Summary
Interaktioner med GPCR-β-arrestin är ett framväxande fält i GPCR Drug discovery. Noggrann, exakt och enkel att ställa in metoder är nödvändiga för att övervaka sådana interaktioner i levande system. Vi visar en strukturell kompletterings analys för att övervaka interaktioner med GPCR-β-arrestin i levande celler i realtid, och den kan utökas till alla GPCR.
Abstract
Interaktioner mellan G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) och β-arrestiner är vitala processer med fysiologiska implikationer av stor betydelse. För närvarande är karaktäriseringen av nya läkemedel mot deras interaktioner med β-arrestins och andra cytosoliska proteiner oerhört värdefull inom området GPCR Drug discovery särskilt under studiet av GPCR partisk agonism. Här visar vi tillämpningen av en ny strukturell kompletterings analys för att korrekt övervaka receptor-β-arrestin interaktioner i realtid levande system. Denna metod är enkel, noggrann och kan lätt utvidgas till någon GPCR av intresse och även den har den fördelen att den övervinner ospecifika interaktioner på grund av närvaron av en låg uttryck promotor närvarande i varje vektorsystem. Detta strukturella komplement analys ger viktiga funktioner som möjliggör en noggrann och exakt övervakning av receptor-β-arrestin interaktioner, vilket gör det lämpligt i studien av partisk vid av alla GPCR system samt GPCR c-Terminus ' fosforylering koder skrivna av olika GPCR-kinaser (GRKs) och post-translationella modifieringar av arrestins som stabiliserar eller destabilisera receptorn-β-arrestin Complex.
Introduction
Gpcrs representerar målet på nästan 35% av nuvarande läkemedel på marknaden1,2 och en klar förståelse av deras farmakologi är avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska läkemedel3. En av de viktigaste aspekterna i GPCR Drug discovery, särskilt under utvecklingen av partiska agonister är karakterisering av nya ligander mot receptor-β-arrestin interaktioner4 och β-arrestin interaktioner med andra cytosoliska proteiner som proteinet5.
Det har dokumenterats att β-arrestin beroende signalering spelar en nyckelroll i neurologiska sjukdomar såsom bipolär sjukdom, stor depression, och schizofreni6 och även allvarliga biverkningar i vissa mediciner såsom morfin7.
Nuvarande metoder som används för att övervaka dessa interaktioner vanligtvis inte representerar faktiska endogena nivåer av proteinerna i studien, i vissa fall de visar svag signal, photoblekning och beroende på GPCR kan det vara tekniskt utmanande att ställa in8. Denna nya strukturella komplessionstest analys använder låg uttryck promotorn vektorer för att efterlikna endogena fysiologiska nivåer och ger hög känslighet jämfört med nuvarande metoder9. Med detta tillvägagångssätt var det möjligt att enkelt karakterisera galanin receptor-β-arrestin1/2 och även β-arrestin2-clathrin interaktioner10. Denna metod kan användas i stor utsträckning för alla GPCR av särskilt intresse där β-arrestins spelar en viktig fysiologisk funktion eller deras signalering är relevant i vissa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer design strategi
- Design primers att introducera gener av intresse i pBiT 1,1-C [TK/LgBiT], pBiT 2,1-C [TK/SmBiT], pBiT 1,1-N [TK/LgBiT] och pBiT 2,1-N [TK/SmBiT] vektorer.
- Välj minst en av dessa tre platser som en av de två unika restriktionsenzymer som behövs för riktad kloning på grund av närvaron av en in-Frame stopp kodon som delar upp multiklonings platsen som visas i figur 111.
- Införliva nukleotidsekvens i primers som visas i tabell 1 för att koda de linkerrester som visas i rött i tabell 211.
- För pbit 1.1-c [TK/lgbit] och pbit 2.1-c [TK/smbit] vektorer, se till att 5 ́ primer innehåller en ATG kodon och en potent Kozak konsensus sekvens (gccgccacc).
- För pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] och pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer, se till att 3 ́ primer innehåller en stopp kodon.
Anmärkning: varje vektor innehåller HSV-TK promotorn för att minimera ospecifik Association och minska experimentella artefakter, även varje vektor har en uttrycks kassett för ampicillin resistens hos bakterier.
2. PCR
- Ställa in och köra PCR-reaktioner för att förstärka DNA-skäret av genen av intresse med hjälp av primers som utformats från steg 1. Det är viktigt att använda en HiFi-DNA-polymeras för att minimera mutationer.
- Använd exakt följande ordning för att förbereda 50 μL PCR-reaktion. Tillsätt 35,5 μL destillerat vatten, 5 μL 10X Polymerasbuffert, 5 μL dNTP-blandning (2,5 mM vardera), 1 μL plasmid-mall (200 ng/μL), 1,25 μL av främre och omvända primrar (10 μM) och 1 μL HiFi-polymeras (5 U/μL).
- Med hjälp av en termocyklern ställa in följande DNA förstärknings program.
- Denature vid 95 ° c i 5 min.
- Upprepa 25 gånger följande termiska cykel: 95 ° c för 30 s, 60 ° c i 1 min, 72 ° c för 2 min per 1 KBP som ska amplifieras.
- Kör en slutlig förlängning på 72 ° c i 10 min.
- Håll proverna vid 4 ° c i termocyklern.
Obs: det rekommenderas starkt att använda en HiFi-polymeras för att minimera punktmutationer särskilt de som inträffar under amplifiering av långa sekvenser. Som amplikon blir längre, graden av noggrannhet i replikation av DNA minskar. För PCR-reaktionen, Välj glödgningstemperaturen baserat på smälttemperaturen i den region där oligos direkt hybridiserar med DNA-mallen och inte med alla sekvensen av primern.
- Rening av PCR-produkter
- Isolera PCR-produkten från resten av PCR-reaktionen med hjälp av ett kit från en tillverkare av preferens12. PCR-produkten är nu klar för begränsning av matsmältningen.
3. DNA-nedbrytning
- För PCR-produktens matsmältning Bered 50 μL av digestionsreaktionen enligt följande.
- Tillsätt 12 μL destillerat vatten med hjälp av ett 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 5 μL 10X-buffert med den bästa kompatibiliteten med båda restriktionsenzymer.
- Från steg 2,4 Tillsätt 30 μL PCR-produkt
- Tillsätt slutligen 1,5 μL av varje begränsnings enzym.
- Blanda kortfattat med Vortex och inkubera vid 37,5 ° c över natten.
- För mottagaren plasmid matsmältningen förbereda 50 μL av digestionsreaktionen enligt följande:
- Tillsätt 23 μL destillerat vatten med ett 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 5 μL 10X-buffert med den bästa kompatibiliteten med båda restriktionsenzymer.
- Tillsätt 15 μL mottagar-plasmid (200 ng/μL).
- Tillsätt 1,5 μL av varje begränsnings enzym.
- Blanda kortfattat med Vortex och inkubera vid 37,5 ° c över natten.
Anmärkning: det är viktigt att använda 3 μg mottagar-plasmid för att få tillräckligt med material efter DNA-aguppstod gel rening. Det är också relevant att lämna DNA-nedbrytnings över natten med båda enzymerna för att uppnå hög kloningseffektivitet.
4. DNA aguppstod gel rening och kloning
- Förbered en 1% aguppstod gel för att köra smält DNA plasmid och skär och fortsätta att skära motsvarande band. När motsvarande vektor-och insats band har purified12, Bestäm DNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
- Utför DNA ligering att smälta insatsen till mottagaren plasmid.
- Bered ligeringreaktioner på cirka 100 ng av totalt DNA inklusive 50 ng av plasmid-vektor.
- Ställ in kvoten för mottagarens plasmid-INSERT på cirka 1:3; Det kan beräknas med hjälp av en Vector-INSERT kalkylator13.
- Ställ in negativa kontroller parallellt. Till exempel, en ligering av mottagaren plasmid DNA utan INSERT kommer att ge information om hur mycket bakgrund av osmält eller själv-ligating mottagare plasmid är närvarande.
5. omvandling av kloner
- Placera ett rör av DH5α kompetenta celler från frysen vid-80 ° c och omedelbart överföra den på is för 20 min.
- Efter den tiden, ta 55 μL av DH5α kompetenta celler och tillsätt 4 μL av ligering reaktion och blanda genom att bläddra i röret och förvara på is för 45 min.
- Placera röret i ett vattenbad som tidigare värmde vid 42 ° c för exakt 48 s och omedelbart få rören tillbaka på is för ytterligare 3 min.
- Tillsätt 600 μL av Luria buljong (LB) medium som tidigare värmde vid 37,5 ° c och inkubera med skakning i 1 timme vid 200 rpm.
- Överför 200 μL till en agarplatta som innehåller ampicillin 100 μg/mL och fördela försiktigt över ytan med vätskan absorberas oftast.
- Inkubera plattorna över natten för att se kolonierna nästa morgon. Mottagaren plasmid på skär plattan bör ha betydligt fler kolonier än mottagaren plasmid ensam tallrik.
6. isolering av den färdiga plasmid
- Välj 3-10 enskilda bakteriekolonier och överför till 1 mL LB-medium innehållande ampicillin (100 μg/mL) och inkubera i 6 timmar.
- Ta 200 μL bakteriell suspension och överför till 5 mL LB-medium som innehåller samma koncentration av ampicillin som i steg 6,1 och inkubera över natten vid 37,5 ° c med skakning vid 200 rpm.
- Med hjälp av en miniprep DNA-kit rening, utföra miniprep DNA-reningar med 5 mL LB odlas över natten enligt tillverkarens instruktioner14.
- För att identifiera lyckade ligationer, Ställ in PCR-reaktioner på samma sätt som i avsnitt 2 med hjälp av DNA som erhållits från steg 6,3 som en mall med samma primers som i avsnitt 2 under den första PCR. Positiva kloner kommer att producera PCR-produkter med motsvarande storlek.
- Efter stora prep DNA rening av de positiva klonerna, genomföra en diagnostisk begränsning nedbrytning av 500 ng av renat DNA med de enzymer som används under klonings steget och köra smält produkter på en 1% aguppstod gel. Det bör finnas två band: en storleken på vektorn och en storleken på den nya insatsen.
- Kontrollera konstruera sekvens genom sekvensering med hjälp av följande primers: framåt 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' och omvänd 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '.
Anmärkning: när DNA replikeras med hjälp av PCR, det finns alltid möjlighet till fel under amplifiering även när du använder en HiFi-polymeras, därför är mycket viktigt att sekvensera den slutliga konstruktioner.
7. transfektion och proteinuttryck
- I en tidigare Poly-L-lysine-belagda vita 96 väl plattan, utföra cell sådd en dag före transfektion på 2,5 x 104 celler per brunn med Dulbecco modifierade Eagle ' s medium kompletteras med 10% av fetalt nötkreatur Serum, 100 U/ml Penicillin G, och 100 μg/ mL streptomycin.
- Använd endast 60 innerbrunnar för att minimera risken för termiska gradienter över plattan och kanteffekter från avdunstning. Tillsätt 200 μL sterilt destillerat vatten till 36 ytterbrunnar och 150 μL i utrymmena mellan brunnar och inkubera över natten vid 37,5 ° c och 5% av CO2.
- Följande morgon utför transfektion med 100 ng av totalt DNA (50 ng varje konstruktion).
- Ställ in fyra olika plasmidkombinationer (receptor: β-arrestin) enligt figur 2b.
- För varje plasmid kombination använda 20 μL av modifierad örn minsta essentiella Media buffrade med HEPES med 0,3 μL lipidic transfektion reagens per brunn.
- Tillsätt 20 μL lipidtransfektionsreagens-DNA-blandning till varje brunn och blanda plattan i cirklar i 10 s.
- Byt färskt medium efter 6 timmars inkubering vid 37,5 ° c och 5% CO2.
- Inkubera plattan i 24 h vid 37,5 ° c och 5% CO2.
8. övervakning receptor-β-arrestin1/2 interaktioner i HEK293 celler
- Aspirera medium och tillsätt 100 μL av modifierad örn minsta väsentliga Media buffrad med HEPES till varje brunn och låt plattan stabiliseras vid RT för 10 min.
- Förbered furimazinsubstratet genom att kombinera 1 volym 100x substrat med 19 volymer LCS utspädnings buffert (en 20-faldig utspädning)11, skapa en 5x lager att blanda med cell odlingssubstrat.
- Tillsätt 25 μL 5x furimazin till varje brunn och blanda försiktigt i cirklar för 10 s.
- Mät luminiscens i 10 minuter för signal stabilisering vid RT.
Obs: genom att använda denna baslinje signal för att normalisera svaret från varje brunn det kommer att bidra till att minska variationen orsakad av skillnader i antalet celler pläterade per brunn, även skillnader i transfektion effektivitet, etc. En gång beräknat, genomsnittet normaliserade svar från replikat brunnar för en given läkemedelsbehandling. - Förbered 13,5 x ligand lösning i modifierad örn minsta viktiga Media buffrade med HEPES.
- För experiment vid rumstemperatur med 10 μL 13,5 x ligand, tillsätt föreningarna med hjälp av injektorer eller en flerkanalspipett och blanda plattan för hand eller med en orbitalskak (20 s vid 200 rpm).
- För experiment vid 37,5 ° c med 10 μL 13,5 x ligand, Använd injektorer för att fördela föreningar och blanda med hjälp av instrumentet orbital shaker. Om du inte använder injektorer ska du ta bort plattan från luminometern, lägga till ligander och blanda plattan för hand eller använda en orbitalskak (20 s vid 200 rpm).
Obs: Använd injektorer och en shaker i detekterings instrumentet för att minimera temperaturvariationer i samband med att plattan från luminometern tar bort. Standardluminometrar med bänkskiva kan användas för denna analys. Använd en integrations tid på 0,25 – 2 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som presenteras här övervakades interaktioner mellan en prototypisk GPCR och två β-arrestin-isoformer. Glukagon som peptid receptor (GLP-1R) konstruktioner gjordes med primers innehållande NheI och EcoRI enzym begränsnings platser och klonade in i vektorer pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] och pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] medan i fallet med β-arrestins, två ytterligare vektorer var används pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] och pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] med hjälp av enzym begränsnings platser BgIII och EcoRI i fråga om β-arrestin2 och NheI och XhoI när det gäller β-arrestin1. HEK293 celler transfekterade med 50 ng av GLP-1R-lgbit/smbit och 50 ng av β-arrestin märkta med lgbit eller smbit vid N-eller C-terminalen. Fyra olika plasmidkombinationer screenades (figur 3) och den med den högsta luminescerande signalen valdes för ytterligare experiment (figur 4). För bestämning av EC50-värdena för varje beta-arrestin-isoform-rekrytering utfördes dos svars kurvor med 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM och 1 nM GLP-1 ligand-koncentration (figur 4c). Dos svars kurvor erhölls från den maximala responsen för varje koncentration från de kinetiska studierna (figur 4a, 4b).
Figur 1. Nukleotidsekvenser av multiklonings platser av vektorerna som används vid utformningen av GLP-1R-β-arrestin1/2 strukturell kompletterings analys.
För att utveckla den strukturella kompletterings analysen för GLP-1R-β-arrestin1/2-systemet var det nödvändigt att märka på C-terminalen GLP-1R med LgBiT och SmBiT med hjälp av enzymrestriktionerna NheI och EcoRI vid pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] och pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] Vektor. När det gäller β-arrestin1/2 var de också märkta med LgBiT och SmBiT vid C-och N-terminalen med hjälp av enzymrestriktionerna BglII/EcoRI för β-arrestin2 och NheI/XhoI för β-arrestin1 vid de fyra vektorerna. Alla vektorer använder HSV-TK-promotorn för att minimera ospecifik Association och reducera experimentella artefakter och varje vektor innehåller en uttrycks kassett för ampicillin-resistens hos bakterier. Bild anpassad från referens 11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk representation av GPCR: β-arrestin1/2 strukturell kompletterings analys.
a) hur den strukturella kompletterings analysen för GPCR: β-arrestin1/2 fungerar i närvaro av ligand. b) strukturell representation av de olika plasmidkombinationerna för de GPCR och β-arrestin-isoformerna som är märkta med lgbit eller smbit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GLP-1R/β-arrestins orientering screening.
För att erhålla den högsta känsligheten 4 olika plasmid kombinationer uttrycktes under 24 h efter transfektion. Luminescent signaler upptäcktes i nästan alla olika plasmid kombinationer (a-c) med undantag för endast en GLP-1R: β-arrestin orientering (d). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± S.E.M. av två experiment utförda i duplikat. varje dubblett var i genomsnitt före beräkningen av S.E.M. Pilarna indikerar den tid vid vilken cellerna behandlades med GLP-1 vid 10 μM slutkoncentration. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. GLP-1R-β-arrestin1/2 interaktioner är dosberoende sätt.
Dosberoende ligand-förhållande av β-arrestin2 (a) och β-arrestin1 rekrytering (b). Dosresponskurvor som visar differentiell rekrytering mellan β-arrestin1 och β-arrestin2 av GLP-1R (c). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± S.E.M. av två experiment utförda i duplikat. varje dubblett var i genomsnitt före beräkningen av S.E.M. Pilarna anger den tid vid vilken cellerna behandlades med GLP-1 vid motsvarande koncentrationer (10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM och 1 nM, slutliga koncentrationer). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vektor | Enzym begränsning som används | Primer sekvens |
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2,1-C [TK/SmBiT] | Saci | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCC(rev SI)-3 ́ |
| Mina | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCCC(rev SI)-3 ́ | |
| XhoI | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCC(rev SI)-3 ́ | |
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2,1-N [TK/SmBiT] | Två | 5 ́-XXXXXXXXCTCGAGCGGT (SI)-3 ́ |
| Saci | 5 ́-XXXXXXXXGAGCTCAG(SI)-3 ́ | |
| Mina | 5 ́-XXXXXXXXGAATTCa(SI)-3 ́ |
Tabell 1. Sekvenser av primers för olika restriktioner enzym platser i kodning sekvens av länkaren för pBiT 1.1 och pBiT 2,1 vektorer.
SI = sekvens av intresse; Rev SI = omvänt komplement till sekvensen av intresse. Tabell anpassad från referens 11.
| Vektor | Länkare sekvens | Enzym begränsning som används | ||
| pBiT 1.1-C [TK/LgBiT]/pBiT 2,1-C [TK/SmBiT] | SI-GLYalaglnglyasnserglyserserglyglyglyglyserglyglyglykoglyserserdet-(lgbit/smbit) | Saci | ||
| SI-GLYasnserglyseringlyglyglyglyserglyglyglykoglysersergly-(lgbit/smbit) | Mina | |||
| (LgBiT/SmBiT)-serserglyglyglyglyserglyglyglyglyserserdet | XhoI | |||
| pBiT 1.1-N [TK/LgBiT]/pBiT 2,1-N [TK/SmBiT] | (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSergly-si | XhoI | ||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGLN-si | Saci | |||
| (LgBiT/SmBiT)-GlySerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyAlaGlnGlyAsnSer-SI | Mina | |||
Tabell 2. Linker Amino Acid sekvenser relaterade med SacI, EcoRI eller XhoI restriktioner platser i pBiT 1,1 och pBiT 2,1 vektorer.
Röda rester måste kodas av PCR-primers. Tabell anpassad från referens 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av den metod som presenteras här, interaktioner mellan alla GPCR och β-arrestin1/2 kan övervakas i realtid levande system med hjälp av denna GPCR-β-arrestin strukturella komplement analys. I detta avseende kunde vi konstatera differential β-arrestin rekrytering mellan de två β-arrestin isoformerna av GLP-1R (en prototypisk klass B GPCR), observerade vi också en dissociation av receptorn-β-arrestin komplexa några minuter efter att ha nått den maximala självlysande signalen.
För att få bästa möjliga känslighet i det strukturella kompletterings analyssystemet, screenades det med fyra olika rumsliga orienteringar mellan receptorn och varje β-arrestin isoform och den med högsta luminescerande signal användes för bakre studier såsom kurvor för dos responsstimulering (figur 4). Med hjälp av denna metodik var det möjligt att karakterisera interaktioner med receptor-β-arrestin med hjälp av en GPCR av högt terapeutiskt värde i endokrinologiska sjukdomar som diabetes mellitus15. På samma sätt kan denna strategi lätt anpassas till alla GPCR genom enkel märkning av GPCR av intresse med LgBiT eller SmBiT på C-terminalen och använda β-arrestin1/2 konstruktioner som beskrivs här och det framstår som ett kraftfullt alternativ till nuvarande metoder utan nödvändigheten av en komplex inrättas där överlappningar mellan givaren och acceptorn kan vara ett hinder som i vissa fall av BRET och FRET. En annan betydande fördel är att de vektorer som används i detta system innehåller låg uttrycksmedel i ett försök att efterlikna endogena uttrycks nivåer. Med denna funktion, kan vi utesluta möjligheten av icke-specifika föreningar på grund av höga uttrycks nivåer av receptorn och/eller β-arrestin. I figur 3 och figur 4, finns det en tydlig skillnad i receptorn-β-arrestin komplex mellan β-arrestin1 kontra β-arrestin2 och även en högre effekt och intensitet mot β-arrestin1 över β-arrestin2. Screening i fyra olika riktningar föreslogs för att öka känsligheten hos analysen som gör systemet mycket känsligt även på endogena uttrycks nivåer.
Denna metodik är mycket rättfram att prestera. Det kanske mest kritiska steget inom detta protokoll är primer design för att förstärka receptorn av intresse. Användaren måste vara mycket försiktig i valet av vad begränsningen enzym att använda enligt figur 1 och baserat på detta för att lägga till motsvarande nukleotider till primers (tabell 1) för att koda de röda markerade aminosyror (tabell 2).
En begränsning av denna metod kan vara att furimazin kommer att brytas ned i en vattenlösning vid eller nära Fysiologiskt pH, vilket leder till en gradvis minskning av luminiscens intensitet oberoende av eventuella förändringar i GPCR-β-arrestin interaktioner16. För att övervinna denna begränsning bör användaren alltid inkludera en normaliserings kontroll (fordonsbehandlade prover) vid kontinuerlig övervakning av Luminescens under längre tidsperioder. Det är också viktigt att använda låga nivåer av foster bovint serum under analysen eftersom dess närvaro det kan öka graden av furimazin nedbrytning16. Ett problem som kan uppstå under analysen är att för luminescerande värden för en känd interaktion med GPCR-β-arrestin kan ingen signifikant ökning registreras jämfört med baslinjens värden i alla fyra olika plasmidkombinationerna. Detta kan bero på det låga uttrycket från HSV-TK-promotorn17. I så fall är ett alternativ att subklona den öppna läsning ramar kodning lgbit och smbit fusions proteiner till uttrycks vektorer med hjälp av CMV promotorn. När du byter till en starkare promotor, optimering av mängden transfekterade DNA bör göras för att få den bästa assay svar.
Med hjälp av denna strukturella kompletterings analysen kunde vi Observera med stor noggrannhet β-arrestin1/2 rekrytering interaktioner med en prototypisk klass B GPCR. Med denna metod, är det möjligt att farmakologiskt karakterisera nya läkemedel av särskilt intresseinriktning GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) av Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) finansierat av ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J.
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
- Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
- New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
- Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
