Summary
Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.
Abstract
RNA verimi ve bütünlüğü RNA analizi için belirleyicidir. Ancak, tüm lazer yakalama mikrodisesi (LCM) prosedürü boyunca RNA bütünlüğünü korumak genellikle teknik olarak zordur. LCM çalışmaları düşük miktarda malzeme ile çalıştığı için, sınırlı RNA verimleri ile ilgili endişeler de önemlidir. Bu nedenle kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. Boyama protokolünün etkisi, kriyokesit kalınlığı, mikrodiskoplu doku miktarı, RNA ekstraksiyon kiti ve Mikrodissected kemik hücrelerinden elde edilen RNA verimi ve bütünlüğü üzerine kullanılan LCM sistemi değerlendirildi. Sekiz μm kalınlığında dondurulmuş kemik bölümleri yapışkan film kullanılarak yapılmış ve ticari bir LCM lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyanmış. Örnek polietilen tereftalat (PET) membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Yeterli verimde yüksek kaliteli RNA'lar elde etmek için numune toplama için yerçekimi ni kullanan bir LCM sistemi ve kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılmıştır. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü hem fizyolojik koşullarda hem de hastalık süreçlerinde herhangi bir sert doku hücrelerinde yerinde gen ekspresyonunda çalışmak için kullanılabilir.
Introduction
Dokular heterojen ve uzamsal olarak dağılmış hücre tiplerinden oluşur. Belirli bir dokudaki farklı hücre tipleri aynı sinyale farklı yanıt verebilir. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullarda farklı hücre tiplerinin rolünün değerlendirilmesi için belirli hücre popülasyonlarını izole edebilmek esastır. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) karmaşık dokulardan belirtilen hücreleri izole etmek ve kaldırmak için nispeten hızlı ve hassas bir yöntem sunar1. LCM sistemleri, enzimatik işleme veya kültür de büyüme gerek kalmadan histolojik doku bölümlerinden ilgi hücreleri ayırmak için bir lazer ışını nın gücünü kullanın. Bu, hücrelerin doğal doku habitatlarında olduğu ve farklı hücreler arasındaki mekansal ilişkiyi de içeren doku mimarisinin korundiğı anlamına gelir. Hem yakalanan hücrelerin hem de artık dokunun morfolojisi iyi korunmuştur ve aynı slayttan birkaç doku bileşeni sırayla örneklenebilir. İzole hücreler daha sonra RNA, DNA, protein veya metabolit içeriği nin sonraki analizi için kullanılabilir2,3.
Farklı hücre popülasyonlarında veya farklı tedavilerden sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için, sonraki analiz için yeterli kalite ve nicelikte mRNA'lar elde etmek gerekir4,5. DNA'nın aksine, RNA'lar fiksasyona karşı daha duyarlıdır ve amaç RNA'yı incelemek olduğunda dondurulmuş doku kullanımı önerilir. MRNA'lar her yerde bulunan ribonükleazlar (RNase) tarafından hızla bozulduğu için, numune işleme ve hazırlama sırasında sıkı RNase içermeyen koşullar ve numunelerin oda sıcaklığında depolanmasından kaçınmak gereklidir. Buna ek olarak, herhangi bir uzun sulu faz adımları olmadan hızlı teknikler RNA bozulmasını önlemek için çok önemlidir6. RNA verimi ve bütünlüğü de LCM işlemi ve Kullanılan LCM sistemi etkilenebilir7,8. Şu anda, farklı çalışma prensipleri ile dört LCM sistemleri mevcuttur2. Farklı RNA izolasyon kitleri RNA miktarı ve kalite7,8önemli farklılıklar ile test edilmiştir beri RNA ekstraksiyon yöntemi de önemli olabilir.
Herhangi bir doku hazırlama yöntemi iyi morfolojik kontrast elde etmek ve daha fazla analiz için RNA bütünlüğünü korumak arasında bir denge bulma gerektirir. Kemikten dondurulmuş kesitler hazırlamak için, bir yapıştırıcı film geliştirilmiş ve sürekligeliştirilmiş 9. Kemik bölümleri kesilir ve doğrudan yapışkan film üzerine boyanmaktadır. Bu yapışkan film boyama birçok türleri için geçerlidir, ve LCMkullanarakkemik kriyokesitlerden ilgi hücreleri izole etmek için istihdam edilebilir 9,10,11,12,13, 14. Cerrahi çıkarma, gömme, dondurma, kesme ve boyama dahil tüm adımlar bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. Daha da önemlisi, osteoblastlar, kemik astar hücreleri ve osteoklastlar gibi hücreler açıkça9,10,11,12,13,14olarak tanımlanabilir. Bu yöntem hızlı ve basit olma avantajına sahiptir. Kemik kriyokesitleri oluşturmak için alternatif bir yöntem bant transfer sistemi15kullanmaktır. Ancak, ikinci teknik daha zaman alıcıdır ve ek enstrümantasyon gerektirir, çünkü bölümler yapışkan banttan ultraviyole (UV) çapraz bağlama ile önceden kaplanmış membran slaytlara aktarılması gerekir. Bant aktarım sistemi başarıyla LCM16,17,18,19ile birleştiğinde olmasına rağmen, çapraz bağlı kaplama bir arka plan deseni oluşturabilirsiniz unutulmamalıdır hücre tipi tanımlama20ile müdahale edebilir.
Tipik olarak, mikrodiskoplu hücrelerden sadece küçük miktarda RNA çıkarılır ve RNA kalitesi ve miktarı genellikle mikro-kılcal elektroforez21ile değerlendirilir. Bir bilgisayar programı RNA bütünlük numarası (RIN) olarak adlandırılan RNA özleri kalite dizini atamak için kullanılır. 1.0'lık RIN değeri tamamen bozulmuş RNA'yı gösterirken, 10,0 değeri RNA'nın tamamen sağlam olduğunu gösterir22. Genellikle, 5 üzerinde indeksler RNA çalışmaları için yeterli olarak kabul edilir. RIN değeri 5.0−10.0 olan örneklerdeki gen ekspresyonu desenlerinin birbiriyle iyi ilişkili olduğubildirilmiştir 23. Bu yöntemin duyarlılığı yüksek olmasına rağmen, toplam RNA'nın 50 pg/μL'si kadar az tespit edilebildiği için, numunedeki RNA konsantrasyonu çok düşükse kalite değerlendirmesi elde etmek çok zor olabilir. Bu nedenle, RNA kalitesini değerlendirmek için, LCM'den sonra kalan doku bölümü genellikle24numaralı slayta tampon ıslatarak RNA'yı ayıklamak için kullanılır.
LCM farklı dondurulmuş dokularda yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, çıkarılan RNA'ların RIN değerleri nadiren rapor edilir. Ayrıca, fare kemiklerinde RNA'yı incelemek için en uygun yöntemi açıklığa kavuşturmak için karşılaştırmalı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, yüksek kaliteli RNA elde etmek için numune hazırlama, LCM protokolü ve RNA ekstraksiyonu optimize etmek için yetişkin fare uyluk kemiğinden dondurulmuş kesitler kullanılmıştır. Bu protokol özellikle numune toplama için yerçekimi kullanan LCM sistemi için optimize edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerden alınan kemik dokusu, hayvan bakımı için geçerli kurallara uygun olarak sıkı bir şekilde kullanılmış ve hayvanların acı çekmesini en aza indirmek için tüm çabalar gösterülmüştür.
1. Hayvanlar ve Donma Katıştırma
- Ev hayvanları sürekli oda sıcaklığı (RT; 24 °C) ve 12 saat açık/12 saat karanlık döngü ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlar.
NOT: Bu çalışmada kemik dokuları 3 aylık erkek yabani tip C57BL/6 farelerinden elde edildi. - Nekropside, genel anestezi altında abdominal vena kavadan eksanguinate fareler (ketamin/ksilazin, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
NOT: RNA bozulmasını önlemek için, RNase içermeyen aletler ve malzemeler kullanın, eldiven giyin ve tüm deney boyunca NUMUNELerin RT'de depolanmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. - Hızla tüm uyluk çıkarın, neşter ve kağıt havlu kullanarak çevreleyen yumuşak dokuların onları temizleyin. Katıştırma kalıbına optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği dökün ve femuru gömme kalıbının dibine koyun. Numuneleri sıvı nitrojenle dondurun. OCT, RT'de saydam ve dondurulduğunda beyazdır.
- Tamamen dondurulduktan sonra, numuneleri folyoya sarın ve kuru buzda -80 °C'ye aktarın. Numuneleri ilave işleme ye kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
2. Bölüm Hazırlığı
- Kriyostattaki sıcaklığı -19 °C'ye, blok tutucunun sıcaklığını ise -17 °C'ye ayarlayın. % 70 etanol kullanarak kriyostat iç silin. Sert dokular, cam slaytlar ve dondurucu içine bir montaj aracı için tek kullanımlık bıçak yerleştirin. Kesit süresince kriyostat içinde tutun.
- Kuru buz daki donmuş doku bloğunu kriyostat'a aktarın ve en az 10 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
NOT: Kriyoseksiyon için -80 °C'den -19 °C'ye kadar bir bloğun tekrar tekrar erimesinden ve sık sık bisiklete binmekten kaçının. - OCT bloğunu kalıbın dışına itmek için gömme kalıbının altına basın. Blok sahibine, bloğu ona yapıştıracak kadar OCT ortamı uygulayın. OCT ortamı tamamen donana kadar bekleyin.
- Blok tutucuyu nesne tutucuya yerleştirin ve yerine sıkın. Bıçağın konumunu ayarlayın ve numuneyi kaplayan OCT'yi kaldırmak için 15 μm kesme artışlarını kullanarak bloğu kırpın. Örnek daha erken kesilmişse ve yüzeye maruz kalmışsa, ilk 2−3 doku kesitini bloktan atın.
- Kriyostat'ı 8 μm kesit oluşturacak şekilde ayarlayın ve atılacak 2−3 kriyokesiti kesin (ilk birkaçı genellikle 8 μm'den daha kalın olacaktır). Yapışkan filmi bloğun üzerine yerleştirin ve filmi blota yapıştırmak için uygun bir alet kullanın. Film tarafından bölüm tutarak yavaş ve sabit bir hızda kesme olun.
- Örneğin erimesini önlemek için filmi (örnek yukarı bakacak şekilde) hemen önceden soğutulmuş bir cam kaydırağa (kriyostat içindeki kriyobar üzerine) yerleştirin. Daha kolay boyama için filmi cam slayta sabitlemek için bant kullanın. Boyama protokolü ile hemen devam edin.
3. Hızlı Boyama Protokolü
- 50 mL tüplerde aşağıdaki çözeltilerden 40 mL hazırlayın ve buza koyun: %95 etanol, RNase içermeyen su, %100 etanol, %100 etanol ve %100 ksilen. Buz (boyama hariç) tüm adımları gerçekleştirin. Her deneysel gün için, rnase içermeyen su ile taze tüm sulu reaktifler hazırlayın.
DİkKAT: Ksilen tarafından zehirlenme önlemek için kaputta çalışın. - % 95 etanol 30 s için kuluçka bölümleri, daha sonra cm ve downstream uygulamaları ile müdahale edebilir tamamen EKIM kaldırmak için RNase içermeyen su 30 s daldırma.
- 50 μL'lik ticari LCM dondurulmuş kesit lekesi(Malzeme Tablosu)bölümün üzerine dağıtın, RT'de 10 s'lik kuluçkaya yatırın ve slaytın kenarını emici mendil kağıdına yerleştirerek süzün. % 100 etanol 30 s durulama tarafından aşırı leke kaldırın.
- Kemik kesitlerini 30 s için %100 etanol içeren ikinci bir tüpe batırın ve 30 s için %100 ksilene aktarın.
- Destek olarak kuru cam kaydırağa yapıştırıcı film (örnek yukarı bakacak şekilde) koyun. Filmin etkilenmemesi ve mümkün olduğunca düz yerleştirilmemesin. Numunenin tamamen kurumasını izin vermeyin.
- Üzerine pet membran çerçeve slayt yerleştirin. Kısa bir süre filme takmak için zara eldivenli bir parmak basın. Örnek daha sonra membran ve yapışkan film arasında sıkışmış. Yapışkan film katlanmış veya kırışık olmamalı ve film ve membran arasında hiçbir hava kabarcıkları olmalıdır. LCM ile hemen devam edin.
4. Lazer Yakalama Mikrodisseksi
- Yüzey dekontaminantı(Malzeme Tablosu)kullanarak sahne ve kapak tutucuyu RNase'den temizleyin. Slaytı ve kapakları sırasıyla slayt tutucuya ve kapak tutucuya yükleyin.
- Odağı ayarlayın ve 1,25x hedefiyle slayta genel bakış elde edin. 40x hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın. Slayta genel bakışı kullanarak ilgi alanını seçin. Lazer parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: diyafram, 7; lazer gücü, 60; hız, 5; darbe frekansı, 201; numune dengesi, 20. Bu parametreleri her amaç için optimize edin.
- Lazer örneği kesmezse, lazer gücünü artırın. Alternatif olarak, lazer birden fazla kez uygulanabilir. Buna ek olarak, hedefi eksik kesik noktaları olup olup yok olup yok olup yok olup, Taşı ve kesme seçeneğini kullanarak bu noktalardaki çizgiyi yeniden çizin. Sonraki slaytların diseksiyonu için lazer ayarlarını kaydedin.
- Morfolojik kriterlere göre distal femoral cancellous veya kortikal kemik osteoblastlar, osteositler ve kemik astar hücreleri seçin. UV lazer tarafından hasarı en aza indirmek için hedef hücrelerden daha uzak lazer yolu için bir çizgi çizin. Boyama dan sonra 1 saatten daha kısa sürede tüm mikrodisbölümleri gerçekleştirin.
- Her hücre türünü 0,5 mL'lik ayrı bir tüp üniçinde toplayın.
NOT: Sıvı geri kazanımı yerine kuru yakalama RNA bozulmasını önleyebilir. Buna ek olarak, mikrocentrifuge tüp kapağı nda bulunan tampon çok küçük hacimli ya buharlaşır veya kristalize olabilir (bileşimine bağlı olarak) LCM sırasında. - Mümkün olan durumlarda LCM'den sonra toplama tüpü kapağını gözlemleyerek yakalama başarısını onaylayın. RNA çıkarma ile hemen devam edin.
5. RNA Çıkarma
- Toplama tüpünün kapağına β-mercaptoetanol içeren lysis tamponunun 50 μL'sini verin ve 1 dk. kapakta yukarı ve aşağı boru lar atarak numuneyi lyse. Birkaç kapak biraraya gelecekse, toplam arabellek hacminin RNA ekstraksiyon kiti(Tablo Malzemeler)için tavsiye edildiği gibi olduğuna dikkat edin.
DİkKAT: β-mercaptoetanol, RNA'yı bozulmadan korumak için eklenmelidir, ancak toksik olarak kabul edilir. Koruyucu giysiler ve eldiven giyin ve kaputta çalışın. - Buna ek olarak, her slayt için β-mercaptoetanol içeren lysis tampon 350 μL ile etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüp hazırlayın. RNA ayıklamak için LCM'den sonra kalan bölümleri kullanın. Filmi membrandan dikkatlice ayırın ve lysis tamponunu birkaç kez yavaşça keserek numuneyi inceleyerek inceleyin.
NOT: Toplam lysis tamponu miktarı 350 μL olmalıdır. Slayttan akacağı için hepsini aynı anda sindirim için kullanmayın. -
Lysate örneklerini kuru buzüzerine koyun ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - RT.LCM tarafından hasat edilen hücrelerden toplama tüplerinden 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneyi hasat etmek için birden fazla kapak kullanılmışsa, havuz birkaç lysates.
- Üreticinin talimatlarına göre RNA ayıklayın. Genomik DNA'yı çıkarmak için kolonları DNase I ile tedavi edin. 14 μL RNa içermeyen su ile elute RNA, 12 μL eluat ile sonuçlanır. RNA'yı -80 °C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
6. RNA Verim ve Bütünlüğünün Ölçülmesi
- Islince buzda RNA'yı eritin. Mikro kapiller elektroforez kullanarak izole RNA'nın verimini ve bütünlüğünü ölçün. Üreticinin talimatlarına göre toplam RNA'yı (numune başına 1°L) bir yongaya(Malzeme Tablosu)yükleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare uyluk kemiğinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için LCM protokolü geliştirilmiştir. Optimize edilmiş protokolde, 8 μm kalınlığında dondurulmuş kemik kesitleri bir yapışkan film üzerinde kesildi ve ticari bir LCM dondurulmuş kesit lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyandı. Örnek PET membran ve yapışkan film arasında sıkışmış oldu. Fare kemik hücreleri örnek toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak mikrodiskopedildi. Yeterli verimyüksek kaliteli RNA elde etmek için kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılmıştır. İzole RNA'nın verimi ve bütünlüğü mikro-kılcal elektroforez kullanılarak ölçüldü (Şekil 1).
Farklı lizis protokolleri kullanılarak elde edilen RNA kalitesi ve miktarı arasındaki fark temsili jel ve elektroferogramlarda görülebilir. Numune 1 dk boyunca kapakta yukarı ve aşağı borular ile incelendiğinde, 1 mm2 mikrodissected kemik dokusundan (8 μm kalınlığında bölüm) yaklaşık 8,5 ng RNA izole etmek mümkün oldu. RIN değeri 8.60 idi (Şekil 2).
Alternatif olarak, LCM de-odaklı lazer darbe kullanan bir LCM sistemi kullanılarak yapıldı, hangi sarkan yapışkan kap içine malzeme mancınık. RNA kalitesi ve miktarı temsili jel ve elektrofeogramlarda tahmin edilebilir. Taze donmuş kemikler için 1 mm2 mikrodissected kemik dokusundan (8 μm kalınlığında kesit) yaklaşık 1,6 ng RNA izole etmek mümkündür. RIN değeri 1(Şekil 3)idi.
Şekil 1: Taze donmuş kemikler için lazer yakalama mikrodiseksiyon protokolünün akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RNA örneklerinin temsili jel (üst) ve elektropherogramları (alt) LCM, numune toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. RNA örnekleri LCM tarafından hasat edilen dokudan (örnek 1, 3, 5, 7 ve 9) ve ilgili kontrol bölümlerinden (sırasıyla 2, 4, 6, 8 ve 10 örnekleri) alındı. Bir RNA örneği lekeli ancak LCM için kullanılmayan kontrol bölümünden alındı (örnek 11). Toplam 1 mm2 alan mikrodissected ve farklı lysis protokolleri kullanıldı. Örnek 1: Tüpe β-merkaptoetanol içeren lysis tamponunun 350 μL'si eklendi. Kapak dikkatlice kapatıldı ve tüp ters çevrilmiş. LCM tarafından hasat edilen hücreler 1 dk girdap, 10 dk ve girdap 1 dk. Örnek 3: 350 μL β-mercaptoethanol içeren lysis tamponunun toplama tüpüne ilave edilerek, kapağı dikkatlice kapatılarak tüp ters çevrilerek lysed edildi. LCM tarafından hasat edilen hücreler, toplama tüplerinin 30 dakika boyunca ters çevrilerek rt. Örnek 5: Β-mercaptoetanol içeren lysis tamponunun 50 μL'si toplama tüpünün kapağına eklenmiş ve numune 1 dk boyunca kapakta aşağı yukarı borular ile ıslatılarak incelenmiştir. Lysat santrifüj edildi ve β-mercaptoetanol içeren lysis tamponunun 300 μL'si tüpe eklendi. Örnek 7: Tüpe β-merektoetanol içeren lysis tamponunun 350 μL'si eklendi. Kapak dikkatlice kapatıldı ve tüp ters çevrilmiş. LCM tarafından hasat edilen hücreler girdap ve ters birkaç kez lysed edildi. Örnek 9: Β-merektoetanol içeren lysis tamponunun 50 μL'si toplama tüpünün kapağına eklenmiş ve numune kapaktaki RT'de 5 dakika kuluçka yada kin ile incelenmiştir. Lysat santrifüj edildi ve tüpe β-mercaptoetanol içeren 300 μL likli lysis tamponu eklendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA örneklerinin temsili jel (üst) ve elektropherogramları (alt) LCM, malzemeyi bölümün üzerinde konumlandırılmış yapıştırıcı kapağın içine mancınık yapan de-odaklı lazer darbesi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. RNA örnekleri LCM tarafından hasat edilen dokudan (örnek 5 ve 6) ve ilgili kontrol bölümünden (örnek 7) alındı. Bir RNA örneği lekeli ancak LCM için kullanılmayan kontrol bölümünden alındı (örnek 8). Toplam 0,5 mm2 veya 1 mm2'lik alan mikrodiskesildi (örnekler sırasıyla 5 ve 6). Toplama tüpüne β-mercaptoetanol içeren 350 μL likit tampon eklenmiş, kapak dikkatlice kapatılmıştır ve tüp ters çevrilmiş. LCM tarafından hasat edilen hücreler, rt'de 30 dakika boyunca toplama tüplerinin baş aşağı kuluçkaya yatırılmasıyla lysed edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hem RNA kalitesi hem de miktarı doku manipülasyonu, LCM prosesi ve RNA ekstraksiyonu gibi numune hazırlamanın tüm aşamalarında olumsuz etkilenebilir. Bu nedenle, sonraki gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir.
LCM için çoğu laboratuvar 7−8 μm kalınlığında2. Kalın kesitler daha fazla malzemenin hasat edilmesine olanak sağlayacaktır. Ancak, çok kalın ise, bu mikroskobik çözünürlüğü azaltabilir ve lazer ile kesmek mümkün olmayabilir. Bu optimal doku kalınlığı LCM sistemi (ve lazer ve slayt tipi) kullanılan yanı sıra soru8,25doku bağlıdır muhtemeldir. Bu çalışmada farklı kalınlıklarda (4, 8 veya 12 μm) kriyokesitler test edilmiştir; 8 μm kalınlığındaki kesitler LCM için ideal bulunurken, 12 μm kemik kesitinin lazerle kesilmesi daha zor, 4 m'lik kesitler ise daha düşük miktarda RNA vermiştir.
Endojen RNase aktivitesi farklı dokular arasında değişir. Bu nedenle, çok düşük RNase aktivitesi olan dokular için geliştirilen boyama protokolleri diğer doku tipleri için uygun olmayabilir. Nükleer hızlı kırmızı26 ve cresyl menekşe24 RNA bütünlüğünü koruma açısından en iyi olduğu ileri sürüldü. Buna ek olarak, alkol bazlı yöntemler RNA bütünlüğünü korumak için sulu lekeler üstündü. Ancak, onlar geri dönüşü olmayan boyama yoğunluğu27muzdarip . Zaman dikkate alınması gereken önemli bir parametredir. Bir yandan, arama ve bölümünde ilgi hücreleri tanımlamak ve LCM gerçekleştirmek için gerekli zaman genellikle nispeten uzundur. Diğer taraftan, LCM için kullanılabilir zaman sınırlıdır, çünkü, bazı durumlarda, 20% RNA bozulması 30 dk28sonra ulaşılmıştır. Bu nedenle, mikrodiskes28sırasında plazmaneklerin argon akısı ile maruz kalma veya tamponlu alkol bazlı teremor mor boyama kullanımı ve laboratuvarda nem seviyesini düşük tutmak gibi RNA'yı stabilize etmek için farklı yöntemler uygulanmıştır. 27- Buna ek olarak, mikrodisese miparabasmı için maksimum 15 dk önerildi2. Bu çalışmada, dondurulmuş kemik bölümleri ticari bir LCM lekesi için hızlı bir protokol kullanılarak boyandı ve RT'de 1 saat sonra bile RIN değerleri 8.3'ten 9.1'e düşürüldü. Bu nedenle tüm mikrodiskesler boyama dan sonra 1 saatten daha kısa sürede gerçekleştirildi. Buna ek olarak, boyama için farklı protokoller (sulu reaktiflerde daha kısa kuluçkalar veya ksilen adım olmadan) test edildi. RIN değerlerinde önemli bir iyileşme sağlanamadı.
LCM çalışmalarında iki farklı Tip RNA çıkarma yöntemi karşılaştırılmıştır: faz ayırma yöntemi ile sütun tabanlı bir yöntem. Kolonlar dayalı RNA çıkarma yöntemifaz ayırma yöntemi8ile karşılaştırıldığında daha iyi RNA kalitesi ve daha yüksek verim yol açmıştır bulundu. Başka bir çalışmada, minimum sindirim süresi ve sıcaklık (RT 5 dakika) kullanan ticari bir kit, daha yüksek sıcaklıkta (30 dk 42 °C)7daha uzun sindirim süresi gerektiren bir RNA izolasyon kiti ile karşılaştırıldığında üstün RNA kalitesi elde etti. Bu çalışmada, taze dondurulmuş fare kemikleri ve kolon tabanlı RNA çıkarma yöntemi kullanılarak LCM örneklerinden yeterli konsantrasyonda yüksek kaliteli RNA (RIN > 8) elde etmek mümkün oldu. İyi RNA verimi için iyice sıvı (kapakta 1 dk borulama) gereklidir. RNA ekstraksiyon yönteminin LCM'den sonra elde edilen RNA verimi ve bütünlüğü üzerindeki etkisi üreticilerin talimatlarına göre birkaç farklı RNA izolasyon kitleri kullanılarak araştırılmıştır. Ancak, optimize edilen protokolde kullanılan kit ile daha kaliteli RNA'lar ve artan miktar elde edildi. Pilot çalışmada, 1 mm2 son alanın mikrodissected doku bölgeleri kesildi ve 8 μm kalınlığında kemik kesitleri (yaklaşık 800 pg/μL) kullanılarak yaklaşık 8.5 ng RNA'nın izole edilmesi mümkün oldu. Tipik olarak osteoblastlar, osteositler ve kemik astar hücreleri örnek başına 2−3 kesitte ele geçirildi.
Farklı LCM aletleri arasında doğrudan karşılaştırmalar azdır. Bir çalışmada, kullanılan lazer in türü (sırasıyla UV ve kızılötesi [IR]) ve doku yakalama yöntemi (sırasıyla şeffaf termoplastik film ile kaplanmış yapıştırıcı izolasyon kapağı vs kapaklar) farklı iki ortak LCM aletleri test edilmiştir. Bu ince kesitli taze dondurulmuş fare beyin bölümleri için, IR sistemi mütevazı yüksek RNA kalitesi7sonuçlandı bulundu . Bu çalışmada, temassız numune toplamaya olanak sağlayan iki LCM sistemi karşılaştırıldı. Bir sistemde, mikrodissected örnek29hemen altında yerleştirilen kap içine yerçekimi tarafından düşer. Başka bir sistem, sarkan kap içine malzeme mancınık bir de-odaklı lazer darbe kullanır30. Taze dondurulmuş kemikler için, doku yakalama için yerçekimi kullanıldığında daha yüksek RNA miktarları ve RIN değerleri elde edildi. Buna ek olarak, mancınık teknolojisi pet membran ek ağırlığı nedeniyle, yapışkan film, kriyo-kesit ve PET membran oluşan "sandviç" ile uyumlu değildir.
LCM doku yüzeyine fiziksel erişim gerektirir. Bu nedenle, morfolojinin görme bozukluğu sonucu numunenin montaj ve cam kaplaması uygulanamaz. Bu sınırlamayı aşmak için, bir sıvı kapak ortamı geliştirilmiştir31. Alternatif olarak, 10−15 μL etanol doğrudan doku bölümüne eklenebilir, buharlaşma dan önce daha iyi morfolojik analiz sağlayan2. Bu çalışmada, dondurulmuş kemik bölümleri bir yapıştırıcı film üzerinde kesilmiş ve örnek tamamen kurumasına izin verilmeden önce, PET membran ve film arasında sıkışmış oldu. Bu "sandviç" yöntemi iyi morfolojik kontrast verdi ve belirli kemik hücreleri açıkça tespit edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar ute Zeitz ve Nikole Ginner onların mükemmel teknik yardım yanı sıra destek için Vetcore ve hayvan bakım personeli için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
