, F), er resultatet det samme som for Mfnf-post i paneler A og B (blå spor), hvilket indikerer, at Fusidinsyre alene ikke er tilstrækkelig til at standse translokation eller frameshift. Derfor bekræfter det, at både Fusidinsyre og neomycin er nødvendige for de ulige forskydninger for de to sider af mRNA.
Figur 1 : Instrumenter til den virksomhedsbaserede Dual DNA-lineal analyse. (A) skematisk af magnetisk detektion. 1: prøve og dens beslag; 2: motor; 3: Atomic sensor og magnetisk skjold. B) foto af det atomare magnetometer og prøve håndteringssystem. Tallene angiver de faktiske tilsvarende komponenter, der er vist i skematisk. Bemærk det magnetiske skjold er inde i papkassen for forbedret termisk stabilitet. C) magnetiserings Station. D) centrifuge, der anvendes til anvendelse i kraft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Dual lineal-analyse med enkelt-NT-opløsning til undersøgelse af ribosom-translokation. (A) skematisk af Dual lineal assay, hvor to DNA-linealer er konstrueret til henholdsvis sonde de 5 'og 3 'ends. Den røde linje indikerer polyT linker. (B) optimering af linker længde for lineal-in. (C) virksomheder resultater til at bestemme dissociation kræfter af duplexer mellem lineal-ins og mRNA. (D) dissociations kræfter på duplexerne mellem lineal-outs og mRNA. Fejl bjælken defineres som forholdet mellem instrumentets støj og det samlede magnetiske signal fald (B0) med en typisk værdi på ± 3-5%. Figur er blevet gengivet med tilladelse9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Probing translokation trin under påvirkning af forskellige antibiotika. A) sondering af MF-præ-og MF-post-komplekserne. Inset angiver de skematiske ribosomer i præ og post, som svarer til de faste og bindestreg-foret ovals, hhv. (B, C) VIRKSOMHEDER resultater uden antibiotika. (D, E) Resultater med både Fusidinsyre og neomycin. (F, G) Resultater med Fusidinsyre. (H, I) Resultater med viomycin. Venstre paneler: Brug lineal-in at sonde 5 ' side; højre paneler: Brug lineal-out at sonde 3 ' side. Fejllinjerne beregnes på samme måde som i den forrige figur. Figur er blevet gengivet med tilladelse9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Virksomheder resultater af at bruge dobbelte linealer til sonde frameshifting. (A, B) MFNF-præ og MFNF-post uden antibiotika. (C, D) Resultater med både Fusidinsyre og neomycin. (E, F) Resultater med kun Fusidinsyre. Venstre paneler: Brug lineal-in at sonde 5 'side; højre paneler: Brug lineal-ud til at sonde 3 'side. Fejllinjerne beregnes på samme måde som i den forrige figur. Figur er blevet gengivet med tilladelse9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores dobbelte lineal analyse spiller de magnetiske perler to vigtige roller. For det første tjener de som krafttransducere, fordi centrifugal kraften er proportional med deres kraftige masse. For det andet er perlerne signal bærere detekteret af en atomisk magnetometer, som i øjeblikket er den mest nøjagtige magnetiske sensor. Ved at kombinere mekanisk manipulation og magnetisk detektion er virksomhedernes teknik i stand til at løse et stort antal molekylære interaktioner baseret på deres kritiske dissociations kræfter, som er grundlaget for DNA-linealerne. Den dobbelte lineal analyse er unikt egnet til at sonde begge sider af mRNA under omplacering. Fordi det er en fysisk tilgang, der kun afhænger af dannelsen af duplexer, er det ikke begrænset af mRNA sider eller andre biologiske konstammer. Dette er en fordel i forhold til andre teknikker, der er baseret på biokemiske reaktioner. Vi har vist, at ved hjælp af en lang linker molekyle, kan linealerne nå den målrettede binding websted for at bestemme mRNA position. Specifikt for ribosome er linker længde 50 T, hvilket svarer til 17 nm i længden. Denne længde er meget tæt på størrelsen af ribosom17. Koncentrationerne af antibiotika er typiske værdier fra litteraturen. Det er også muligt at bruge vores metode til at afsløre de debut værdier for deres funktioner.
Der er to kritiske aspekter for dual lineal assay. Den ene er den delikate funktionaliserede overflade til molekylær immobilisering og efterfølgende biologiske reaktioner. Hver lastning og vask trin skal udføres med minimal forstyrrelse af overfladen, således at molekylerne immobiliseret på overfladen vil forblive intakt. For DNA-mRNA-hybridiseringsproces er der behov for tilstrækkelig tid til at sikre fuldførelsen af processen. Det anbefales også at bruge TAM10 buffer med ekstra 1 M NaCl til at opretholde et homeostatisk system. Det andet kritiske aspekt er magnetisering af perlerne. Da overdreven perler anvendes, der er masser af frie perler ikke immobiliseret på overfladen. Ved magnetisering af prøven bør den coatede overflade derfor nærme sig og lade magneten stå lodret. Enhver mindre swing af prøven kan muligvis forårsage skrabe skade på overfladen.
Vores Dual DNA lineal assay er i øjeblikket den eneste metode, der objektivt kan sonde både indgangen og exit sider af mRNA i ribosom komplekser med enkelt-NT opløsning. Nye mekanistiske oplysninger om ribosom translokation er opnået. Metoden er generelt anvendelig til molekyl forskydning af nukleinsyrer, som er almindeligt forekommende i molekylær biologi.
For fremtidig udvikling og applikationer, har vi vist, at ved hjælp af akustisk stråling kraft til at erstatte centrifugalkraft vil yderligere forbedre kraft opløsningen, nå sub-NT regime18. Vi undersøger også multiplexed detektion ved hjælp af atomare magnetometre for at forbedre detekterings effektiviteten. Med disse forbedringer forventer vi, at vores metode, som er beskrevet i dette arbejde, vil finde brede anvendelser inden for biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterede ikke om potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af de amerikanske National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. anerkender støtte fra Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
