Summary
È stato sviluppato un protocollo di microdissezione di cattura laser (LCM) per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica nelle cellule di qualsiasi tessuto duro.
Abstract
La resa e l'integrità dell'RNA sono decisive per l'analisi dell'RNA. Tuttavia, è spesso tecnicamente difficile mantenere l'integrità dell'RNA durante l'intera procedura di microdissezione di cattura laser (LCM). Poiché gli studi LCM funzionano con basse quantità di materiale, anche le preoccupazioni circa le limitate rese di RNA sono importanti. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee. È stato valutato l'effetto del protocollo di colorazione, dello spessore delle criosezioni, della quantità di tessuto microdissecazione, del kit di estrazione dell'RNA e del sistema LCM utilizzato sulla resa e l'integrità dell'RNA ottenuto dalle cellule ossee microdisseche. Le sezioni ossee congelate spesse otto m sono state realizzate utilizzando una pellicola adesiva e macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia Commerciale di LCM. Il campione è stato inserito tra una membrana di terephthalate (PET) in polietilene e la pellicola adesiva. Un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni e un metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne è stato utilizzato per ottenere RNA di alta qualità di resa sufficiente. L'attuale studio si concentra sulle sezioni del femore del topo. Tuttavia, il protocollo LCM riportato qui può essere utilizzato per studiare l'espressione genica situ in cellule di qualsiasi tessuto duro sia in condizioni fisiologiche che nei processi della malattia.
Introduction
I tessuti sono costituiti da tipi di cellule eterogenee e distribuite spazialmente. Diversi tipi di cellule in un dato tessuto possono rispondere in modo diverso allo stesso segnale. Pertanto, è essenziale poter isolare specifiche popolazioni cellulari per la valutazione del ruolo dei diversi tipi di cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La microdissezione di cattura laser (LCM) offre un metodo relativamente rapido e preciso per isolare e rimuovere le cellule specificate dai tessuti complessi1. I sistemi LCM utilizzano la potenza di un raggio laser per separare le cellule di interesse dalle sezioni del tessuto istologico senza la necessità di elaborazione enzimatica o crescita della coltura. Ciò significa che le cellule sono nel loro habitat di tessuto naturale, e che l'architettura dei tessuti tra cui la relazione spaziale tra le diverse cellule viene mantenuta. La morfologia delle cellule catturate e del tessuto residuo è ben conservata e diversi componenti del tessuto possono essere campionati in sequenza dallo stesso vetrino. Le cellule isolate possono quindi essere utilizzate per analisi successive del loro RNA, DNA, proteina o contenuto dimetaboliti 2,3.
Per analizzare l'espressione genica in diverse popolazioni cellulari, o dopo diversi trattamenti, è necessario ottenere mRNA di quantità e quantità sufficienti per la successiva analisi4,5. A differenza del DNA, gli RNA sono più sensibili alla fissazione e l'uso del tessuto congelato è raccomandato quando l'obiettivo è studiare l'RNA. Poiché gli mRNA sono rapidamente degradati da ribonucles onnipresenti (RNase), sono necessarie severe condizioni prive di RNase durante la movimentazione e la preparazione dei campioni ed evitare lo stoccaggio di campioni a temperatura ambiente. Inoltre, tecniche rapide senza fasi di fase acquose prolungate sono cruciali per prevenire la degradazione dell'RNA6. La resa e l'integrità dell'RNA possono anche essere influenzate dal processo LCM e dal sistema LCM utilizzato7,8. Attualmente, sono disponibili quattro sistemi LCM con diversi principi operativi2. Il metodo di estrazione dell'RNA può anche essere importante, dal momento che diversi kit di isolamento dell'RNA sono stati testati con differenze significative nella quantità e qualità dell'RNA7,8.
Qualsiasi metodo di preparazione dei tessuti richiede di trovare un equilibrio tra l'ottenimento di un buon contrasto morfologico e il mantenimento dell'integrità dell'RNA per ulteriori analisi. Per la preparazione di sezioni congelate dall'osso, è stata sviluppata una pellicola adesiva e continuamente migliorata9. Le sezioni ossee vengono tagliate e macchiate direttamente sulla pellicola adesiva. Questo film adesivo è applicabile a molti tipi di colorazione e può essere impiegato per isolare le cellule di interesse dalle criosezioni ossee utilizzando LCM9,10,11,12,13, 14. Tutti i passaggi, tra cui la rimozione chirurgica, l'incorporamento, il congelamento, il taglio e la colorazione possono essere completati in meno di un'ora. È importante sottolineare che cellule come osteoblasti, cellule di rivestimento osseo e osteoclasts possono essere chiaramente identificate9,10,11,12,13,14. Questo metodo ha il vantaggio di essere rapido e semplice. Un metodo alternativo per la generazione di criosezioni ossee consiste nell'utilizzare il sistema di trasferimento del nastro15. Tuttavia, quest'ultima tecnica richiede più tempo e richiede una strumentazione aggiuntiva, poiché le sezioni devono essere trasferite dal nastro adesivo su vetrini a membrana prerivestiti mediante collegamento incrociato ultravioletto (UV). Sebbene il sistema di trasferimento a nastro sia stato accoppiato con successo con LCM16,17,18,19, va notato che il rivestimento incrociato può creare un modello di sfondo che può interferire con l'identificazione del tipo di cella20.
Tipicamente, solo piccole quantità di RNA vengono estratte da cellule microdissected, e la qualità e la quantità dell'RNA sono spesso valutate dall'elettroforesi micro-capillare21. Un programma per computer viene utilizzato per assegnare un indice di qualità agli estratti di RNA chiamati RNA integrity number (RIN). Un valore RIN di 1,0 indica RNA completamente degradato, mentre un valore di 10,0 suggerisce che l'RNA è completamente intatto22. Di solito, gli indici superiori a 5 sono considerati sufficienti per gli studi sull'RNA. Sono stati riportati modelli di espressione genica in campioni con un valore RIN di 5,0,10,0 per correlare bene tra loro23. Anche se la sensibilità di questo metodo è elevata, dal momento che è possibile rilevare appena 50 pg/L di RNA totale, può essere molto difficile ottenere una valutazione della qualità se la concentrazione di RNA nel campione è molto bassa. Pertanto, al fine di valutare la qualità dell'RNA, la sezione tissutale rimanente dopo il LCM viene spesso utilizzata per estrarre l'RNA, pipetting buffer sulla diapositiva24.
Anche se LCM è stato ampiamente utilizzato su diversi tessuti congelati, valori di RIN di RNA estratti sono raramente segnalati. Inoltre, non esistono studi comparativi per chiarire il metodo più appropriato per studiare l'RNA nelle ossa dei topi. Nel presente studio, sezioni congelate di femori murini adulti sono stati utilizzati per ottimizzare la preparazione del campione, il protocollo LCM e l'estrazione dell'RNA al fine di ottenere RNA di alta qualità. Il protocollo attuale è stato ottimizzato in particolare per il sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni.
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Protocol
Il tessuto osseo dei topi è stato utilizzato in stretta conformità con le linee guida prevalenti per la cura degli animali e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.
1. Animali e congelare l'incorporamento
- Animali da casa in condizioni di temperatura ambiente costante (RT; 24 ) e un ciclo di luce 12 h 12 h scuro con accesso gratuito al cibo e all'acqua.
NOTA: Tessuti ossei in questo studio sono stati ottenuti da topi di tipo selvatico C57BL/6 di tipo maschile di 3 mesi. - Alla necroscopia, i topi esanguinati dalla vena cava addominale in anestesia generale (ketamina/xylazina, 100/6 mg/kg intraperitoneale).
NOT: Per evitare la degradazione dell'RNA, utilizzare strumenti e materiali privi di RNase, indossare guanti e lavorare rapidamente evitando lo stoccaggio di campioni in RT durante l'intero esperimento. - Rimuovere rapidamente i femore interi, pulirli dei tessuti molli circostanti utilizzando bisturi e asciugamani di carta. Versare il composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) nello stampo di incorporamento e inserire il femore nella parte inferiore dello stampo di incorporamento. Congelare i campioni in azoto liquido. Lo Strumento di personalizzazione di Office è trasparente in RT e bianco quando è bloccato.
- Una volta completamente congelati, avvolgere i campioni in lamina e trasferirli su ghiaccio secco a -80 gradi centigradi. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore elaborazione.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Sezione Preparazione
- Impostare la temperatura nel criostato su -19 gradi centigradi e del supporto del blocco su -17 gradi centigradi. Pulire l'interno criostato utilizzando il 70% di etanolo. Posizionare la lama usa e getta per i tessuti duri, i vetrini di vetro e uno strumento di raccordo nel criostat per raffreddare. Tenerli all'interno del criostato per tutta la durata del sezionamento.
- Trasferire il blocco di tessuto congelato sul ghiaccio secco al criostato e lasciarlo eclavitare per almeno 10 min.
NOT: Evitare lo scongelamento ripetitivo e il ciclo frequente di un isolato da -80 gradi a -19 gradi per la criosezione. - Premere la parte inferiore dello stampo di incorporamento per spingere il blocco dello stampo dello STAMPo fuori dallo stampo. Applicare un supporto dello Strumento di personalizzazione di Office sufficiente al supporto del blocco per aderire al blocco. Attendere che il supporto dello Strumento di personalizzazione di Office sia completamente congelato.
- Posizionare il supporto del blocco nel supporto dell'oggetto e stringerlo in posizione. Regolare la posizione della lama e tagliare il blocco utilizzando incrementi di taglio di 15 m per rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office che copre il campione. Se il campione è stato tagliato in precedenza e la superficie esposta all'aria, scartare le prime sezioni di tessuto di 2/3 dal blocco.
- Regolare il criostato per generare 8 sezioni m e tagliare 2/3 criosezioni che verranno scartate (le prime saranno in genere più spesse di 8 m). Posizionare la pellicola adesiva sul blocco e utilizzare uno strumento di raccordo per aderire alla pellicola al blocco. Fare il taglio lentamente e ad una velocità costante tenendo la sezione dal film.
- Posizionare immediatamente il film (campione rivolto verso l'alto) su uno scivolo di vetro preraffreddato (sul criobar all'interno del criostato) per evitare lo scongelamento del campione. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la pellicola alla vetrina di vetro per una colorazione più facile. Procedere immediatamente con il protocollo di colorazione.
3. Protocollo di colorazione rapida
- Preparare 40 mL delle seguenti soluzioni in tubi da 50 mL e metterli su ghiaccio: 95% di etanolo, acqua senza RNase, 100% etanolo, 100% etanolo e 100% xilene. Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio (tranne la colorazione). Per ogni giornata sperimentale, preparare tutti i reagenti acquosi freschi con acqua senza RNase.
ATTENZIONE: Lavorare nel cofano per evitare l'intossicazione da xilene. - Incubare sezioni per 30 s nel 95% di etanolo, quindi immergere le sezioni 30 s in acqua senza RNase per rimuovere lo OCT con attenzione e completamente che possono interferire con le applicazioni LCM e a valle.
- Distribuisce 50 l di macchia commerciale di sezione congelata LCM (Table of Materials) sulla sezione, incuba per 10 s a RT e sgocciolailo posizionando il bordo del vetrino su carta velina assorbente. Rimuovere la colorazione in eccesso risciacquando 30 s in 100% etanolo.
- Immergere le sezioni ossee in un secondo tubo con 100% etanolo per 30 s e trasferirle al 100% di xilene per 30 s.
- Mettere la pellicola adesiva (campione rivolto verso l'alto) su vetrine di vetro secco come supporto. Fare attenzione che il film non sia influenzato e posizionato il più piatto possibile. Non lasciare che il campione si asciughi completamente.
- Posizionare una diapositiva a cornice di membrana PET. Premere poco un dito guantato sulla membrana per attaccarlo alla pellicola. Il campione viene quindi inserito tra la membrana e la pellicola adesiva. La pellicola adesiva non deve essere piegata o rugosa e non devono essere presenti bolle d'aria tra la pellicola e la membrana. Procedere immediatamente con l'LCM.
4. Microdissection di cattura laser
- Pulire lo stage e il supporto del tappo da RNase utilizzando il detaminante superficiale (Tabella dei materiali). Caricare rispettivamente il vetrino e i tappi nel supporto della diapositiva e nel supporto del cappuccio.
- Regolare la messa a fuoco e acquisire la panoramica della diapositiva con obiettivo 1.25x. Passare all'obiettivo 40x e regolare la messa a fuoco. Scegliere l'area di interesse utilizzando la panoramica della diapositiva. Regolare i parametri laser come segue: apertura, 7; potenza laser, 60; velocità, 5; frequenza dell'impulso, 201; l'equilibrio dei campioni, 20. Ottimizzare questi parametri per ogni obiettivo.
- Se il laser non riesce a tagliare il campione, aumentare la potenza del laser. In alternativa, il laser può essere applicato più di una volta. Inoltre, ispezionare l'obiettivo alla ricerca di macchie di tagli incompleti e ridisegnare la linea in questi punti utilizzando l'opzione Sposta e taglia. Salvare le impostazioni laser per la dissezione delle diapositive successive.
- Selezionare osteoblasti, osteociti e cellule di rivestimento osseo in osso femorale disidrato annullato o corticale in base a criteri morfologici. Disegnare una linea per il percorso laser più lontano dalle celle bersaglio per ridurre al minimo i danni da parte del laser UV. Eseguire tutte le microdisezioni entro meno di 1 h dopo la colorazione.
- Raccogliere ogni tipo di cella in un tappo separato di un tubo da 0,5 mL.
NOT: La cattura a secco invece del recupero di liquidi può evitare la degradazione dell'RNA. Inoltre, volumi molto piccoli di buffer contenuti nel tappo del tubo di microcentrifuga possono evaporare o cristallizzare (a seconda della sua composizione) durante il LCM. - Confermare il successo della cattura mediante l'osservazione del tappo del tubo di raccolta dopo la LCM, ove applicabile. Procedere immediatamente con l'estrazione dell'RNA.
5. Estrazione dell'RNA
- Distribuisci 50 luna del buffer di lisi contenente il buffer di lisi nel tappo del tubo di raccolta e litradisci il campione pipetting su e giù nel tappo per 1 min. Se verranno raggruppati più tappi, assicurarsi che il volume totale del buffer sia consigliato per il kit di estrazione dell'RNA (Tabella dei materiali).
AVVISO: è necessario aggiungere il mercaptoetanolo per proteggere l'RNA dalla degradazione, ma è considerato tossico. Indossare abiti e guanti protettivi e lavorare nel cofano. - Inoltre, per ogni vetrio preparate un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL etichettato con 350 l' l del buffer di lisi contenente il mercaptoetanolo. Utilizzare le sezioni rimanenti dopo il LCM per estrarre l'RNA. Separare con cura la pellicola dalla membrana e lisizzare il campione sgranocchiando lentamente il buffer di lisi sulla sezione più volte.
NOT: La quantità totale di buffer di lisi deve essere 350. Non usare tutto in una volta per la digestione in quanto scorrerà fuori dallo scivolo. -
Mettete i campioni di lisa su ghiaccio secco e conservateli a -80 gradi centigradi.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. - Scongelare i lisati a RT. Trasferire lisari da cellule raccolte da LCM dai tubi di raccolta nei tubi di microcentrismo da 1,5 mL. Se più di un tappo è stato utilizzato per raccogliere il campione, piscina diversi lisati.
- Estrarre l'RNA secondo le istruzioni del produttore. Trattare le colonne con DNase I per rimuovere il DNA genomico. RNA elute con 14-L di acqua senza RNase, con conseguente eluato di 12 l. Conservare l'RNA a -80 gradi centigradi.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
6. Misurazione della resa e dell'integrità dell'RNA
- Scongelare l'RNA sul ghiaccio bagnato. Misurare la resa e l'integrità dell'RNA isolato utilizzando l'elettroforesi micro-capillare. Caricare l'RNA totale (1 L per campione) in un chip (Tabella dei materiali)secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
È stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica nelle cellule ossee dei femori murini. Nel protocollo ottimizzato, 8 sezioni di osso congelato spesse 8 m sono state tagliate su una pellicola adesiva e macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia di sezione congelata LCM commerciale. Il campione è stato inserito tra la membrana PET e la pellicola adesiva. Le cellule ossee del topo sono state microcono utilizzando un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni. È stato utilizzato un metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne per ottenere un RNA di alta qualità di resa sufficiente. La resa e l'integrità dell'RNA isolato sono state misurate utilizzando l'elettroforesi micro-capillare (Figura 1).
La differenza nella qualità dell'RNA e nella quantità ottenuta utilizzando diversi protocolli di lisi può essere osservata nel gel rappresentativo e negli elettroferici. Quando il campione è stato lisciviato pipettando su e giù nel tappo per 1 min, è stato possibile isolare circa 8,5 ng di RNA da 1 mm2 tessuto osseo microabformato (sezione di 8 m di spessore). Il valore RIN era 8,60 (Figura 2).
In alternativa, LCM è stato eseguito utilizzando un sistema LCM che utilizza impulsi laser de-focalizzati, che catapulta il materiale nel tappo adesivo a strapiombo. La qualità e la quantità dell'RNA possono essere stimate nel gel rappresentativo e negli elettroferogrammi. Per le ossa congelate fresche, è stato possibile isolare circa 1,6 ng di RNA da 1 mm2 microdissected osso di tessuto osseo (sezione spessa 8 m). Il valore RIN era 1 (Figura 3).
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo di microdissezione di cattura laser per ossa fresche congelate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gel rappresentativo (in alto) ed elettroferogrammi (in basso) di campioni di RNA. LCM è stato eseguito utilizzando un sistema LCM che utilizza la gravità per la raccolta dei campioni. I campioni di RNA sono stati recuperati dal tessuto raccolto l'CmL (campioni 1, 3, 5, 7 e 9) e dalle sezioni di controllo corrispondenti (campioni rispettivamente 2, 4, 6, 8 e 10). Un campione di RNA è stato recuperato dalla sezione di controllo che è stata macchiata ma non è stata utilizzata per LCM (esempio 11). Una superficie totale di 1 mm2 è stata microdistratta, e sono stati utilizzati diversi protocolli di lisi. Nel tubo è stato aggiunto 350 l ofthet contenente il mercaptoetanolo. Il tappo è stato chiuso con cura, e il tubo invertito. Le cellule raccolte da LCM sono state lismiate vortice di 1 min, incubando a RT per 10 min e vortice 1 min. Le cellule raccolte da LCM sono state lizzate con tubi di raccolta di incubazione a testa in giù per 30 min a RT. Campione 5: 50 l' buffer di lisi contenente s-mercaptoetanolo è stato aggiunto nel tappo del tubo di raccolta e il campione è stato lised per pipetting su e giù nel tappo per 1 min. Il lisato è stato centrifugo e 300 Litri del tampone di lisi contenente z-mercaptoetanolo è stato aggiunto nel tubo. Nel tubo è stato aggiunto 350 l di lingro contenente il mercaptoetanolo. Il tappo è stato chiuso con cura, e il tubo invertito. Le cellule raccolte da LCM sono state lismilate mediante vortice e inversione più volte. Esempio 9: 50 L del buffer di lisi contenente il mercaptoetanolo è stato aggiunto nel tappo del tubo di raccolta e il campione è stato liscito per incubazione per 5 min a RT nel tappo. Il lisato è stato centrifugo, e 300 lun del tampone di lisi contenente z-mercaptoetanolo è stato aggiunto al tubo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gel rappresentativo (in alto) ed elettroferogrammi (in basso) di campioni di RNA. LCM è stato eseguito utilizzando un sistema LCM che utilizza impulsi laser de-focalizzati, che catapulta il materiale nel tappo adesivo posizionato sopra la sezione. I campioni di RNA sono stati recuperati dal tessuto raccolto l'ML (campioni 5 e 6) e dalla corrispondente sezione di controllo (campione 7). Un campione di RNA è stato recuperato dalla sezione di controllo che è stata macchiata ma non è stata utilizzata per LCM (esempio 8). Una superficie totale di 0,5 mm2 o 1 mm2 è stata microdissecata (campioni rispettivamente 5 e 6). Nel tubo di raccolta è stato aggiunto 350 - L del tampone di lisi contenente il mercaptoetanolo, il tappo è stato accuratamente chiuso e il tubo invertito. Le cellule raccolte da LCM sono state lised incubando tubi di raccolta a testa in giù per 30 min a RT. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sia la qualità dell'RNA che la quantità possono essere influenzate negativamente in tutte le fasi della preparazione del campione, come la manipolazione dei tessuti, il processo LCM e l'estrazione dell'RNA. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo LCM per ottenere una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la successiva analisi dell'espressione genica.
Per LCM, la maggior parte dei laboratori utilizza le sezioni di 7,8 m di spessore2. Sezioni più spesse consentirebbero di raccogliere più materiale. Tuttavia, se sono troppo spessi, questo potrebbe ridurre la risoluzione microscopica e il laser potrebbe non essere in grado di tagliare. È probabile che lo spessore ottimale del tessuto dipenda dal sistema LCM (e dal tipo di laser e diapositiva) utilizzato, nonché dal tessuto in questione8,25. Nel presente studio sono state testate criosezioni di diversi spessori (4, 8 o 12 m); Sono state trovate 8 sezioni di spessore di m per l'Ambiente LCM, mentre le sezioni ossee di 12 m erano più difficili da tagliare con il laser e le sezioni di 4 m davano una minore quantità di RNA.
L'attività endogena di RNase varia da diversi tessuti. Pertanto, i protocolli di colorazione sviluppati per tessuti con un'attività rNASe molto bassa potrebbero non essere adatti ad altri tipi di tessuto. Nucleare veloce rosso26 e cresyl viola24 sono stati suggeriti per essere il migliore in termini di conservazione dell'integrità dell'RNA. Inoltre, i metodi a base di alcol erano superiori alle macchie acquose per mantenere l'integrità dell'RNA. Tuttavia, hanno sofferto di intensità di colorazione irriproducibile27. Il tempo è un parametro importante da considerare. Da un lato, il tempo necessario per cercare e identificare le celle di interesse nella sezione e per eseguire LCM è spesso relativamente lungo. D'altra parte, il tempo disponibile per LCM è limitato, poiché, in alcuni casi, il 20% di degradazione dell'RNA è stato raggiunto dopo 30 min28. Pertanto, sono stati applicati diversi metodi per stabilizzare l'RNA, come l'esposizione delle sezioni al flusso di argon durante la microdissezione28, o l'uso di colorazione viola a base di alcol tamponata e mantenere basso il livello di umidità in laboratorio 27. Inoltre, è stato suggerito un massimo di 15 min per la fase di microdissezione2. In questo studio, le sezioni ossee congelate sono state macchiate utilizzando un protocollo rapido per una macchia Commerciale LCM, e anche dopo 1 h a RT, i valori di RIN sono diminuiti da 8,3 a 9,1. Pertanto, tutte le microdissezioni sono state eseguite entro meno di 1 h dopo la colorazione. Inoltre, sono stati testati diversi protocolli per la colorazione (con incubazioni più brevi in reagenti acquosi o senza il passo xilene). Non è stato raggiunto alcun miglioramento significativo dei valori RIN.
Negli studi LCM sono stati confrontati due diversi tipi di metodi di estrazione dell'RNA: un metodo di separazione di fase rispetto a un metodo basato su colonne. Si è scoperto che il metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne ha portato a una migliore qualità dell'RNA e a una maggiore resa rispetto al metodo di separazione di fase8. In un altro studio, un kit commerciale che utilizza tempi e temperature minimi di digestione (5 min a RT) ha portato a una qualità dell'RNA superiore rispetto a un kit di isolamento dell'RNA che ha bisogno di tempi di digestione più lunghi a temperature più elevate (30 min a 42 gradi centigradi)7. Nel presente studio, è stato possibile estrarre RNA di alta qualità (RIN > 8) di concentrazione sufficiente da campioni di LCM utilizzando ossa di topo congelate fresche e un metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne. La lisi approfondita (1 min pipetting nel cappuccio) è essenziale per una buona resa dell'RNA. L'effetto del metodo di estrazione dell'RNA sulla resa e l'integrità dell'RNA ottenute dopo che LCM è stato studiato utilizzando diversi kit di isolamento dell'RNA secondo le istruzioni dei produttori. Tuttavia, gli RNA di migliore qualità e l'aumento della quantità sono stati ottenuti con il kit utilizzato nel protocollo ottimizzato. Nello studio pilota sono state tagliate regioni di tessuto microdicarcoto di 1 mm2 area finale, ed è stato possibile isolare circa 8,5 ng di RNA utilizzando sezioni ossee spesse 8.m (circa 800 pg/L). Tipicamente, gli osteoblasti, gli osteociti e le cellule di rivestimento osseo sono stati catturati in 2,3 sezioni per campione.
I confronti diretti tra i diversi strumenti LCM sono scarsi. In uno studio, sono stati testati due strumenti LCM comuni, che differiscono nel tipo di laser utilizzato (UV e infrarossi [IR], rispettivamente) e nel metodo di cattura del tessuto (tappo di isolamento adesivo contro tappi rivestiti rispettivamente con pellicola termoplastica trasparente). Si è scoperto che per le sezioni del cervello di topi congelati di nuova sezione, il sistema IR ha provocato una qualità dell'RNA modestamente superiore7. Nel presente studio sono stati confrontati due sistemi LCM che consentono la raccolta di campioni senza contatto. In un sistema, il campione microdissected cade per gravità nel tappo posto appena sotto29. Un altro sistema utilizza un impulso laser di sforatura, che catapulta il materiale nel tappo sporgente30. Per le ossa congelate fresche, sono stati ottenuti quantità di RNA e valori di RIN più elevati quando la gravità è stata utilizzata per la cattura dei tessuti. Inoltre, la tecnologia di catapultazione non è compatibile con il "sandwich" composto da pellicola adesiva, criosezione e membrana PET, a causa del peso aggiuntivo della membrana PET.
LCM richiede l'accesso fisico alla superficie del tessuto. Pertanto, il montaggio e la copertura in vetro del campione è inapplicabile, con la conseguenza di una visualizzazione compromessa della morfologia. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato un mezzo di copertura fluida31. In alternativa, è possibile aggiungere una luna di etanolo direttamente sulla sezione dei tessuti, consentendo una migliore analisi morfologica prima dell'evaporazione2. Nel presente studio, le sezioni ossee congelate sono state tagliate su una pellicola adesiva e, prima che il campione fosse permesso di asciugarsi completamente, veniva inserito tra la membrana PET e la pellicola. Questo metodo "sandwich" ha dato un buon contrasto morfologico e specifiche cellule ossee sono state chiaramente identificate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ute e Nikole Ginner per il loro eccellente aiuto tecnico, così come il personale Vetcore e la cura degli animali per il loro supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
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