Summary
Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.
Abstract
A projeção Visual preliminar dos girinos da rã aquática Xenopus laevis sere como um sistema modelo excelente para estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento da conectividade neuronal. Durante o estabelecimento da projeção retino-tectal, os axônios óticos estendem do olho e navegam através das regiões distintas do cérebro para alcangar seu tecido do alvo, o Tectum ótico. Uma vez que os axônios óticos entram no Tectum, elaboram os mandris terminais que funcionam para aumentar o número de conexões sináptica que podem fazer com os interneurônios do alvo no Tectum. Aqui, nós descrevemos um método para expressar o ADN que codifica a proteína fluorescente verde (GFP), e o ganho-e construções do gene da perda--função, em neurônios óticos (pilhas retinal do gânglio) em embriões de Xenopus . Nós explicamos como microinjeção um reagente combinado do ADN/lipofection nos ocular de uns embriões velhos do dia tais que os genes exógenos são expressos no único ou em números pequenos de neurônios óticos. Marcando genes com GFP ou coinjetando com um plasmídeo de GFP, os mandris axonal terminais de neurônios óticos individuais com sinalização molecular alterada podem ser imaged diretamente nos cérebros de girinos intactos, vivos de Xenopus diversos dias mais tarde, e sua morfologia pode ser quantificada. Este protocolo permite a determinação de mecanismos moleculares Cell-Autonomous que fundamentam o desenvolvimento do arborização ótico do AXON in vivo.
Introduction
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, axônios de neurônios pré-sinápticos navegar através de diversas regiões do cérebro para alcançar suas áreas-alvo. Quando os axônios invadem seus tecidos-alvo, eles estabelecem conexões sinápticas com neurônios-alvo pós-sinápticos. Em muitos tipos de neurônios, os axônios aumentam o número e a extensão espacial das conexões sinápticas que eles podem fazer elaborando redes de ramos terminais ou mandris1. A projeção retino-tectal de girinos da rã aquática Xenopus laevis é um poderoso modelo de vertebrados para o exame de mecanismos subjacentes à arborização do AXON terminal e à conectividade sináptica2,3,4 . O GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada pode ser observado diretamente em girinos intactos, vivos de Xenopus 5,6,7,8. Para expressar a GFP isoladamente ou em conjunto com versões completas ou truncadas de genes em pequeno número de neurônios ópticos, utilizamos uma técnica envolvendo microinjeção/lipofection de DNA em oculares de embriões de um dia de idade Xenopus 9, a técnica 10. this foi desenvolvida originalmente para estudar mecanismos do pathfinding ótico do AXON em Tadpoles novos de Xenopus , e tem sido aplicada desde que nós e outro para determinar os mecanismos moleculars pilha-autônomos que subjacentes o AXON ótico arborização em Xenopus girinos5,6,7,8,9,10.
Técnicas alternativas para expressar genes exógenos em um pequeno número de neurônios ópticos foram desenvolvidas em outras espécies-modelo, bem como em X. laevis. No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta desafios e limitações quando comparada à microinjeção de DNA/reagente de lipofection em olhos de embriões Xenopus . Em camundongos, a transgênese pode ser usada para expressar genes em um pequeno número de neurônios ópticos, mas a geração de camundongos transgênicos é dispendiosa e os camundongos transgênicos e demorados frequentemente apresentam efeitos colaterais indesejáveis11. O zebrafish transgenic que expressa genes exógenos em neurônios óticos pode igualmente ser criado injetando plasmídeos em embriões adiantados12da fase da segmentação. No entanto, este processo requer a clonagem de um promotor específico para expressar genes em um padrão de mosaico em neurônios ópticos em larvas de zebrafish12. A frequência de expressão de DNA exógeno em neurônios ópticos em zebrafish transgênico também é um pouco menor (< 30%) comparado aos girinos Xenopus que foram microinjetados com reagente de DNA/Liposomal (30 − 60%)12. No ovo o electroporation tem sido usado igualmente para expressar genes no pequeno número de neurônios óticos nos pintainhos13. Entretanto, este procedimento não caracterizou inteiramente os mecanismos que estabelecem projeções óticas porque o arborização ótico do AXON não pode ser imaged em embriões intactos, vivos do pintainho. Finalmente, vários laboratórios usaram eletroporação para transfecção genes em pequeno número de neurônios ópticos em Xenopus girinos14,15. Ainda, o electroporation exige a optimização dos equipamentos e dos protocolos (stimulator, elétrodos, padrões espaciais e temporais de pulsos da onda) Além daquele usado para o microinjection do reagente do ADN/lipofection em ocular de embriões de Xenopus .
Nós e outros usamos previamente a técnica da microinjeção/lipofection do ADN em eyebuds de embriões do Xenopus para determinar os mecanismos autônomos da sinalização da pilha que estabelecem o arborização ótico5,6 do AXON 7 anos de , 8. inicialmenteutilizamos esta abordagem para dissecar as funções da proteína do adaptador de caderina e WNT β-catenina na arborização axonal óptica em Xenopus girinos5,6. Em um estudo, nós mostramos que a ligação β-catenina à α-catenina e ao PDZ é necessária, respectivamente, para iniciar e moldar os mandris axonais ópticos in vivo5. Em um segundo relato, demonstramos que os domínios de ligação β-catenina para α-catenina e GSK-3β modulam de forma oposta os padrões de projeção dos mandris axonais ópticos ventrais6. Mais recentemente, identificamos papéis para o fator WNT, polipose adenomatosa coli (APC), na regulação das características morfológicas de mandris axonais ópticos em Xenopus girinos7. Ao coexpressar o N-terminal e os domínios centrais da APC que modulam a estabilidade da β-catenina e a organização dos microtúnios em conjunto com a GFP em neurônios ópticos individuais, determinamos papéis compartilhados e distintos para esses domínios de interação APC no número de filiais, comprimento e ângulo em mandris axonais ópticos in vivo7. Outro laboratório utilizou a técnica de microinjeção/lipofecção para determinar papéis autônomos de células para sinalização pelo receptor BDNF, TrkB, em mandris axonais ópticos em Xenopus girinos8. Este grupo mostrou que a expressão de um TrkB dominante-negativo perturbou a ramificação e a maturação sináptica em mandris óticos individuais do AXON in vivo8. Globalmente, a técnica de lipofecção no Xenopus já iluminou os papéis específicos de diferentes genes na ramificação do axão óptico no ambiente nativo.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade touro Califórnia (protocolo n º TUCA003TE01X).
1. obtenção de embriões X. laevis
- Obtenha embriões de X. laevis pelo acoplamento natural dos pares de râs adultas masculinas e fêmeas aprontado com a gonadotropina coriónica humana (HCG), pela fertilização in vitro dos ovos derramados das râs adultas fêmeas APRONTADO com HCG, ou requisitando diretamente (tabela de Materiais).
-
Embriões de degeleia obtidos com solução de cisteína a 2% à temperatura ambiente (tabela de materiais)16.
- Colete 50 − 100 embriões em um grande prato de Petri. Retire a solução em que os embriões se encontram decantando ou usando uma pipeta de transferência plástica. Adicionar 25 mL de solução de cisteína a 2% (0,5 g de cisteína em 25 mL ddH2o, pH a 8,0) para o prato que contém os embriões.
- Agitar suavemente a placa de Petri contendo os embriões na solução de cisteína até que os casacos de geléia dos embriões caem e os embriões coletam em um moita no centro do prato (5 − 10 min). Neste ponto, lentamente e delicadamente despeje a solução de cisteína em um copo de resíduos. Tome cuidado para não derramar muitos dos embriões na taça de resíduos, juntamente com a solução de cisteína.
- Enxágüe os embriões na placa de Petri 6x com 10% de solução modificada de Mark ' s Ringer (MMR) ou outra solução adequada (por exemplo, solução de Barth modificada, MBS), rodando o prato cada vez que a solução é substituída.
- Cultura os embriões em 10% MMR até que alcancem estágios desenvolventes 22 − 2417. Os embriões de Xenopus podem ser incubados em temperaturas entre 15 − 25 ° c. A taxa de desenvolvimento dos embriões depende da temperatura que são incubadas em17.
Nota: Os embriões de Xenopus requisitados de um catálogo chegam geralmente no laboratório em estágios desenvolventes 20 − 24, assim que podem ser dejellied e injetado imediatamente.
2. preparando Plasmíos de DNA e fazendo uma mistura de DNA/DOTAP
- Construções de expressão de DNA subclone emvetores de expressãode Xenopus pCS2 + ou pCS2 + MT ou seus derivados (originalmente construídos por D. Turner e R. Rupp)5,6,7. os vetores de pCS2 + contêm um promotor modificado do citomegalovírus (CMV) que facilite a expressão de gene nas râs.
- Amplificar pCS2 plasmís contendo GFP e/ou genes de interesse com kits protocolo (tabela de materiais) seguindo o procedimento padrão. Na etapa de eluição final do protocolo protocolo, realize uma eluição sequencial do DNA em DDH2o para produzir uma concentração final de > 1 μg/μl.
- Armazene todos os plasmídios pCS2 a-80 ° c até estarem prontos para realizar um experimento de microinjeção/lipofecção, ou seja, quando os embriões estão em estágios de desenvolvimento 22 − 24.
- Thaw DNA plasmís para ser lipofected em temperatura ambiente. Imediatamente antes da lipofection, centrifugue brevemente plasmíos de DNA. Isso impedirá que o precipitado se formate na mistura DNA/DOTAP que pode entupir a ponta da pipeta microcapilar.
- Combine plasmíos de DNA com o reagente de transfecção lipossomal DOTAP (tabela de materiais) em uma proporção de 1:3 (w/v)9,10. Por exemplo, transfira 2 μg de DNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 6 μL de DOTAP, ou transfira 3 μg de DNA em um tubo de microcentrífuga e adicione 9 μL de DOTAP.
- Uma vez que o DNA e DOTAP são combinados, mexa suavemente o tubo de microcentrífuga para misturar a solução. A solução de DNA/DOTAP deve ficar ligeiramente opaca após a mistura.
- Se dois plasmídeo estão a ser lipofected em conjunto (por exemplo, pCS2-GFP com um segundo plasmídeo pCS2 contendo uma versão truncada ou de comprimento total de um gene) em neurônios óticos, primeiro Combine os dois plasmídos (após brevemente centrifugação ambos) em uma proporção de 1:1 e, em seguida, adicionar DOTAP em uma relação 1:3 (w/v). Por exemplo, combine 1 μg de pCS2-GFP com 1 μg de um segundo plasmídeo pCS2 e, em seguida, adicione 6 μL de DOTAP.
Nota: Estudos mostraram que a lipofecção de dois plasmídios em oculares de embriões Xenopus nesses estágios de desenvolvimento resultará em sua coexpressão em neurônios ópticos individuais9,10.
3. carregando uma agulha de microinjeção com DNA/DOTAP
- Aperte suavemente a ponta de uma pipeta microcapilar de vidro puxado com fórceps fino (tabela de materiais).
- Backfill a pipeta microcapilar de vidro com óleo mineral usando um microfil tal que uma gota minúscula do óleo mineral apareça na ponta cortada da micropipeta. Encha a pipeta microcapilar no meio do óleo mineral.
- Carregue a pipeta microcapilar de vidro puxada que é enchida agora com o óleo mineral em um suporte apropriado da injeção conectado a um injector. Se utilizar um injector (tabela de materiais), ejecte o êmbolo a meio caminho antes de carregar a pipeta microcapilar sobre ela. Uma vez que a pipeta microcapilar é fixada firmemente ao injector, estenda o atuador na extensão cheia para confirmar que a pipeta microcapilar é unida fortemente ao injector e não se move com a extensão do atuador.
- Transfira uma gota de 3 μL da mistura DNA/DOTAP para uma folha quadrada de corte (1 polegada quadrada) de papel de parafina.
- um microscópio de dissecação estereofónico, mova a ponta da pipeta microcapilar de vidro na gota de DNA/DOTAP.
- Lentamente, sugar a gota de DNA/DOTAP na pipeta microcapilar de vidro usando a opção de preenchimento no aparelho de injeção. À medida que o líquido é carregado na pipeta microcapilar, a gota vai ficar menor. Devido à ligeira opacidade da solução DNA/DOTAP, o limite entre o óleo mineral e a solução DNA/DOTAP deve ser visível na pipeta microcapilar de vidro (Figura 1). Se necessário, pare de encher a pipeta microcapilar periodicamente para permitir que a pressão na pipeta microcapilar de vidro Recalibrate.
Figura 1: imagens de pipeta microcapilar. As imagens mostram uma pipeta microcapilar no aparelho de injeção, antes (a), e após (B) enchimento com DNA/DOTAP. Abra as setas, ponta do êmbolo na pipeta microcapilar (a, B). Seta fechada, linha entre o óleo mineral e o DNA/DOTAP na pipeta microcapilar preenchida (B). Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. microinjetando DNA/DOTAP em Eyebuds de 1 dia velho Xenopus embriões
- Devitellinize manualmente dez embriões de Xenopus do estágio 20 − 24 com o fórceps fino em um prato de Petri de 10 milímetros enchido com o 0.1 x MMR. Segure o envelope vitelina na cintura para evitar ferir os embriões. Com fórceps em ambas as mãos esquerda e direita do experimentador, estale a bolha do envelope do vitelina e libere o embrião do envelope do vitelina. Tome cuidado para não ferir os embriões ao remover o envelope vitelina.
Nota: Começando no estágio 20, os embriões de Xenopus desenvolvem um recuo ou "cintura" entre as metades anterior e posterior do embrião. Esta cintura permite uma lacuna para formar entre o envelope vitelina e o embrião nesta posição. - Use uma pipeta de transferência plástica com uma ponta do corte para transferir 5 − 10 embriões devitellinized do estágio 22 − 24 a um prato de Petri de 10 milímetros enchido com o 1x MMR.
Nota: A solução de sal mais elevada em 1x MMR facilita a cura de feridas da punctura que resultarão da microinjeção. - o estereomicroscópio, segure um dos embriões devitellinized no prato de Petri com fórceps em cada mão, e arranje o embrião de modo que seu pólo anterior esteja apontado acima no campo de visão. Oriente o embrião para que ele está deitado lateralmente e um dos seus olhos (esquerda ou direita) está virado para cima.
- o estereomicroscópio, segure o embrião com a pinça na mão não dominante do experimentador e, com a mão dominante do experimentador, introduza a ponta da micropipeta de vidro no olho (do lado ventral ou dorsal, dependendo da metade do o embrião que está sendo injetado atualmente), logo abaixo da epiderme (Figura 2). Injete entre 70 − 210 nL da solução DNA/DOTAP. Isso pode ser feito em vários pulsos, dependendo do tamanho do pulso que o injector está definido para (geralmente 70 nL).
Nota: O profundidade da injeção é muito importante para o lipofecção em neurônios óticos. Se a posição da ponta do microcapilar é inserida corretamente muito superficialmente no olho, em seguida, após a microinjecção, a epiderme cinzenta sobrejacente o olho vai inchar. Se a posição for muito profunda, o olho cinzento não mostrará quaisquer alterações, e a frequência de expressão de DNA em neurônios ópticos será menor. - Gire o embrião ao redor e execute a mesma microinjeção no ocular no lado contralateral do embrião.
- Injete ambos os olhos de 6 − 10 (ou mais) embriões em cada experimento.
- Após a microinjeção, armazene os embriões em uma placa de Petri com 1x MMR por aproximadamente 30 minutos para facilitar a cicatrização de feridas.
- Após 30 min, transfira embriões injetados em uma solução de 0,1 x MMR com 0, 1% de agente clareador (Feniltiocarbamida) para reduzir a pigmentação. Cultura os embriões cobertos por aproximadamente cinco dias, até que os embriões se desenvolveram em girinos em estágios 46 − 4716.
Figura 2: demarcação da região ocular para microinjeção. Esquema (A) e fotomicrografia (B) do embrião de X. laevis em estágios de desenvolvimento 22/23 mostram a região do EyeBud que deve ser alvejada para o microinjection (Destaques vermelhos). Barra de escala = 1 mm. o painel A foi modificado de Zahn et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. imagem latente de GFP que expressa mandris axonal óticos em Tadpoles intactos, vivendo
Nota: Quando os girinos que foram lipofected com ADN alcangam estágios desenvolventes 46 − 47, estão prontos para a imagem latente.
- Antes da imagem, os girinos devem ser anestesiados. Para anestesiar os girinos, transfira os girinos lipofected em uma solução de tricaína a 0, 2% em ddH2O em uma placa de Petri de 10 mm. Aguarde 5 − 10 min até que os girinos se tornem imóveis. Verifique se os girinos ainda estão vivos observando seus corações batendo um microscópio de dissecação estéreo.
- Coloc um girino anestesiado em uma câmara feito-à-medida do silicone em uma corrediça e em um selo de vidro com um COVERSLIP. O girino deve inclinar ligeiramente de modo que um lado (esquerdo ou direito) de sua cabeça seja inclinado para cima e apenas toque mal o deslizamento de tampa.
- Tela a metade do midbrain tectal dorsal do girino que é inclinado para cima na baixa ampliação para GFP que expressa mandris axonal óticos.
Nota: Um microscópio ereto do Widefield equipado com uma iluminação do epilfuorescence e uma lente objetiva apocromático (tabela dos materiais) pode ser usado para telar para Arbors fluorescentes. - Se o hemisfério tectal contiver entre um a três GFP expressando mandris axonal óticos, Capture uma z-série das imagens destes mandris usando um objetivo de longa distância de trabalho do ar do contraste 40x elevado (tabela dos materiais). Para cada mandril axonal, Capture 10 − 20 fatias da z-série em intervalos de 1,5 μm.
- A fim Ver os mandris do AXON no outro lado do midbrain tectal, recarregue o girino na câmara do silicone de modo que inclina ao outro lado e sele com um deslizamento de tampa. Em seguida, repita os passos 5,3 e 5,4.
6. reconstrução e quantificação da morfologia do mandril axonal óptico
- Selecione uma pilha de imagens que contenha entre um a três GFP que expressa os mandris axonal óticos.
- Use a ferramenta de desenho à mão livre no software de edição gráfica (tabela de materiais) para rastrear a porção de cada mandril axonal óptico visível em cada z-Slice. Traçar através das partes de cada mandril evidente em cada z-fatia criará uma projeção 2D exata do mandril. As cores diferentes podem ser usadas para traçar GFP distinto que expressa Arbors axonal óticos.
- Faça todas as medições morfométricas em reconstruções 2D dos mandris axonais, com referência à série z original de imagens quando necessário7. Usando o software Image J (tabela de materiais), medir parâmetros morfológicos como o número de ramificações (ou seja, número de pontas de ramificação ou pontos de ramificação), comprimento total do ramo de mandril, comprimento por ramo, comprimento e largura do mandril, forma geral do mandril (L/W relação, circularidade) e ângulo das ramificações7.
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Representative Results
O protocolo descrito neste artigo rende uma taxa do sucesso de 30 − 60% de embriões injetados de Xenopus que expressam GFP (sozinho ou junto com uns construtores adicionais do ADN) em um a dez mandris axonal óticos. Na Figura 3, mostramos imagens confocais representativas de GFP expressando controle e mandris axonais ópticos mutantes em girinos Xenopus intactos do nosso estudo publicado recentemente7. Para este estudo, nós clonamos dois mutantes de domínio do APC (apcnterm e apcβ-Cat) em plasmídeo pCS2, e coinjetados estes plasmídeos, juntamente com um plasmídeo de rotulagem de pCS2-GFP em olhos de um dia de embriões Xenopus velhos. A Figura 4 mostra os resultados de várias medições quantitativas que fizemos nas reconstruções do controle e dos mandris axonais mutantes da APC, incluindo o número de ramos, comprimento total do ramo do mandril e comprimento médio das ramificações.
Figura 3: imagens representativas da GFP expressando controle e mandris axonal óptico mutante. (A) esquemático de mutantes do N-terminal APC e mutantes de domínio central que foram clonados em Plasmís pCS2. B) imagens confocais representativas de mandris axonais ópticos mutantes GFP e GFP-APC em tecta de girinos Xenopus vivos intactos. (C) reconstruções de imagens da série z do controle GFP e dos mandris axonais ópticos mutantes da APC. Barras de escala = 30 μm (B), 40 μm (C). Este número foi modificado de Jin et al.7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificação de morfologias de reconstruções de controle e de mandris axonais mutantes. Parcelas do número de filiais (A), comprimento total do ramo do mandril (B) e comprimento médio da ramificação (C) confirmam diferenças observadas entre o controle e o mutante APC expressando mandris axonais. Os dados nos painéis A − C são mostrados como A porcentagem da média do controle com SEM. * acima da barra ou da linha de dados indica p < 0, 5. Parcelas de dispersão adicionais de número de ramificações versus comprimento médio de ramificação com linhas de regressão mostram correlação inversa entre esses parâmetros em mandris axonais ópticos expressando domínios APC (D, E). Números da amostra: (A) GFP-12, APCNTERM – 18 APCβ-Cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25. Este número foi modificado de Jin et al.7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, Nós demonstramos como expressar construções exógenas do ADN no único ou em números pequenos de neurônios óticos e como a imagem GFP individual que expressa mandris axonal óticos com sinalização molecular normal e alterada em girinos intactos, vivos da râ X . a laevis. Também explicamos como reconstruir e quantificar a morfologia da GFP expressando mandris axonais ópticos a partir de imagens capturadas in vivo. Para expressar os plasmídios exógenos do ADN no número pequeno de neurônios óticos, nós microinjeção uma mistura do reagente do ADN/lipofection no primórdios do EyeBud de uns embriões velhos do Xenopus de um dia, usando uma técnica desenvolvida primeiramente no laboratório de Christine Holt para estudar ótico AXON pathfinding em jovens girinos9,10,19,20,21. Nós e outros também aplicamos esta microinjeçãode DNA/técnica de lipofection para estudar mecanismos moleculares que regulam a arborização de AXON óptico em maisvelhos, vivendo X. laevis girinos5,6, 7 anos de , o procedimento 8. this barato, simples para o transgênese específico transiente, da pilha permite a determinação da função Cell-Autonomous do gene em desenvolver mandris axonal óticos em um sistema de modelo vivo do vertebrado.
Há vários fatores importantes a serem considerados para as melhores práticas quando a microinjecção de DNA/DOTAP em olhos de embriões Xenopus . Primeiro, como observado em outros relatos, a concentração de DNA deve ser superior a 1 μg/μl9,10. As concentrações do ADN entre 1 − 3 μg/μL são as melhores, mas as concentrações do ADN tão baixas quanto 0,7 μg/μL podem igualmente ser usadas. Em segundo, o ADN microinjectar no estágio 22 − 24 embriões de Xenopus é ideal para experiências em que o objetivo é examinar os mecanismos que regulam a arborização axonal ótica. Em embriões nessas fases de desenvolvimento, os olhos são morfologicamente diferenciados e podem ser mais facilmente direcionados para a injeção14. A maioria de neurônios óticos no primórdios do EyeBud de embriões do estágio 22 − 24 são igualmente borne-mitotic, que conduz a um número menor de neurônios óticos que expressam GFP, que permite por sua vez para a melhor definição quando os mandris axonal óticos individuais da imagem latente do GFP nos girinos. Finalmente, estudos prévios mostraram que os genes exógenos são expressos ~ 8 h após a lipofecção9. Conseqüentemente, expressar construções do gene nos ocular de embriões do estágio 22 − 24 significa que os genes perturbarão nem a seleção do Fate da pilha de neurônios óticos nem o conseqüência inicial de seus axônios. Um terceiro fator que garantirá o sucesso quando o DNA microinjectado nos eyebuds do embrião de Xenopus é que o ADN deve ser injetado em uma região relativamente superficial do EyeBud9,10. Injetar em tecidos mais profundos em ou ao redor do olho irá resultar em uma menor percentagem de embriões que contêm neurônios ópticos que expressam o DNA exógeno10.
Há igualmente diversas edições a estar cientes de quando imagem latente e reconstrução GFP que expressam mandris axonal óticos em girinos intactos, vivendo de Xenopus . Primeiramente, os investigadores devem somente capturar imagens dos hemisférios tectal que contêm entre um a três GFP que expressam mandris axonal óticos. Se uma única imagem contiver mais de três GFP expressando mandris axonal óticos, os mandris são prováveis ter as filiais de sobreposição, que farão difícil definir os mandris individuais durante o processo da reconstrução. Outra questão a ser consciente é que a reconstrução e quantificação da morfologia do mandril axonal óptico são as etapas mais demoradas neste protocolo. Nós estimamos que reconstruindo e quantificando a morfologia axonal do mandril da ótica exija aproximadamente 80 − 90% do tempo total do experimento. Embora as técnicas sejam desenvolvidas para automatizar a reconstrução de mandris dendríticos do neurônio tectal, estes métodos computacionais não foram aplicados ainda aos mandris axonal óticos também22. Embora trabalhoso, o processo de reconstrução da morfologia do mandril óptico aumenta drasticamente a compreensão dos pesquisadores sobre os detalhes da morfologia do mandril axonal óptico. Este detalhe adicionado, por sua vez, melhora significativamente a qualidade das imagens de GFP expressando mandris estes investigadores podem capturar em experiências futuras.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao touro University California College da Medicina Osteopática por apoiar a nossa pesquisa. Reconhecemos os alunos anteriores no laboratório (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ajudaram a implementar esta técnica de microinjeção em nosso laboratório. Estamos gratos ao Dr. Christine Holt, em cujo laboratório esta microinjeção de DNA/técnica de lipofection em embriões Xenopus foi desenvolvida pela primeira vez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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