Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الحصول على خلايا السرطان الجذعية من أورام أمراض النساء وسرطان الثدي

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذه المنهجية هو تحديد الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) في خطوط الخلايا السرطانية وعينات الأورام البشرية الأولية مع بروتوكول تشكيل الكرة ، بطريقة قوية ، وذلك باستخدام العينات الوظيفية والتوصيف فينوتيبيك مع قياس التدفق الخلوي والغربية لطخه.

Abstract

الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) هي مجموعة صغيرة من السكان مع التجديد الذاتي واللدونة التي هي المسؤولة عن تكوين الورم، ومقاومة للعلاج والأمراض المتكررة. ويمكن تحديد هذه الكثافة السكانية من خلال علامات السطح والنشاط الأنزيمي والصورة الوظيفية. هذه النهج في حد ذاتها محدودة ، بسبب عدم التجانس فينوتيبيك واللدونة CSC. هنا، نقوم بتحديث بروتوكول تشكيل الكرة للحصول على مجالات CSC من سرطان الثدي وأمراض النساء، وتقييم الخصائص الوظيفية، وعلامات CSC والتعبير البروتين. يتم الحصول على المجالات مع البذر خلية واحدة في كثافة منخفضة في ثقافة التعليق، وذلك باستخدام متوسطة ميثيل سيلولوز شبه الصلبة لتجنب الهجرة والمجاميع. يمكن استخدام هذا البروتوكول المربح في خطوط الخلايا السرطانية ولكن أيضًا في الأورام الأولية. ثقافة تعليق ثلاثيالأبعاد غير ملتصقة يعتقد أن تحاكي البيئة الدقيقة الورم، ولا سيما CSC-المتخصصة، وتستكمل مع عامل نمو البشرة وعامل النمو الليفي الأساسي لضمان إشارات CSC. وبهدف التحديد القوي لـ CSC، نقترح نهجاً تكميلياً يجمع بين التقييم الوظيفي والتقييم المنسب. قدرة تشكيل المجال، والتجديد الذاتي ومنطقة إسقاط الكرة إنشاء خصائص وظيفية CSC. بالإضافة إلى ذلك ، يشمل التوصيف تقييم قياس التدفق الخلوي للعلامات ، ممثلة في CD44+/ CD24- و CD133 ، ولطخة غربية ، مع الأخذ في الاعتبار ALDH. كما تم تحسين البروتوكول المقدم لعينات الورم الأولية ، بعد إجراء هضم العينة ، مفيدًا للأبحاث الانتقالية.

Introduction

مجموعات السرطان غير متجانسة، مع الخلايا التي تقدم مختلف مورفولوجيا، والانتشار والقدرة على الغزو، وذلك بسبب التعبير الجيني التفاضلي. من بين هذه الخلايا ، يوجد عدد أقلية من الخلايا الجذعية السرطانية (CSC)1، التي لديها القدرة على التجديد الذاتي ، وتلخيص عدم تجانس مكانة الورم الأساسي وإنتاج السلف التمييز بشكل شاذ التي لا تستجيب بشكل كاف للضوابط المثلية2. يمكن ترجمة خصائص CSC مباشرة في الممارسة السريرية ، بالنظر إلى الارتباط بالأحداث ، مثل الورم أو مقاومة العلاج الكيميائي3. يمكن أن يؤدي تحديد CSC إلى تطوير العلاجات المستهدفة التي قد تشمل انسداد علامات السطح ، وتعزيز التمايز CSC ، ومنع مكونات مسار إشارة CSC ، وتدمير المتخصصة ، والآليات اللاجينية4.

وقد تم إجراء عزل CSC في خطوط الخلايا وفي عينات من الأورام الأولية5،6،7،8. يتضمن الملف الوظيفي الموصوف لـ CSC القدرة على الكلونية والسكان الجانبيين وتشكيل الورم9. وقد ارتبط CD44عالية/ CD24 النمط الظاهريمنخفضة باستمرار مع لجنة الخدمة المدنية في الثدي, التي أثبتت أن الورم في الجسم الحي وارتبطت بالفعل مع الظهارية للانتقال mesenchymal5,10. وقد ارتبط نشاط ALDH عالية أيضا مع الجذعية والظهارية للانتقال mesenchymal (EMT) في عدة أنواع من الأورام الصلبة11. وقد ارتبط التعبير ALDH مع مقاومة للعلاج الكيميائي وCSC النمط الظاهري في المختبر12،13،14،15،16. وقد تم ربط العديد من العلامات الأخرى إلى خصائص CSC في أنواع مختلفة من الأورام، مثل CD133، CD49f، ITGA6، CD1663،4 وغيرها، كما هو موضح في الجدول 1.

تتكون الأورام من نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة وتوسيع CSC. في هذا النموذج ، تزرع تعليق الخلايا من خطوط الخلايا ومن عينات الدم أو الورم في متوسط مكمل بعوامل النمو ، وهي عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، دون مصل الأبقار الجنينوفي وفي الظروف غير الملتصقة17. تثبيط التصاق الخلية يؤدي إلى الموت عن طريق أنوكيس من الخلايا المتباينة18. وتستمد المجالات من النمو الكلوية لخلية معزولة. لهذا الغرض، يتم توزيع الخلايا في كثافة منخفضة لتجنب انصهار الخلايا وتجميع19. وتشمل استراتيجية أخرى استخدام ميثيل سيلولوز شبه الصلبة20.

اكتسب بروتوكول تشكيل المجال شعبية في عزلة CSC والتوسع ، وذلك بسبب الوقت والتكلفة والتقنية ، ومربحة ، وقابلة للاستنساخ21،22. على الرغم من بعض الاحتياطيات على مدى تشكيل المجال الذي يعكس CSC، هناك ميل من الخلايا الجذعية للنمو في ظروف غير ملتصقة مع النمط الظاهري المميز، الذي يشبه البيئة الدقيقة الأصلية21. لا توجد أي من الطرق المتاحة لعزل CSC من الأورام الصلبة لديها كفاءة كاملة ، مما يسلط الضوء على أهمية تطوير علامات أكثر تحديدًا أو مجموعات من المنهجيات والعلامات.

في هذا البروتوكول، نحن بالتفصيل عزل CSC مع بروتوكول تشكيل المجال، مع مبدأ نمو خلية واحدة في الظروف غير المنضمة والقدرة على إنتاج نمط ظاهري متمايزة. يتم تمثيل تخطيطي لهذا الإجراء في الشكل 1. كما وصف ناصف التوصيف مع علامات السطح والتعبير ALDH لCSC، سواء بالنسبة لخطوط خلايا أورام الثدي وأمراض النساء وعينات من الأورام الأولية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ هذا البروتوكول امتثالا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لمستشفى كويمبرا والمركز الجامعي (CHUC) بنك الأورام، وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات للصحة في CHUC واللجنة الوطنية البرتغالية لحماية البيانات.

1- بروتوكول تشكيل المجال والسكان المنضمين المشتقين من ثقافات الخلايا المستمرة

ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة صارمة.

  1. إعداد قوارير أو لوحات ثقافة التعليق غير الملتصقة بطلاء سطح النمو ببولي (2-هيدروكسيثيل-ميثاكريلات (بولي-هيما)
    1. إعداد حل 15 ملغ / مل عن طريق تحريك بولي هيما في الإيثانول المطلق في 65 درجة مئوية. قارورة أو لوحات زراعة خلايا المعاطف مع 50 ميكرولتر/سم2.
    2. يترك ليجف عند 37 درجة مئوية في فرن التجفيف. إذا لزم الأمر، التفاف لوحات وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد وسائل الإعلام الاستزراع في المجال (SCM)
    1. إعداد محلول 2٪ من ميثيل سيلوز في الماء فائق النقاء وتعقيم في الأوتوكلاف. ميثيل سيلوز يميل إلى أن يكون أسهل لsolubilize عن طريق التبريد; لذلك تفريق مسحوق في الماء في 80 درجة مئوية ويحرك حتى يبرد23.
    2. إعداد حل مركز مرتين من SCM (حل الأسهم). يحتوي محلول عمل SCM على DMEM-F12 ، مكمّل بـ 100 mM putrescine ، 1 ٪ من الأنسولين ، والمنقول ، والسيلينيوم ، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية (10000 U /mL البنسلين ، 10 ملغ / مل ستريبتومسين و 25 ميكروغرام / مل أمفوتريكسين B).
    3. لإعداد SCM، اخلط يُمزج أحجاممتساوية من محلول مخزون SCM مع محلول الميثيلسيلوز بنسبة 2٪.
    4. أكمل الوسط مباشرة قبل الاستخدام بإضافة 10 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (EFG) و10 نانوغرام/مل عامل نمو الليفي الأساسي (bFGF).
    5. إذا كانت خطوط الخلايا أكثر fastidious في الاستخدام, تكملة المتوسطة مع 0.4% الزلال مصل البقر, التي قد تكون ميزة.
  3. ابدأ بقارورة من سرطان الثدي MCF7 أو HCC1806 أو خلايا سرطان بطانة الرحم ECC-1 أو RL95-2 (أو خط الخلايا السرطانية الأخرى المختارة) مع التقاء 80٪ إلى 90٪.
  4. تجاهل وسائط ثقافة الخلية، وغسل مع الفوسفات محلول المالحة المخزنة مؤقتا (PBS) وفصل الخلايا مع التربسين-EDTA (1 إلى 2 مل لقارورة ثقافة الخلية 75 سم2).
  5. إضافة وسائط زراعة الخلايا (2 إلى 4 مل لقارورة زراعة خلايا 75 سم2) والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقيقة لتجاهل الإنزيمات.
  6. تعليق بيليه في حجم معروف من وسائل الإعلام ثقافة الخلية وماصة صعودا وهبوطا لضمان تعليق خلية واحدة. لهذا الغرض، يمكن استخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  7. عد الخلايا في مقياس الهيموكومتر وحساب تركيز الخلية من تعليق الخلية. استفد من هذه الخطوة لضمان مراقبة تعليق خلية واحدة. يعد العد الدقيق للخلايا أمرًا ضروريًا للقياس الكمي الدقيق لآثار العلاجات.
  8. تعليق كمية محددة من تعليق الخلية في وسط كامل SCM ونقل إلى الأطباق المغلفة بولي هيما. كقيمة مرجعية لكثافة البذر، والنظر في 500 إلى 2000 خلية/سم2.
    ملاحظة: الأمثل لكثافة البذر ووقت الثقافة لكل خط الخلية ينصح بشدة24.
  9. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 أيام دون إزعاج لوحات.
  10. إعادة تركيز عوامل النمو بإضافة 10 نانوغرام/مل EFG و 10 نانوغرام/مل bFGF إلى وسائط ثقافة الخلايا. كرر هذه الخطوة كل يومين.
  11. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى 5 أيام بعد الطلاء (وهذا يمكن أن تختلف من 3 إلى 12 يوما وفقا لخط الخلية) للحصول على المجالات، والتي تقدم مورفولوجيا تعليق الكرة على شكل مستعمرات الخلايا.
  12. استخدام أو جمع المجالات، عن طريق الأنابيب، للتجارب.
  13. للحصول على السكان المنضمين المشتقة، ضع المجالات في ظروف الثقافة القياسية، لكل من خط الخلية المستخدم. 1 إلى 2 أيام في وقت لاحق، فمن الممكن لمراقبة طبقة أحادية من الخلايا تنمو حول المجالات المنضمة، والذي يقدم مورفولوجيا مماثلة لخط الخلية من أصل.

2. بروتوكول تشكيل المجال من عينات الورم البشري

ملاحظة: يجب أن يمتثل استخدام العينات البشرية لأغراض البحث لتشريعات كل بلد، وأن توافق عليه لجنة الأخلاقيات التابعة للمؤسسات المعنية.

  1. إعداد وسائل النقل التي تحتوي على DMEM/F12، تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 2٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية (10،000 U/mL البنسلين، 10 ملغ/مل ستريبتومسين و 25 ميكروغرام/مل أمفوريكسين B).
  2. إعداد وسائل الإعلام الهضم التي تحتوي على DMEM/F12، تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ محلول مضاد المضادات الحيوية، 1 ملغ/مل نوع الكولاجين الرابع و 100 ميكروغرام/مل DNAse I.
  3. إعداد وسائط تعطيل الإنزيم التي تحتوي على DMEM/F12، مع استكمال FBS 10٪ و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية (10،000 U/mL البنسلين، 10 ملغ/مل ستريبتومسين و 25 ميكروغرام/مل أمفوريكسين B).
  4. إعداد المجلس الأعلى للقضاة على النحو المبين في القسم 1.2.
  5. الحصول على العينة أثناء الدراسة العيانية للقطعة المنطوقة في أقرب وقت ممكن بعد الاستئصال الجراحي.
  6. وضع العينات في وسائط النقل ونقلها إلى المختبر حيث يتم تجهيزها. يجب أن تبدأ معالجة العينة في غضون ساعة واحدة بعد جمع لتحسين معدل نجاح الإجراء. تطبيق الحذر في جمع العينة. التعامل مع العينات بعناية. تجنب استخدام المناطق النخرية أو الكواية.
  7. تحت غرفة التدفق المعقم، نقل العينة إلى طبق ومقطعة إلى قطع أصغر (حوالي 1 ملم3)مع مشرط.
  8. احتضان الأنسجة البشرية في أنبوب مع وسائل الإعلام الهضم في شاكر الدورية تصل إلى 180 دقيقة، في 37 درجة مئوية. حدد هذا الأنبوب على أنه الأنبوب A.
  9. استبدال محلول الإنزيم كل 15 دقيقة.
    1. جمع وسائل الإعلام الهضم (دون إزالة أي شظايا الأنسجة) ونقلها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون إلى أنبوب جديد نصف مليئة وسائط تعطيل الانزيم. الحفاظ على هذا الأنبوب في درجة حرارة الغرفة والتعرف عليه على أنه أنبوب B.
    2. إضافة وسائل الإعلام الهضم جديدة إلى أنبوب A وإعادته إلى شاكر الدورية في 37 درجة مئوية.
    3. في كل مجموعة، تحقق من صلاحية الخلية باستخدام طريقة الاستبعاد الأزرق trypan.
    4. كرر هذا الإجراء لمدة 180 دقيقة أو حتى عدد الخلايا أقل بكثير.
  10. احتضان شظايا الأنسجة في الأنبوب A في محلول هضم ثان يحتوي على أجزاء متساوية من أككوتاز والتربسين-EDTA، مع التحريك لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  11. إضافة وسائط تعطيل الإنزيم إلى الأنبوب A وتصفية المحتويات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في الأنبوب B.
  12. الطرد المركزي تعليق الخلية في أنبوب B في 200 × ز لمدة 10 دقيقة.
  13. تعليق بيليه في SCM والتحقق من تركيز الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتوم.
  14. تعليق كمية محددة من تعليق الخلية في SCM ونقل إلى بولي هيما المغلفة الأطباق (انظر الخطوة 1.1) مع كثافة البذر من 4000 خلية / سم2.
  15. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2 أيام دون إزعاج لوحات.
  16. إعادة تركيز عوامل النمو بإضافة 10 نانوغرام/مل EFG و 10 نانوغرام/مل bFGF إلى وسائط ثقافة الخلايا.
    ملاحظة: يجب القيام بذلك كل يومين.
  17. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى 5 أيام بعد الطلاء (وهذا يمكن أن تختلف تصل إلى 12 يوما) للحصول على المجالات، والتي تقدم مورفولوجيا تعليق الكرة على شكل مستعمرات الخلايا.

Figure 1
الشكل 1: الحصول على الخلايا الجذعية السرطانية من عينات ورم بطانة الرحم البشرية (A) وخطوط خلايا سرطان الثدي وأمراض النساء (B). عينات الورم البشري مجزأة، هضمها الأنزيمية ومطلي في المجال عبادة المتوسطة في أطباق بولي هيما المغلفة. يتم فصل خطوط الخلايا السرطانية، ويتم حساب تعليق الخلايا، ويتم توزيع الخلايا المفردة بكثافة منخفضة في لوحات مغلفة بولي هيما في ظل الظروف المناسبة. ينتج المجالات ينال, عندما يوضع تحت يتضمّن ثقافة شروط, ينتج مجموعة مشتقّة أتباع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. القدرة على تشكيل المجال، والتجديد الذاتي، ومنطقة إسقاط الكرة

ملاحظة: قدرة تشكيل المجال هي قدرة مجموعة خلايا الورم على إنتاج المجالات. التجديد الذاتي هو قدرة خلايا الكرة على إنتاج مستعمرات جديدة من الخلايا الكروية في التعليق. ومنطقة إسقاط الكرة تمثل المنطقة التي يشغلها المجال، وبالتالي فهي معبرة عن حجمها وعدد الانقسامات الخلوية التي خضعت لها في فترة زمنية معينة.

  1. تحديد القدرة على تشكيل المجال
    1. بعد الانتهاء من بروتوكول تشكيل المجال، وجمع المجالات في أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقيقة.
    2. تجاهل SCM وتعليق بلطف بيليه في حجم معروف من وسائل الإعلام الطازجة. بهدف تركيز المجالات لتسهيل العد ، تعليق المجالات في حجم وسائل الإعلام الصغيرة. يجب الحرص على عدم تعكير صفو المجالات.
    3. استخدم مقياس الهيموكيتوم لعد المجالات التي يزيد قطرها عن 40 ميكرومتر. بدلا من ذلك ، يمكن عد المجالات مباشرة على لوحة باستخدام المجهر مجهزةgraticule 25 أو باستخدام نظام آلي26،27.
    4. حساب النسبة المئوية للمجالات التي تم الحصول عليها مقابل عدد الخلايا المطلية في البداية.
  2. تحديد التجديد الذاتي
    1. بعد الانتهاء من بروتوكول تشكيل المجال، وجمع المجالات في أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقيقة.
    2. تجاهل وسائل الإعلام زراعة الكرة وتعليق بلطف بيليه في التربسين-EDTA.
    3. احتضان ما يصل إلى 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    4. إضافة وسائط تنشيط الإنزيم وماصة صعودا وهبوطا لضمان تعليق خلية واحدة.
    5. باستخدام مقياس الهيموكيتوم وطريقة الاستبعاد الأزرق trypan، عد الخلايا القابلة للحياة في التعليق.
    6. بدء بروتوكول تشكيل المجال كما هو موضح في القسم 1.
    7. بعد 8 أيام، استخدم مقياس الهيموكيتوم لحساب المجالات التي يزيد قطرها عن 40 ميكرومتر.
    8. حساب النسبة المئوية للمجالات التي تم الحصول عليها مقابل عدد الخلايا المطلية في البداية.
  3. تحديد منطقة إسقاط الكرة
    1. لتقييم المساحة التي تشغلها المجالات، احصل على صور لـ 10 حقول عشوائية على الأقل لكل حالة، في مجهر مقلوب مجهز بوحدة اكتساب الصور. يوصى بتكبير من 100 X إلى 400X.
    2. تحليل الصور باستخدام برامج التصوير ، مثل برنامج ImageJ28، عن طريق رسم مجالات الاهتمام المقابلة للمجالات وقياس مساحتها بالبكسل.
    3. حساب منطقة إسقاط الكرة كمتوسط مساحة البيكسلات المقاسة.

4. تقييم علامة الخلايا الجذعية السرطانية مع قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: كان CD44+/CD24-/النمط الظاهري المنخفض مرتبطًا باستمرار بالخلايا الجذعية لسرطان الثدي وأمراض النساء. يمكن استخدام الإجراء الموصوف لتقييم هذا وعلامات سطح الخلية الأخرى.

  1. بعد الانتهاء من بروتوكول تشكيل المجال، وجمع المجالات في أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقيقة.
  2. تجاهل SCM وتعليق بلطف بيليه في التربسين-EDTA.
  3. احتضان ما يصل إلى 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  4. إضافة وسائط تنشيط الإنزيم وماصة صعودا وهبوطا لضمان تعليق خلية واحدة.
  5. الطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقيقة، تجاهل supernatant وتعليق بلطف الخلايا في برنامج تلفزيوني.
  6. السماح للخلايا للراحة في تعليق لمدة 30 دقيقة لضمان استعادة تشكيل الغشاء.
  7. باستخدام مقياس الهيموكيتوم وطريقة الاستبعاد الأزرق trypan، عد الخلايا في التعليق.
  8. ضبط حجم تعليق الخلية إلى 106 خلايا / 500 ميكرولتر.
  9. احتضان الأجسام المضادة أحادية النسيلة وفقا لتعليمات الموردين (التركيز والوقت ودرجة الحرارة والضوء / الظلام) والنظر في مجموعة التجربة الممثلة في الجدول 2 أو العلامات الواردة في الجدول 1.
  10. مباشرة بعد تلطيخ، وإجراء تحليل التدفق الخلوي باستخدام تدفق الخلايا مع وحدات الكشف المناسبة.
  11. توحيد إعداد مقياس الخلايا، بعد البروتوكولات التي أنشأها اتحاد EuroFlow29.
  12. إعداد البوابات الأساسية على أساس الأمام والجانب مبعثر باستثناء الحطام والخلايا الميتة. ويمكن تحسين ذلك عن طريق وضع العلامات المصاحبة مع المرفق الخامس ولغات الخلايا السلبية.
  13. تعيين بوابات الفلورسينس على أساس عينات غير ملطخة والتعويض عن التداخل الطيفي باستخدام ضوابط واحدة ملطخة.

5. تقييم علامة الخلايا الجذعية السرطانية مع لطخة الغربية

ملاحظة: بالإضافة إلى نشاط ALDH1 ، ارتبط التعبير العالي عن هذه العلامة باستمرار مع سرطان الثدي والخلايا الجذعية النسائية13،14. يمكن استخدام الإجراء الموصوف لتقييم هذا وعلامات الخلية الأخرى.

  1. بعد الانتهاء من بروتوكول تشكيل المجال، وجمع المجالات في أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقيقة.
  2. إعداد الخلايا الكاملة
    1. وضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد والتخلص من supernatant دون تعطيل بيليه.
    2. غسل بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد والتخلص منها عن طريق الطرد المركزي.
    3. تعليق بيليه في حجم صغير (200-500 ميكرولتر) من العازلة RIPA العازلة30 (NaCl 150 mM، تريس-HCl 1.50 mM درجة الحموضة 7.4, تريتون-X100 1% vol./vol., حمض ديوكسيكولك الصوديوم 0.5% wt./vol., الصوديوم dodecyl كبريتات 0.5% wt./vol.) تستكمل مع cOm مينيسلي وdithiothreitol 1 m.
    4. الحفاظ على عينات الباردة (على الجليد)، وتقديمها إلى دوامة وسونيكيشن مع السعة 30٪.
    5. الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 14،000 × ز في جهاز طرد مركزي المبردة تعيين إلى 4 درجة مئوية.
    6. نقل supernatants إلى الأنابيب الدقيقة الجديدة التي تم تحديدها بشكل صحيح.
    7. تحديد تركيزات البروتين باستخدام BCA أو برادفورد المقالات31.
    8. إذا لزم الأمر، تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من تحليل لطخة الغربية.
  3. تنفيذ التسخ عينة، electrophoresis، نقل الإلكترون والكشف عن البروتين وفقا لبروتوكولات النشاف الغربية القياسية، كما هو موضح32،33،34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح بروتوكول تشكيل الكرة بالحصول على المستعمرات الكروية في تعليق من عدة خطوط خلايا بطانة الرحم وسرطان الثدي(الشكل 2A)أو بعد الهضم الأنزيمي اللطيف للأنسجة من عينات الورم البشري(الشكل 2E). في كلتا الحالتين ، بعد أيام قليلة من الطلاء ، يتم الحصول على مستعمرات كروية أحادية النسيلة في التعليق. كل من بطانة الرحم ومجالات سرطان الثدي تؤدي إلى أحادية الخلية مع مورفولوجيا مماثلة لخط الخلية من أصل، 1 إلى 2 أيام بعد الطلاء(الشكل 2A).

ويمكن مقارنة النسب وأصول الأنسجة المتميزة من خلال القدرة على تشكيل المجال والتجديد الذاتي ومنطقة الإسقاط. ويمكن ملاحظة النتائج التمثيلية من خطوط خلايا سرطان الثدي في الرسوم البيانية في الشكل 2B-D. الخلايا الهرمونية مستقبلات إيجابية سرطان الثدي MCF7 تظهر قدرة أعلى تشكيل الكرة, الذاتي التجديد ومنطقة الإسقاط من خلايا سرطان الثدي السلبية الثلاثيHCC180614. بالنسبة لكلا الخطين الخلويين، نسبة مئوية صغيرة من الخلايا المطلية (أقل من 3%) كان قادرا على إنتاج مجالات تؤكد على الخلايا الجذعية السرطانية كأقلية ضمن التغايرية الخلايا السرطانية. تم تسجيل براءة اختراع الخلايا الجذعية السرطانية التجديد الذاتي من قبل قيمة مختلفة إلى حد كبير من المجال التجديد الذاتي للخطوط الخلية الممثلة. منطقة إسقاط الكرة، كمقياس تقريبي لبعد المجالات، ترتبط بعدد الدورات المعتمية وتعرض فترات زمنية مختلفة لكلا النسبين.

في حين أن نسبة صغيرة فقط من الخلايا قادرة على تشكيل الأورام في المختبر والاحتفاظ بالقدرة على التجديد الذاتي تحمل خصائص الخلايا الجذعية، ارتبطت عدة علامات مع هذا النمط الظاهري.

يسمح بروتوكول قياس التدفق الخلوي المقدم بنهج تجريبية متعددة الاستخدامات ، مع الأخذ في الاعتبار المستضدات السطحية (انظر الجدول 1). النتائج التمثيلية، الموضحة في الشكل 3A-B،تتعلق بعلامات غشاء CD44/CD24 وCD133 التي تم اقتراحها على أنها مطابقة للنمط الظاهري الأكثر شبهاً بالخلايا الجذعية السرطانية. وسمح تحليل المجالات التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا بطانة الرحم RL95-2 وECC-1 بتحديد أربع مجموعات سكانية(الشكل 3A). المجالات التي تم الحصول عليها من بطانة الرحم RL95-2 تتألف CD44عالية/ CD24- عدد السكان ثلاث مرات أكبر من خط الخلية الأبوية35. في حالة مجالات ECC-1 ، يماثل CD44high/CD24- عدد السكان الرئيسي ، وهو أيضًا إيجابي CD133 ، في حين أن CD44منخفض/ CD24-، CD44منخفض/ CD24+ و CD44-/ CD24+ يكون له تعبير CD133 سلبي أو منخفض.

يمكن أيضًا تقييم علامات السطح وداخل الخلايا بواسطة اللطخة الغربية بعد حصاد الكرة اللطيف وإعداد عينة البروتين بعناية. الشكل 3C يظهر النتائج النموذجية لتغير ALDH، علامة يرتبط نشاطها المتزايد أو التعبير البروتين المعزز مع النمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية13،14 على المجالات والخلايا المشتقة المرتبطة فيما يتعلق بخط الخلية ECC1 بطانة الرحم.

Figure 2
الشكل 2: خلايا سرطان بطانة الرحم وسرطان الثدي، والمجالات والسكان المنضمين المشتقة. (أ) . صور تمثيلية لبطانة الرحم (RL95-2 وECC-1) والثدي (MCF7 و HCC1806) خطوط الخلايا السرطانية، وبطانة الرحم (ES1) والثدي (MS1) وفئات الأتباع المشتقة (G1). تم الحصول على صور تمثيلية لخطوط الخلايا السرطانية RL95-2 و ECC-1 و MCF7 و HCC1806 بتكبير 200x (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). تم الحصول على صور تمثيلية لـ ES1 RL95-2 و ES1 ECC-1 بتكبير 200x (شريط المقياس = 50 ميكرون). تم الحصول على صور تمثيلية من MS1 MCF7 و MS1 HCC1806 في تكبير 200x (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). تم الحصول على صور تمثيلية لـ G1 RL95-2 وG1 ECC-1 بتكبير 200x (شريط المقياس = 50 ميكرون). تم الحصول على صور تمثيلية لـ G1 MCF7 و G1 HCC1806 بتكبير 200x (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (B-D) . قدرة تشكيل المجال، والتجديد الذاتي ومنطقة إسقاط الكرة من مجالات سرطان الثدي MCF7 و HCC1806. (هـ) . صور تمثيلية للمجالات التي تم الحصول عليها من عينات ورم بطانة الرحم البشرية. تم التقاط هذه الصور في تكبير 200x (شريط مقياس = 50 ميكرون). تم تعديل جزء من هذا الرقم من منشور سابق بإذن من الناشر14. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التقييم المشترك لعلامات الخلايا الجذعية السرطانية في خلايا سرطان بطانة الرحم. (أ) . قطع تمثيلية من CD44/CD24 وضع العلامات من خط الخلية RL95-2 وخلايا المجال RL95-2. (ب) . مخططات تمثيلية لوضع علامات CD133 على خلايا الكرة (ES1) التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا RL95-2 و ECC-1. تمثل الكثافة مقياساً لعدد الخلايا. CD44+/ CD24-، CD44منخفضة/ CD24-، CD44منخفضة/ CD24± وCD44--/ CD24+ يتم رسم هازة السكان باللون الأخضر والوردي والأزرق والأصفر ، على التوالي. ج. التعبير ALDH في خط الخلية ECC-1، والمجالات (ES1)، والسكان المشتقة المنتقاة (G1). يمثل المناعي ALDH والتعبير actin للظروف التجريبية المعنية. تم تقييم التعبير ALDH مع الجسم المضاد ALDH1/2، الذي يكشف عن ISOFORMS ALDH1A1، ALDH1A2، ALDH1A3 و ALDH2 من الماوس والجرذ وأصل الإنسان. وقد تم تعديل جزء من هذا الرقم من المنشورات السابقة بإذن من الناشرين13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة علامات الخلايا الجذعية لسرطان النساء وسرطان الثدي.

علامه أصل الخلايا الجذعية مراجع
CD24 سرطان المبيض 60
CD29 سرطان الثدي 61
CD44 سرطان المبيض 62,63
CD44/CD24-/low سرطان الثدي 13،5،3،64
CD44+/CD24-/low/ESA سرطان الثدي 65
CD44/ALDH1+/مرحبا سرطان الثدي 66
CD44/CD24-/low/ABCG2 سرطان الثدي 67
CD44/CD24-/low/ALDH1 سرطان الثدي 43،68،69
CD44/CD24-/low/EpCAM سرطان الثدي 5
CD44/CD24-/low/SSEA-3 سرطان الثدي 70
CD44/CD49f/CD133/2 سرطان الثدي 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi سرطان الثدي 69
CD44/CD117 سرطان المبيض 7
CD44/MyD88 سرطان المبيض 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- سرطان المبيض 74,75
CD44/CD24/Epcam سرطان المبيض 76,77
CD44/CD24- سرطان المبيض 78,79
CD44/CD166 سرطان المبيض 80
CD44/CD24 سرطان عنق الرحم 81
CD49f سرطان الثدي 4
سرطان عنق الرحم 82
CD117 أو c-كيت سرطان بطانة الرحم 83
سرطان المبيض 62,84
CD133 سرطان الثدي 4,85
سرطان المبيض 62,86
سرطان بطانة الرحم 13،87،88،89
سرطان عنق الرحم 82
CD133مرحبا/ CXCR4مرحبا/ ALDH1مرحبا سرطان الثدي 90
CD133/ALDH1 سرطان الثدي 91
سرطان المبيض 60,92
CD133/CXCR4 سرطان بطانة الرحم 93
ABCG2 سرطان الثدي 65
سرطان عنق الرحم 82,81
ALDH-1 سرطان الثدي 4
سرطان بطانة الرحم 94,95
سرطان عنق الرحم 82
CXCR4 أو CD184 سرطان الثدي 96
EpCAM/CD49f سرطان الثدي 97
EpCAMمرحبا/ PROCRمرحبا/ SSEA-3 سرطان الثدي 70
GD2/GD3/GD3Sمرحبا سرطان الثدي 98
ITGA6 سرطان الثدي 4
PROCR سرطان الثدي 43

ملاحظة: يقدم هذا الجدول قائمة بأسطح الخلايا الجذعية التي تعبر عنها مختلف الخلايا الجذعية لأمراض النساء وسرطان الثدي؛ يتم التعبير عن معظم هذه العلامات أيضًا من خلال مجموعة من الأنسجة الأخرى. لا تهدف هذه القائمة إلى تضمين كافة العلامات المبلغ عنها.

الجدول 2: قائمة الأنابيب التي سيتم تضمينها في تجربة قياس التدفق الخلوي النموذجية لتقييم النمط الظاهري CD24/CD44. يعرض الجدول مجموعة دنيا من أنابيب العينة المطلوبة لتجربة تلطيخ مشترك، بما في ذلك الضوابط اللازمة.

انبوب حاله مستضد الفلوروفور
1 خلايا غير ملطخة اي
2 واحد ملطخة CD44 CD44-PE
3 واحد ملطخة CD24 CD24-APC
4 مزدوج ملطخة CD44/CD24 CD44-PE و CD24-APC

ملاحظة: يمكن إجراء هذه التجربة إضافة ملحق V-FICT إلى الأنبوب 4 وإضافة أنبوب التحكم المعني من أجل بوابة الخلايا السلبية المرفقة V واستبعاد الخلايا النهائية في الخلايا المبرمج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول تفاصيل نهج للحصول على الأورام من خطوط الخلايا السرطانية والعينات البشرية الأولية. يتم إثراء الأورام في مجموعة فرعية مع خصائص تشبه الخلايا الجذعية36. يعتمد هذا الإثراء في CSC على الجدوى في بيئة خالية من الرسو في حين تعتمد الخلايا المتباينة على الالتصاق إلى الركيزة37. كما الطلاء الأولي للخلايا السرطانية في بيئة الالتزام المنخفض الذي يفرض تعليق لا يضمن الإثراء في CSC في حد ذاته، ونحن نقدم استراتيجيات لتقييم التجديد الذاتي (قدرة تشكيل المجال والتجديد الذاتي)، والقدرة على التمايز (السكان المنضمة المشتقة)، والنمط الظاهري من CSC (مع تدفق الخلايا و / أو وصمة عار الغربية). يمكن التعرف على الخلايا الجذعية السرطانية من خلال العديد من علامات الفينوتيبيك الموصوفة على نطاق واسع (انظر الجدول 1).

وبما أن الثقافات الأولية للورم البشري غالباً ما تكون صعبة في إنشائها والحفاظ عليها في الثقافة، فإن بروتوكول تشكيل الكرة قد يوفر أداة للتعامل مع هذه العينات. اقترح إجراء الهضم الأنزيمي تعليق خلية واحدة من عينات الأنسجة بطانة الرحم38. ويوفر بروتوكول تشكيل المجال أعداداً كبيرة من الخدمة المدنية، التي يصعب الحصول عليها بوسائل أخرى. قد يكون النموذج ثلاثي الأبعاد أكثر كفاءة في محاكاة الحالة في الجسم الحي ، أي البيئة الدقيقة الفسيولوجية وعدم تغايرية الورم ، من ثقافات الخلايا الأحادية التقليدية.

اليقين حول الأصل أحادي النسيلة من الأورام هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. التقليل من التجميع ، والذي يميل إلى الحدوث في ثقافات التعليق ، وتحسين شامل لكثافات البذر لتوزيع تعليق الخلية الواحدة أمر بالغ الأهمية24. واقترح مؤلفون آخرون طلاء خلية واحدة لكل بئر39،40. لتجنب هذا الإجراء الشاق، تغلبنا على هذه المسألة من خلال ضمان مطلي تعليق خلية واحدة في كثافة منخفضة في وسط ميثيل سيلولوز المخصب. نظرا لحيازة المياه واللزوجة تعزيز خصائص23، يوفر ميثيلسيلولوز وسيلة شبه صلبة تتجنب الهجرة والتجميع ، وضمان monoclonality من المجالات التي تم الحصول عليها21. عدد الأيام في الثقافة هو جانب آخر يعتمد على التحسين ، حيث أن عدد الأيام اللازمة للحصول على المجالات بأقطار أعلى من 40 ميكرومتر يعتمد على كل نوع خلية مضاعفة الوقت24. الوسط المنخفض أو الخالي من المصل هو سمة أخرى للبروتوكول ، حيث أن الوسيط المحتوي على FBS مناسب لنمو الخلايا المتمايز في الظروف الملتصقة41، كما هو الحال في خطوط الخلايا الأبوية وفي الخلايا المشتقة. يعتمد البروتوكول على الحفاظ على تركيز ثابت لعوامل النمو المحددة. EGF الإشارات يلعب دورا هاما في الحفاظ على مسارات متعددة القدرات في حين أن bFGF بمثابة mitogen المساهمة في توليد المجالات42،43.

يوفر بروتوكول تشكيل المجال، المرتبط بالتقنيات المناسبة، الوسائل لتوسيع وعزل وتقييم مجموعات محددة من CSC21. وقد أشار العديد من المؤلفين إلى فائدتها في تقييم التعبير الجيني للخلايا الجذعية44،45،46،47 وstemness في الأورام47،48، لدراسة الانتقال الظهاري - mesenchymal44،49 والورم45،48، لتقييم تأثير العلاجات الجديدة21،50 ومقاومة الدواء44، 51، وإقامة الثقافات من العينات الأولية21،45،46. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أنها تجربة حساسة، تعتمد إلى حد كبير على الظروف الثقافية الملائمة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المجالات الحالية التغايرية الخلوية بسبب CSC التقسيم غير المتماثل52 ولا تمثل نموذجا جيدا لتعقيد تكوين الخلايا الجذعية السرطانية وصيانتها في الحي في مجال46.

وإلى جانب بروتوكول تشكيل الكرة، استخدمت مقالات أخرى للكشف عن CSC. في ورم الجسم الحي يستتبع تلقيح أعداد الخلايا المنخفضة في الفئران المنقوصة للمناعة للحصول على الأورام36،53. ويتوقف ذلك على توافر الظروف المناسبة لإجراء الدراسات الحيوانية، ونظرا للبيئة الدقيقة غير الخاصة بالأنواع، قد يكون انتعاش الخلايا الحية أمرا صعبا. مستعمرة تشكيل وحدة المقاسة، وتقييم قدرة الخلية لتوليد المستعمرات بعد أن يتم مطلي في كثافة منخفضة52،ويوفر أعداد منخفضة الخلية. يعتمد السكان الجانبيون على فرز الخلايا المنشطة للفلوريسينس (FACS) لعزل مجموعة من الخلايا مع القدرة على قذف وصمة عار Hoescht 33342. تعتمد هذه الطريقة الحساسة على تعبير ATP ملزمة كاسيت البروتين (ABC) الناقلين، المسؤولة عن efflux المخدرات54. ومع ذلك ، يرتبط السكان الجانبيين ببعض العيوب ، وهي عدم التحديد لبعض الأنماط الظاهرية لـ CSC وخصائص الصبغة ، وهي سامة وتتأثر إلى حد كبير بالظروف التجريبية (درجة الحرارة ، التركيز)54،55. ALDEFLUOR هو آخر اختبار التدفق القائم على علم الخلايا لتحديد الخلايا مع نشاط ALDH داخل الخلايا. القضية الرئيسية هي عدم وجود استنساخ بين الدراسات التي يبدو أن تتأثر إلى حد كبير من الظروف الثقافية54.

وغالبا ما يقترن بروتوكول تشكيل المجال مع تحليل فينوتيبيك، كما اقترحنا هنا، مع التأكيد على فائدة الأساليب التكميلية لتحديد CSC13،14. أوصينا بتخصيب CSC من خلال بروتوكول تشكيل الكرة ومزيد من التأكيد على الجذع من خلال تقييم العلامات الكيميائية الحيوية عن طريق قياس التدفق الخلوي ولطخة الغربية. حددت دراسات قياس التدفق الخلوي مجموعات غير متجانسة داخل المجالات. في الواقع ، هناك إثراء في CSC في الدراسات المبينة ، ممثلة في هذا البروتوكول من قبل الخلاياالمنخفضة CD44عالية/ CD24. بسبب CSC غير المتماثلة التجديد الذاتي24، تم أيضا تحديد الأنماط الظاهرية الخلية الأخرى. وفي حالة الوثيقة CD133، أظهرت النتائج التمثيلية أن السكان ذوي الرُبُل الأعلى إيجابيون في حالة خط الخلية ECC-1، ولكن سلبي في مجالات RL95-2. وهذا يشير إلى عدم وجود خصوصية لبعض علامات CSC الموصوفة ، والتي ليست فريدة من نوعها لهذه الخلايا ، وقد تختلف مع اللدونة من النمط الظاهري ، وإلى أهمية استخدام مزيج من الاستراتيجيات لتأكيد الجذعية.

اللطخة الغربية هي منهجية بديلة قد تكون مفيدة في بعض الحالات. على سبيل المثال ، في حين أن نشاط ALDH يستخدم على نطاق واسع ، فمن المعروف الآن أن isoforms متعددة تسهم في استقلاب ALDEFLUOR54. وهكذا ، قد تكون أساليب محددة مضادة للأجسام أكثر موثوقية ، وقد أظهرنا بالفعل الارتباط بين التعبير البروتينALDH وstemness13،14.

تمثل القدرة على تشكيل المجال والتجديد الذاتي والسكان المنضمين المشتقة قدرة CSC على تقسيم وإنتاج ذرية متمايزة إلى أجل غير مسمى ، والتي تترجم سريريًا إلى أحداث مثل الانتكاس والتكرار ومقاومة العلاج9. يمكن تفسير مقاومة الأدوية في CSC من خلال التعبير المفرط عن بروتينات الغشاء المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) ، والتعبير ALDH المشاركة في آليات إزالة السموم ، وآليات إصلاح الحمض النووي ، والحماية من أنواع الأكسجين التفاعلية ومقاومة المبرمج56. CSC لديها القدرة على أن تكون هادئة بسبب لدونة لها، وقد برز هذا كآلية لمقاومة المخدرات. ويمكن تجنيب هذه الفئات من العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي بسبب دورة الخلية الخلايا المتباينة المعتقلين57. المجالات هي مجموعة الأورام مع المقاومة المبلغ عنها للعقاقير الخلوية المستخدمة في العلاج التقليدي وكانت أيضا محور امعان مع العلاجات المستهدفة54،58،59. يمكن اختبار حساسية المجالات للخلايا المستخدمة في سرطان الثدي وسرطان بطانة الرحم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون عزل CSC من عينة الورم منصة للتطبيق السريري للعلاج الخاص بكل ورم ، مع التنبؤ بالمقاومة والأمراض المتكررة الناتجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من قبل الجمعية البرتغالية لأمراض النساء من خلال جائزة البحوث لعام 2016 ومن قبل CIMAGO. Cnc. يتم دعم IBILI من خلال مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، البرتغال (UID/NEU/04539/2013)، ويشارك في تمويلها فيدر-سيفيل (POCI-01-0145-FEDER-007440). كان مستشفى كويمبرا والمركز الجامعي (CHUC) بنك الأورام ، الذي وافقت عليه لجنة أخلاقيات الصحة التابعة للجنة واللجنة الوطنية البرتغالية لحماية البيانات ، مصدر عينات بطانة الرحم للمرضى الذين تمت متابعتهم في خدمة أمراض النساء في المؤسسة. تم إنتاج الشكل 1 باستخدام سيرفييه الفن الطبي، المتاحة من www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , University of Coimbra. Master thesis (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics? PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 157، الخلايا الجذعية النيوبلاستيك، أورام الثدي، الأورام، سرطان النساء، بروتوكول تشكيل الكرة، علامات الخلايا الجذعية السرطانية
الحصول على خلايا السرطان الجذعية من أورام أمراض النساء وسرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laranjo, M., Carvalho, M. J.,… More

Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter