Summary
この記事では、マウスの心筋凍結傷害後の心臓リモデリングを研究するモデルを示す。
Abstract
動物モデルの使用は、急性冠症候群とその合併症の新しい治療戦略を開発するために不可欠です。本稿では、再現性と再現性の高い正確な梗塞サイズを生成するマウス凍結傷害梗塞モデルを示す。簡単に言えば、動物の挿管と立体切除の後、心臓は胸部から持ち上げられます。手持ち式液体窒素送達システムのプローブは、凍結傷害を誘発するために心筋壁に適用される。心室機能の障害と電気伝導は、心エコー検査または光学マッピングで監視することができます。梗塞領域のトランスムラール心筋リモデリングは、コラーゲン沈着および心筋細胞の喪失を特徴とする。他のモデル(例えば、LAD-ligation)と比較して、このモデルはより均一な梗塞のサイズを生成するために手持ち型液体窒素送達システムを利用する。
Introduction
急性冠症候群(ACS)は、西洋の世界1、2の主要な死因である。冠状動脈の急性閉塞は、患部心臓組織3の虚血カスケードおよび壊死の活性化につながる。損傷した心筋は徐々に非収縮性瘢痕組織に置き換えられ、これは心不全4,5として臨床的に現れる。ACSの治療の最近の進歩にもかかわらず、ACSおよびACS関連心不全の有病率は上昇しており、治療選択肢は限られている6、7である。したがって、ACSとその合併症を研究する動物モデルの開発は非常に興味深い。
現在までに、ACSおよびACS誘発心筋リモデリングを研究するために最も広く使用されている動物モデルは、左下下冠動脈(LAD)のライゲーションである。LADのライゲーションは、ACS中のヒト心筋組織と同様に、心筋の急性虚血につながる。 しかし、一貫性のない梗塞のサイズは、LADライゲーションのアキレス腱のままです。LADの外科的変動および解剖学的変動は、一貫性のない梗塞サイズを引き起こし、この手順8、9、10の再現性および複製性を妨げる。さらに、LADライゲーションは、高い内および後の外科的死亡率を有する。再現性を向上させ、死亡率を11、12に減らす最近の努力にもかかわらず、多くの動物が反リモデリング療法を適切に評価するために依然として必要とされている。
ACSの代替モデルは、無線周波数13、熱14または低温傷害15、16、17、18を含む、近年提案され、研究されている。現在の凍結傷害法は、被験体の心臓組織15,16を損傷するために液体窒素中で予め冷却された金属棒を適用する。しかし、十分な梗塞サイズを生成するには、この手順を数回繰り返す必要があります。組織に比べてロッドの伝導性と低熱容量が高いため、プローブは迅速に温まり、組織は不均一に冷却(したがって梗塞)されます。これらの限界を克服するために、我々は、手持ち型液体窒素送達システムを利用した凍結梗塞モデルを本明細書で説明する。このモデルは再現性、実行が容易であり、速く、確実に確立することができる。冠動脈解剖学に依存しない再現可能なトランスムラール梗塞病変が発生し、最終的には心不全を引き起こす。この方法は、新規治療薬理学および組織工学ベースの戦略の評価のための改造プロセスを研究するのに特に適している。
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Protocol
動物は、実験動物資源研究所が作成し、国立衛生研究所によって発行された実験動物の原則ガイドに従って人道的ケアを受けました。すべての動物プロトコルは、責任ある地方自治体(カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)機関動物ケアおよび使用委員会)によって承認されました。
1. 動物の世話
- 約27gの重さの14週齢でマウスを得る(例えば、実験動物研究所から)。
注: BALB/c マウスは、この記事に使用されます。 - 換気キャビネットで従来の条件下でマウスを保ち、標準的なマウスチョウとオートクレーブ水アドリビタムを供給します。
2. マウスの準備
- 誘導室を使用して、イソファラン(3.5%)でマウスを麻酔する。
- ヘアトリマーを使用して、胸と首の上の髪を削除します。
- 加熱されたパッドの上にマウスを置き、マウスの口と鼻を覆うフェイスマスクで麻酔を維持します。
- 後ろ足と尾をつまんで、反射神経がないことを確認して、麻酔の十分な深さを確認してください。
- 鎮鎮薬に皮下ブプレノルフィン(0.03mg/kg)を注入する。
- 後肢と前肢を広げ、テープを使用して位置を固定します。
- ポビドネヨウ素を使用して、剃毛領域を消毒し、続いて80%のエタノールでスクラブする。この手順を 2 回繰り返します。
- 胸骨の下の3分の1から顎に中線の皮膚切開を行うには、小さなはさみを使用してください。
- 湾曲した鉗子を使用し、慎重に気管を露出させるために首の周りの筋肉を分離します。
- マイクロハサミを使用して、2番目と3番目の軟骨リングの間に気管切開を行います。
- 換気器を110/minの換気周波数に設定し、潮の容積は0.5 mLです。
- フェイスマスクを取り外し、人工呼吸器に接続されたプラスチックカニューレ(20G)を気管に挿入します。動物の換気をする。
注:両側肺換気を確認することにより、換気カニューレがあまりにも深く挿入されていないことを確認してください。 - 3番目と7番目の肋骨の間の胸骨起源から右胸筋を切り離すために焼灼を使用してください。
- 側面斜めのばねはさみを使用して、胸骨にできるだけ近い4番目から6番目の肋骨をカットします。
- 出血が見える場合は、乳房動脈を焼く。
- イソファランを2.5%に減少させる。
- 基礎となる結合組織を解剖し、胸腔内の明確な視野を得る。
- 鈍い鉗子を使用して心膜を開き、心臓を露出させる。
- ミニゴールドスタインリトラクターを使用して肋骨を広げ、胸腔を開いたままにします。
- 鈍い棒で胸腔から心臓を持ち上げる。
- 胸の開口部を減らし、心臓が後退するのを防ぐために、リトラクタの緊張を下げます。
- クライオプローブ(直径3mm)を10sで予冷します。
- 前の左心室壁に凍結プローブを適用し、10sのために凍結し、左心室凍結傷害梗塞を生成する。
注:凍結プローブは、科学的な質問や必要性に応じて異なる心臓壁に適用することができます。 - クライオプローブを室温生理生理で灌漑し、左心室壁からプローブを取り外します。
- リトラクタを使用して胸の開口部を拡大します。
- 鈍い棒で胸腔に心臓を穏やかに戻す。
- リトラクタを取り外し、6-0縫合糸を使用して単一の結び目で立体摘出術を接続します。
- 6-0 ランニング縫合糸を使用して胸腔を閉じます。結び目を結ぶ前に、胸から残りの空気を取り除くために10 mLの注射器を使用してください。
- 口蓋端で皮膚を適応させ、縫合糸(5-0)で気管開口部の点まで縫合します。
- イソファランを1.5%に設定し、動物が自発呼吸を得るまで待ちます。
- 気管カテーテルを取り外し、麻酔を維持するために動物の口と鼻にフェイスマスクを再適用します。
- 8-0で気管切開を閉じる縫合。
- 気管を覆うために、腹部の首の筋肉を位置に戻します。
- 皮膚縫合糸を完成させます。
- 飲料水にメタミゾール(100mL当たり50mgのメタミゾール)を3日間鎮痛させ、毎日動物を監視します。
注:このモデルの観察期間は8週間です。鎮鎮薬に関する教育機関のガイドラインに従ってください。.
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Representative Results
凍結傷害梗塞モデルは、ACSおよびその合併症を研究するのに適している。低死亡率と効率的な術後回復は、このモデルで見られます。凍結傷害誘発心筋損傷は、心臓機能の低下、電気的結合解除、およびトランスムラールの改造につながる。
心エコー検査は、生体内の心臓機能を非侵襲的に監視するために使用することができる。凍結傷を負った心臓において、心エコー検査は、排出分率および分画領域変化を有意に減少させた(図1a-c)。機能障害は7日目から56日間の観察エンドポイントまで続く。
詳細な心臓機能は、圧力体積ループ(PVループ)解析を通じて侵襲的に評価することができる。1.2 Fr伝導カテーテルは左心室に導入され、左心室圧は左心室容積に対してプロットされる。ストローク体積、ストローク作業、心拍出量、プリロード調整最大電力などのヘモダイナミクスパラメータを計算できます。図1d-hに示すように、凍結梗塞は左心室障害(LV0機能は、脳卒中体積、脳卒中作業、心拍出量およびプリロード調整された最大電力の減少として反映される)
心臓電気生理学を研究するために、光学マッピングはex vivoを行うことができる。心臓を除去し、ランゲンドルフ灌流技術を浸透させ、蛍光電圧感受性色素で染色する。凍結傷を負った心臓は、損傷の境界で電気伝導の閉塞を示し、局所的な電気的結合解除を示す(図1i)。
マッソンのトリクロムによる組織学的染色は、損傷部位における骨素線維組織形成を示す(図2a)。梗塞サイズは、梗塞瘢痕面積または中線瘢痕長19(図2b)を測定することによって算出することができる。α-肉体アクチニン(心筋細胞マーカー)およびコラーゲン-Iに対する免疫蛍光染色は、損傷部位における線維性リモデリングおよび心筋細胞の喪失を確認する(図2c)。
図 1: 凍結傷を負った心臓の機能的および電気生理学的分析。代表的な2次元心エコー画像は、術前(D0)および術後7日目(D7)、28(D28)、および56(D56)で撮影された。(a)上のパネルは、エンド・シストレでのパラスター的な長軸ビューと、末収縮期の下部パネルを示す。(b, c)吐出画分(EF)および分画領域変化(FAC)は、凍結梗塞後に減少し、圧力体積曲線解析により心臓機能が経時的に減少したままであった。(d-g)56日目の損傷後脳卒中容積(SV)、脳卒中作業(SW)、心拍出量(CO)、およびプリロード調整最大電力(PAMP)は、術前の在来動物に比べて有意に低かった。(h)原生および56日後の手術後の動物からの代表的なPVループは、胸部静脈カバ(TVC)閉塞後の圧力信号の振幅の特徴的な右シフトおよび減少を示した。(i)手術後14日目のネイティブおよび凍結傷を負った心臓からの心臓光学マッピングのイソクロネ地図。上部と下部のパネルは、それぞれ頂点とベースからペースでハートを示しています。梗塞領域は、白い破線でマークされています。グループ間の差異は、ボンフェローニのポストホック試験または学生のt-テストによる分散(ANOVA)の一方通行分析によって評価された。N=3匹。* は p < 0.05 を示します。誤差記号は標準偏差(SD)を表します。ESPVR = 終末収縮圧体関係;EDPVR = 末拡張期圧力容積関係。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ネイティブおよびクライオ傷害を受けた心臓の数学的評価。(a)マッソンのトリクロム染色は、梗塞領域におけるコラーゲン沈着(緑色)を示す。左心室の梗塞率は、(b)面積および(c)中線梗塞長として測定した。(d)免疫蛍光染色は、梗塞領域における心筋細胞の併伴損失と共にコラーゲン-I沈着の増加を示す。LV = 左心室;RV = 右心室;endo = 心内膜;エピ = 心膜。 N=3匹。エラー バーには SD が表示されます。
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Discussion
この記事では、ACSおよび関連する薬理学的および治療的選択肢を調査するマウス凍結傷害モデルについて説明する。
最も重要なステップは、心臓組織上の凍結プローブの適用です。最適な梗塞サイズを得て、再現可能な結果を保証するために、接触時間を厳密に制御する必要があります。心筋の長時間の冷却は、特大梗塞または心室穿孔につながる。対照的に、短い冷却時間は限られた心膜病変を生成し、すべての常駐細胞を排除するわけではありません。したがって、再生細胞移植を研究する際に、これは混乱する可能性があります。
他の凍結梗塞法20と比較して、本稿に記載の開いた胸部アプローチは、梗塞が心臓の異なる位置に自由に誘導することができるという利点を有する。さらに、このアプローチは、梗塞の境界が見えるように、治療細胞注射またはパッチアプリケーションを容易にし、細胞移植部位はそれに応じて選択することができる。
このモデルの欠点は、心筋損傷の病因である。凍結傷害は、直接虚血ではなく細胞膜を破壊する氷結晶の生成による細胞死をもたらす。さらに、傷害の方向は通常心膜内向きであり、虚血性梗塞は心内膜から心膜層に外側に伝播する傾向がある。したがって、このモデルは、心筋虚血の病態生理学的メカニズムを研究するか、虚血再灌流設定を模倣するために限定される。
結論として、ここで説明するモデルは、安価であり、実行しやすく、迅速かつ確実に確立することができる。心筋細胞壊死およびその後の瘢痕形成は時間の経過とともに発症し、ポンプ機能および電気伝導性の進行性障害をもたらす。よく制御可能な梗塞のサイズ、形および位置はこのモデルは心臓機能または心臓の再生を回復することを目指して実験的介入を評価するのに理想的である。正常にテストされた治療オプションは、大規模な動物研究でさらに確認されるべきです。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
クリスチャン・ポールマンの技術支援に感謝します。D.W.はマックス・ケイド財団の支援を受けました。T.D.は、エルス・クレーナー・フォンダシオン(2012_EKES.04)とドイツ・フォルシュンゲインシャフト(DE2133/2-1_)から助成金を受け取りました。S. S. ドイツフォルシュンゲミンシャフト (DFG;SCHR992/3- 1、SCHR992/4-1)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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