Summary
Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.
Abstract
Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.
Introduction
Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и более конкретные ткани, такие как нейроэктодерм и сомиты, могут быть привиты между эмбрионами для производства химерных животных1,2,4,6. На протяжении почти столетия, исследования таких химерных животных предоставили решающее понимание регенерации, дифференциации тканей, контроля размера, и узор1,7,8.
В последнее десятилетие, многочисленные транскрипционные исследования регенерирующих тканей дали понимание генетических программ, лежащих в основе регенерации саламандры9,10,11,12,13. Эти исследования добавили к расширяющемуся списку генов-кандидатов, которые на сегодняшний день в значительной степени не характерны в контексте регенерации. Целевые методы мутагенеза, такие как CRISPR/ Cas, теперь позволяют исследуют такие гены, и такие генетические подходы в значительной степени облегчаются недавним секвенированием и сборкой большого аксолотла генома14,15,16.
Мы стремились разработать методы, которые соединяли классическую биологию развития с новой генетической технологией с целью вскрытия механизмов регенерации. Методы генерации гаплоидных эмбрионов аксолотлов и других саламандр были созданы на протяжениидесятилетий 17. Хотя эти методы уже давно отмечается, что преимущества саламандры, как генетическая модель организмов18, несколько последующих генетических исследований включили гаплоидных животных. Мы используем интроактивации в аксолотле для производства гаплоидных эмбрионов, которые служат донорами тканей для прививки19. Используя эмбрионы, несущие флуоресцентные генетические маркеры, мы разработали надежные методы генерации конечностей, полученных почти полностью из донорских тканей(рисунок 1А). Объединив эти два метода, мы обошли поздней эмбриональной летальности, связанной с гаплоидией, что позволяет для производства полностью развитых, привитых гаплоидных конечностей(Рисунок 1B, Рисунок 1B', и Рисунок 2).
Проводя CRISPR/Cas-опосредованный мутагенез в гаплоидных эмбрионах до прививки для создания химерных аксолотлов с мутантными гаплоидными конечностями, мы можем исследовать функцию генов конкретно в контексте развития конечностей и регенерации. Это позволяет спасать конечности от потенциально эмбрионально-смертельных фенотипов мутантов. Хотя CRISPR / Cas микроинъекции может генерировать животных, которые являются весьма мутант, такие животные, как правило, очень мозаики, с некоторой степенью удержания аллелей дикого типа и различные различные мутации в целевых местах14,20. Мутагенез на основе CRISPR в гаплоидных клетках увеличивает пенетранс одного аллеля потери функции мутаций, так как они не могут быть замаскированы сохраненными аллелями дикого типа. По этой причине скрининг на основе CRISPR в гаплоидных клеточных линиях все чаще используется для исследования генетической основы многих клеточных процессов21,22,23. Объединив CRISPR основе линии отслеживания с нашими гаплоидных протоколов прививки конечностей, подход, описанный здесь может служить платформой для гаплоидных генетических экранов у живых животных20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры, используемые в этом протоколе, были утверждены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных йельского университета (IACUC, 2017-10557) и соответствовали всем федеральным правилам и руководящим принципам, регулирующим использование позвоночных животных. Все эксперименты на животных были проведены на Ambystoma mexicanum (аксолотлы) в помещениях в йельском университете.
1. Поколение диплоидных эмбрионов
- Получите диплоидные эмбрионы GFP, чтобы служить в качестве трансплантата хостов через естественное спаривание с помощью одного или двух родителей gfp 24.
- Соберите свежеотложенные диплоидные яйца и поместите их в металлическое сито.
- Тщательно промыть яйца 40% раствором Holtfreter (20 мм NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,8 мМ NaHCO3,0,2 мм CaCl2, 4 мМ MgSO4, рН до 7,4).
- Поместите яйца в свежий 40% раствор Holtfreter и хранить при 12 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диплоидные эмбрионы всегда должны быть получены, прежде чем перейти к поколению гаплоидных эмбрионов.
2. Поколение гаплоидных эмбрионов
- Подготовка донора женского гамета
- 48 ч перед проведением инактивации in vitro, обезболизовать сексуально зрелый белый или белый/RFP женский аксолотль путем погружения в 1 г/L HEPES-буферизированный MS-222 в 40% растворе Holtfreter25.
- Убедитесь, что животное полностью обезглавлена примерно через 30 минут погружения, крепко щипая хвост между большим и указательным пальцами. Полностью обезопаденные животные физически не реагируют на любую щепотку.
- Подготовьте раствор человеческого хорионического гонадотропина (HCG), содержащего 10 000 U/mL в стерильном сольнике.
- Использование 30 G инсулина шприц, вводить 0,15 CC ХГЧ (1500 единиц) в мускулатуру спинной к задней конечности обезболной женщины под углом 45 "к средней линии, чтобы избежать контакта со спинным мозгом.
- Верните самку на свежий 40% раствор Holtfreter и поместите в холодильник на 8-12 градусов по Цельсию.
- После 48 ч верните самку к комнатной температуре. Поместите несколько камней или пластиковых растений в контейнер в качестве поверхностей для откладки яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самки вводят с HCG часто депозит пустые желе случаях в течение нескольких часов, прежде чем откладывать яйца. - Удалите камни или пластиковые растения после того, как самка начала последовательно откладывать яйца.
- Разрешить самке сидеть в пустом баке в течение 30 мин до 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание материалов для животного, чтобы отложить яйца на позволит более жесткий контроль сбора яйцеклеток.
- Мужская коллекция гамет
- В то время как откладка яйцеклеток самки застопорилась, анестезируйте сексуально зрелый мужской аксолотл GFP, чтобы служить донором спермы, как и в шаге 2.1.1.
- Поместите полностью обезожженного самца на спину на влажные бумажные полотенца под рассекающимся микроскопом.
- Если экспериментатор прав, положение кончик пипетки P1000 в основании клоака с правой рукой.
- Поместите левый указательный палец и большой палец левой руки 2'3 см рострала к тазу. Аккуратно сжать животное при перемещении пальцев к задним ногам, чтобы избавиться от спермических образцов мочи.
- Соберите каждый, который сбрасывается из клоаки в отдельную микроцентрифугую трубку. Повторите этот процесс, чтобы собрать от 6 до 10 образцов.
- Пипетка 5,0 л от каждого образца на чашку Петри, чтобы проверить качество спермы с помощью перевернутого микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированные образцы спермы молочно-белого цвета, как правило, варьируются от 5 до 20 Л, и, как правило, извлекаются после нескольких, более высокий объем сперматозоидов образцов мочи извлекаются. Сперма будет собирать в нижней части труб в более высоких образцах объема, когда оставили спокойно. Концентрированные образцы здоровой спермы очень подвижно и теряют активность по мере снижения их концентрации. Здоровые самцы могут производить до 50 л концентрированной спермы.
- Коллекция женских гамет
- После получения и подтверждения здорового образца спермы, анестезирует HCG-инъекционные женские аксолотлы, как в шаге 2.1.1.
- Поместите полностью обезопадинированную самку на влажные бумажные полотенца на спине.
- Извлеките неоплодотворенные яйцеклетки у самки, используя движение рук, аналогичное тому, что было в шаге 2.2.4.
- Соберите яйца с помощью мокрых щипц и перенесите их в 10 см чашку Петри. Лечить яйца с облученной спермы в течение 15 минут сбора.
- Мужская подготовка гамет и активация in vitro
- Используйте пипетку P10 или P20, чтобы пипетку спермы вверх и вниз, разбивая комки, чтобы сформировать однородную подвеску.
- Ориентирующий процент подвижной спермы, поместив 0,5 л капли неразбавленной сперматозоиды на крышку чашки Петри или стеклянный слайд и рассматривая с перевернутым микроскопом.
- Добавьте 9,5 л из модифицированного раствора Ringer Марка (MMR; Таблица материалов) к этому образцу, чтобы сделать 20x разбавления спермы. Аккуратно пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
- С перевернутым микроскопом, подсчитайте сперму в трех 1,0 капли l 20x разбавленного aliquot на крышке чашки Петри или гемоцитометр для оценки концентрации спермы неразбавленной подвески.
- Подготовка спермы для облучения путем разбавления аликвот оригинального образца спермы около 80000 motile клеток / мл в стерильных 0,1x MMR.
- Подсчитайте количество яиц, полученных в течение последних 15 мин. Добавить 0,5 л свежеразбавленной спермы от шага 2,4,5 за яйцо в чашку Петри. Используйте кончик пипетки, чтобы распространить эту подвеску в слой толщиной 1 мм.
- Используя пластиковый лифт, поместите образец 4 см от луковиц 254 нм кросслинкера. Генетически инактивировать сперму путем облучения образца с 800000 uJ/mm2.
- Используя пипетку P10, пипетка подвески на неоплодотворенных яйца, покрытие каждое яйцо с 0,25 -0,5 л облученных сперматозоидов. Разрешить яйца сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут.
- После 30 мин, затопить яйца с 0,1x MMR. Немедленно поместите яйца в инкубатор 8'10 градусов для инъекций на следующий день или при 18 градусах Цельсия для инъекций в течение 7 часов после активации (hpa).
- Деджузы гаплоиды с помощью острых щипцы 30 мин после гидратации. Немедленно поместите яйца в инкубатор 8-10 градусов по Цельсию для инъекций на следующий день или при 18 градусах По Цельсию для инъекций в тот же день.
3. Гаплоид мутагенез и техническое обслуживание
- Микроинъекции CRISPR/Cas9
- Дизайн sgRNAs с использованием CRISPRscan и синтезировать26,27.
- Для мультиплексного мутагенеза подготовьте запас в 5 сгРН (10 нг/л для каждого сгРНК) и белка Cas9 (1 мкг/кЛ). Подготовьте 100-кратное разбавление этого запаса (0,1 нг/Л на сгРНН, 10 нг/Л Cas9) для инъекций. Для одного гена, высокой частоты мутации мутагенеза, следуйте протоколу, изложенному ранее28.
- Вводят гаплоидные эмбрионы на одноклеточном этапе 7 л.с., если они хранятся при 18 градусах Цельсия, или впрысните эмбрионы на следующий день на стадии 2х8 клеток, если они хранятся при 8–10 градусах Цельсия.
- Перенос эмбрионов на 1,0x MMR с 20% полисахарозом 400.
- Если одна клетка, вводить каждый эмбрион с 5 nL капли инъекционного раствора (примерно 1/4 радиуса яйцеклетки), содержащие общую массу 0,5 пг/сгРНК и 50 пг Cas9 белка. Если многоклеточный, распределить эту массу путем введения меньших объемов в несколько клеток.
- Разрешить эмбрионам заживать в полисахарозе 400 не менее 4 ч и максимум 18 ч при 18 градусах Цельсия.
- Хаплоидный эмбрион жилья
- Перенос эмбрионов в 0,1x MMR с антибиотиком-антимикоттик.
- Дом каждого эмбриона в отдельных хорошо 24-хорошо пластины, а некоторые умрут или развиваться ненормально. Поддерживайте при 16–18 градусах По Цельсию. Более низкие температуры могут быть использованы для продления развития, если это необходимо.
- Замените средства массовой информации свежим 0,1x MMR с антибиотиком-антимикоттик через день.
4. Подготовка эмбриона хозяина-диплоида
- Поддерживайте эмбрионы в желе покрытие на 12 до 16 градусов по Цельсию, пока они не достигнут стадии 22 до 26.
- Соберите эмбрионы, которые готовы к прививке, поместите их в сито (размер сетки 4 мм) и аккуратно промойте их 40% раствором Holtfreter.
- Перенесите эмбрионы в фильтр-стерилизованный 0.1x MMR, содержащий 1,5% отбеливателя на срок до 2 мин. Полностью погрузите эмбрионы в раствор отбеливателя и аккуратно закружите их, чтобы желе покрывало в полной мере контактировало с раствором отбеливателя, чтобы убить микробов на эмбрионах.
- Через 2 мин разбавьте отбеливатель, содержащий эмбрионы, с равным объемом фильтростеризованного 0,1x MMR.
- Аккуратно вылейте эмбрионы в сито, освященное отбеливателем (размер сетки 4 мм) и промыть эмбрионы пять раз фильтром-стерилизованным 0,1x MMR.
- Поместите эмбрионы в стерильные 10 см петри блюда с 0,1x MMR с антибиотиками для dejellying (пенициллин 100 единиц /мл, стрептомицин 100 мкг /Л, 0,25 мкг/мл, gentamicin 25 мкг/мл).
- Под флуоресцентным стереомикроскопом удалите желе и вителлинные мембраны с эмбрионов ГФПЗ с помощью острых щипц (размеры наконечника 0,05 х 0,01 мм2).
- Перенесите эмбрионы GFP в новое блюдо Петри. Свести к минимуму количество жидкости, передаваемых из чашки Петри, где они были dejellied.
- Промыть эмбрионы гФПЗ стерильными 0,1x MMR антибиотиками в четыре-шесть раз для удаления загрязняющих веществ.
- Поместите чистые эмбрионы на 4 градуса Цельсия на ночь перед прививкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждение эмбрионов делает их более жесткими и чистыми отделения мезодерма от эндодерма возможно.
5. Поколение хаплоид-диплоида Химеры
- Хирургическое блюдо и подготовка СМИ
- Подготовка стерильных хирургических операционных блюд, залива autoclaved 2% агарозы в 0,1x MMR в стерильные 35 мм легкосцепление петри блюда. Заполните блюда Петри на полпути агарозой.
- После того, как агарозо остынет, используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать 25 мм в длину наклонного корыта в агарозе, чтобы удерживать эмбрионы на месте.
- Заполните блюдо стерильными хирургическими носителями (0,1x MMR с анти-микоплазмой 2,5 мкг/мл, амфотерицином B 0,25 мкг/мл и ципрофлоксацином 10,0 мкг/мл) и поставьте в холодильник при 4 градусах Цельсия.
- Процедура прививки эмбрионов
- Поместите одного здорового гаплоидного донора с одним или двумя этапами, соответствующими эмбрионам диплоидного хозяина внутри корыта прехосленного операционного блюда, содержащего хирургические носители(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру на стадии охлаждения (10 градусов по Цельсию или ниже), если это возможно. - Используйте два ультра-тонких, автоклавированных щипцы (прямой наконечник, наконечник размеры 0,05 х 0,02 мм2), чтобы удалить эктодерм и мезодерм слоев от хозяина с бутоном конечности вблизи центра (Рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямоугольная область трансплантата ткани охватывает бутон конечностей и простирается от девятого сомита до задней половины жаберного выпуклости, около 2 мм, вдоль передней задней оси. Вдоль оси дорсовентра, привитые области охватывает примерно 1,5 мм, в том числе сомиты только за брюшной край жаберного выпуклости. Привитые области включает в себя все боковые пластины мезодерма и боковые половинки сомитов, не нарушая основной эндодерм. Подробнее о рисунке 4 и сопроводительном видео. - Отложите ткань хозяина и удалите эквивалентный размер листа ткани из гаплоидного донора с помощью тех же методов.
- Поместите гаплоидный лист донорской ткани на соответствующую область эмбриона донора.
- Закрепите ткань, покрывая ее аутоклавизированным, прямоугольным осколкостью стекла из измельченного микроскопа крышки стекла и мягко нажав его на тело эмбриона хозяина.
- Переверните гаплоидный эмбрион донора на другую сторону, чтобы собрать бутон конечностей для второго эмбриона хозяина. Повторите шаги 5.2.2 до 5.2.5.
- Тщательно удалите оставшиеся лишние ткани хозяина и эмбрион донора из тарелки.
- Оставьте трансплантаты со стеклянными осколками на месте в течение 60-75 минут, проверяя каждые 20 минут, чтобы убедиться, что стекло не соскользнуло.
- После того, как ткани трансплантатов полностью придерживаться, используйте щипцы медленно снимать стеклянные осколки якоря.
- Поместите одного здорового гаплоидного донора с одним или двумя этапами, соответствующими эмбрионам диплоидного хозяина внутри корыта прехосленного операционного блюда, содержащего хирургические носители(рисунок 3).
- Обслуживание химеры
- Перенесите привитые эмбрионы в свежие хирургические носители и поддерживайте их на уровне 8–12 градусов на ночь, чтобы исцелиться. Индивидуально размещается привяженный эмбрион в 12 или 24-колодцах пластин.
- После 36–48 ч перенесите привитые эмбрионы в стерильные 0,1x MMR антибиотик-антимикотик. Сильные антибиотики в хирургических носителях вызывают токсичность у привитых эмбрионов через 3 дня.
- Замените средства массовой информации свежими 0,1x MMR и антибиотиками каждые 2–3 дня.
- Поддерживайте привяженный эмбрион при 18 градусах Цельсия до тех пор, пока они не смогут прокормить28.
- После 1 до 2 месяцев развития и ухода, гаплоидные конечности могут быть забил для чистоты трансплантата с помощью флуоресцентного рассеивание микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие ненейронных или некровных хост-тканей в конечностях является показателем нечистой прививки и часто связано с ненормальным развитием конечностей. Эти животные должны быть исключены из дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Развитие гаплоидных эмбрионов можно отличить от диплоидных эмбрионов по их фенотипу «гаплоидного синдрома»29. На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней задней оси и неполным корпусом желтоковой вилки(рисунок 3А). Флуоресцентный микроскоп может быть использован для обеспечения того, чтобы гаплоидные эмбрионы были свободны от патернатно производных экспрессии GFP(рисунок 3B).
Когда трансплантаты чисты, выражение GFP должно быть ограничено в первую очередь брахиальным сплетением, нейронной сетью, полученной из спинного мозга хозяина, как видно на рисунке 2. Пунктуатив GFP выражение также будет присутствовать в одиночных клетках, которые, как представляется, сенсорные нейроны и кровоточащий клетки-хозяина, которые мигрируют в развивающейся конечности. При использовании доноров RFP, гаплоидные трансплантатные конечности покажут универсальное выражение RFP(рисунок 1B'). На протяжении всего развития, немутагенизированных гаплоидных конечностей значительно короче, чем противоположные диплоидные передние конечности в размер-соответствует химерных животных (Рисунок 1B ,и Рисунок 5, n 16 пар конечностей, гаплоидное среднее значение 0,522 см, SD - 0,087 см, диплоидное среднее - 0,667 см, SD - 0,069 см, парное значение T-test p-value; 0,0001, среднее соотношение 0,784, SD - 0,113). Немутагенизированные гаплоидные конечности также полностью регенерируют (4/4 гаплоидных и 4/4 диплоидных полной регенерации, Рисунок 6),хотя они показывают небольшую задержку в достижении цифровой стадии роста по сравнению с диплоидами (n No 4 гаплоидных, n 4 диплоид; 23 дня после ампутации: гаплоиды и 1 цифровой этап вне очереди;
Успешная прививка требует практики, и последовательность будет варьироваться в зависимости от навыков микроманипуляции техники и стерильной техники. Неудачные и нечистые трансплантаты производят различные фенотипы, как видно на рисунке 7 и рисунке 8. В наших руках примерно 38,7% (SD - 8,78%) яйцеклеток превращаются в обычно развитые гаплоидные эмбрионы и 11,1% (SD - 5,46%) из всех гаплоидно-диплоидных трансплантатов производят жизнеспособных животных с нормально развитыми, чисто привитыми гаплоидными конечностями(рисунок 9).
Рисунок 1: Обзор протокола и пример химерного аксолотла. (A) Схема с изложением относительного времени шаги, предпринятые для получения диплоидных эмбрионов хозяина, спермы и яйцеклеток для того, чтобы генерировать гаплоиды и химерные эмбрионы. (B) Композитное яркое изображение ювенильного аксолотла, произведенного эмбриональным иплотным прививом гаплоидного эмбриона к диплоидному хозяину GFP (B') Наложение зеленых и красных флуоресцентных изображений того же 8 см ювенильного аксолотла. Гаплоидная конечность грубо нормальная, но короче, чем противоположная диплоидная конечность. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Флуоресцентное изображение обычно развитой и чисто привитых гаплоидных конечностей. GFP- гаплоидные конечности, привитые диплоидному хозяину GFP, показывает шаблон экспрессии GFP, который, как представляется, ограничивается спинномозгными нервами, иннервирующих конечности (желтая стрелка) и отдельными сенсорными нейронами и кровоточающими клетками (белыми стрелками). На фото конечность принадлежала несовершеннолетнему 4 см. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение диплоидных и гаплоидных эмбрионов. (A) Светлое изображение диплоидов (слева) и гаплоидов (справа). Обратите внимание на уменьшенную кривизну AP-оси и выступающий эндодерм гаплоидных эмбрионов (белые стрелки). (B) Зеленое флуоресцентное изображение тех же эмбрионов. GFP-гаплоиды были созданы с использованием яйцеклеток из GFP-женщины и облученной спермы из GFP. Диплоиды - это ГФПЗ. Эмбрионы на фото примерно стадии 2530. Постановочная серия. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схемастого изложения степени гаплоидных конечностей бадтат атлет. (A) Боковой вид стадии 25 гаплоидного эмбриона. Пунктирные линии показывают приблизительную область, которая должна быть пересажены, по отношению к жаберной выпуклости и конечностей бутон. (B) Поперечная схема стадии 25. Пунктирные линии показывают приблизительную область и типы тканей, которые должны быть удалены из хозяина и заменены соответствующей гаплоидной донорской ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Сравнение длин гаплоидных и диплоидных конечностей. (A) Рассеянный участок длины гаплоидных конечностей (розовый) и противоположных диплоидных конечностей (зеленый) из 16 аналогичного размера химерных животных (гаплоидное среднее - 0,522 см, SD - 0,087 см, диплоидное среднее - 0,667 см, SD - 0,069 см). Конечности измерялись от основания зевгопода до стыка цифр 2 и 3. (B) Рассеянный участок гаплоидной длины конечностей до диплоидных соотношений длины конечностей 16 животных (среднее соотношение 0,784, SD - 0,113 см). (C) Рассеянный участок длины тела (см) из 16 измеренных химер (средняя длина животного - 8,72 см и 0,456 см). Звери измерялись от кончика мили до кончика хвоста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Сравнение регенерации в гаплоидных и диплоидных конечностях. (A) Haploid конечности до ампутации. (B) Та же гаплоидная конечность после регенерации. (C) Диплоид конечности до ампутации. (D) Та же диплоидная конечность после регенерации. 4/4 гаплоидных конечностей и 4/4 диплоидных конечностей регенерируются с нормальной морфологией. Черные пунктирные линии указывают на плоскость ампутации. Шкала баров 1 мм. Ампутации были выполнены на размер соответствии несовершеннолетних животных (8,5 см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Примеры нормального и аномального развития гаплоидных конечностей. (A) Гаплоидная конечность с грубо нормальной морфологии. (B-E) Примеры трансплантатов, которые не смогли поддержать полное развитие гаплоида. (B) Олигодакли. (C) Более тяжелые олигодатии. (D) Нет различных цифровых структур присутствуют. (E) Нет конечностей. На рисунке конечности принадлежат несовершеннолетним аналогичного размера (от 8,0 до 10 см). Шкала баров 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Примеры клеток ГФПЗ при нечистых гаплоидных трансплантатах конечностей. (A,A') Морфологически нормальная гаплоидная трансплантатная конечность с диплоидными клетками GFP в коже и дермией (белый пунктирный контур), выявленные флуоресцентной микроскопией. (B,B') Привитая ненормальная гаплоидная конечность с диплоидными клетками GFP, вносящих значительный вклад в дерму и кожу (белый контур). (C,C') Привитая аномальная гаплоидная конечность, в которой эпидермис был заменен диплоидными клетками GFP (белый контур). На рисунке конечности принадлежат несовершеннолетним аналогичного размера (от 8,0 до 10,0 см). Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Показатели успеха гаплоидного эмбриона и гаплоидного поколения конечностей. ( A) Процент жизнеспособных гаплоидных эмбрионов, генерируемых с помощью активации in vitro. Данные были собраны в ходе пяти независимых экспериментов по активации in vitro. Зеленый цвет указывает на долю яиц, которые производятся стадии 25 гаплоидных эмбрионов, которые могут быть использованы для прививки (средний - 38,7%, SD - 8,78%). Серый цвет указывает на то, что доля яиц, которые не имели признаков расщепления, были нежизнеспособны или были нормальными в развитии. (B) Процент нормально развитых, чисто привитых гаплоидных конечностей. Фиолетовый указывает на фракцию трансплантатов, которые дали чистые, обычно развитые гаплоидные конечности (средний - 11,1%, SD - 5,46%). Зеленый цвет указывает на конечности, которые развивались нормально, но имели загрязняющие ткани хозяина GFP (средний - 11,3%, SD - 8,64%). Красный цвет указывает на трансплантат конечностей, которые не развивались нормально (средний - 27,1%, SD - 30,3%). Синий цвет указывает на все привитые эмбрионы и животных, которые не выжили, чтобы завершить развитие конечностей (средний - 50,5%, SD - 31,2%). Потеря привитых животных была распределена по поздним эмбриональным и личиночных стадиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.
Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активации in vitro. Надлежащее количество подвижной спермы должны быть использованы для активации яйцеклеток. Чтобы продлить подвижность, образцы спермы всегда должны поддерживаться при 4 градусах Цельсия. Перед нанесением любого образца спермы на яйца, проверьте жизнеспособность спермы с помощью перевернутого микроскопа. Полностью неподвижной спермы никогда не должны использоваться, и концентрация должна быть скорректирована до 80000 motile клеток / мл. Слишком много спермы в шаге активации может также предотвратить нормальное развитие яйцеклетки. Ямы спермы, которые появляются как малые, темные отступы на поверхности яйцеклетки, являются физическим признаком того, что сперматозоидная клетка проникла в яйцеклетку и обычно появляется от 20 до 60 мин после применения спермы. Яйца с десятью или более ямами спермы не могут активироваться должным образом.
Неоплодотворенные яйца могут быть активированы, если собраны в течение 15 минут после того, как заложены под водой, помещены в сухой чашке Петри, и тщательно высушены бумажными полотенцами до применения спермы. Кроме того, как показано на видео, яйца могут быть выдавлены из гормона вводили женщины. Мы находим, что эти "сухие" яйца дают более последовательные результаты, хотя мы регулярно используем оба метода.
Успешная прививка требует надлежащего соединения диплоидных эмбрионов с соответствующим образом поставил гаплоидной ткани бутона конечностей. Этот протокол содержит ряд мер по обеспечению сопоставления этапов. Поскольку естественное спаривание не всегда приводит к откладыванию яйцеклеток, инъекция ХГЧ для получения гаплоидных яйцеклеток не должна выполняться до тех пор, пока естественно спаренная самка не начнет откладывать диплоидные яйца. После этой инъекции, индуцированных женщин должны быть размещены при пониженной температуре (от 8 до 12 градусов по Цельсию), что позволит уменьшить скорость откладки яйцеклетки. Корпус гормонстимулированной женщины при нормальной температуре может привести к тому, что большинство яйцеклеток будет отложено в течение короткого периода времени. Начало яйцеклетки, откладываемых в охлажденной самке, указывает на то, что самка готова к анестезии и извлечению яйцеклеток. Активация яоцита должна происходить в течение 15 минут от извлечения яйцеклеток. Поскольку активированные гаплоидные эмбрионы будут на несколько дней отставать от естественно вырабатываемых диплоидных эмбрионов в развитии, мы рекомендуем инкубировать диплоидные эмбрионы при 12 градусах Цельсия при одновременном увеличении относительной скорости развития гаплоидов путем инкубации их при 18 градусах Цельсия. Потому что будут некоторое изменение в интервале между HCG-инъекцией и закладкой яйцеклеток индуцированных женщин, небольшие корректировки в температурах инкубации либо гаплоидов или диплоидов может быть необходимо, так что постановка хозяина и донора эмбрионов в паре во время прививки. Эмбрионы должны быть охлаждены до 4 градусов по Цельсию в течение нескольких часов до прививки, и это почти арестовывает развитие. Различать время начала охлаждая haploid и diploid зародыши до прививки может позволить этап-сопрягая. В то время как гаплоидные эмбрионы морфологически отличаются от диплоидов, и гаплоиды, и диплоиды достигают стадии 21 после закрытия нервных складок, а эмбрионы лежат на одной из сторон. Как и диплоиды, гаплоидные эмбрионы стадии 25 имеют видные жаберные и склонные выпуклости. Большая голова выступает под углом относительно тела в гаплоидах, хотя это значительно снижается по отношению к стадии 25 диплоидных эмбрионов, чьи головы выступают из тела под прямым углом30.
Стерильная техника имеет решающее значение для успешной пересадки тканей. Стерильные условия должны поддерживаться в течение всего эксперимента с гаплоидного поколения через эмбриональное развитие химер. Мы рекомендуем держать всех родительских животных в чистых, несистемных условиях воды в период откладки яиц, чтобы свести к минимуму количество загрязняющих органических материалов в начале процедуры. Последовательное, ежедневное удаление умерших или умирающих эмбрионов в течение всего процесса имеет важное значение для поддержания здоровья других эмбрионов. Мы рекомендуем индивидуально жилье всех гаплоидных и химерных эмбрионов, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение.
Эмбриогенная микродиссекция и навыки пересадки тканей приобретаются на практике. Во время процесса прививки важно не проколоть и не рвать сам бутон конечностей. Ткани, удаленные из эмбрионов хозяина и донора, должны выходить за пределы бутона конечностей, как на фото, для обеспечения буферизации зоны. Если слишком малая область ткани привитается, гаплоидные конечности будут проникли в диплоидную кожу Ипфоид gFP и другие ткани.
Одним из ограничений этого метода прививки является то, что нервная ткань и кровь в конечностях являются производными от тела хозяина. В некоторых редких случаях, мы смогли генерировать привитые гаплоидные конечности, которые полностью отсутствуют все признаки GFP, выражающие нервы. В этих случаях мы смогли заменить достаточное количество нервной ткани у животного-хозяина на донора. Тем не менее, такие обширные прививки трудно, ненадежны, и часто производит отклонения в развитии за пределами конечности.
Гаплоидия является эмбриональным смертельным исходом в аксолотле. Аналогичным образом, мутации во многих генах, потенциально необходимых для развития конечностей и регенерации, также являются ранними эмбриональными смертельными исходами. Наш протокол обходит эмбриональную летальность гаплоиды для производства экспериментальных конечностей, а также может быть использован в тех случаях, когда мутация гена регенерации кандидата производит эмбриональный смертоносный фенотип. Наша методика прививки бутона конечностей обеспечивает преимущество для выполнения этого по сравнению с ранее описанными методами бутона конечностей и способствующих пересадке тканей, так как она выполняется во время раннего эмбрионального развития и включает в себя трансплантацию полного эктодерма и мезодермовых слоев1,2.
Haploid конечности бутон прививки была ранее описана; однако, в этом более предыдущем изучении, почки конечной конечностей haploid были привиты ectopically31. Микроскопический ядерный анализ внематочной конечностей, полученных из этих трансплантатов, выявил обширный вклад диплоидной ткани. Хотя эти конечности развивались ненормально, они смогли регенерировать31. Вместо того, чтобы прививать внематочное почки конечностей, мы заменяем весь эндогенный бутон конечностей эквивалентными гаплоидными тканями. С помощью флуоресцентных маркеров, мы можем визуально определить гаплоидные конечности, которые свободны от диплоидных вкладов, за исключением нервных и кровяных клеток, без ущерба для гаплоидной конечности себя. Мы находим, что гаплоидные конечности развиваются и регенерируют нормально. Тем не менее, конечности, в которых хосты GFP вносят свой вклад в ткани, кроме нервных и кровоточащие клетки, часто отображают аномалии. Таким образом, при исследовании функции генов в гаплоидных конечностях, те, с чрезмерным вкладом хозяина должны быть исключены из анализа, прежде чем генотип может быть связан с любым фенотипом наблюдается в мутантных haploid конечностей.
Недавние инновации, такие как сборка генома аксолотла и недавние методы вставки на основе CRISPR/Cas15,16,32, резко расширили генетическую податливость аксолотла. Методы ограничения генетических манипуляций временно и пространственно имеют большие перспективы, но их текущее применение ограничено ресурсами, необходимыми для генерации, размещения и распределения линий животных. Описанный здесь протокол ускоряет процесс, с помощью которого последствия генетических возмущений генов могут быть исследованы при развитии и регенерации конечностей. Там было мало характеристики многих генов, как установлено, upregulated в регенерирующих конечностей, и эти гены могут быть вовлечены в различные важные процессы развития и клеток. Хотя мы ожидаем, что многие гены, необходимые для регенерации конечностей также потребуется для развития конечностей, этот метод может выявить ли какие-либо гены, причастные к регенерации имеют потери функции фенотипов, которые регенерации конкретных. CRISPR/Cas mutagenesis в аксолотах обычно производит аллельский мозаикизм, который включает в себя сохраненные аллели wildtype, и этот мозаичный сам по себе может рассматриваться как количественный фенотип20. Используя секвенирование ампутированных оригинальных и регенерированных конечностей следующего поколения, исследователи могут дать количественную оценку того, теряются ли гаплоидные клетки с мутациями в гене интереса после регенерации. Такой подход может позволить исследуют фенотипы регенерации, производимые возмущением необходимых в противном случае генов развития.
Гаплоидные генетические экраны, несвязанные функциями, облегчают исследование генетического происхождения многих биологических процессов без необходимости установления двухпалычных линий мутантных клеток. Объединив гапогенез, мутагенез CRISPR/Cas9 и прививку бутона конечностей, мы предоставляем новую платформу для гаплоидного генетического экрана, исследующего развитие конечностей и регенерацию у живого животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J.
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J.
- Armstrong, B.
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
