Summary
Vi præsenterer en komplet protokol for postmortem diagnose af dyr rabies under feltbetingelser ved hjælp af en hurtig immunkromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernen biopsi prøveudtagning til endelig fortolkning. Vi beskriver også yderligere applikationer ved hjælp af enheden til molekylær analyse og viral genotypering.
Abstract
Funktionelle rabiesovervågningssystemer er afgørende for at tilvejebringe pålidelige data og øge det politiske engagement, der er nødvendigt for sygdomsbekæmpelse. Hidtil skal dyr, der mistænkes for at være rabiespositive, underkastes en postmortem-bekræftelse ved hjælp af klassiske eller molekylære laboratoriemetoder. De fleste endemiske områder ligger imidlertid i lav- og mellemindkomstlande, hvor diagnosticering af rabies af dyr er begrænset til centrale veterinærlaboratorier. Dårlig adgang til overvågningsinfrastruktur fører til alvorlig underrapportering af sygdomme fra fjerntliggende områder. Der er for nylig udviklet adskillige diagnostiske protokoller, der kræver lav teknisk ekspertise, hvilket giver mulighed for at etablere rabiesdiagnose i decentraliserede laboratorier. Vi præsenterer her en komplet protokol for feltpostmortemdiagnose af husdyr rabies ved hjælp af en hurtig immunkromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernebiopsiprøvetagning til den endelige fortolkning. Vi fuldender protokollen ved at beskrive en yderligere brug af enheden til molekylær analyse og viral genolyping. RIDT registrerer nemt rabiesvirus og andre lyssavira i hjerneprøver. Princippet om sådanne test er enkelt: hjernemateriale påføres på en teststrip, hvor guldkonjugerede antistoffer binder sig specifikt til rabiesantigener. Antigen-antistofkomplekserne binder sig yderligere til faste antistoffer på testlinjen, hvilket resulterer i en klart synlig lilla linje. Virussen inaktiveres i teststrippen, men viralt RNA kan efterfølgende ekstraheres. Dette gør det muligt for teststrippen, snarere end den infektiøse hjerneprøve, at blive sikkert og nemt sendt til et udstyret laboratorium til bekræftelse og molekylær typning. Baseret på en ændring af producentens protokol, fandt vi øget test følsomhed, nå 98% i forhold til guld standard referencemetode, den direkte immunofluorescens antistof test. Fordelene ved testen er talrige: hurtig, nem at bruge, lave omkostninger og ingen krav til laboratorieinfrastruktur, såsom mikroskopi eller koldkæde overholdelse. RIDT'er er et nyttigt alternativ til områder, hvor der ikke findes referencediagnosticeringsmetoder.
Introduction
Hunde rabies er den vigtigste årsag til menneskers rabies, globalt ansvarlig for ca. 59.000 dødsfald om året, næsten alle forekommer i lav- og mellemindkomstlande (LMICs) i Asien og Afrika1. Det vigtigste etikologiske middel er en neurotropisk hunde-associeret klassisk rabiesvirus (RABV, familie Rhabdoviridae, slægten Lyssavirus, arter Rabies lyssavirus). Andre rabiesrelaterede lyssavira, der for det meste cirkulerer hos flagermusarter, forårsager imidlertid også sygdom2,3. I de berørte regioner hæmmes sygdomsovervågning og -bekæmpelse ofte af et lavt politisk engagement , sandsynligvis på grund af mangel på pålidelige data4,5,6. En af grundene til sygdomsunderrapportering er manglen på laboratoriediagnose, til dels på grund af begrænset adgang til udstyrede laboratorier og uddannet personale samt vanskelighederne ved forsendelse af enhederne. Laboratoriediagnose er nødvendig for at bekræfte rabiestilfælde og giver desuden mulighed for genetisk karakterisering af de involverede stammer, hvilket giver indsigt i virusoverførsel på regionalt niveau4,5,7.
De nuværende guldstandarder for diagnosticering af rabies efter døden, som er godkendt af både Verdenssundhedsorganisationen (WHO) og Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE), er den direkte fluorescerende antistoftest (DFAT), den direkte hurtige immunhistokemitest (DRIT) og molekylære metoder (f.eks. omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR))4,8. Korrekt anvendelse i lMIC'er er dog fortsat begrænset på grund af utilstrækkelige laboratoriefaciliteter med inkonsekvent strømforsyning, uoverbørlig prøvetransport og mangel på et kvalitetsstyringssystem. Da diagnosticering af rabies ved dyr typisk kun udføres på centrale veterinærlaboratorier i læger, afspejler de eksisterende overvågningsdata hovedsagelig rabiessituationen i byområder.
Nyligt udviklede diagnosealternativer med lavteknologi giver mulighed for at etablere rabiesdiagnose i fjerntliggende områder og decentraliserede rabieslaboratorier4,8,9. Den hurtige immunkromatografiske diagnostiske test (RIDT) er en lateral flowtest baseret på immunkromatografi med guldkonjugerede detektorantistoffer og er et meget lovende rabiesdiagnostikværktøj10,11,12,13. Princippet er enkelt: Efter fortynding blandes hjernematerialet i den medfølgende buffer, og der påføres et par dråber på teststrippen, hvor guldkonjugerede monoklonale antistoffer binder specifikt sig til rabiesantigener, hovedsagelig nukleoproteiner (Figur 1). Antigen-antistofkomplekserne gennemgår derefter lateral flowmigration, der bindes ved testlinjen (T-line) til faste antistoffer mod rabiesantigener, hvilket resulterer i en klart synlig lilla linje. De resterende guldkonjugerede antistoffer, der ikke er bundet til rabiesantigener, fortsætter med at migrere og fastgøres til membranen gennem yderligere målretningsantistoffer, hvilket resulterer i en klart synlig lilla kontrollinje (C-line).
Den ene trin, lave omkostninger metode er hurtig, ekstremt let og kræver ikke dyrt udstyr eller særlige opbevaringsforhold. Ved ændring af fabrikantens protokol for at eliminere fortyndingstrinnet er næsten alt udstyr og reagenser, der kræves for at udføre testen, inkluderet i pakke14. Resultatet aflæses efter 5-10 minutter uden mikroskop. Dette er en stor fordel i forhold til DFAT-testen, som kræver et fluorescensmikroskop og immunfluorescenskonjugat sammen med køletransport og prøveopbevaring. Selv DRIT-testen, som kan udføres ved hjælp af et let mikroskop, kræver en kontinuerlig kølekæde til opbevaring af anti-rabies antistoffer, som heller ikke er kommercielt tilgængelige. I forhold til DRIT kræver RIDT ingen giftige kemikalier, en særlig fordel i lande, hvor bortskaffelse af affald er dårligt reguleret. Den hurtige test er mindre tidskrævende med meget lettere fortolkning i forhold til guldstandardtestene DFAT og DRIT. Dette giver mulighed for on-site test af personale med begrænset teknisk ekspertise.
På grundlag af disse testegenskaber bliver det muligt at foretage hurtig diagnosticering af mistænkte dyr i fjerntliggende områder, hvilket gør det lettere at implementere profylakse efter eksponering (PEP) for eksponerede personer så hurtigt som muligt. Desuden er fjerntransport af rabiesprøver ikke nødvendig, hvilket resulterer i bedre prøvekvalitet på testtidspunktet. De resultater, der er opnået ved RIDT-testene, bør dog på nuværende tidspunkt bekræftes ved hjælp af en referencediagnostisk test som DFAT eller DRIT.
RIDT-teknikker til påvisning af RABV og andre lyssavira er blevet evalueret. En af de første undersøgelser blev udført af koreanske forskere i 200710. Sammenlignet med DFAT-metoden viste RIDT i 51 dyreprøver og 4 RABV-isolater en følsomhed og specificitet på henholdsvis 91,7 % og 100 %. Disse resultater blev senere bekræftet med 110 animalske hjerneprøver fra Korea, med følsomhed og specificitet, sammenlignet med DFAT, på 95% og 98,9%, henholdsvis15. For nylig vurderede andre undersøgelser denne RIDT's ydeevne ved hjælp af virusisolater og/eller inficerede hjerneprøver fra forskellige dyr med forskellig geografisk oprindelse. Et panel på 21 prøver, herunder afrikansk RABV og andre afrikanske lyssavira (Duvenhage virus (DUVV), Lagos bat virus (LBV) og Mokola virus (MOKV)), blev opdaget med succes, med følsomhed på 100% i forhold til DFAT16. Lignende høj følsomhed (96,5%) og specificitet (100 %) fra et panel på 115 hjerneprøver fra Etiopien17. En anden undersøgelse evaluerede europæiske RABV-isolater, to andre europæiske lyssavira (europæisk batlysavirus type 1 (EBLV-1) og type 2 (EBLV-2)) og det australske batlysavirus (ABLV)18. Baseret på analyse af 172 dyrehjernprøver havde RIDT-sættet 88,3 % følsomhed og 100 % specificitet sammenlignet med DFAT, og de tre rabiesrelaterede lyssavira blev med succes opdaget. I denne undersøgelse kom nogle af de falske negative resultater fra hjerneprøver gemt i glycerol buffer, hvilket tyder på, at forkert glycerol fjernelse påvirket kapillær flow eller antistof bindende. En nylig analyse af 43 kliniske prøver fra australske flagermus bekræftede tidligere testresultater, med fuldstændig konkordans til DFAT19. Der blev udført to undersøgelser i Indien ved hjælp af RIDT på et begrænset antal kliniske prøver (11 og 34 prøver). Sammenlignet med DFAT var følsomheden mellem 85,7 % og 91,7%,og specificiteten var 100 %20,21. En anden evaluering af dette kit ved hjælp af 80 animalske hjerneprøver fra Afrika, Europa og Mellemøsten opnået fuldstændig konkordans med DFAT for specificitet (100%) men en højere følsomhed (96,9%) i forhold til de foregående undersøgelser22. I en nylig sammenligning mellem laboratorier af denne RIDT udført i 22 forskellige laboratorier ved hjælp af et panel på 10 prøver, samlede konkordans var 99,5%23.
Kun én nylig multicentrisk undersøgelse viste utilfredsstillende samlede RIDT-resultater24. Prøver fra tre forskellige datasæt blev testet og gav variable følsomheds- og specificitetsværdier sammenlignet med DFAT. F.eks. gav følsomhed og specificitet opnået med det første panel (n=51) og det andet panel (n=31) af prøver fra forsøgsdemittede dyr, der alle blev testet i laboratorium A, en følsomhed på henholdsvis 16 % og 43 %, mens specificiteten var 100 % for begge. Omvendt gav resultaterne af det tredje panel (n=30) af kliniske feltprøver analyseret ved laboratorium B fuldstændig konkordans med resultaterne af DFAT, som blev yderligere næsten fuldstændig bekræftet af laboratorium A (85% følsomhed og 100% specificitet). Batch-til-batch-variation blev foreslået som en mulig forklaring på den svingende relativt lave følsomhed med RIDT24.
Samtidig udførte en anden undersøgelse en lignende valideringsproces af ovennævnte RIDT, med en ændring af producenten anbefalede protokol14. Forfortyndingstrinnet (1:10) i PBS blev udeladt under klargøring af hjernematerialet. På grundlag af denne enklere modificerede protokol opnåede forfatterne følsomhed og specificitet på henholdsvis 95,3 % og 93,3 % sammenlignet med DFAT ved under laboratorieforhold at teste et datasæt på 73 animalske hjerneprøver, naturligt eller eksperimentelt inficeret med forskellige RABV-stammer. Undersøgelsen præsenterede den første evaluering af denne RIDT i marken (Tchad, Afrika). I 48 kliniske hjerneprøver var følsomhed og specificitet henholdsvis 94,4 % og 100 %. Uoverensstemmelserne mellem DFAT og RIDT skyldtes falske positive resultater med DFAT, bestemt efter bekræftelse med RT-PCR. Da disse resultater blev slettet, var der fuldstændig overensstemmelse, og det viste, at RIDT var mere pålidelig end DFAT under disse feltbetingelser14. Der blev ikke observeret nogen batch-til-batch-variation ved hjælp af den ændrede protokol. Da den ændrede protokol blev anvendt på et lille antal af de divergerende DFAT/ RIDT-prøver (n=8) i undersøgelsen af Eggerbauer et al.24,blev alle fundet konsnative (100 % følsomhed).
En anden stor fordel ved RIDT er sekundær anvendelse til påvisning af viral RNA, der er fastgjort på strimlen ved hjælp af molekylære teknikker (såsom RT-PCR) og efterfølgende genotyping14,24. Efter et ekstraktionstrin påviste Léchenne et al.14 viral RNA, der var fastgjort på Anigen-anordningens membran ved hjælp af RT-PCR med 86,3 % følsomhed i et panel på 51 prøver (herunder 18 prøver, der blev testet og afsendt fra Tchad ved omgivelsestemperatur). Efterfølgende genotypering var mulig i 93 % af de 14 testede prøver. Der blev anvendt en sekvensering af PCR-ampliconer på mindst 500 nukleotider i længden. Ud over RABV-isolater påviste testen fire andre lyssavirusarter, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 og Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), under en fuldt samstemmende international interlaboratorietest14. Følsomheden af viral RNA-detektion var endnu højere (100 %) i undersøgelsen af Eggerbauer et al., baseret på laboratorieprøver undersøgelse24. Sidstnævnte undersøgelse viste også, at den buffer, der anvendes i RIDT kit inaktiveret virus. Derved kan enhederne nemt sendes ved omgivelsestemperatur uden specifikke biosikkerhedsforanstaltninger til referencelaboratorier, til molekylær bekræftelse og genolyping.
Baseret på de tidligere evalueringer giver RIDT-værktøjer mange fordele til brug i feltindstillinger, især når referencediagnosticeringsteknikkerne ikke er tilgængelige. Denne test har imidlertid også visse begrænsninger, navnlig lav følsomhed af antigendetektion14,24. Testen gælder for prøver, der indeholder store mængder virale antigener, såsom hjerneprøver. Det er dog ikke hensigtsmæssigt for andre prøver såsom spyt eller andre kropsvæsker. En anden ulempe er omkostningerne ved enheden (omkring 5-10 euro i Europa), hvilket er billigere i forhold til omkostningerne ved at udføre DFAT, RT-PCR eller DRIT, men som stadig er høj for LMICs. Den fremtidige udvikling og validering af lignende RIDT'er fra andre virksomheder kan imidlertid føre til et prisfald. En undersøgelse rapporterede batch-til-batch variationer. Selv om det ikke er rapporteret af andre, bør der ikke desto mindre udføres streng kvalitetskontrol ved afprøvning af et nyt parti, som for alle reagenser, der anvendes i et kvalitetsstyringsmiljø. Brugen af den ændrede protokol blev ikke ændret, når der blev brugt forskellige batches14. Alle undtagen én undersøgelse viste, at RDIT's følsomhed var høj sammenlignet med DFAT (ca. 90-95 %). Da rabies altid er dødelig, anbefales det stadig kraftigt at bekræfte eventuelle negative resultater med RDIT ved hjælp af en referencediagnostiktest som DFAT, DRIT eller RT-PCR14.
I dette manuskript præsenterer vi en komplet protokol for felteftermorgendiagnosticering af husdyr rabies baseret på et eksempel på en kommercialiseret RIDT, fra hjerneprøve indsamling til anvendelse af en modificeret protokol i forhold til fabrikanten anbefalinger (som tidligere blev valideret14) og efterfølgende molekylær analyse. Denne protokol blev anvendt og valideret mange gange under feltbetingelser i Vest- og Centralafrika, hvor RIDT rutinemæssigt blev brugt til rabiesdiagnose sammen med DFAT-testen. Vi demonstrerer desuden en anden applikation til enheden, i laboratoriemiljøer, til udvinding og detektion ved hjælp af RT-PCR viral RNA fast på enheden.
Protocol
1. Prøvetagning via foramen magnum (occipital rute)25
BEMÆRK: Denne teknik kan implementeres under laboratorieforhold eller i feltindstillinger. Prøverne skal forarbejdes så hurtigt som muligt efter det mistænkte dyrs død eller opbevares ved kølig temperatur (nedkølet eller frosset, hvis det er muligt) for at undgå nedbrydning, som kan påvirke resultaterne. I lighed med andre referenceteknikker baseret på lyssavirusantigendetektion såsom DFAT og DRIT bør nedbrudte prøver ikke testes, da det kan påvirke resultatet (risiko for falsk negativt resultat).
FORSIGTIG: Alle prøver bør betragtes som potentielt infektiøse. Sikkerhedsforskrifter og -procedurer bør følges nøje, selv ifeltindstillingerne 4. Brug især passende personlige værnemidler, herunder maske, briller, handsker og en laboratoriekittel. Brug passende desinfektionsmiddel til materiale og dekontaminering af prøver (f.eks. natriumhypochlorit med anbefalede fortyndinger fra producenten, 70 % alkohol - ethanol eller isopropanol, 1 % sæbeopløsning). Alt personale, der håndterer prøver, skal vaccineres mod rabies.
- Fjern dyret hovedet med en kniv før den første halshvirvel (atlas ryghvirvel) for at få adgang til foramen magnum.
BEMÆRK: For at minimere inficeret aerosol undgå at bruge en manuel sav eller lignende værktøj. - Opsaml hjernestamme (medulla oblongata) ved hjælp af en engangsplastpipette (Figur 2A),et drikkehalm (Figur 2B), en klemme (figur 2C) eller en pipette (forsynet med RIDT) (Figur 2D).
BEMÆRK: Der skal lægges særlig vægt på indsamling af prøven, da det er et yderst vigtigt skridt for resultaternes pålidelighed. Ud over den tilhørende video, som viser på en enkel måde, hvordan man indsamler den del af hjernestammen af interesse, et træningstrin anbefales stærkt at sørge for at indsamle den korrekte anatomiske sektion. - Eventuelt og ud over hjernestammen (medulla oblongata), indsamle andre dele af hjernestammen eller hjernen (cerebellum, hippocampus, thalamus og cortex) ved samme occipital rute ved at skubbe og dreje plast pipetten eller halmen mod øjenhulen (Figur 3).
- Hvis du bruger et strå eller en pipette, skal du forsigtigt presse den til at deponere hjerneprøven (0,5-2 g) i et rør til efterfølgende analyse og/eller biobanking.
BEMÆRK: Prøveopbevaring i glycerol anbefales ikke, da det ser ud til at påvirke kapillærstrømmen eller antistofbindingstrinnet i RIDT18.
2. Gennemførelse af den ændrede RIDT-protokol14
BEMÆRK: Denne ændring udelader et fortyndingstrin (1:10) i PBS, som angivet i producentprotokollen (alle versioner), og kan implementeres under laboratorie- eller feltindstillinger.
- Podepinden/dropperen anvendes til at opsamle, hvad der svarer til en halv jordnødde- eller ært (0,1-0,5 g) hjernemateriale, og anbringes i bufferprøvens rør.
BEMÆRK: For den ændrede protokol er alle reagenser/forbrugsstoffer inkluderet i sættet (der kræves ingen PBS eller yderligere rør) (Figur 4). Dokumenter pakkekassens batchnummer, og kontroller udløbsdatoens gyldighed. - Knus forsigtigt hjernematerialet direkte i røret med podepinden eller dropperen i ca. 30 s, indtil der opnås en homogen suspension.
BEMÆRK: Bufferreaktionen inaktiverer virussets infektivitet under betingelserne i fabrikantens protokol24. - Ved hjælp af dropperen deponeres fire dråber (ca. 100 μL) af suspensionen i prøveindgangen på testanordningen.
- Vent på fuldstændig prøveoverførsel (1-5 min),før testenheden læses. Migrationen bør starte hurtigt efter deponering af prøven (1-5 min).
- I tilfælde af forsinkelse (på grund af høj viskositetsaffjedring) eller for at fremskynde starten af migrationen, forsigtigt ridse bunden af depositum site af enheden med dropper (1-5 gange) og i sidste ende tilføje 1-2 flere dråber. Migrationen bør påbegyndes umiddelbart derefter.
- Testresultatet læses i registreringsvinduet efter 5-10 min og højst 20 min efter afslutningen af overflytningen.
- Fortolke resultatet baseret på tilstedeværelse eller fravær af kontrollinjen (C-line) og testlinjen (T-line) (lilla linjer) i registreringsvinduet i henhold til figur 5. Prøven er positiv, når to linjer er synlige (figur 5A), negativ, hvis kun C-linjen er til stede ( figur5B) og ugyldig, hvis kun T-linjen er til stede, eller hvis ingen linjer er synlige ( figur5C).
BEMÆRK: Ugyldige resultater skal gentages mindst én gang. Andre teknikker bør udføres, hvis resultaterne forbliver ugyldige. Negative resultater opnået med RIDT skal efterfølgende bekræftes ved hjælp af en guldstandardreferencemetode som DFAT, DRIT og molekylære metoder (polymerasekædereaktion eller PCR). Selv om følsomheden af denne test er høj (se repræsentative resultater), er det ikke 100%. - Opbevar brugte enheder ved stuetemperatur eller opbevares/fryses, når det er muligt, til efterfølgende molekylær analyse (se afsnit 4). Den resterende prøvesuspension fryses ved -20 °C/-80 °C i bufferrøret for om nødvendigt at gentage testen eller til efterfølgende molekylær analyse.
3. RNA-ekstraktion og detektion foretaget af RT-qPCR fra RIDT-enheden
BEMÆRK: Dette trin kan kun gennemføres under laboratorieforhold med tilpasset miljø og egnet udstyr til molekylær diagnose. Det kan gøres kort efter RIDT-testen eller med tilbagevirkende kraft på arkiverede RIDT-enheder, der opbevares ved stuetemperatur (15-30 °C), nedkølet eller frosset.
- RNA-ekstraktion
BEMÆRK: For at overvåge ekstraktionstrinnet anbefales det at anvende en intern betjeningsanitet, der kan være et endogent mRNA (f.eks. ß-actin) eller en udefrakomment kontrol (såsom eGFP syntetisk RNA), der er direkte tilsat prøven i de første trin af ekstraktionen26,27.- Åbn enheden forsigtigt, og fjern filterpapiret.
- Prøvens aflejringsområde hældes, og det anbringes i et rør indeholdende 1 ml Tri-Reagens LS. Inkuber ved RT i 1 time med blid regelmæssig manuel omrøring.
- Udfør ekstraktionen i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger, som tidligere beskrevet27. På dette trin kan den eksogene interne kontrol tilføjes.
- Under processen tilsættes 2 μL glykogen for at lette udfældningen af RNA i henhold til fabrikantens anbefalinger.
- Det endelige volumen for RNA-resuspension justeres i nukleasefrit vand med et volumen på 50 μL, der normalt anvendes.
BEMÆRK: Ved afslutningen af centrifugeringstrinnet for vandig og organisk faseadskillelse (efter tilsætning af 200 μL chloroform i Tri-Reagens LS) vil membranstykket fra enheden være i bunden af røret og ikke forstyrre indsamlingen af den øvre vandige fase. Alternativt kan andre nemme og hurtige protokoller anvendes, for eksempel ved hjælp af fenolbaserede reagenser og silicamembraner28.
- Detektion ved RT-qPCR26
BEMÆRK: Påvisning af potentiel viral RNA til stede i ekstraherede prøver kan ske ved hjælp af forskellige molekylære teknikker, såsom reverse-transskription PCR, konventionelle (endepunkt) eller realtid PCR (qPCR). Flere metoder er tilgængelige, såsom konventionelle RT-PCR27,,29 eller RT-qPCR26,30 rettet mod den virale nukleoprotein eller polymerase genet. Et eksempel vil blive præsenteret nedenfor baseret på en dobbelt kombineret pan-lyssavirus RT-qPCR rettet mod en bevaret region blandt den virale polymerase. Denne RT-qPCR-teknik forbinder to forskellige RT-qPCR: den ene baseret på TaqMan-sondeteknologien (pan-RABV RT-qPCR) og den anden ved hjælp af SyBR Green-detektionen (pan-lyssa RT-qPCR). Desuden foretages detektering af en udefrakommende intern kontrol (eGFP RNA), der er direkte tilsat under ekstraktionsprocessen, af en specifik TaqMan-sondebaseret RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Omhyggelig validering på stedet af de molekylære teknikker, der er udvalgt til påvisning af viralt RNA, er især vigtigt at kontrollere, at primere og sonder til RT-PCR i realtid er tilpasset til påvisning af de stammer, der cirkulerer i området af interesse4.- RNA-prøven fortyndes til 1:10 i nukleasefrit vand. Hver RNA-prøve testes i to eksemplarer ved hjælp af en 96-brønds reaktionsplade eller andre formater. Brug positive og negative kontroller for hver analyse og test mindst i to eksemplarer.
- Den vigtigste mixreaktionsopløsning til de tre forskellige RT-qPCR-analyser i henhold til tabel 1og med de primere/sonder , der er angivet i tabel 2.
- Der tilsættes 5 μL fortyndede RNA-prøver og 15 μL masterblanding til hver af de tre forskellige analyser. Den pan-RABV RT-qPCR-analyse og eGFP RT-qPCR-analysen kan cykle i samme plade.
- De forskellige analyser anvendes efter de termiske cykelforhold, der er angivet i tabel 3. Hvis der kun findes én PCR-termisk cycler, skal du starte med pan-RABV RT-qPCR og holde pladen til pan-lyssa RT-qPCR ved 4 °C indtil udgangen af pan-RABV RT-qPCR.
- De opnåede resultater analyseres med de tre analyser i henhold til tabel 4.
4. Genootyping efter RNA-ekstraktion fra RIDT-enheden
- Omvendt transskription RT27,29
- Der forebesætning af en masterblanding med 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 tilfældige primere (200 μg/μL) og 2 μL nukleasefrit vand i et endeligt volumen på 10 μL.
- Inkuber ved 65 °C i 10 min i en varmeblok og opbevares derefter på is.
- Forbered en masterblanding med 6 μL 5x First-Strand Buffer, 2 μL af 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) hævet transkription, 2 μL (80 U) RNasin, 2 μL dNTP-blanding (10 μM) og komplet med nukleasefrit vand for at opnå et endeligt volumen på 20 μL for hver prøve.
- Master mix (20 μL) tilsættes prøven (10 μL) (sidste volumen på 30 μL) og inkuberes ved 42 °C i 90 min i en varmeblok.
- Fortsæt til næste trin med PCR-forstærkning eller opbevar cDNA ved -20 °C.
- Konventionel PCR27,29,31
BEMÆRK: Forskellige teknikker til konventionel PCR er tilgængelige for genolyping. To præsenteres, både hemi-indlejret PCR, rettet mod en del af nukleoprotein eller en del af det virale protein i lyssavirus. Protokollen er den samme for hver af disse analyser, bortset fra primere og cykelforhold. Positive (positive RNA) og negative (negative cDNA og/eller nukleasefrit vand) bør indgå i hver serie og hver runde AF PCR.- Forbered hver prøve i en 0,2 ml mikrorør en master mix reaktion løsning til det første PCR trin. Denne blanding indeholder 5 μL 10x NH4 Reaktionsbuffer, 2,5 μL MgCl2-opløsning (50 mM), 1 μL dNTP Mix (10 μM), 1 μL af hver primer (10 μM), 0,2 μL (1 U) Biotaq DNA polymerase og 37,3 μL nukleasefrit vand (slutvolumen på 48 μL). Primere er angivet i tabel 5.
- Der tilsættes 2 μL cDNA i hvert rør og en cyklus på en separat konventionel PCR-termisk cycler for hver analyse i henhold til tabel 6.
- Der forbered en anden master mix reaktionsopløsning, der er identisk med den foregående med anvendelse af de relevante primere (Tabel 5) til den hemi-indlejrede PCR-reaktion.
- Der tilsættes 2 μL af det første runde PCR-produkt og -cyklus på en konventionel PCR-termisk cycler ved hjælp af de cykelparametre, der er angivet i tabel 6.
- Visualiser de forskellige PCR-produkter (første og anden runde PCR) efter at have lagt dem på en 1% agarose gel (100 ml Tris-aceta EDTA buffer 1x - TAE 1x) med ethidium bromid (endelig koncentration omkring 0,01%) og køre gelen i løbet af 30 min ved 120 V. Der observeres et positivt PCR-resultat i form af et lyst bånd af den forventede størrelse (tabel 5).
- Sanger rækkefølge
- Udfør en Sanger sekvensering af ampliconer opnået med pan-lyssavirus hemi-indlejret PCR og fuldføre genotyping analyse.
Representative Results
Som med enhver anden diagnosticeringsmetode er indsamling af prøver af afgørende betydning for pålideligheden af resultaterne, især når den udføres i feltindstillinger. Indsamlingsprocessen skal være så enkel som muligt for at sikre indsamling af prøver af høj kvalitet. Indsamlingen af en hjernebiopsi (hjernestamme med medulla oblongata) via foramen magnum-ruten til postmortem-diagnosticering af rabies af dyr opfylder dette krav, som angivet i figur 2A-D25.
Efter indsamlingen sendes hjerneprøven til RIDT's modificerede protokol, opsummeret i figur 6. Som anført i protokolafsnittet er den vigtigste tilpasning fra fabrikantens side, forudsat at protokollen ikke indeholder fortyndingstrinnet i PBS, hvilket forenkler proceduren og de nødvendige hjælpematerialer/reagenser, således at alle indgår i sættet (Figur 4).
Denne modificerede protokol blev implementeret og evalueret i fem forskellige laboratorier, herunder en WHO samarbejdscenter om rabies (Lab 1, Frankrig), en FAO reference center for rabies (Lab 5, Italien) og tre referencelaboratorier placeret i enzootiske afrikanske lande, Tchad (Lab 2), Elfenbenskysten (Lab 3) og Mali (Lab 4). I Tchad blev der foretaget en evaluering af RIDT i både laboratorie- og feltmiljøer.
Sammenlignet med referenceteknikken DFAT var RDIT's følsomhed og specificitet høj for alle laboratorier med henholdsvis 96% til 100% og 93,7% til 100% (tabel 7). Rdit's laveste følsomhed og specificitet blev opnået for Lab 1 (Frankrig) under laboratorietevalideringstrinnet. Baseret på det kumulative antal testede prøver (n=162) (supplerende tabel 1) var den samlede følsomhed og specificitet sammenlignet med DFAT henholdsvis 98,2 % og 95,8 % (tabel 7). Disse foreløbige, men lovende resultater blev imidlertid opnået på et begrænset stikprøvedatasæt og skal bekræftes yderligere på et stort antal positive og negative prøver, især for dem, der blev testet i enzootiske områder, for at undgå enhver potentiel undervurdering eller partiskhed som følge af de nuværende heterogene datasæt.
RIDT-testen er velegnet til at detektere lyssavirus hos hjernebiopsier fra inficerede dyr, hvor niveauet af lyssavirusantigener er vigtigt. Testgrænsen for påvisning er dog fortsat høj ved test af titreret virussuspension (tabel 8; Figur 7).
Tabel 9 (fra Léchenne 201614)viser et eksempel på resultater opnået efter RNA-påvisning af den dobbelte kombinerede pan-lyssavirus RT-qPCR, der er målrettet mod den virale polymerase af lyssavirus. Et panel på 51 positive RIDT-test udført under laboratorieforhold (Lab 1, n=32) eller i Tchad (Lab 2, n=19) og derefter sendt ved omgivelsestemperatur til Lab 1, blev testet. Der blev opnået positiv påvisning for 18 (94,7 %), 26 (81,2 %) og 44 (86,3 %) prøver fra henholdsvis Lab 1, Lab 2 og de to tilsammen. Desuden blev der udført genolyping for 14 af disse prøver (10 fra Lab 1 og 4 fra Lab 2) ved hjælp af det hemi-indlejrede PCR, der var målrettet mod det delvise nukleoprotein-gen og lykkedes for 13 af dem (93 %) (fra Léchenne et al. 201614).
Figur 1: Skematisk repræsentation af strukturen af en RIDT til rabiesdiagnose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempler på hurtige enkle teknikker til indsamling af hjerneprøver (hjernestamme med medulla oblongata) hos dyr (hund vist her) via occipital foramen i feltindstillinger (Mali). (A) Indsamling med engangsplastpipette (B) Indsamling med et plastdrikkestrå (C) Samling med klemme (D) Indsamling med bortskaffelsesdråber, der er forsynet med RIDT-sættet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Langsgående anatomisk del af hundehovedet, der viser de forskellige dele af hjernen (hjernestamme, lillehjernen, hippocampus, thalamus og cortex), der indsamles, når der i en rotationsbevægelse skubbes en engangsplastpipette gennem occipital foramen-ruten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Beskrivelse af indholdet af RIDT-sættet, herunder enheden, en engangsplastdråbe, en engangspodepind og analysefortyndingsmiddel. Det rør, hvor prøven skal opsamles og opbevares, leveres ikke. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative resultater for fortolkningen af Anigen RIDT. (A) Positive resultater (synlig tilstedeværelse af to linjer, C-line og T-line) (B) Negative resultater (synlig tilstedeværelse af C-line kun) (C) Ugyldige resultater (fravær af synlig C-linje). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Skematisk gengivelse af RIDT-protokollen, tilpasset fra producentens anvisninger. (A) Modificeret version af protokollen, med sletning af fortyndingstrinnet anbefalet af fabrikanten (B) Indledende protokol anbefalet af fabrikanten, med et fortyndingstrin før 1:10 i PBS af hjerneprøverne. De trin, der slettes i den ændrede version af protokollen (vist i figur 6A),er angivet med en rød linje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Eksempel på bestemmelse af grænseværdien for påvisning af RIDT14. Der blev anvendt en seriel 10:1 fortynding af en titreret rabiesvirus af stammen 9704ARG. Mængden af virus, der deponeres på hver enhed, er angivet i FFU (fluorescerende fokusdannende enheder). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Pan-RABV RT-qPCR-analyse | |
| Reagens | μL/reaktion |
| 2X reaktionsmix (en buffer indeholdende 0,4 mM af hver dNTP og 6 mM MgSO4) | 10 |
| Nukleasefrit vand | 1.5 |
| Taq3long (Fremad) [10 μM] | 1 |
| Taq17revy (Omvendt) [10 μM] | 1 |
| RABV4 [10 μM] | 0.3 |
| RABV5 [10 μM] | 0.3 |
| MgSO4 [50-mM] (findes i sættet) | 0.25 |
| ROX Reference Dye (25 μM) (findes i sættet) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (Promega) | 0.2 |
| SuperScript III RT/Platin Taq Mix | 0.4 |
| I alt pr. reaktion | 15 |
| eGFP RT-qPCR-analyse | |
| Reagens | μL/reaktion |
| 2X reaktionsmix (en buffer indeholdende 0,4 mM af hver dNTP og 6 mM MgSO4) | 10 |
| Nukleasefrit vand | 2.8 |
| EGFP1F (Fremad) [10 μM] | 0.5 |
| EGFP2R (Omvendt) [10 μM] | 0.5 |
| eGFP-sonde [10 μM] | 0.3 |
| MgSO4 [50-mM] (findes i sættet) | 0.25 |
| ROX Reference Dye (25 μM) (findes i sættet) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (Promega) | 0.2 |
| SuperScript III RT/Platin Taq Mix | 0.4 |
| I alt pr. reaktion | 15 |
| Pan-lyssa RT-qPCR-analyse | |
| Reagens | μL/reaktion |
| 2x SYBR Grøn Reaktion Mix | 10 |
| Nukleasefrit vand | 2.1 |
| Taq5long (Fremad) [10 μM] | 1 |
| Taq16revy (Omvendt) [10 μM] | 1 |
| MgSO4 [50-mM] (findes i sættet) | 0.25 |
| ROX Reference Dye (25 μM) | 0.05 |
| RNasin (40U/μL) (Promega) | 0.2 |
| SuperScript III RT/Platin Taq Mix | 0.4 |
| I alt pr. reaktion | 15 |
Tabel 1: Beskrivelse af mastermixreaktionsopløsningen for de tre forskellige RT-qPCR-analyser (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR og eGFP RT-qPCR).
| RT-qPCR-analyse | Navn | Type | Længde | Sekvens (5'-3') | Følelse | Position |
| pan-RABV RT-qPCR-analyse | Taq3long delte et år. | Primer | 22 | ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A | S | 7273-7294a |
| Taq17aflæns | Primer | 25 | GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G | Som | 7390-7414a | |
| RABV4 delte et ud af alt | Sonde (FAM/TAMRA) | 29 | AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC | Som | 7314-7342a | |
| RABV5 delte et ud af alt | Sonde (FAM/TAMRA) | 32 | AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA | S | 7353-7384a | |
| Pan-lyssa RT-qPCR-analyse | Taq5long delte et år. | Primer | 23 | TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA | S | 7272-7294a |
| Taq16aflæns | Primer | 25 | GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C | Som | 7366-7390a | |
| eGFP RT-qPCR-analyse | EGFP1F | Primer | 20 | GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC | S | 637-656b |
| EGFP2R | Primer | 19 | GAA CTC CAG CAG GAC KAT G | Som | 768-750b | |
| EGFP | Sonde (FAM/TAMRA) | 22 | AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A | S | 703-724b |
Tabel 2: Beskrivelse af primere/sonder for de tre forskellige RT-qPCR-analyser (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR og eGFP RT-qPCR). en Ifølge Pasteur virus (PV) RABV genom sekvens (GenBank tiltrædelse nummer M13215). b. Ifølge kloning vektor pEGFP-1 sekvens (GenBank tiltrædelse nummer U55761).
| Pan-RABV RT-qPCR- og eGFP RT-qPCR-analyser | ||||
| Trin | Cyklus | Temp | Tid | Dataindsamling |
| Omvendt transskription | 1 | 45 °C | 15 min. | |
| RT inaktivering/indledende denaturering | 1 | 95 °C | 3 min. | |
| Forstærkning | 40 | 95 °C | kr. | |
| 61 °C | 1 min. | Slutpunkt | ||
| Pan-lyssa RT-qPCR-analyse | ||||
| Trin | Cyklus | Temp | Tid | Dataindsamling |
| Omvendt transskription | 1 | 45 °C | 15 min. | |
| RT inaktivering/indledende denaturering | 1 | 95 °C | 3 min. | |
| Forstærkning | 40 | 95 °C | kr. | |
| 55 °C | 1 min. | Slutpunkt | ||
| Dissociationskurve | 1 | 95 °C | kr. | Forøgelse af 0.1 °C/s, 55-95 °C |
| 55 °C | 1 min. | |||
| 95 °C | kr. | |||
| 55 °C | kr. | |||
Tabel 3: Beskrivelse af de termiske cykelforhold for de tre forskellige RT-qPCR-analyser (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR og eGFP RT-qPCR).
| Analyse | Analyse | Resultater | Fortolkning |
| eGFP RT-qPCR | Cq i intervallet for accept | Validering af ekstraktion valideret | Analyse af andre analyser kan gøres |
| Cq ud af intervallet for accept | Ekstraktionen er ikke valideret | Prøven igen (gentag kørslen og/og ekstraktionen), anmod om nødvendigt en ny prøve | |
| pan-RABV RT-qPCR | Cq <38 | Positive | Positiv påvisning af viralt RNA |
| Cq ≥38 | Negative | Analyse af pan-lyssa RT-qPCR-analysen | |
| pan-lyssa RT-qPCR | Smeltekurve betragtes som positiv | Positive | Positiv påvisning af viralt RNA |
| Smeltekurve, der betragtes som negativ | Negative | Manglende påvisning af viralt RNA |
Tabel 4: Samlet fortolkning af den dobbelte kombinerede pan-lyssavirus RT-qPCR-analyse.
| Hemi-indlejret konventionel PCR-analyse | PCR runde | Navn | Længde | Sekvens (5'-3') | Følelse | Placeren | Amplicon størrelse (bp) |
| Hemi-indlejret PCR rettet mod polymerase genet | 1. runde | PVO5m | 20 | ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA | S | 7170-7189 | 320 |
| PVO9 (PVO9) | 19 | TGA CCA TTC BIL BIL GTN G | Som | 7471-7489 | |||
| 2. runde | PVO5m | 20 | ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A | S | 7170-7189 | 250 | |
| PVO8 (PVO8) | 22 | GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A | Som | 7398-7419 | |||
| Hemi-indlejret PCR rettet mod nukleoprotein genet | 1. runde | kr. | 20 | ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG | S | 55-74 | 1532 |
| N8m | 19 | CAG TCT CYT CNG CCA TCT C | Som | 1568-1586 | |||
| 2. runde | kr. | 20 | ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG | S | 55-74 | 845 | |
| kr. | 19 | GCC CTG GTT CGA ACA TTC T | Som | 881-899 |
Tabel 5: Beskrivelse af de primere, der anvendes til den konventionelle hemi-indlejrede PCR.
| Hemi-indlejret PCR rettet mod polymerase genet | ||||
| Trin | Cyklus | Temperatur | Tid | |
| Første og anden runde | Indledende denaturering | 1 | 94 °C | 3 min. |
| Denaturering | 35 | 94 °C | kr. | |
| Hybridisering | 56 °C | kr. | ||
| Forlængelse | 72 °C | kr. | ||
| Endelig forlængelse | 1 | 72 °C | 3 min. | |
| Hemi-indlejret PCR rettet mod nukleoprotein genet | ||||
| Trin | Cyklus | Temperatur | Tid | |
| Første runde | Indledende denaturering | 1 | 94 °C | 3 min. |
| Denaturering | 35 | 94 °C | kr. | |
| Hybridisering | 56 °C | kr. | ||
| Forlængelse | 72 °C | kr. | ||
| Endelig forlængelse | 1 | 72 °C | 3 min. | |
| Anden runde | Indledende denaturering | 1 | 94 °C | 3 min. |
| Denaturering | 35 | 94 °C | kr. | |
| Hybridisering | 58 °C | kr. | ||
| Forlængelse | 72 °C | kr. | ||
| Endelig forlængelse | 1 | 72 °C | 3 min. | |
Tabel 6: Beskrivelse af de termiske cykelforhold for den konventionelle hemi-indlejrede PCR.
| Lab | Land | Evalueringsperioden | Nb af prøver | DFAT-resultater | RIDT-resultater | Følsomhed | Specificitet | ||
| Pos | Neg | Pos | Neg | ||||||
| Laboratorium 1 | Frankrig | 2015 | 82 | 50 | 32 | 50 | 32 | 96% | 93.7% |
| Laboratorium 2 | Tchad | 2012-2015 | 44 | 33 | 11 | 33 | 11 | 100% | 100% |
| Laboratorium 3 | Elfenbenskysten | 2017 | 10 | 8 | 2 | 8 | 2 | 100% | 100% |
| Laboratorium 4 | Mali | 2017 | 18 | 15 | 3 | 15 | 3 | 100% | 100% |
| Laboratorium 6 | Italien | 2016 | 8 | 8 | 0 | 8 | 0 | 100% | - |
| Alle | 2015-2017 | 162 | 114 | 48 | 114 | 48 | 98.2% | 95.8% | |
Tabel 7: Bestemmelse af RIDT-testens iboende parametre (følsomhed, specificitet) sammenlignet med DFAT-referencemetoden, baseret på en analyse af i alt 162 prøver og med deltagelse af 5 forskellige laboratorier.
| Virus stammeen | Oprindelig vært | Placering | Oprindelig koncentration (FFU/mL)b | Detektionsgrænse (FFU/mL)c |
| kr. | Rød ræv | Frankrig | 3,1 x 107 | kr. |
| Cvs | Lab-isolat | - | 1,6 x 107 | kr. |
| kr. | Menneskelige | Thailand | 8,1 x 107 | > 8,1 x 106 |
| 9508CZK (SAD) | Lab-isolat | - | 5,4 x 108 | kr. |
| Pv | Lab-isolat | - | 4,3 x 107 | kr. |
| kr. | Hund | Fransk Guyana | 2,4 x 106 | > 2,4 x 105 |
| kr. | Bat | Argentina | 9,5 x 107 | kr. |
| kr. | Menneskelige | Filippinerne | 2,5 x 107 | kr. |
Tabel 8: Grænse for påvisning af RIDT ved hjælp af 8 forskellige titrerede rabiesvirussussussussuspensioner (fra Léchenne et al. 201614). en CVS: Udfordre virus stamme, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Pasteur virus. b. Antal fluorescerende fokusdannende enheder (FFU) pr. ml. c. Antal fluorescerende fokusdannende enheder (FFU), der er deponeret på strimlen.
| RIDT udført i | ||||||||||
| Laboratorium 1 | Laboratorium 2 | Kombineret | ||||||||
| Positive | Negative | Samlede | Positive | Negative | Samlede | Positive | Negative | Samlede | ||
| Viral RNA-detektion | Positive | 18 | 1 | 19 | 26 | 0 | 32 | 44 | 7 | 51 |
| Negative | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 3 | 3 | |
| Samlede | 18 | 1 | 19 | 26 | 0 | 35 | 44 | 10 | 54 | |
Tabel 9: Påvisning af viral RNA med RT-qPCR på Anigen-teststrip, der anvendes under laboratorieforhold (Lab 1), under feltforhold og afsendt ved omgivelsestemperatur (Lab 2) eller kombineret (fra Léchenne et al. 201614).
Supplerende tabel 1: Beskrivelse af de 162 prøver, der er testet med RIDT-testen til bestemmelse af de iboende parametre, der er vist i tabel 7. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Discussion
RIDT er en enkel, hurtig og billig metode til postmortem rabies diagnose og et lovende felt alternativ til laboratorietest. Anvendelsen af en sådan test, især for decentraliserede områder i lav- og mellemindkomstlande, vil forbedre forståelsen af forekomsten af rabiesvirus og overførsel på lokalt og potentielt nationalt plan. Når det kombineres med den hurtige hjerneprøve indsamling metode (uden fuld obduktion), en stor fordel er, at testen kan udføres helt i marken indstilling, væk fra laboratoriefaciliteter. Hjerneprøver indsamlet via foramen magnum kan bruges til test, og derfor er det ikke nødvendigt helt at åbne dyrets kranium. Testen er enkel at udføre og fortolke og er særlig velegnet til feltovervågning14. Andre fordele ved RIDT i forhold til DFAT eller DRIT er ikke behov for positive og negative kontroller og kit opbevaring ved stuetemperatur. Desuden kræver den ændrede protokol, hvor fortyndingstrinnet (1:10) i PBS udelades, ikke ekstra reagenser for at udføre testen og forenkler proceduren yderligere under feltbetingelser.
Et centralt punkt er kvaliteten af hjerneprøverne. Prøverne udtages og testes så hurtigt som muligt efter det mistænkte dyrs død eller opbevares ved kølig temperatur inden prøvningen for at undgå nedbrydning. Dekokomprotesterede prøver bør ikke testes, da det kan påvirke resultatet (risiko for falsk negativt resultat). Selv om der endnu ikke foreligger data om tab af følsomhed af RIDT over tid for hjerneprøver, antager vi, at det ligner i forhold til DFAT-test32. Tiden mellem dyrets død og udførelsen af testen kan dog reduceres, da testen kan udføres hurtigt og direkte i marken. Der er således generelt en lavere risiko for nedbrudte prøver.
Et andet vigtigt trin i protokollen er overførsel af prøvesuspension. Migrationen bør starte umiddelbart efter deponering af prøven (1-5 min). En høj viskositet af suspensionen kan derfor have en negativ indflydelse på migrationen. Forsigtigt skrabe bunden af enheden depositum site med dropper og tilføje 1-2 flere dråber ofte løser dette problem, og migrationen begynder umiddelbart efter.
De fleste RIDT-test, der blev udført i afrikanske laboratorier (Tchad, Elfenbenskysten og Mali), blev udført ved omgivelsestemperatur, som kan overstige 30 °C, mens det temperaturområde, der anbefales af fabrikanten, er 15 °C - 30 °C. Selv om vi ikke identificerede nogen indvirkning af høj temperatur på RIDT test ydeevne, er det nødvendigt at vurdere det mere omhyggeligt. På samme måde kræver virkningen af høj temperatur under opbevaring og transport af enheden efter brug til viral RNA-detektion og genotypering yderligere evaluering. Følsomheden af den virale RNA-påvisning af RT-qPCR fra RIDT-strimlen kan påvirkes af kvaliteten af den hjerneprøve, der oprindeligt blev anvendt i testen, men også af tilstanden af opbevaring af RIDT-testene efter brug. For eksempel var RNA-detektionens følsomhed højere, når ridt-test blev opbevaret under kontrollerede laboratorieforhold (94,7 %) sammenlignet med under feltbetingelser (f.eks.14 Disse betingelser kan også påvirke integriteten (især længden) af RNA, der er fastgjort på strimlen, hvilket muligvis forklarer den moderate følsomhed for genotypering baseret på længere PCR-ampliconer (f.eks. >500 nukleotider)14. Følsomheden af RT-qPCR udført på teststrippen var lavere end den, der blev opnået ved hjælp af FTA Whatman-kort (80,6 %)14. I lighed med andre molekylære teknikker kan den virale belastning også påvirke genotypingens succes baseret på RDIT-strimler med potentielle negative resultater for prøver med lav viral belastning14.
Testen er på nuværende tidspunkt ikke anbefalet af WHO og OIE til rutinemæssig diagnosticering og sygdomsovervågning, og et resultat kan ikke bruges alene til at vejlede PEP-beslutningstagningen. Der er stadig behov for yderligere testvalidering. En præcis hurtig rabiesdiagnose er imidlertid et afgørende element i velfungerende kontinuerlige rabiesovervågningssystemer og er medvirkende til at øge det politiske engagement, hvilket er yderst vigtigt for en vellykket bæredygtig rabieskontrol33. RIDT-test giver nye muligheder for rabiesdiagnostik i denne sammenhæng og er et nyttigt redskab til at udvide overvågningen af rabies i dyr i marken i lav- eller mellemindkomstområder.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet gennem Global Alliance for Vaccines and Immunisation (GAVI), Wolfermann Nägeli Foundation, Swiss African Research Cooperation (SARECO), SWF Stiftung für wissenschaftliche Forschung, Freiwillige Akademische Gesellschaft (FAG) Basel, Det Bilaterale Videnskabs- og Teknologisamarbejdsprogram i Schweiz med Asien og Novartis Foundation for biomedicinsk forskning.
Vi takker især hundeejerne, veterinærpersonalet og laboratoriepersonalet for deres store engagement. Vi ønsker også at anerkende Lisa Crump for sprogredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed) | Bio-Rad, France | 3572112 | Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique. |
| Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, France | 4351104 | Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper | - | - | Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route). |
| Evans Blue Solution 1% | Bio-Rad, France | 3574911 | Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope. |
| Primer eGFPF1 | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'. |
| Primer eGFPR2 | Eurofins Genomics, Germany | - | Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'. |
| Primer Taq17 revlong | Eurofins Genomics, Germany | - | Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'. |
| Primer Taq3 long | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'. |
| Probe eGFP FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'. |
| Probe RABV4 FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'. |
| Probe RABV5 FAM/TAMRA | Eurofins Genomics, Germany | - | Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'. |
| Rapid Rabies Ag Test Kit | BioNote Inc., Republic of Korea | RG18-01DD | Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies. |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega, USA | N2515 | Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen, France | 11732-020 | Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device. |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, France | 15596026 | Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT. |
References
- Hampson, K., et al. Correction: Estimating the Global Burden of Endemic Canine Rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), e0003786 (2015).
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Walker, P. J., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae. The Journal of General Virology. 99 (4), 447-448 (2018).
- World Health Organization (WHO). WHO Expert Consultation on Rabies, third report. HO Technical Report Series, No. 1012. , Geneva. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO (2018).
- Dacheux, L., et al. More Accurate Insight into the Incidence of Human Rabies in Developing Countries through Validated Laboratory Techniques. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (11), e765 (2010).
- Welburn, S. C., Beange, I., Ducrotoy, M. J., Okello, A. L. The Neglected Zoonoses - The Case for Integrated Control and Advocacy. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. , (2015).
- Dacheux, L., Bourhy, H. Diagnostic tests for human rabies. Revue Scientifique Et Technique (International Office of Epizootics). 37 (2), 581-593 (2018).
- World Organisation for Animal Health. OIE Terrestrial Manual - Rabies (Infection with rabies virus and other Lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. , http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf (2018).
- Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Lumlertdacha, B., Sitprija, V. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 3098-3099 (2000).
- Kang, B., et al. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for rabies virus. Journal of Virological Methods. 145 (1), 30-36 (2007).
- Nishizono, A., et al. A simple and rapid immunochromatographic test kit for rabies diagnosis. Microbiology and Immunology. 52 (4), 243-249 (2008).
- Kasempimolporn, S., Saengseesom, W., Huadsakul, S., Boonchang, S., Sitprija, V. Evaluation of a rapid immunochromatographic test strip for detection of Rabies virus in dog saliva samples. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 23 (6), 1197-1201 (2011).
- Ahmed, K., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based rapid immunochromatographic test for direct detection of rabies virus in the brain of humans and animals. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (4), 736-740 (2012).
- Léchenne, M., et al. Validation of a Rapid Rabies Diagnostic Tool for Field Surveillance in Developing Countries. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), e0005010 (2016).
- Yang, D. K., et al. Comparison of four diagnostic methods for detecting rabies viruses circulating in Korea. Journal of Veterinary Science. 13 (1), 43-48 (2012).
- Markotter, W., et al. Evaluation of a rapid immunodiagnostic test kit for detection of African lyssaviruses from brain material. The Onderstepoort Journal of Veterinary Research. 76 (2), 257-262 (2009).
- Reta, T., et al. Evaluation of Rapid Immunodiagnostic Test for Rabies Diagnosis Using Clinical Brain Samples in Ethiopia. Journal of Veterinary Science & Medical Diagnosis. 2 (3), 1-3 (2013).
- Servat, A., Picard-Meyer, E., Robardet, E., Muzniece, Z., Must, K., Cliquet, F. Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for the detection of rabies from brain material of European mammals. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 40 (1), 61-66 (2012).
- Certoma, A., et al. Assessment of a Rabies Virus Rapid Diagnostic Test for the Detection of Australian Bat Lyssavirus. Tropical Medicine and Infectious Disease. 3 (4), (2018).
- Ahmad, A., Singh, C. K. Comparison of rapid immunodiagnosis assay kit with molecular and immunopathological approaches for diagnosis of rabies in cattle. Veterinary World. 9 (1), 107-112 (2016).
- Sharma, P., Singh, C. K., Narang, D. Comparison of immunochromatographic diagnostic test with Hheminested Reverse transcriptase polymerase chain reaction for detection of rabies virus from brain samples of various species. Veterinary World. 8 (2), 135-138 (2015).
- Voehl, K. M., Saturday, G. A. Evaluation of a rapid immunodiagnostic rabies field surveillance test on samples collected from military operations in Africa, Europe, and the Middle East. U.S. Army Medical Department Journal. , 27-32 (2014).
- Servat, A., Robardet, E., Cliquet, F. An inter-laboratory comparison to evaluate the technical performance of rabies diagnosis lateral flow assays. Journal of Virological Methods. 272, 113702 (2019).
- Eggerbauer, E., et al. Evaluation of Six Commercially Available Rapid Immunochromatographic Tests for the Diagnosis of Rabies in Brain Material. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004776 (2016).
- Barrat, J. Simple technique for the collection and shipment of brain specimens for rabies diagnosis. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , World Health Organization. 425-432 (1996).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Dacheux, L., et al. A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 47 (11), 1410-1417 (2008).
- Application of next generation sequencing to rabies virus and other lyssaviruses. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 49-61 (2019).
- Conventional pan-lyssavirus reverse transcriptase polymerase chain reaction. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 1-16 (2019).
- Rabies real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Laboratory techniques in rabies. Rupprecht, C., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. 2, World Health Organization. 17-34 (2019).
- Talbi, C., et al. Evolutionary history and dynamics of dog rabies virus in western and central Africa. The Journal of General Virology. 90 (Pt 4), 783-791 (2009).
- McElhinney, L. M., Marston, D. A., Brookes, S. M., Fooks, A. R. Effects of carcase decomposition on rabies virus infectivity and detection. Journal of Virological Methods. 207, 110-113 (2014).
- Vigilato, M. A. N., et al. Progress towards eliminating canine rabies: policies and perspectives from Latin America and the Caribbean. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 368 (1623), 20120143 (2013).
