Summary
ここでは、オープンヘッド制御皮質衝撃を介したマウス外傷性脳損傷の誘導のためのプロトコルについて説明する。
Abstract
米国疾病管理・傷害予防センターは、米国では毎年約200万人が外傷性脳損傷(TBI)を受けていると推定しています。実際、TBIは傷害関連死亡率の3分の1以上に寄与する要因です。それにもかかわらず、TBIの病態生理学の根底にある細胞および分子機構は十分に理解されていない。従って、ヒト患者におけるTBIに関連する傷害機構を複製することができるTBIの前臨床モデルは、重要な研究ニーズである。TBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルは、露出した皮質に直接影響を与える機械装置を利用する。ヒト患者におけるTBIの異種傷害パターンおよび異種性質を完全に要約できるモデルはないが、CCIは臨床的に適用可能なTBIの広い範囲を誘導することができる。さらに、CCIは簡単に標準化され、研究者は実験全体だけでなく、調査グループ間で結果を比較することができます。以下のプロトコルは、TBIのマウスモデルにおいて市販の影響を与える装置を有する重度のCCIを適用する詳細な説明である。
Introduction
疾病管理・傷害予防センターは、毎年約200万人のアメリカ人が外傷性脳損傷(TBI)を持続すると推定しています1,2.実際、TBIは米国における負傷関連死亡者の30%以上に貢献しており、医療費は年間800億ドルに近く、1人当たり年間約400万ドルが重度のTBI3、4、5を生き延びています。TBIの影響は、慢性外傷性脳症(CTE)と呼ばかれた行動、認知、運動障害の陰湿な発症を伴う生存者によって被った重要な長期的な神経認知および神経精神合併症によって強調される。6,7,8,9,10. 臨床症状をもたらさないサブ臨床脳震盪事象であっても、長期的な神経機能障害を引き起こす可能性がある11,12.
TBIの研究のための動物モデルは、1800年代後半の13以来採用されています.●1980年代にはTBIのモデリングを目的とした空気インパクターが開発されました。この方法は、現在、制御された皮質影響(CCI)14と呼ばれています。CCIの制御と再現性は、げっ歯類15で使用するためのモデルを適応させるために研究者を導いた.私たちの研究室は、市販のインパクターと電子作動装置16、17を介してTBIを誘導するために、このモデルを使用しています。このモデルは使用される生力学的変数に応じて臨床的に適用可能なTBI状態の広い範囲を作り出すことができる。当研究室で引き起こされた重度の損傷後のTBI脳の組織学的評価は、横質皮質および海馬の損失、ならびに反対面上皮および歪みを示す。さらに、CCIは、行動アッセイ18によって測定される運動および認知機能において一貫した障害を生み出す。CCIの制限には、開頭術の必要性とインパクターと作動装置の取得費用が含まれます。
TBIのいくつかの追加モデルが存在し、横液パーカッションモデル、重量降下モデル、および爆発傷害モデル19、20、21を含む文献で十分に確立されています。これらのモデルのそれぞれは、独自の明確な利点を持っていますが、主な欠点は、混合傷害、高死亡率と標準化の欠如、それぞれ22.さらに、これらのモデルのいずれもCCIの正確さ、精密および再現性を提供しない。CCIモデルは、作動装置に入力された生体力学的パラメータを調整することにより、研究者が傷害の大きさ、傷害の深さ、および脳に適用される運動エネルギーを正確に制御することを可能にする。これは、研究者が脳の特定の領域にTBIの全スペクトルを適用する能力を与えます.また、実験から実験まで最大の再現性を可能にします。
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Protocol
すべての手順は、ノースウェスタン大学の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました.C57BL/6マウスはジャクソン研究所から購入し、ノースウェスタン大学比較医学センター(イリノイ州シカゴ)のバリア施設に収容された。すべての動物は、食料と水への無料アクセスで12/12時間の光/暗いサイクルに収容されました。
1. 麻酔を誘発する
- ケタミン(125mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)を経精管内注射でマウスを麻酔する。
2. バイタルサイン監視 15分
- 温度、呼吸数、皮膚の色を監視します。マウスは、タッチに暖かく感じる必要があります。皮膚はピンクに見え、よく浸透しているはずです。呼吸数は毎分50~70呼吸の範囲でなければなりません。
3. 手術前の処置
- 傷害誘発の前日にすべてのマウスの体重を量る。
- 各実験対象のオートクレーブによって手術器具の1セットを殺菌する。使用前に衝撃装置を殺菌してください。
- 「低い」設定に設定された電気加熱パッドの上にきれいなケージを置き、マウスが一度歩行した後に熱から離れることができるように配置することにより、回復ケージを準備します。
- 殺菌された層流フード内の手術室を設置します。
- ステレオタキスティック操作フレームを配置します。
- 影響を受けるデバイスをステレオタキスティック フレームに取り付けます。
- 速度および所望時間のための所望の生体力学的パラメータを持つ作動装置を設定する。
注:このプロトコルでは、2.5 m/sに設定された速度と0.1sの留まり時間を持つ5mm径頭蓋切除術を介して3mm径衝撃先端を利用して重度の脳損傷が記載されています。広範囲の生体力学的パラメータは、TBIの全スペクトルを誘導するために使用されてもよい。
- 新しい個人用保護具と滅菌手袋をしないでください。
- 電気バリカンを使用して手術部位から毛皮を剃ります。
- 角膜損傷や乾燥を防ぐために、マウスの目に保護オプタルの歯を塗布します。
- マウスを手術室に置きます。
- ヨウ素ベースの外科スクラブで皮膚を3回アルコールと交互に準備します。
4. 制御された皮質影響の適用
- 頭皮を頭蓋骨を露出させるメスで中間線に1cmを切開します。
- ミニチュアイヤーバー間の両側側骨を固定し、切開部クランプ内の切開部をロックすることにより、マウスヘッドに安定した3点ホールドを作成することにより、立体操作フレーム内にマウスを配置します。
- 頭蓋切除術中に頭皮がドリルビットに接触しないように、ヘモスタットまたはロック鉗子で手術部位から頭皮を引き離します。
- 露出した頭蓋骨の矢状縫合糸と冠状動脈縫合糸を特定します。
注:このプロトコルは、矢状縫合糸の左2mmの頭蓋切除術と冠状縫合糸への2mmのrostralを中心にします。 - トレフィンドリルビットを使用して頭蓋骨切除術を行います。
- 頭蓋切除術を行うには、まずドリルを最高速度でアクティブにしてから、頭蓋骨切除部位で頭蓋骨に垂直なトレフィンドリルビットを適用します。
- 頭蓋骨との接触が行われたら、ドリルに穏やかな、でも圧力を適用します。ドリルが頭蓋骨を貫通すると、わずかな「与え」が感じられます。基礎となるデュラを貫通しないでください。
注:このプロトコルは、頭蓋切除術を実行するために5 mmトレフィンドリルビットを利用しています。
- 鉗子と小さなゲージの皮下注射針を使用して骨のフラップを取り除き、基礎となるデュラ母体を完全に露出させます。
- インパクター先端を手術場に回転させ、露出したデュラ母校に接触するまで下ろします。接触が行われたら、器械の接触センサーは接触がなされたことを外科医に警告するために聞こえる調子を作る。これにより、変形深度が設定されるゼロ点がマークされます。
注:このプロトコルは、重度の傷害を生成するために3ミリメートルの衝撃先端を利用しています。1 mm の小さなヒントは、より局所的な傷害を適用するために使用できます。 - 衝撃の先端を引き込み、ステレオタキスティック フレーム上のインパクター位置を下げて、必要な衝撃深度を設定します。
注:このプロトコルでは、変形深度を2mmに設定することにより、重大な傷害について説明します。 - 作動装置のインパクターを作動させることによって傷害を適用する。
- 衝撃装置をフィールドから回転させ、ステレオタキスティックフレームから動物を取り外します。
5. 手術部位閉鎖
- 無菌綿先端アプリケーターからの直接圧力で頭蓋骨および傷ついた皮質表面からの出血を制御する。
- 無菌綿の先端アプリケーターで頭蓋骨を乾燥させます。
- 市販の外科用接着剤またはモノフィラメント縫合糸を使用して頭蓋切除術の上に頭皮を閉じます。
注:このプロトコルでは、獣医の外科接着剤が頭皮を閉じるために使用されます。ボーン フラップは交換されず、破棄されます。
6. 術後のケアとモニタリング
- 術後の鎮鎮静症を投与する(例えば、持続放出ブプレノルフィン0.1〜0.5mg/kg投与皮下投与72時間の持続的な鎮鎮創)。
- 動物を横のデキュビタス回復位置に清潔な予暖かいケージに置きます。
- 目を覚ますと移動するまで動物を観察し、その後、そのホームケージに各マウスを返します。
- 食料と水への無料アクセスを確保します。通常の食物および水の摂取量は、通常、傷害後1〜2時間以内に再開する。
- 実験を通して3日ごとに体重を測定します。
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Representative Results
インパクターはステレオタキスティックフレームに直接取り付け、衝撃点、深さ、浸透点を制御するために10 μmの解像度を可能にします。採用された電磁力は1.5-6 m/sの範囲の衝撃速度を与えることができる。これは臨床的に関連するTBIの全範囲の比類のない精密および再現性を可能にする。研究者は、インパクトのある先端のサイズ、衝撃速度、衝撃深さなどの傷害パラメータを変更するパイロット実験を実行して、望ましい程度の傷害を生み出すパラメータを決定できます。このプロトコルは、矢状縫合糸の左5mm頭蓋切除術2mmを行い、冠状縫合糸に2mmのrostralを行うことにより、左頭蓋周領域に重度のTBIを記述する(図1A)。制御された皮質の衝撃は2.5 m/sの3つのmmの衝撃の先端および2つのmmの変形の深さと渡される(図2)。傷害は、硬膜下、閉塞性皮内出血、くも膜下出血(図3)で構成される。この傷害の1ヶ月後の神経認知テストは、ワーキングメモリ、スキル獲得、および運動協調18の持続的な欠陥を示す。当研究室で引き起こされた重度の損傷後のTBI脳の組織学的評価は、横質皮質および海馬の損失、ならびに反対面上皮および歪みを示す。このモデルを用いた重度の損傷を受けた脳のMRI検査は、脳脊髄液による進行性組織喪失および置換を示す(図4)23.最後に、負傷した脳および恥の脳のフローサイトメトリック分析は、傷害17、18の過程を通じて炎症細胞に浸潤する顕著な違いを示す。
図1:制御された皮質衝撃のマウスモデルの装置セットアップ。
(A)作動装置は2.5m/sの速度および0.1 s.(B)の付き合い時間を設定し、3つのmmの衝撃の先端が付いているインパクターは立体フレームに固定される。(C)5mm頭蓋切除術を用いて、耳棒と切開棒を備えた立体作動フレームに固定するマウス。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オープンヘッド制御皮質衝撃による重度のTBI。
(A)接地ケーブルをマウスの後ろの領域にクリップし、接触センサーがアラームを鳴らすまで、衝撃の先端がデュラマターに下げられます。これがゼロポイントです。(B)衝撃先端を引き込み、2mmの深さの傷をステレオタキスティックフレームにダイヤルし、衝撃を加えます。(C) CCIを塗布した後、衝撃先端がフィールド外で回転し、マウスが立体フレームから回収されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:コントロールされた皮質衝撃によって誘発された重度のTBI後のマウス脳の総検査
(A) 12週齢のナイーブマウスからの脳。(B)制御された皮質衝撃を介して重度のTBIを維持した後、12週齢のマウス24時間からの脳。(C)12週齢のマウスからの脳は、制御された皮質影響を介して重度のTBIを維持した後7日間である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:皮質影響を制御した後の重度TBIの経口およびMRI評価
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色された冠状片および代表的な冠状T1加重MR画像。(A)シャム傷害, 頭蓋のみから成る.(B)CCIは、衝撃部位における皮質(Ctx)の大量損失および基礎海馬形成(HF)および視床(TH)の喪失および歪みを伴う重度のTBIをもたらす。(C)1日目のTBIにおけるMRIは、左頭蓋側皮質上の組織外傷および上皮腫を示す。(D-E)傷害後の7日目と14日目の代表的な画像は、脳脊髄液による脱酸組織の進行性置換を表す過減衰の増加領域を示す。フィギュアはマキンデら23.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
信頼性の高い一貫性のある傷害を適用するために重要ないくつかの手順があります。まず、マウスは、頭蓋切除術の実行中に動きを保証しない外科的麻酔の深い平面に達しなければなりません。多くの麻酔薬はげっ歯類の全身麻酔を誘発するために使用されるかもしれませんが、吸入麻酔薬などの呼吸抑制を誘発する麻酔薬は、重度のTBIと組み合わせると呼吸停止を引き起こす可能性があります。このプロトコルは、ケタミン(125 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)を経食内に注入します。薬物のこの組み合わせは、約30-45分の期間の投与の5分以内に麻酔の外科面を生成します。さらに、薬物のこの組み合わせは、呼吸抑制をもたらさない。次の重要なステップは、頭蓋切除術のパフォーマンスです。頭蓋切除術は、最小限の熱と振動がマウスの脳に伝達されることを確実にするために、常に高速で新鮮なトレフィンドリルビットで行われるべきです。熱と振動は、CCIの領域外の隣接する脳組織に損傷を与える可能性があり、被験者と実験の間の損傷の大きさとメカニズムに一貫性がありません。次に、傷害の深さと位置が傷害の適用間で一貫していることを保障するためにCCIの適用の前に、マウスの頭部は立体フレーム内でしっかりと固定されなければならない。ミニチュアイヤーバーと切開クランプは、ステレオタキスティックフレーム内でマウスヘッドを適切に固定する上で不可欠なコンポーネントです。最後に、コンタクトセンサーを備えたデバイスを利用することが重要です。センサーは、衝撃を与える先端と露出したデュラ母子との間の正確な接触点を示します。これにより、研究者は、傷害の深さがステレオタキスティックフレームで設定できる正確なゼロ点に注意することができ、傷害の正確で再現可能な程度を保証します。
切開された頭皮がCCIの時点でフィールドの外にあることを確認するために、多くの場合、クランプや鉗子などのリトラクタを使用して頭蓋骨切除術の部位から頭皮に引っ張る必要があります。傷害が適用されると頭皮がCCIフィールドに戻った場合、傷害の大きさと重症度は信頼できません。さらに、マウスヘッドが立体フレーム内で固定されていることを確認することが不可欠ですが、研究者は固定が呼吸を損なわないことを確認する必要があります。制限された呼吸に二次的な傷害の時の低酸素症は、実験対象者間の傷害の程度、重症度、およびメカニズムを信頼できない傷害の二次的な形態を導入する。
正確に複数の生体力学的パラメータを指定する能力を考えると、CCIはげっ歯類モデル15における外傷性脳損傷を誘導するための最も一貫性のある信頼性の高い方法の1つである。しかし、TBIのどのモデルが科学的な質問22に答えるのに最も適しているかを選択する際に、研究者が注意すべき多くの制限があります。CCIは、脳損傷の誘発前に麻酔と外科的処置(頭蓋切除術)を必要とするという観点から、脳損傷のすべての前臨床モデルと同じ制限に苦しんでいる。麻酔と頭蓋切除術の両方は炎症反応を生成することができ、データ分析24の間に潜在的な結合者と考えられなければならない。さらに、CCIは信頼性が高く一貫した傷害を生じるが、ヒト患者のほとんどのTBIは拡散し、複数の同時機構25を介して生じる。これは、CCIが適用される傷害の重症度に応じて様々な程度の拡散効果を有する焦点損傷を生じるので、ヒトTBI患者への直接翻訳を問題にする可能性がある。最後に、CCIは、いくつかの研究グループにコストが高いと証明することができるいくつかの機械部品の購入とメンテナンスを必要とします。機械部品の適切なメンテナンスがなければ、実験から実験24に適用される実際の生体力学的パラメータに実質的なドリフトが生じる可能性がある。
各実験に適したコントロールを特定することは非常に重要です。シャム傷を負ったマウスは、すべての実験で重要なコントロールです。偽傷害群は麻酔、頭皮切開、立体性フレームへの配置、術後鎮痛を受けるべきである。しかし、恥傷群は頭蓋切除術を受けるべきではない。頭蓋切除術からの振動および熱伝達は、専門家の精密で迅速に行われた場合でも、軽度の外傷性脳損傷をもたらす。この傷害はひどく見ることは困難であるが、それは容易に顕微鏡的に同定される。最後に、研究者は、マウスの年齢として脳内で起こる正常な変化を排除するために、年齢に一致したナイーブマウスのグループを使用することを検討すべきである。
限界にもかかわらず、CCIはげっ歯類のTBIを誘導するための最も一貫性があり、再生可能なモデルのままである。CCIは、TBIを誘導する代替方法と比較して、被験者や実験を横断して標準化することが容易であり、研究者は、正確に定義された脳の解剖学的領域にTBIのスペクトル全体を適用することができます。上記のプロトコルは、マウスの左頭蓋側皮質に対する重度のTBIの適用について説明する。このモデルは高速でトレフィンドリルビットと行われる5つのmmの頭蓋切除術を利用する。3 mm の衝撃先端は、2.5 m/s の速度で 2 mm の損傷深さと 0.1 s のドパータイムで使用されます。適切に適用し、実験対象が適切に回収されると、100%に近い長期生存率が得られ、マウスTBIの短期、中間、長期の研究が行われる。
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Disclosures
著者は金銭的な利益相反を持っていない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生助成協会GM117341と外科医C.ジェームズ・カリコ研究フェローシップS.J.S.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Injection Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 5939911020 | |
| Buprenorphine SR Lab 0.5mg/mL | Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA | BSRLAB0.5-182012 | |
| High Speed Rotary Micromotor KiT0 | Foredom Electric Company | K.1070 | |
| Imapact one for Stereotaxix CCI | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39463920 | |
| Ketathesia Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein, Inc | 56344 | |
| Mouse Specific Stereotaxic Base | Leica Biosystems Nussloch GmbH | 39462980 | |
| Trephines for Micro Drill | Fine Science Tools, Inc | 18004-50 |
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