Summary
Ce protocole décrit une méthode pour suivre les trajectoires individuelles de vieillissement du cerveau à travers un programme de don de cerveau et une caractérisation appropriée des cerveaux. Les donneurs de cerveau sont impliqués dans une étude longitudinale à long terme comprenant des évaluations multidimensionnelles en série. Le protocole contient une description détaillée du traitement du cerveau et une méthodologie diagnostique précise.
Abstract
Dans une population qui vieillit constamment, on s’attend à ce que la prévalence des troubles neurodégénératifs augmente. Comprendre les mécanismes de la maladie est la clé pour trouver des mesures préventives et curatives. La façon la plus efficace d’y parvenir est par l’examen direct des tissus cérébraux malades et sains. Les auteurs présentent un protocole pour obtenir, traiter, caractériser et stocker les tissus cérébraux de bonne qualité donnés par des personnes inscrites dans un programme de don de cerveaux antemortem. Le programme de dons comprend une approche empathique en personne à l’égard des personnes, une collection d’information clinique, biologique, sociale et de style de vie complémentaire et des évaluations multidimensionnelles en série au fil du temps pour suivre les trajectoires individuelles du vieillissement normal et du déclin cognitif. Étant donné que de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre banque de cerveaux offre un protocole unique pour trancher des spécimens frais. Les sections cérébrales des deux hémisphères sont alternativement gelées (à -80 °C) ou fixées en formaline; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Avec cette approche, une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés peut être obtenue, et des études d’omics peuvent être effectuées sur des tissus histologiquement bien définis des deux hémisphères offrant ainsi une évaluation plus complète des mécanismes de la maladie neurodégénérative. Le diagnostic correct et défini de ces maladies ne peut être réalisé qu’en combinant le syndrome clinique avec l’évaluation neuropathologique, qui ajoute souvent des indices étiologiques importants nécessaires pour interpréter la pathogénie. Cette méthode peut prendre du temps, être coûteuse et limitée car elle ne couvre qu’une zone géographique limitée. Indépendamment de ses limites, le degré élevé de caractérisation qu’il fournit peut être gratifiant. Notre but ultime est d’établir la première Banque italienne du cerveau, tout en soulignant l’importance des études épidémiologiques vérifiées neuropathologiquement.
Introduction
Selon l’OMS, environ 50 millions de personnes souffrent actuellement de démence, un chiffre qui devrait tripler d’ici 2050. La maladie d’Alzheimer est la principale cause de démence, suivie par la maladie cérébrovasculaire et d’autres troubles neurodégénératifs liés à l’âge. En 2017, l’OMS a mis au point l’Observatoire mondial de la démence pour sensibiliser la population à la démence et encourager un plan d’action mondial à son encontre1. Chaque individu a sa propre trajectoire de vieillissement cérébral, donc la recherche de la guérison peut être difficile en raison de la complexité de la pathogénie des maladies neurodégénératives. Peut-être, chaque personne possède sa propre pathogénie écrite dans le tissu cérébral nécessitant une approche personnalisée. Ainsi, l’étude des tissus cérébraux sera la clé pour comprendre les mécanismes de la neurodégénérescence.
En repensant à l’histoire des neurosciences, nous nous rendons compte que les découvertes les plus impressionnantes et révolutionnaires n’auraient jamais pu se produire sans l’examen direct du cerveau humain. Au fil du temps, la source de tissus cérébraux à étudier est passée de dissections grossières, de « rencontres fortuites » aléatoires et, dans certains cas, de commerce illégal, à des collectes de cerveaux organisées et à des banques stratégiques modernes de cerveaux. La prise en compte de nombreux aspects éthiques est l’un des principaux facteurs qui différencient les banques cérébrales modernes des collections cérébrales du passé. Les premières vraies banques de cerveau modernes (BB) ont été instituées dans la seconde moitié du20ème siècle. Nicholas Corsellis et Wallace Tourtelotte peuvent être considérés comme des pionniers de la banque moderne du cerveau. Au Royaume-Uni, Corsellis a rassemblé une collection contenant plus de 1000 cerveaux bien documentés affectés par divers troubles mentaux et neurologiques2. En outre, Corsellis a contribué à révéler la nécessité de préserver les tissus cérébraux frais dans la glace pour le bien des tests biochimiques3. Pendant ce temps aux États-Unis, Wallace Tourtelotte a introduit des programmes de don de cerveau antemortem pour faciliter la sollicitation de donneurs potentiels de cerveau et de s’assurer que les cerveaux recueillis sont accompagnés d’une histoire médicale et neurologique complète4,5. Pour un aperçu historique des collections de cerveaux et des BB modernes, voir Carlos et coll. 6.
Alors, pourquoi avons-nous encore besoin de cerveaux humains ? Les maladies du cerveau ne peuvent recevoir un diagnostic précis qu’après un examen neuropathologique. La neuropathologie conteste le diagnostic clinique, et est la clé d’une interprétation correcte des symptômes cliniques et de la découverte des bases histologiques de nouvelles variantes syndromiques. En effet, le diagnostic peut être redéfini en fonction de l’image pathologique. Néanmoins, le taux d’autopsie a diminué au cours des dernières décennies en raison du développement récent de techniques de neuroimagerie innovantes. Grâce à l’imagerie cérébrale, les altérations morphologiques, fonctionnelles et métaboliques du cerveau, ainsi que l’étendue de l’erreur de pliage des protéines, peuvent être évaluées in vivo. Cependant, la neuroimagerie in vivo et d’autres études de biomarqueurs ne peuvent donner qu’une « estimation » de l’image pathologique, car elles sont incapables de détecter des changements cellulaires et moléculaires subtils. Les progrès de l’imagerie moléculaire et la découverte de nouveaux biomarqueurs, molécules cibles et traceurs7 (ex. amyloïdes, TAU, traceurs microgliaux) rendent le cerveau humain encore plus indispensable à l’interprétation des données obtenues à partir d’évaluations cliniques et de tests de biomarqueurs. En outre, les technologies omiques (génomique, épigénomique, transcriptomique, métabolomique, protéomique, lipidomique, etc.), réalisée sur des tissus cérébraux frais et congelés, a ouvert de nouvelles possibilités de compréhension des mécanismes de la maladie et de découverte des gènes de risque, de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques, et des cibles médicamenteuses potentielles8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
À ces fins, les BB modernes archivent des tissus cérébraux de haute qualité bien caractérisés qui les rendent disponibles pour la communauté scientifique3,24. Les cerveaux fournis par les BB devraient être accompagnés d’une histoire clinique complète. L’activité d’un BB comprend les éléments suivants : (1) Reconnaissance et recrutement de personnes malades et en bonne santé dans les programmes de don de cerveau; la condition idéale serait d’obtenir un suivi multidisciplinaire des donneurs tout au long de la vie afin d’obtenir un historique clinique, de style de vie et social complet, ainsi que des profils de biomarqueurs; en effet, la réserve cognitive et la structure du cerveau dépendent du mode de vie et des facteurs socio-éducatifs25,26, de sorte que ces informations enrichit les données totales à portée de main. (2) Acquisition du cerveau (composé de cerveaux, de cervelet et de troncs cérébraux) et des tissus connexes (p. ex., moelle épinière, nerfs crâniens et ganglions, etc.) à la suite de la disparition du donneur, tout en respectant des règlements juridiques et éthiques normalisés. (3) Traitement approprié (dissection, fixation, congélation) du cerveau, tel que défini dans un protocole opératoire normalisé, pour obtenir des tissus de haute qualité et pour permettre une utilisation future dans la recherche multidisciplinaire. (4) Caractérisation neuropathologique détaillée fournissant un diagnostic définitif défini. (5) Stockage et distribution de matériel tissulaire à la communauté de recherche27,28.
Tous les BB stockent les tissus incorporés congelés et la formaline-fixe-paraffine. Chaque BB a son propre protocole. À l’exception d’études particulières, comme le protocole de coupe bihémisphérique de l’Institut de recherche biomédicale (New Jersey)29 et l’étude de la pathologie cérébrovasculaire30du Deramecourt , les plus grands BB au monde ont simplement coupé le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral le long de la ligne médiane (plan sagittal). Une moitié est disséquée fraîche puis congelée pour des études biochimiques, tandis que l’autre est fixée en formaline pour l’évaluation histopathologique. Ainsi, les analyses biochimiques et histopathologiques sont menées séparément sur chaque hémisphère. La décision quant à quel côté est fixé ou gelé (lateralité), dépend de la banque singulière31,32,33,34,35. Comme de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre BB offre un protocole unique pour trancher les cerveaux frais : les sections adjacentes du tronc cérébral et chaque hémisphère sont alternativement fixes et congelées ; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Grâce à cette méthode, l’utilisation du tissu cérébral est optimisée, et une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés peut être réalisée avec la possibilité d’obtenir et de comparer des informations histologiques et biochimiques de toutes les zones des deux hémisphères.
Le cadre de notre projet de banque de cerveaux est la ville d’Abbiategrasso. Abbiategrasso est une petite ville située à environ 22 km au sud-ouest de la ville de Milan, dans le nord de l’Italie. Sa population est d’environ 32 600 habitants. Il abrite la Fondation Golgi-Cenci (GC). Gc Foundation fait partie d’un grand hôpital gériatrique de réadaptation (ASP Golgi-Redaelli), et est un institut axé sur la recherche sur le vieillissement et les soins aux personnes âgées. En particulier, il se concentre sur l’étude du vieillissement mental, les facteurs sociaux et comportementaux qui l’influencent, et la biologie et la pathologie sous-jacentes aux troubles neurocognitifs dépendants de l’âge (MNT). En 2009, la Fondation GC a lancé une nouvelle étude longitudinale auprès de 1 321 participants (sur 1644 sujets admissibles : taux de réponse initial de 80,3 %) né entre 1935 et 1939 (âgés de 70 à 75 ans), d’origine caucasienne, vivant dans la même petite zone géographique. L’étude a été appelée InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; en anglais: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) et est actuellement en cours. InveCe.Ab est prévu d’obtenir une cohorte avec une homogénéité maximale et la moindre variabilité afin d’évaluer l’incidence, la prévalence et l’histoire naturelle de la démence, ainsi que son risque possible ou des facteurs de protection, y compris les variables comportementales, psychosociales, cliniques et biologiques36. Les caractéristiques de la cohorte sont indiquées à la figure 1 et au tableau 1. Les données épidémiologiques sont compatibles avec la tendance de démence dans la population européenne37,,38 et les participants d’InveCe.Ab ont des caractéristiques génétiques et environnementales homogènes, représentant un bon modèle pour étudier la trajectoire du vieillissement normal aux désordres neurocognitifs. En effet, les populations homogènes ont besoin de moins de sujets pour atteindre une puissance statistique adéquate. La méthodologie InveCe.Ab a déjà été rapportée ailleurs36, mais il est important de souligner son approche multidimensionnelle par des contrôles périodiques (tous les 2 à 3 ans) en utilisant le même ensemble d’évaluations, y compris: l’échantillonnage sanguin (panneau métabolique, homocystéine et vitamines, extraction d’ADN au profil Apolipoprotéine E (APOE) et autres polymorphismes génétiques liés à la cognition et au vieillissement), mesures anthropométriques (poids, taille et taille), Test de marche (double test de tâche), entretien pour évaluer le mode de vie (observance du régime méditerranéen, niveaux d’activité physique et engagement cognitif) et les facteurs sociaux (implication sociale, solitude), une évaluation neuropsychologique et un examen général clinique. Comparer ces données longitudinales avec les données neuropathologiques postmortem serait crucial pour la recherche. Par conséquent, notre équipe et en particulier le Dr Michela Mangieri ont conçu l’approche neuropathologique mentionnée ci-dessus. Depuis 2014 et lors du second suivi, les participants d’InveCe.Ab ont été invités à donner leur cerveau, ce qui a entraîné la naissance de l’Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Les principaux donateurs d’ABB sont les participants d’InveCe.Ab, mais ABB est maintenant ouvert à d’autres donateurs bénévoles. Il s’agit de patients de l’ASP Golgi-Redaelli, qui abrite plusieurs patients atteints de différentes maladies neurologiques ou de volontaires adultes qui apprennent le projet ABB et appartiennent à la même zone géographique (Abbiategrasso et environs). Tous les donateurs subissent le même protocole d’évaluation.
Les auteurs proposent une méthode pour suivre les trajectoires individuelles du vieillissement normal et la progression possible vers les MNT, et pour gérer, traiter et caractériser avec précision les cerveaux acquis auprès de ces donneurs suivis longitudinalement. En outre, notre objectif est de rencontrer et d’engager les individus dans des évaluations neurologiques périodiques, des séminaires et des activités éducatives concernant le bien-être du cerveau et de les sensibiliser au don du cerveau à des fins de recherche.
Protocol
Conformément au Comité d’éthique de la recherche humaine de notre institution et au Code de conduite BNE, l’ABB exerce ses activités conformément aux normes éthiques39,40. La procédure de récolte du cerveau a été soumise et approuvée par le Comité d’éthique de l’Université de Pavie dans le cadre de l’étude InveCe.Ab36. Les procédures d’étude étaient conformes aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et aux modifications suivantes. Le formulaire de consentement est complet et facilement compréhensible. Se joindre au programme de dons est une décision personnelle, et une sensibilisation complète est nécessaire. Dans le cas où une personne n’est pas jugée compétente pour signer le formulaire de consentement, l’autorisation du tuteur légal ou du plus proche parent (NOK) est justifiée. Le tableau 2 fait état de critères d’inclusion et d’exclusion pour le don de cerveaux. La recherche a été réalisée sous la supervision de la Federazione Alzheimer Italia.
1. Recrutement au programme de don de cerveau
- Convoquer les sujets qui avaient manifesté leur intérêt pour le don de cerveau et leur NOK et/ou tuteur légal pour présenter le projet (la portée du programme de dons; le processus d’ablation du cerveau, de conservation, d’utilisation et de distribution), le droit de se retirer du programme à tout moment, la protection de l’anonymat et les stratégies de suivi. Discutez de la possibilité d’autres enquêtes sur les biomarqueurs et des tests génétiques. Notez les souhaits du donateur potentiel ou de son NOK d’être informé des résultats.
- Expliquez tous les aspects économiques, y compris le manque de gain financier pour la Fondation et le donateur (les cerveaux sont donnés et distribués altruistement). Informez-les qu’ABB couvre les frais de transport corporel, tandis que la famille couvre ceux des funérailles, de l’inhumation ou de la crémation.
- En cas d’acceptation, obtenir la signature du consentement à participer au programme de dons. Donnez au donneur un code numérique individuel pour garantir l’anonymat. Notez le nombre d’identification des participants à l’étude longitudinale et fournissez un autre code pour que la banque de cerveaux sépare facilement les deux sous-groupes de donneurs (participants ou non participants à l’étude longitudinale; voir le tableau 3).
- Donnez au donneur une carte d’identité qui déclare son statut de donneur et affiche le numéro de téléphone (disponible 24/7) pour informer la Banque du cerveau de son décès.
2. Évaluation des donateurs et suivis en série
REMARQUE : Il est possible de donner son consentement uniquement pour certains, et non pour tous, des examens mentionnés ci-dessous. Toutes les évaluations cliniques sont effectuées par la même équipe, y compris un neurologue, un gériatre avec une expertise en neurologie et 3 psychologues. Si de nouveaux symptômes se développent ou si le déclin cognitif progresse, l’intervalle de temps entre les suivis peut être raccourci.
- Comme dans le cas de l’étude InveCe.Ab, obtenez un questionnaire style de vie social, y compris le degré d’autonomie (ADL, IADL), les habitudes personnelles, les facteurs sociaux et de style de vie qui peuvent affecter les fonctions mentales. Recueillir des antécédents familiaux, médicaux et neurologiques avec des informations concernant les maladies génétiques, infectieuses, toxiques, métaboliques, auto-immunes, cardiovasculaires, traumatiques, dégénératives, néoplastiques et neurologiques. Recueillir les examens cliniques précédents et la liste des traitements pharmacologiques.
- Effectuer une évaluation neuro-motrice étendue comprenant des essais pour la fonction crânienne des nerfs, fundus oculi, champ visuel, force et tonalité de muscle, sensibilités, réflexes de tendon, réflexes exteroceptifs et primitifs, signes méningés, posture, démarche, mouvements, coordination, fonctions sphincériques, et toute présence de signes focaux ou babinski. Évaluez le langage, l’état mental et tout changement de comportement.
- Effectuer une évaluation neuro-cognitive étendue comprenant la cognition globale et une évaluation neuropsychologique complète de domaines cognitifs spécifiques : mémoire verbale et visuelle, attention, vitesse psychomotrice, langage, mémoire sémantique, fonctions exécutives, et capacités visuospatiales (tableau 4 pour plus de détails). Considérez la présence de dépression (échelle CES-D).
- Obtenir un échantillon de sang qui est utilisé à la fois pourl’analysede la chimie du sang ( tableau 5 ) et l’isolement et le stockage de l’ADN, plasma et cellules monococleaires sanguines périphériques (PBMC). Déterminer le génotypage de l’APOE (rs429358 et rs7412) (un profilage génétique plus étendu a été déterminé chez les participants d’InveCe.Ab; voir le tableau 6). Enregistrez un ECG (altérations cardiaques, fibrillation auriculaire) et un électroencéphalogramme d’état de repos pour l’analyse quantitative (QEEG).
- Envisager des tests de biomarqueurs facultatifs, y compris le liquide céphalo-rachidien (CSF) TAU, le phospho-TAU et le β-amyloïde, et l’imagerie cérébrale (IRM pour détecter la dégénérescence in vivo, l’ischémie ou l’inflammation; FDG-PET pour détecter l’échec métabolique; PIB-PET pour détecter l’amyloidose cérébrale liée à la pathophysiologie de la maladie d’Alzheimer).
- Planifiez le programme de contrôle ultérieur du donneur de cerveaux. Mettre en place les intervalles de temps selon les différents groupes d’âge (jusqu’à 64 ans: tous les 10 ans, 65-74 ans: tous les 3 ans, à partir de 75 ans: tous les 2 ans).
- Attribuer un diagnostic clinique et/ou un diagnostic neurocognitif selon DSM-V. Classer la mise en scène clinique de démence avec le score clinique de démence (CDR). Mettre à jour le CDR dans la dernière période avant le décès.
- Préparer une base de données graphiquement similaire à celle du papier. Insérez toutes les données recueillies dans la base de données Brain Bank. Planifiez une révision par un autre greffier pour vérifier toute erreur.
3. Heure de la mort et ablation du cerveau
NOTE: La loi italienne établit que l’asystole doit durer plus de 20 minutes pour confirmer la mort. L’enregistrement d’un électrocardiogramme plat (ECG) pendant au moins 20 min (nom thanatographie) permet de réaliser une autopsie dans les 24 heures suivant le décès (art 8 et loi n. 578 du 29 décembre 1993). Un temps post mortem de <24 h est une bonne cible pour préserver la qualité globale des tissus. En cas d’autopsie >30 h, l’autopsie est annulée (voir tableau 2). L’équipe d’autopsie est composée d’un pathologiste, d’un neurologue et/ou d’un neurobiologiste, d’une infirmière, d’un technicien de salle anatomique et de tout étudiant stagiaire; les deux premiers membres de l’équipe effectuent également le diagnostic neuropathologique. Lors de la manipulation et de la dissection du cadavre, l’utilisation de vêtements appropriés (manteau, gants, lunettes et filet à cheveux) est obligatoire. Dans cette section, nous décrivons les principaux outils et équipements normalement utilisés dans notre laboratoire. Les lecteurs peuvent choisir les instruments à utiliser à leur discrétion. Pour une description détaillée des matériaux utilisés dans le présent présent, veuillez consulter le tableau des matériaux.
- Assurez-vous que l’agence funéraire choisie par la famille apporte le corps aux installations d’ABB. Effectuer la thanatographie pendant laquelle l’activité cardiaque doit être absente. Si c’est le cas, signez un certificat de décès et commencez les procédures d’autopsie.
- Transportez le cadavre à la salle d’autopsie. Mesurer la circonférence du crâne au niveau de la partie la plus large de la tête. Mesurez de la nasion à l’inion pour obtenir le diamètre antéropostéri (APD), tandis que la distance d’une oreille à l’autre donne le diamètre transversal (TD). Calculer l’indice céphalique (IC) à l’aide de la formule : CI = TD/APD x 100.
- À l’aide d’un scalpel pointu, faire une incision du cuir chevelu sur le plan coronal, de la pointe du processus mastoïde d’un côté à l’autre, en passant sur le sommet. Couper à travers les cheveux, la peau et les tissus sous-cutanés et séparer soigneusement les deux plis du cuir chevelu du crâne inférieur. Effectuer l’incision jusqu’à ce que la graisse supraorbitale jaune devienne visible et reflète le cuir chevelu antérieurement. Tirez l’autre partie postérieurement.
- À l’aide du scalpel et du forceps, prélever un petit échantillon du muscle temporel de chaque côté, mettre un dans 4 % de formaldéhyde et congeler l’autre (voir la section 7).
- Coupez le crâne à l’aide d’une scie électrique à la suite d’une coupe en V sur le côté frontal. Retirez la calotte et coupez les méninges. Les échantillons de dura sont fixés à 4 % de formaldéhyde et congelés (voir la section 7).
- Obtenez environ 10 mL de CSF en insérant une aiguille de 20 G 3.5 po à travers le corpus callosum pour atteindre le troisième ventricule. Évaluez l’apparence, la couleur et la turbidité du CSF et mesurez le pH. Ensuite, faire 10 aliquots d’environ 1 mL chacun et les stocker à -80 °C.
- Soulevez délicatement le cerveau en tirant délicatement sur les deux lobes frontaux et coupez les deux nerfs optiques infundibulum, les artères carotides internes (ICA) et les troisième, quatrième, cinquième et sixième nerfs crâniens. Couper le tentorium pour atteindre le fossa postérieur et couper les artères vertébrales et les nerfs crâniens inférieurs. Insérez le scalpel aussi profondément que possible à travers le magnum foramen, pour couper la partie la plus caudale de la médulle. À ce stade, enlever le cerveau entier doucement.
- Avec le scalpel, percer l’os sur la grotte de Meckel et obtenir le ganglion gisserian des deux côtés. Fixer un ganglion dans 4 % de formaldéhyde et congeler l’autre (voir la section 7). Fracturez la sella turcica osseuse à l’aide d’un maillet chirurgical et d’un ciseau pour enlever la glande pituitaire, puis fixez-la dans 4 % de formaldéhyde.
- Inspectez le crâne et le cerveau entier pour les altérations macroscopiques et les changements vasculaires. Avec un ruban à mesurer, mesurer le cerveau en obtenant les diamètres transversaux et antéropostéris. Récupérer avec soin le cercle de Willis et l’évaluer macroscopiquement (figure 2E) pour la présence de variantes anatomiques, de lésions ou de sténose de navire.
- Prenez 1–2 morceaux de leptomeninges de 2–4 cm2 de la convexité et conservez-les dans le milieu de culture de l’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 4 °C contenant 20 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de stylo/streptocoque, 1 % de glutamine et 1 % d’aminacidés non essentiels (publié précédemment, avec quelques modifications)41.
- Afin d’obtenir des cultures de fibroblastes, placez les leptomeninges sur une boîte de Pétri de 10 cm et lavez-la deux avec la solution saline tampon de phosphate (PBS), chaque fois en jetant le liquide.
- À l’aide d’un scalpel et d’une pointe de pipette, couper les leptomeninges en petits morceaux d’environ 2 ou 3 mm, semer 3–4 morceaux dans chaque puits d’une plaque de 6 puits précédemment recouvert de gélatine à 0,5% et remplir chaque puits de 2 mL de milieu complet complété par 1% d’amphotericin B (effectuer le traitement dans une armoire de biosécurité pour garantir la stérilité de la culture).
- Placer la plaque dans un incubateur de CO2 de 37 °C, 5 % de CO pendant au moins une semaine et changer de milieu dépensé tous les 3 à 4 jours. Trypsiniser les cellules avec la trypsiine stérile 1x lorsque le puits est à environ 70% de la confluence. Placez les fibroblastes leptomeningés dans une fiole T75 et remplissez-la de 12 ml de milieu complet. Après 5 jours trypsinize et les préserver dans 900 μL de FBS et 100 μL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
- Séparez-vous et inspectez le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral et peser individuellement. Retirez la glande pinéale et fixez-la dans 4% de formaldéhyde. Retirez les ampoules olfactives et les nerfs optiques, et fixez ou congelez une de chaque paire, indépendamment du côté. Gardez le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral dans la glace à 4 °C pendant au moins 2 à 4 h jusqu’à ce qu’ils soient prêts à la dissection afin de minimiser les perturbations tissulaires et de réduire la douceur des tissus.
- Après la récolte, faites attention et soin au cadavre. Rattacher l’os à l’aide d’une colle super adhésive, et pointez le cuir chevelu à l’aide d’une aiguille chirurgicale et de sutures non absorbables.
- Montrez du respect et de la gratitude à la personne décédée en traitant le cadavre en douceur. Nettoyez et rasez le visage, et lavez et séchez les cheveux, parce que le cadavre sera mis dans un cercueil ouvert visible à ses proches.
REMARQUE : La recomposition du cadavre est effectuée par un technicien. Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Protocole de dissection ABB
REMARQUE : Le même pathologiste et/ou neurologue tranchent le tronc cérébral, le cervelet et le cerveau sous une hotte de fumée. Un neurobiologiste arrange les tranches après la section. Un stagiaire qui ne manipule pas les sections du cerveau documente l’ensemble de la procédure avec des photos à télécharger dans la base de données pour servir de guide pendant les phases suivantes de traitement des tissus.
- À l’aide d’un couteau de dissection, couper le tronc cérébral axialement et faire la première coupe au niveau du midbrain rostral, à travers le colliculus supérieur, pour obtenir deux tranches exposant la substantia nigra (SN).
- Faire le reste des coupes pour acquérir des tranches de tronc cérébral de 8 mm pour obtenir environ 10 sections. Veillez à inclure les coupes passant par les pons rostraux près des marges supérieures du quatrième ventricule pour observer le locus coeruleus (LC) et à travers la médulla oblongata inférieure à la strie acoustique juste au-dessus de l’apex inférieur du quatrième ventricule pour avoir des tranches, y compris le noyau moteur dorsal du vagus (DMNV).
- Nommez toutes les tranches dans un sens rostrocaudadal comme BS (tronc cérébral) suivie par des nombres arabes pour identifier les sections. Après la dernière section du tronc cérébral, utilisez la désignation SC (moelle épinière) suivie des nombres 1–n. Environ 2–4 tranches de SC sont obtenues en fonction du nombre de métamères spinaux enlevés (Figure 2H–I).
- Étiqueter toutes les sections à fixer ou à congeler alternativement et prendre une photo pour l’archive photo (figure 2). Ensuite, fixer et congeler toutes les tranches décrites ci-dessous (étapes 4.7 et 4.8).
- Couper le cervelet sur le plan sagittal pour séparer les deux hémisphères cérebelaires au niveau du vermis. Effectuer des sectionnages sagittal pour obtenir 5 tranches de chaque hémisphère (Figure 2F–G).
- Nommez toutes les tranches de vermis comme CBR ou CBL (pour le cervelet droit et gauche respectivement) et utilisez des numéros arabes pour identifier les sections. Étiqueter toutes les sections à fixer ou à congeler alternativement et prendre une photo pour l’archive (figure 2). Ensuite, fixer et congeler toutes les tranches décrites ci-dessous.
- Séparez les deux hémisphères du cerveau à travers le corpus callosum (figure 2A–B) et coupez-les singulièrement sur le plan coronal. Faire la première coupe dans un plan passant entre le chiasme optique et les corps mammillaires, par le lobe frontal, pôle temporel, cingulaire antérieur, commissaire antérieur, noyau de Meynert et ganglions basaux.
- Effectuer la deuxième coupe d’environ 1 cm postérieurement en passant par les corps mammillaires et en exposant les ganglions basaux, thalamus antérieur, subthalamus et amygdale. Continuer à trancher pour disséquer les régions antérieures et postérieures afin d’acquérir des tranches de 1 cm afin d’obtenir 15 à 20 sections pour chaque hémisphère.
- Placez les tranches sur une surface plane. Posez-les en suivant leur position d’origine dans la direction antéroposterior, du front au pôle occipital, avec la partie continue avec la tranche précédente orientée vers le haut.
- En comparant les sections des deux hémisphères, sélectionnez d’autres sections de chaque hémisphère à conserver comme matériaux fixes ou congelés. Reconnaître les sections principales à fixer et à traiter pour l’histopathologie, y compris les lobes frontaux et temporels, les ganglions cingulaires, les ganglions basaux, les basalis du noyau de Meynert, l’amygdale, le thalamus, l’hippocampe et le cortex entorhinal, le gyrus occipito-temporel, les lobes pariétal et occipital.
- Nommez toutes les tranches dans un sens antéroposterior comme L (à gauche) ou R (à droite) suivies de numéros arabes et mettez une étiquette indiquant si la tranche doit être fixée ou congelée (Figure 2A–D). Pour identifier les sections, prenez une photo pour l’archive photo. Ensuite, fixer et congeler toutes les tranches décrites dans les sections 7 et 8.
5. Inspection du cerveau et des vaisseaux et évaluation pathologique macroscopique (à l’œil nu)
- Effectuer un examen macroscopique général considérant les altérations meningéales, l’atrophie corticale diffuse ou localisée, l’atrophie hippocampal, l’agrandissement ventriculaire, l’atrophie cérebelaire, l’atrophie du tronc cérébral, la pâleur de substantia nigra, les altérations de matière blanche (préciser le type et l’emplacement).
- Examiner le cercle de Willis considérant l’athérosclérose et l’occlusion. Attribuer le score = 1 en présence d’athéroma sans sténose de plus de 50%, score = 2 si au moins une artère est de 50% ou plus occlus, score = 3 si deux artères ou plus sont 50% ou plus occlus42. Évaluer la présence ou l’absence de pathologie dans d’autres vaisseaux intracrâniens.
- Pour détecter les lésions vasculaires parenchymales, examiner les hémisphères cérébraux, le cervelet et le tronc cérébral. Considérons les lésions lacunar (diamètre < 10 mm), les infarctus ischémiques ou hémorragiques et l’hémorragie (diamètre > 10 mm). Si vous êtes présent, spécifiez la taille en millimètre, en nombre et en emplacement. Aussi, considérez la présence ou l’absence d’hémorragie sous-arachnoïde.
6. Contrôle de la qualité des tissus
NOTE : Le score de facteur agonal (AFS) varie entre 0 et 2 et est important dans l’évaluation de la qualité des tissus. Pour déterminer l’AFS, considérez les conditions cliniques se produisant autour du moment du décès (particulièrement les conditions déterminant l’acidose de cerveau) et la durée de l’état agonal (mort subite ou agonie prolongée). Si AFS > 1, le tissu cérébral pourrait ne pas être de qualité optimale43. Considérez également le cerveau et le pH de CSF; si pH < 6, le tissu cérébral pourrait ne pas être de qualité optimale43,44.
- Vérifiez si la mort a été causée par des conditions qui peuvent endommager les tissus cérébraux, y compris l’hypoxie, l’acidose prolongée, la ventilation mécanique, l’échec multi-organes, la fièvre élevée, le traumatisme crânien grave, l’ingestion de substances neurotoxiques, la déshydratation sévère, l’hypoglycémie grave, l’état épileptique et le coma prolongé. Si l’une de ces conditions est présente, attribuez 1 point.
- Vérifiez la durée de l’état agonal(rapide si la mort se produit dans les 1 h, intermédiaire si la mort se produit entre 1 et 24 h, lent si l’état agonal dure plus de 1 jour). Si une mort intermédiaire ou lente se produit, attribuez 1 point.
- Calculer le score afs, et mesurer le pH CSF par une aiguille de pH d’électrode et le pH de tissu par un pH de surface sur une tranche de cerveau de chaque lobe et sur une section cérebelaire.
7. Congélation des tissus
- Garder tous les tissus à congeler dans la glace à 4 °C. Ensuite, congelez-les rapidement. Placez-les sur un plateau en aluminium préfrozen. Couvrir d’une plaque d’aluminium imbriquée pour les garder à plat. Mettez-les dans de l’azote liquide à -120 °C pendant 3 min.
- Placez les tranches à l’intérieur d’un sac en plastique étiqueté avec leur code d’identification correspondant et le numéro de tranche. Diviser les sacs en plastique en trois boîtes cryogéniques (pour l’hémisphère droit, l’hémisphère gauche et le tronc cérébral) et les stocker à -80 °C.
8. Fixation des tissus
- Envelopper les tranches dans de la gaze une par une, et mettre les tranches dans 10% phosphate tamponné solution de formaline. Après 1 jour, remplacez la solution formaline par une solution fraîche. Laissez-les environ 5 jours dans une chambre froide à 4 °C.
- Conservez toutes les tranches dans leur ensemble et ne divisez que les tranches contenant de l’hippocampe et de l’amygdale en deux parties (figure 3). La partie supérieure des deux tranches contiendra le lobe frontal (R10a–L9a à la figure 3); les parties inférieures contiennent respectivement : (1) l’amygdale, le lobe temporal et les ganglions basaux (L9b à la figure 3B),et (2) l’hippocampe et une partie du lobe temporal (R10b dans la figure 3A). Ceci est fait afin de maintenir la relation entre les différentes structures.
- Placez toutes les sections dans la mémoire tampon de phosphate pendant au moins 2 jours pour laver et enlever les produits de liaison croisée.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
9. Déshydratation, déblaiement, incorporation de paraffine et préparation des diapositives
- Préparer des concentrations croissantes d’alcool éthylique de 70% à 100%, du xylène et deux ensembles de cire de paraffine fondue. Placez les sections du cerveau dans le processeur automatique pour la déshydratation, la procédure de compensation et l’infiltration de paraffine (utiliser deux protocoles différents de traitement des tissus pour les macro (tranches de cerveau et de cervelet) et les micro-échantillons (tranches de tronc cérébral et les autres petits échantillons); Tableau 7). Incorporer le tissu dans la cire de paraffine sur un moule en métal ou en plastique.
- Sélectionnez les sections à trancher pour évaluer toutes les régions d’intérêt appliquant l’indice de Montine pour la caractérisation neuropathologique45 (tableau 8). Ensuite, tranchez les sections sélectionnées.
- Utilisez un microtome de luge pour les macrosections et un microtome rotatif pour les petites sections. Couper 5 tranches de μm pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) et 8 tranches de μm pour les autres colorations et immunohistorique. Placez les tranches sur trois types différents de lames histologiques : 8,5 cm x 11 cm pour les plus grosses tranches, 5 cm x 7,5 cm pour les tranches moyennes et les classiques de 2,5 cm x 7,5 cm pour les plus petites.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
10. Déparaffinisation, coloration histologique et immunohistorique (IHC)
- Effectuer la déparaffinisation pour permettre la réaction avec des solutions de teinture aqueuse. Effectuez-le en utilisant du xylène et en diminuant la concentration d’alcool (5 min pour chaque étape). Réhydrater pendant 5 min avec de l’eau distillée.
- Utilisez les taches histologiques suivantes pour évaluer les anomalies architecturales et structurelles des tissus, et la morphologie cellulaire : H&E (pour les lésions microscopiques vasculaires et l’inflammation), Cresyl Violet (NISSL; pour la perte neuronale), Luxol Fast Blue (LFB; pour la démyélinisation), Gallyas (pour les plaques néuritiques et les fils neuropil).
- Utiliser l’immunohistorichimie (IHC) afin de mettre en évidence la présence de structures cibles spécifiques. Anti-NeuN et anti-GFAP sont utilisés pour identifier les compartiments neuronaux et gliaux; 4G8, AT8, α-SYN et TDP-43 sont utilisés pour identifier les protéines qui s’agrégent dans les maladies neurodégénératives (Tableau des matériaux).
- Prétraiter les sections déda remplies avec 3% H2O2 pendant 10 min puis rincer en PBS. Effectuer un traitement de récupération avec tampon de citrate 0,01 M pH 6 (micro-ondes en série pendant 2, 1 et 2 min) pour les antigènes 4G8, α-SYN, TDP-43 et NeuN; utiliser 70 % d’acide formique pour la 4G8 et l’α-SYN. Préincuber pendant 30 min dans 5% de sérum de chèvre normal.
- Incuber toute la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire. Le lendemain, rincer les sections de PBS avant l’incubation avec l’anticorps secondaire (Envision+ System-HRP étiqueté Polymère) à une dilution de 1:2 dans pbs pendant 1 h à température ambiante.
- Laver plusieurs fois en PBS et incuber dans le système chromogène avec la diaminobenzidine (Liquid DAB+Substrate Chromogen System) en regardant le développement de réaction au microscope (grossissement 4–10x). Enfin laver les sections dans PBS. Contrestain les sections dans l’hématoxyline, déshydrate et coverslip avec le montage DPX.
REMARQUE : Le tableau 8 résume le protocole standard. Effectuez des taches H&E sur toutes les sections, tandis que des taches et des réactions spéciales/spécifiques sont utilisées sur certaines sections. Les cas sélectionnés nécessitent des zones ou des réactions supplémentaires. Table of Materials montre les détails des anticorps utilisés pour iHC.
11. Caractérisation neuropathologique de base
NOTE : Des altérations non spécifiques de tissu cérébral, la pathologie vasculaire, la pathologie de la maladie d’Alzheimer (AD) , les TAUopathies non-AD, les synucleinopathies, la protéine de TAR DNA-liant (TDP-43) la pathologie et les lésions hippocampales sont étudiées. Un microscope optique relié à une caméra est utilisé pour détecter les lésions microscopiques parenchymales. L’évaluation histologique est effectuée par la même équipe de personnel formé en neuropathologie, y compris un professeur de neurologie, un neurologue et un pathologiste. Il est basé sur l’approche45 modifiée de Montine (Tableau 8) comprenant également : (1) les TAUopathies hétérogènes non-AD qui constituent la marque pathologique de la dégénérescence fronto-temporale de lobe (FTLD) liée aux dépôts de TAU : la maladie de Pick, Aphasie progressive primaire non fluide (TAU-nfppa), paralysie supranucléaire progressive (PSP)46,47 et dégénérescence cortico-basale (CBD)48. En outre, les TAUopathies non-AD incluent des conditions liées au vieillissement et sans signification clinique définie telle que la TAUopathie liée à l’âge primaire (PARTIE)49, Astro-Gliopathie TAU liée à l’âge (ARTAG)50, maladie des grains argyrophile48. (2) Lewy Type Synucléinopathy (LTS) qui est liée à la maladie de Parkinson (PD) et la démence de corps de Lewy (LBD). Pour rechercher le SLT, appliquez les étapes hiérarchiques suivantes : dans un premier temps, ampoule olfactive, tronc cérébral, amygdale/cortex temporel ; si les zones précédentes sont positives, ajouter des structures limbiques (formation hippocampale, cortex entorhinal, cingulaire antérieur), gyrus frontal moyen, lobule pariétal inférieur et cortex occipital45. Si des caractéristiques cliniques de la LBD corticale sont présentes (c.-à-d. fluctuations et/ou hallucinations), considérez les structures limbiques et l’isocortex pour la première étape. (3) Dépôts TDP-43, la caractéristique pathologique de FTLD lié aux dépôts TDP-43 : variante comportementale de la démence fronto-temporelle (bvFTD), de la démence sémantique (SD ou svFTD), de la TDP-nfppa et de la maladie des neurones moteurs FTD (FTD-MND). L’IHC pour TDP-43 est exécuté sur les sections suivantes : amygdale, hippocampe, cortex entorhinal et gyrus frontal moyen ; dans les cas de FTLD clinique suspecté, envisager d’examiner d’autres articles51.
- Évaluer les altérations non spécifiques des tissus cérébraux dans certaines sections à l’aide de H&E, NISSL, LFB et IHC pour GFAP et NeuN. Considérons la raréfaction neuronale, les neurones gonflés, la spongiose, la gliose, la perte de myéline, la présence ou l’absence d’infiltrations inflammatoires ou tumorales. Spécifiez l’emplacement courant de ces modifications.
- Pour détecter les lésions vasculaires microscopiques,examiner les diapositives H&E et LFB, y compris au moins deux macro-sections hémisphériques (les premières passant par les corps mammillaires (coupe Charcot) avec des lobes frontaux et temporels, ganglions basaux, thalamus antérieur, amygdale, et le second passant par le lobe occipital), la section « génique » de la formation hippocampale, une section cérebelaire, et les trois sections principales du tronc cérébral (par substantia nigra, locus coeruleus et DMNV).
- Détecter la maladie des petits vaisseaux, y compris l’artériolosclérose, la lipohyalinose, la dilatation de l’espace périvasculaire, la perte de matière blanche, la leptomeningeal et/ou l’angiopathie amyloïde cérébrale et/ou capillaire. Spécifiez le classement (0–3) et l’emplacement courant42,52. Considérez la présence ou l’absence de fuites d’hémosiderine, de microbles et de micro-produits.
- Évaluer la contribution des dommages vasculaires aux troubles cognitifs à l’aide du schéma hiérarchique de Deramecourt (altérations de la paroi des vaisseaux – petites maladies des vaisseaux – infarctus macroscopiques). Pour cette évaluation envisager une section de lobe frontal et temporel, ganglions basaux et hippocampe (score 0–20)30. En outre, estimer la probabilité que la maladie vasculaire cérébrale a contribué à l’affaiblissement cognitif utilisant le score de VVCING (bas-intermédiaire-haut), obtenu en considérant les infarctus macroscopiques hémisphériques et la maladie de petit navire du lobe occipital comprenant l’artériolosclérose modérée à grave et l’angiopathie amyloïde53.
- Évaluer la pathologie de la AD à l’aide de l’IHC (4G8) pour la propagation amyloïde. Définissez les étapes de Thal (1–5)54, la notation amyloïde agrégée (0–3)45, et la morphologie par site (diffuse, focale, évidée).
- Évaluez la pathologie ad tau à l’aide de l’IHC (AT8) et décrivez la morphologie répandue par site (enchevêtrements neurofibrillaires, fils neuropil, plaques néuritiques). Définir l’étape de Braak (I–VI +; signe positif indique la présence de zones supplémentaires de pathologie tau hyperphosphorylée ne suivant pas la hiérarchie du Braak)55 et la notation globale (0–3)45.
- Évaluer les plaques néuritiques à l’aide de la coloration Gallyas et du score cerad (0–3)56. Ensuite, définissez la probabilité des caractéristiques neuropathologiques correspondant à un syndrome clinique de la MA en utilisant le score Amyloïde-Braak-CEARD (score ABC 0–3): aucun-bas-intermédiaire-haut45.
- Utilisez AT8 IHC pour remarquer la présence ou l’absence de pathologie non-AD TAU spécifiant l’emplacement répandu et l’image morphologique particulière. Prenons l’exemple des inclusions neuronales telles que les enchevêtrements en forme de flamme ou de globose, les inclusions sphériques-globulaires (c.-à-d. les corps de Pick)57,les fils neuropil, les neurites dystrophiques, les grains argyrophiliques; et inclusions gliales telles que les astrocytes touffus, les astrocytes épineux, les plaques astrocytiques, les corps enroulés, les inclusions globulaires58,59.
- Utilisez l’IHC α-syn pour détecter les LTS (corps de Lewy, corps pâles et neurites de Lewy) sur les zones de la note ci-dessus. En cas de positivité, appliquer le classement de McKeith (0–4) pour évaluer la gravité des lésions60; ensuite, utilisez les étapes de Beach (I–IV) pour la distribution topographique (ampoule olfactive, tronc cérébral prédominant, limbique prédominant, néocortical)61. Comparez les étapes de Beach et Braak pour définir la relation entre lbd et la pathologie AD60,61,62.
- Considérez la présence ou l’absence d’inclusions cytoplasmiques gliales (GCI; synucleinopathie gliale de type non Lewy) qui sont la caractéristique pathologique de l’atrophie du système multiple (MSA) et spécifiez leur emplacement prédominant63.
- Utilisez tdp-43 IHC pour détecter les dépôts TDP-43 sur les zones de la note ci-dessus. Identifier la morphologie répandue par site : Inclusions cytoplasmiques neuronales (INC), inclusions de neurites distrophiques (DN), Inclusions nucléaires (NII). Définir le modèle : A (NCI prédominant et NN : bvFTD et nfppa); B (INC prédominante : FTD-MND); C (DNs longs prédominants : svPPA et bvFTD)51,64. Utilisez le schéma de Nelson pour définir la présence de TDP-43 dans les cas d’AD65,66.
- Évaluer l’hippocampe à partir du secteur subiculum et Sommer (CA1). Utilisez le score de Rauramaa (0–4) : 1–2 pour les microinfarcts et les macroinfarcts, respectivement; 3–4 correspondant à la perte neuronale modérée et grave, respectivement, et l’atrophie hippocampal (sclérose hippocampale : HS). Soulignez la présence ou l’absence de dépôts de protéines pathologiques (dans l’ordre décroissant de fréquence : pTAU, TDP-43, α-syn)67.
- Définissez le diagnostic neuropathologique et entrez toutes les données pathologiques dans la base de données.
REMARQUE : Les pièces dans lesquelles les données biologiques et les données sensibles des donneurs sont stockées sont toujours verrouillées et seuls le personnel autorisé est autorisé à entrer, afin de garantir à la fois la sécurité et la confidentialité. Le matériel biologique congelé est stocké dans des congélateurs verrouillés à -80 °C, tandis que les tissus de paraffine fixés paraffine sont stockés dans des placards verrouillés à température ambiante. Des congélateurs à double moteur sont utilisés et un congélateur de sauvegarde est également présent. De plus, pour s’assurer que les congélateurs fonctionnent toujours, ils disposent d’un système de surveillance 24 heures sur 24, 7j/7 qui déclenche une alarme. Un générateur d’urgence est également présent, en cas de panne de courant. Les participants sont anonymes avec un code numérique pour assurer leur vie privée; il n’est pas possible pour le personnel non autorisé de revenir à l’identité des donateurs et à leurs données raisonnables. Toutes les informations sont collectées dans une base de données protégée par mot de passe; de même, une copie papier de ces données est conservée dans des archives verrouillées.
Representative Results
Donneurs de cerveau et données de récolte de cerveau
En 2014, le recrutement de donateurs a commencé lors du deuxième suivi d’InveCe.Ab, impliquant 1010 des 1061 sujets admissibles (taux de réponse : 93 %; Figure 1). En ce qui concerne l’étude longitudinale InveCe.Ab, 290 participants sur 1010 (28,7 %) ont accepté de s’inscrire en tant que donateurs (160 déjà inscrits et 130 qui ont exprimé leur intention de s’inscrire). Le niveau d’éducation est plus élevé chez les donateurs que chez les non-donateurs (66 % de nos donateurs ont un niveau d’éducation moyen-élevé : 8 années d’école ou plus), ce qui indique l’importance de la culture et de l’éducation. De nombreuses personnes « en bonne santé » ont également manifesté de l’intérêt pour le programme de don de cerveaux. La plupart de nos « onsemen » avouent qu’ils peuvent sympathiser avec les malades et leurs proches, et que vous voulez contribuer en quelque sorte à la recherche menant à une meilleure compréhension des maladies neurologiques. Les personnes désintéressées qui s’engagent régulièrement dans des programmes de don de sang ou de moelle au cours de la vie sont plus ouvertes à l’idée du don du cerveau, tout comme les personnes qui ont déjà accepté de donner des organes après la mort. Ils sont conscients du fait que même s’il n’y aurait pas de bénéficiaire vivant, leur don serait d’une grande importance pour la recherche. Un autre facteur contribuant au don du cerveau est la préférence pour être incinéré. Actuellement, la population de donneurs ABB comprend un total de 427 personnes (290 participants d’InveCe.Ab + 137 volontaires ou patients de l’hôpital gériatrique ASP Golgi-Redaelli), dont 75 % ont 70 ans ou plus. Il y a une nette prédominance des femmes (64%) et les personnes âgées mentalement intactes (environ 85 %). Jusqu’à présent, 27 cerveaux ont été récoltés sur 40 donneurs décédés (taux d’autopsie de 67 %); 13 sujets n’ont pas été autopsiés pour diverses raisons, y compris l’omission de signaler le décès à ABB, les blessures graves entraînant la destruction du cerveau, les maladies infectieuses dangereuses et 1 cas de MCJ; 4 sujets ont révoqué leur consentement. Jusqu’à présent, 24 des 27 cerveaux récoltés ont reçu une caractérisation neuropathologique complète avec un diagnostic cliniqueo-pathologique défini, tandis que les 3 cerveaux restants sont encore à l’examen (Tableau 3). Les données supplémentaires sur la récolte du cerveau d’ABB comprennent : l’âge moyen au décès (81 ans); intervalle post mortem moyen (10,37 h); moyenne CSF pH (6,64); pH moyen des tissus (6,07); poids cérébral moyen (1012,86 gr); AFS était 1 dans 90% des sujets décédés.
Biomarqueurs neurophysiologiques (QEEG)
QEEG fait partie de l’approche multidimensionnelle. Il s’agit d’une méthode simple, non invasive et peu coûteuse, avec un potentiel probable pour détecter la conversion de troubles neuro-cognitifs légers (MCD doux ou MCI) à un trouble neuro-cognitif majeur (trouble neuro-cognitif majeur ou démence). Tout au long de notre approche multidimensionnelle, un examen QEEG simple est effectué et son rôle possible en tant que biomarqueur pour la démence est testé. Nos données sur une série préliminaire de 36 donneurs de cerveau (18 personnes âgées normales (NOLD), 11 MIL-NCD et 7 major-NCD; 9 avec un diagnostic neuropathologique défini) indiquent que le pourcentage moyen de rythme alpha était sensiblement plus bas dans le principal-NCD comparé à la MNT-légère (p : 0,002) et au NOLD (p : 0,033). Inversement, les fréquences EEG plus lentes (theta/delta) étaient significativement plus élevées dans les MNT majeurs que dans les NOLD/mild-NCD (voir l’exemple de cas à la figure 4). Dans notre série, la distribution de rythme d’EEG peut différencier les sujets de NOLD/doux-NCD des patients principaux-NDC indépendamment du diagnostic étiologique, suggérant que les rythmes de cerveau sont influencés par le fardeau des lésions dégénératives indépendamment du type de lésion. En effet, 7 cerveaux examinés sur 9 présentent une démence due à des pathologies mixtes. La spécificité concernant la nature de la pathologie semble être faible et les rythmes électriques du cerveau semblent être davantage influencés par la charge et la topographie des lésions que par leur nature moléculaire (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lisbonne, données non publiées).
Cas emblématiques
Le protocole ABB peut être utile et nécessaire dans certains cas et conditions. Un exemple est la présence d’une pathologie asymétrique (figure 5). Notre protocole est très approprié pour l’identification et la caractérisation appropriée de ce type de pathologie. Jusqu’à présent, nous avons examiné 4 cerveaux avec une implication asymétrique, dont certains sont présentés à la figure 5. Macroscopiquement, l’atrophie du côté droit (figure 5A) est présente dans un cas avec dilatation ventriculaire sévère dans la section coronale droite ( figure5C) par rapport au côté gauche ( figure5B). Un autre cas affiche infarctus de l’hémisphère droit (Figure 5D) et un autre montre une atrophie claire du corps mammillaire droit (Figure 5E). Au niveau microscopique, un cas de FTLD montre une positivité asymétrique TDP-43 qui est plus intense dans le côté frontal droit par rapport à la gauche (Figure 5F,G).
Macrosections (Figure 6A,C) sont utilisés pour obtenir une vue d’ensemble. La coloration LFB permet d’identifier la perte de myéline (figure 6D) et iHC pour la 4G8 et l’AT8 (figure 6B) permet d’évaluer la distribution de l’immunoréactivité dans les hémisphères à l’œil nu. Dans la série ABB, les cerveaux d’individus apparentés sont disponibles pour être comparés.
Dans la figure 7, des images microscopiques de sections des cerveaux des jumeaux homozygotes sont placées côte à côte pour une comparaison plus facile (jumeau 1 (BB137): Figure 7A,C,E,G,I,K versus twin 2 (BB138: Figure 7B,D,F,H,J,L). Comme dans une étude précédente semblable68, les deux jumeaux ont été comparés par des évaluations cliniques et neuropathologiques. Les jumeaux ont rapporté le même diagnostic de major-NCD dû aux étiologies multiples, mais ils sont morts deux années d’intervalle, à l’âge 83 (démence-début à 72 ans) et 85 (démence-début à 76 ans), respectivement. Leurs cerveaux ont une image neuropathologique très semblable, avec la pathologie de LA AD élevée liée à l’angiopathie amyloïde. L’immunoréactivité 4G8 est diffusée dans tout le cortex (figure 7A,B) et les ganglions basaux (figure 7C,D) avec des plaques diffuses, denses et à noyau. Il est également clairement détecté dans les vaisseaux parenchymales et leptoméningés du cortex et du cervelet (Figure 7A,B,G–J). Au grossissement plus élevé, capCAA est clairement évident (Figure 7G,H). Les plaques immunopositives AT8, les enchevêtrements et les fils sont diffus dans les cortices pariétals des deux cerveaux (Figure 7E,F,L). En ce qui concerne la charge de pathologie amyloïde et NFT, le jumeau 1 est considéré comme un stade Thal 3 (montine A2) et un Braak étape 5 (montine B3), tandis que le jumeau 2 est considéré comme un Thal étape 5 (montine A3) et un Braak étape 6 (montine B3). Ils ont eu les mêmes années d’éducation et de style de vie similaire; cependant, l’un (BB137) était marié et est devenu veuf peu de temps après tandis que l’autre était célibataire (BB138). Ils ont montré différents degrés de variabilité clinico-pathologique avec le même début et le même cours de la maladie mais dans des délais différents. Cela confirme le fait que, bien que la composante génétique joue un rôle clé dans le développement de la maladie, la composante épigénétique et environnementale sont fondamentales pour déterminer des manifestations légèrement différentes.
Dans certains cas, l’image clinique ne correspond pas aux dispositifs neuropathologiques. À la figure 8,deux cas différents ont été cliniquement définis comme des cas de d’AD; Les analyses neuropathologiques montrent, en plus d’une pathologie intermédiaire de la MA, une positivité diffuse pour α-syn. Dans le premier cas, une image grave de LTS (Beach IV) montre des corps de Lewy uniformément trouvés tout au long du gyrus cingoli (figure 8A) et dans SN comme inclusions cytoplasmiques entourées de neuromélanine ( Figure8B,C). Dans le deuxième cas, les corps de Lewy associés aux neurites de Lewy sont distribués diffusement dans l’amygdale (figure 8D,E) et dans le noyau de Meynert (Figure 8F,G) suggérant un diagnostic limbique de SLT. En effet, la topographie des lésions plutôt que leur nature moléculaire produit les manifestations cliniques.
Figure 1 : Diagramme de flux de l’étude Inve.Ce.Ab. À la base, la prévalence globale de la démence était de 3 %. Au cours des suivis, les taux de prévalence étaient : 4,4%(1er)69, 7,1% (2e),10,9% (3e).rd Le taux d’incidence sur huit ans était de 15 p/1000/an (IC à 95 % : 13–18 p/1000/an). Le recrutement des donateurs a commencé en 2014 (lors du deuxième suivi). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Protocole de dissection du cerveau (A), du cervelet (F) et du tronc cérébral (H). Cercle de Willis et hémisphères simples sont indiqués dans (E) et (B). Les coupes coronales de droite (C) et du côté gauche (D) sont numérotées et alternativement fixées (« ») et congelées (« »). Des sections de cervelet sagittal (G) et des sections axiales du tronc cérébral (I) sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Des tranches coronales de lobe fronto-temporal fixe (A) et de gauche (B) sont représentées.
L’hippocampe et le lobe temporal (A, R10b) sont séparés du lobe frontal (A, R10a) sur la tranche droite. Sur la tranche opposée, les ganglions amygdales et basales (B, L9b) sont divisés du lobe frontal (B, L9a). Barre d’échelle: 1,7 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Répartition relative de l’énergie spectrale chez les sujets du NOLD et des personnes à risque majeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images représentatives de pathologies asymétriques. (A) Premier cas : cerveau avec atrophie droite. Les tranches coronales (B) etC) montrent une dilatation ventriculaire à droite particulièrement évidente dans les sections 10–12 (C, flèches). Dans les sections B) et C), « » signifie fixe et « » pour congelés (en italien: congelato). (D) Deuxième cas : infarctus grave de l’hémisphère droit. (E) Troisième cas : atrophie du corps mammillaire droit (flèche). (F, G) Quatrième cas : les images microscopiques montrent une immunoréactivité TDP-43 plus intense dans le cortex droit frontal (G) comparé à celui gauche (F) dans un cas de démence frontotemporale. Barres d’échelle : 183 μm (F, G). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Macrosections. (A, C) Tranches coronales de lobe fronto-temporal fixe (A) et lobe pariétal frais (C). (B) Section fronto-temporelle histologique immunolabeled avec l’anticorps d’AT8. L’immunoréactivité est clairement répartie sur tout le cortex, mais plus intense dans le lobe temporal. (D) Section pariétale histologique tachée de LFB. La flèche indique une zone de démyélinisation de la matière blanche. Barre d’échelle : 1,55 cm (B, D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Jumeaux. Comparaison entre les cerveaux de deux jumeaux homozygotes : BB137 (A, C, E, G, I, K) et BB138 (B, D, F, H, J, L). Les images neuropathologiques sont très similaires. (A) et (B) montrent la positivité diffuse de 4G8 dans le lobe occipital avec la plaque amyloïde, leptomeningeal (flèches) et les vaisseaux parenchymal (pointes de flèche). L’angiopathie amyloïde capillaire (astérisques) est bien reconnue lors de grossissements plus élevés (G) et (H). La 4G8 est diffusée de manière diffuse dans les ganglions basaux (C, D) et autour des vaisseaux leptomamentéaux du cervelet (I, J: flèches). L’immunoréactivité AT8 identifie les enchevêtrements, les fils et les plaques (flèches) dans le cortex pariétal (E, F). Gallyas coloration (K) révèle plaques neuritiques comme AT8 anticorps (L) ne. Barres d’échelle : 470 μm (A–F; I-J); 90 μm (G–H; K–L). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Diagnostic clinique par rapport au diagnostic neuropathologique. Dans ce chiffre, deux cas différents sont rapportés dans lesquels le diagnostic neuropathologique diffère du diagnostic clinique. L’immunoréactivité pour α-syn est un résultat inattendu. (A–C) Premier cas : Gyrus cingoli (A) montre une distribution homogène des corps de Lewy dans SN (flèches B). Dans un neurone de SN, un corps double de Lewy entouré de neuromélanine est montré (C). (D–G) Deuxième cas : Une positivité diffuse pour α-syn est détectable dans le noyau amygdale (D, E) et Meynert (F, G). Les corps cellulaires et les neurites de Lewy (astérisque) sont bien marqués. Barres d’échelle : 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : Modèle d’accord de transfert. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| ¡n | % | ||
| Sexe | Mâles | 607 | 45.9 |
| Femelles | 714 | 54.1 | |
| Cohorte de naissance | 1935 | 236 | 17.8 |
| 1936 | 219 | 16.6 | |
| 1937 | 264 | 20.0 | |
| 1938 | 305 | 23.1 | |
| 1939 | 297 | 22.5 | |
| Matrimonial | Marié | 872 | 66.1 |
| Cohabitant | 13 | 1.0 | |
| Séparés/divorcés | 29 | 2.2 | |
| Veuve | 325 | 24.6 | |
| Seul | 80 | 6.1 | |
| Occupation de la vie primaire | Cols bleus | 666 | 50.6 |
| Cols blancs | 459 | 34.9 | |
| Ménagère | 191 | 14.5 | |
| Années d’éducation | ≤5 ans | 754 | 57.2 |
| >5 ans | 565 | 42.8 |
Tableau 1 : Caractéristiques sociodémographiques des participants à l’étude InveCe.Ab.
| CRITÈRES D’INCLUSION | CRITÈRES D’EXCLUSION |
| Toutes les personnes âgées de 18 ans et plus | Les personnes qui refusent manifestement le don |
| Personnes vivant sur le territoire d’Abbiategrasso | Personnes vivant en dehors de la Lombardie |
| Les bénévoles qui donnent leur consentement par eux-mêmes | Divergences entre les souhaits du donneur potentiel et des noks concernant le don de cerveau |
| Sujets incapables de décider avec l’autorisation de NOK | Situations qui détruisent considérablement la consistance du cerveau |
| Mort par une cause naturelle | Cours clinique de <2 ans à moins que la possibilité d’une maladie à prions ait été exclue |
| Décès causé par un homicide ou un suicide, avec la nécessité d’un rapport du coroner | |
| Intervalle post mortem >30 heures |
Tableau 2 : Critères pour le don de cerveaux.
| N° | Sexe | CODE BB | CODE InveCe | Âge | edu (ans) | Diagnostic clinique | Cdr | Afs | PM (hrs) | tissu de pH | liqueur de pH | diagnostic neuropathologique | ||||
| 1 | F | BB 37 | 87 | 5 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 5 | 2 | 29 | Nd | Nd | Pathologie ad élevée, SVD modéré, TDP43+, Ctx LTS, HS | |||||
| 2 | F | BB 105 | 94 | 5 | Major-NCD en raison de la PUBLICITÉ | 5 | 1 | 5 | 5.72 | 6.78 | Pathologie de la maladie d’A, SVD doux, HS | |||||
| 3 | F | BB 137 | 83 | 3 | Major-NCD en raison de multiples étiologies (AD-VaD) | 5 | 1 | 16 | Nd | Nd | Pathologie ad élevée, SVD modéré, infarctus occipital, CAA-capCAA | |||||
| 4 | M | BB 181 | 71 | 13 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 5 | 2 | 3 | Nd | Nd | LTS sévère (Plage IV), pathologie intermédiaire de l’AD, mildSVD, mCAA | |||||
| 5 | M | BB 115 | I 636 | 78 | 18 | Major-NCD en raison de la PUBLICITÉ | 5 | 1 | 6 | Nd | Nd | AD intermédiaire, SVD modéré, Inflammation, ILBD (Plage IIa), HS | ||||
| 6 | F | BB 23 | I 65 | 79 | 3 | M.D.C. majeur en raison d’une maladie vasculaire | 5 | 1 | 14 | Nd | Nd | CAA sévère et répandue, pathologie intermédiaire de la MA | ||||
| 7 | M | BB 102 | I 412 | 79 | 8 | M.D.C. majeur en raison d’une maladie vasculaire | 3 | 1 | 8 | Nd | Nd | Démence vasculaire, ILBD | ||||
| 8 | M | BB 224 | I 16 | 80 | 3 | Les MNT majeurs en raison de multiples étiologies | 5 | 1 | 11 | Nd | 5.99 | SVD modéré, pathologie de la basse AD, ILBD (Beach IIa), HS | ||||
| 9 | F | BB 47 | 78 | 5 | Major-NCD à plusieurs étiologies (LBD-VaD BPSD) | 5 | 0 | 8 | Nd | Nd | Pathologie de la MALADIE ÉLEVÉE, Pathologie BG TAU, ARTAG, SVD doux, HS | |||||
| 10 | F | BB 153 | I 965 | 79 | 5 | Mild-NCD (décès dû au cancer du côlon avec métastase généralisée) | 0.5 | 1 | 8 | Nd | 6.73 | Pathologie de la mauvaise annonce, BG-SVD modéré | ||||
| 11 | M | BB 118 | I 1211 | 79 | 13 | NOLD (décès dû à un cancer du foie) | 0 | 2 | 3 | Nd | 6.51 | SVD modéré | ||||
| 12 | M | BB 236 | I 521 | 80 | 3 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 4 | 1 | 15 | Nd | 6.15 | Pathologie de la MALADIE ÉLEVÉE, Grave BG-SVD (plusieurs microbrés), HS | ||||
| 13 | F | BB 138 | 85 | 3 | Principale-MNT en raison de multiples étiologies (AD-VaD BPSD) | 4 | 0 | 15 | Nd | 6.75 | Pathologie ad élevée, SVD modéré, CAA, TDP limbique43 | |||||
| 14 | M | BB 109 | I 876 | 79 | 8 | NOLD (mort due à une tumeur au cerveau - GBL) | 0 | 1 | 16 | Nd | 6.4 | Pathologie de la maladie d’AD faible, ILBD (Beach IIa), SVD doux | ||||
| 15 | F | BB 271 | 84 | 8 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 4 | 1 | 2 | Nd | 6.7 | AD intermédiaire, LTS limbiques, BG-SVD modéré, mCAA, TDP | |||||
| 16 | F | BB 71 | I 1080 | 79 | 8 | NOLD (décès dû à une insuffisance cardiaque) | 0 | 0 | 6 | Nd | 6.26 | Modéré BG-SVD, ILBD, amy TDP, faible AD | ||||
| 17 | F | BB 189 | I 858 | 80 | 5 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 3 | 0 | 20 | Nd | 6.42 | AD intermédiaire, CAA-capCAA, TDP43, BG-SVD modéré, HS | ||||
| 18 | F | BB 278 | I 924 | 80 | 5 | Principale-MNT due à la DLB (BPSD) | 3 | 1 | 5 | 6.02 | 7.05 | AD intermédiaire, LTS limbiques (Plage IV), TDP limbique, HS | ||||
| 19 | F | BB 247 | 104 | 8 | Major-NCD en raison de multiples étiologies (probablement une pathologie mixte) | 3 | 0 | 6 | 6.48 | 7.22 | PATHOLOGIE TAU (PART-ARTAG), HS | |||||
| 20 | M | BB 85 | I 19 | 83 | 10 | Principale-MNT due à la DLB (BPSD) | 3 | 1 | 9 | 6.26 | 7.3 | LTS limbiques sévères, AD intermédiaire, SVD modéré, CAA-capCAA grave, HS | ||||
| 21 | F | BB 14 | I 222 | 82 | 8 | Major-NCD en raison de multiples étiologies (AD-VaD) | 2 | 1 | 11 | 5.59 | 6.4 | Pathologie intermédiaire de la PUBLICITÉ, SVD modéré | ||||
| 22 | F | BB 282 | 76 | 8 | MNC frontotemporal majeur (NfpPA BPSD) | 3 | 1 | 10 | 6.07 | 6.39 | TDP (type A), ILBD, SVD modéré, faible AD, HS | |||||
| 23 | F | BB 154 | I 1079 | 80 | 5 | NOLD (décès dû à un cancer avec métastase généralisée) | 0 | 1 | 5 | 6.49 | 6.9 | SVD modérée, CAA, faible AD, encéphalite limbique | ||||
| 24 | F | BB 290 | 65 | 13 | principale MNT Frontotemporal (BBVTD BPSD) | 5 | 1 | 12 | 5.73 | 6.42 | TDP (type A) | |||||
| 25 | F | BB 210 | 89 | 8 | Les MNT majeurs dus à la PUBLICITÉ (BPSD) | 5 | 1 | 15 | 5.94 | 6.4 | en cours | |||||
| 26 | M | BB 293 | 75 | 18 | MNC frontotemporal majeur (BBVTD BPSD) | 5 | 1 | 8 | 6.14 | 6.83 | en cours | |||||
| 27 | F | BB 99 | I 1370 | 79 | 9 | NOLD (décès dû à un choc septique) | 0 | 2 | 14 | 6.3 | 7.12 | en cours | ||||
| M/F | Veux dire | Veux dire | Veux dire | Veux dire | Veux dire | Veux dire | Veux dire | |||||||||
| 0.5 | 81 | 7.7 | 3.2 | 1.0 | 10.4 | 6.1 | 6.6 | |||||||||
Tableau 3 : Diagnostic clinique/neuropathologique de la série ABB. BB: Brain Bank; edu (ans): années d’éducation; CDR : Évaluation clinique de la démence (0 = pas de démence; 0,5 = déficience cognitive légère; 1 = démence légère; 2 = démence modérée; 3 = démence grave; 4 = démence très grave; 5 = démence terminale); AFS: Score de facteur agonal; PM (hrs): Heures post mortem; nd: pas fait; M/F: Hommes/Femmes; BPSD : Symptômes comportementaux et psychologiques de la démence ; VaD : Démence vasculaire ; NOLD : Personnes âgées normales ; GBL: Glioblastome; nfppa : aphasie progressive primaire non fluide ; bfftD : variante comportementale de la démence frontotemporale ; SVD : Maladie des petits navires; LTS: Lewy Type Synucléinopathy; HS : Sclérose hippocampale ; CAA : Angiopathie amyloïde cérébrale ; capCAA: CAA capillaire; mCAA: CAA méningé; ILBD : Maladie secondaire du corps de Lewy ; BG: Ganglions basaux; ARTAG : Astro-gliopathie tau liée à l’âge; PARTIE : TAUopathie liée à l’âge primaire ; amy: amigdala.
| Domaine | Nom du test |
| Dépression | Échelle de dépression du Center for Epidemiology Studies (CES-D) [2] |
| Cognition globale | Mini-examen de l’état mental (MMSE) [1] |
| Mémoire verbale et visuelle | Test de rappel sélectif gratuit et cued [3] |
| Test Corsi [4] | |
| Rappel de la figure du complexe Rey-Osterrieth (ROCF) [5] | |
| Attention/ vitesse psychomotrice | Trail making A [6] |
| Matrices attentionnelles [4] | |
| Mémoire sémantique du langage | Maîtrise verbale sémantique (couleurs, animaux, fruits, villes) [4] |
| Fonctions exécutives | Trail making B [6] |
| Matrices colorées de Corbeau [7] | |
| Capacités visuospatiales | Test de dessin d’horloge (CDT) [8] |
| Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Copie [5] |
Tableau 4 : Évaluation neuropsychologique des donneurs de cerveaux.
| Métabolites |
| Numération complète du sang |
| Cholestérol HDL et LDL |
| Triglycérides |
| Glucose |
| Hémoglobine glyquée (HbA1c) |
| Homocystéine |
| Cobalamine (vitamine B12) |
| Folate |
| Albumine |
| Urée |
| Créatinine |
| Transaminases (ALT et AST) |
| Transférase gamma glutamy |
| Hormone thyroïdienne stimulante (TSH) |
| Vitamine D (25-hydroxy-vitamine D) |
| Protéine c réactive (CRP) |
| Électrolytes |
Tableau 5 : Panneau métabolique pour les donneurs de cerveaux.
| NOM DU GÈNE | dbSNP |
| Apolipoprotéine E (APOE) | rs429358 |
| rs7412 | |
| Catalase (CAT) | rs1001179 |
| Superoxyde dismutase 2 (SOD2) | rs4880 |
| Angiotensinogène (AGT) | rs699 |
| Sirtuin 2 (SIRT2) | rs10410544 |
| Translocase de la membrane mitochondriale externe 40 (TOMM40) | rs2075650 |
| Intégrateur de pontage 1 (BIN1) | rs7561528 |
| Catéchol-O-méthyltransférase (COMT) | rs4680 |
| Méthylènetetrahydrofolate réductase (MTHFR) | rs1801133 |
| rs1801131 | |
| Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) | rs6265 |
| soluté carrier family 6, member 4 (SLC6A4 ou 5HTT) | Région polymorphique liée au gène de l’hydroxytryptamine (5-HTTLPR) |
| rs25531 |
Tableau 6 : Snp analysés pour les donneurs de cerveau InveCe.Ab.
| Processus | Solution | Durée | |
| EXEMPLES DE MACRO | MICRO ÉCHANTILLONS | ||
| FIXATION | 10% FORMALINE TAMPONNÉE | 8 jours à 4 °C | 8 jours à 4 °C |
| Lavage | TAMPON DE PHOSPHATE | 2-15 jours à température ambiante | 2-15 jours à température ambiante |
| Lavage | H2O WASH | 2-3 h, eau du robinet | 2-3 h, eau du robinet |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 70% | 24 h | 8 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 80% | 24 h | 4 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 90% | 60 h (habituellement le week-end) | 4 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 95% | 12 h | 4 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 95% | 12 h | 4 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 100% | 6 h | 4 h |
| Déshydratation | ALCOOL ÉTHYLIQUE 100% | 6 h | 4 h |
| Compensation | XYLÈNE I | 12 h | 10 h |
| Compensation | XYLÈNE II | 12 h | 10 h |
| Infiltration | PARAFFINE I | 12 h | 11 h |
| Infiltration | PARAFFINE II | 12 h | 11 h |
| Intégration | Paraffine | ||
Tableau 7 : Protocole de traitement des tissus ABB.
| Région | H&E | CRESIL VIOLET | Lfb | GALLYAS | 4G8 | AT8 | α-SYN | TDP-43 | Neun | GFAP |
| Tronc cérébral | ||||||||||
| Médulla- Noyau moteur dorsal de Vagus | X | X | X | |||||||
| Pons - Locus Coeruleus | X | X | X | |||||||
| Midbrain - Substantia Nigra | X | X | X | X | ||||||
| Cervelet | ||||||||||
| Cortex cérébelleux et noyau dentate | X | X | X | X | ||||||
| Cerveau | ||||||||||
| Gyrus frontal moyen | X | X | X | X | X | X | X | |||
| Ganglions basaux + noyau de Meynert | X | X | X | X | X | X | ||||
| Cingule, antérieur | X | X | X | X | X | X | X | |||
| Amygdale | X | X | X | X | X | X | ||||
| Thalamus et noyau subthalamique | X | X | ||||||||
| Gyri temporel supérieur et moyen | X | X | X | X | X | X | X | X | X | |
| Hippocampe et cortex entorhinal | X | X | X | X | X | X | X | X | X | X |
| Lobule pariétal inférieur | X | X | X | X | X | X | X | |||
| Cortex occipital | X | X | X | X | X | |||||
| Ampoule olfactive | X | X | ||||||||
Tableau 8 : Régions évaluées, coloration et immunohistorique.
Discussion
Étapes critiques du protocole
Notre objectif est d’obtenir, caractériser et stocker des tissus de bonne qualité provenant de sujets ayant une histoire détaillée dérivée de l’observation longitudinale. Afin d’atteindre cet objectif, il est nécessaire de traiter les aspects clés suivants. Comme décrit ci-dessus, le protocole commence par le recrutement des donateurs, qui est la première étape cruciale. Ensuite, il est nécessaire que les donateurs poursuivent le programme de suivi et maintiennent l’adhésion au projet au fil du temps jusqu’au don réel du cerveau. Au moment du décès, il est nécessaire que le personnel d’ABB soit rapidement avisé afin de convoquer l’équipe d’autopsie dans les 24 heures, ce qui est important pour une qualité adéquate des tissus. La coupe fraîche des hémisphères cérébraux nécessite une main stable et une formation spécifique. Pour éviter les dommages cellulaires causés par le gel lent et obtenir des tranches de bonne qualité pour le cryostat et omics, il est important qu’ils soient congelés rapidement. Compte tenu de la vitesse de pénétration de la solution de formaline (1 mm/heure), pour préserver l’antigénicité des tissus, le temps de trempage de la seule tranche est maintenu à son minimum.
Dépannage de la méthode
Afin de répondre aux étapes critiques mentionnées ci-dessus, nous offrons l’approche suivante. Recrutement des donneurs et adhésion aux suivis : Il existe plusieurs facteurs qui entravent le don du cerveau, y compris la crainte d’endommager la figure, la pureté et l’intégrité du corps, ou la possibilité de ressentir de la douleur après la mort. Certains craignent même que l’autopsie puisse être menée alors qu’ils sont encore en vie70,71. Des préoccupations concernant la perturbation des arrangements funéraires et le fardeau financier sont également présents72. En outre, le manque de connaissances du personnel médical sur les procédures post mortem et l’incapacité de répondre aux préoccupations des donneurs potentiels ou de leurs NOK peuvent décourager l’enregistrement. Tous ces facteurs peuvent produire un faible niveau de sensibilisation avec un faible nombre de participants inscrits et une forte possibilité de perte de donneurs au fil du temps. En effet, le programme de recrutement des donateurs devrait être efficace pour sensibiliser les gens, inspirer la confiance et convaincre les gens de s’inscrire et de maintenir des taux élevés de participation au suivi. D’après notre expérience, cela se fait par une sélection minutieuse des donateurs potentiels et une explication approfondie des objectifs du BB. Nous offrons des activités éducatives et une approche empathique répondant aux craintes et aux besoins des personnes en bonne santé et des personnes atteintes de maladies neurodégénératives et de leurs familles. Nous constatons que les donateurs potentiels sont plus susceptibles de donner leur consentement lorsqu’ils sont approchés en personne. Une approche en personne crée une relation fondée sur la confiance et le respect mutuels, qui est fondamentale pour atteindre un pourcentage élevé d’inscription au don de cerveau et aux évaluations de suivi. Un personnel hautement qualifié avec un fort sens de l’éthique aborde d’abord le donneur potentiel, discute de la possibilité de donner le cerveau après la mort, explique la valeur du tissu cérébral humain à la recherche neuroscientifique, et clarifie tout doute concernant les procédures post mortem. Le bouche-à-oreille favorable est tout aussi important. Après la récolte du cerveau, une attention et des soins appropriés sont accordés pour recomposer le cadavre. Il est important de montrer du respect et de la gratitude à la personne décédée en traitant le cadavre doucement. Quelques mois plus tard, une réunion est prévue pour communiquer les résultats de l’analyse neuropathologique chaque fois que les membres de la famille le demandent.
L’heure du décès et la récolte du cerveau: Lorsque la personne accepte, ils deviennent un donneur et sont donnés une carte d’identité avec un numéro à contacter 24 heures par jour, 7 jours/semaine (le numéro de réception de l’ASP Golgi-Redaelli Hôpital gériatrique qui est connecté à nous). En outre, une étiquette adhésive est donnée aux parents à utiliser en cas d’hospitalisation. Les agences funéraires de la région ont déjà été informées d’amener le corps dans les installations d’ABB, où l’équipe d’autopsie est convoquée. L’équipe d’autopsie est composée d’un pathologiste, d’un neurologue et/ou d’un neurobiologiste, et d’un technicien de salle anatomique, qui sont de garde tous les jours de 6 h à 23 h; certains étudiants stagiaires sont également fréquemment présents pour aider et prendre des photos.
La précision et la cohérence des nouvelles procédures de coupe sont assurées par la participation des deux mêmes opérateurs (un neurologue et un pathologiste) qui ont développé la méthode et ont plusieurs années d’expérience en neuropathologie. Lors de la congélation des tranches, elles sont mises sur un plateau en aluminium préfrouzen et recouvertes d’une plaque d’aluminium imbriquée pour les garder bien plates. Immédiatement après, ils sont mis dans l’azote liquide pendant 3 minutes, avant de les stocker à -80 °C. Les tranches à fixer sont emballées individuellement dans de la gaze et trempées dans une solution de formaline tamponnée de phosphate de 10 %, qui est remplacée après une journée. Par la suite, ils sont conservés en formaline pas plus de 5 jours supplémentaires; toutefois, étant donné que la solution formaline pénètre à 1 mm/jour, nous aimerions raccourcir davantage le temps de trempage.
Limitations de la méthode
La méthode de recherche décrite ici ne couvre qu’une zone géographique limitée, et les personnes impliquées dans le programme de don possèdent des caractéristiques qui ne représentent pas entièrement la population générale. Bien qu’il soit plus qu’acceptable, un intervalle post mortem pouvant aller jusqu’à 24 heures peut produire des altérations dans certaines structures protéiques, enzymes et ARN des tissus cérébraux. La détermination de l’AFS et du pH peut ne pas être entièrement suffisante pour déterminer la qualité des tissus73 et nous développons d’autres moyens d’authentifier la qualité des tissus en fonction de l’intégrité de l’ARN.
En ce qui concerne la procédure de coupe des microtomes, bien que très utile pour reconstruire les relations anatomiques, il convient de noter que l’utilisation de macrosections n’est pas simple et présente quelques difficultés techniques. Notre méthode est difficile et prend beaucoup de temps. Les coûts sont assez élevés et le financement n’est pas toujours facile. Le financement provient principalement de ressources publiques (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) et privées (Fondation Golgi-Cenci), de dons privés, d’organismes à but non lucratif (p. ex. « Federazione Alzheimer Italia ») et de subventions de participation.
L’importance de la méthode ABB par rapport aux méthodes existantes/alternatives
Au début, notre programme de don de cerveau s’adressait aux personnes participant à l’étude longitudinale InveCe.Ab. En conséquence, les cerveaux donnés sont accompagnés d’informations cliniques, biologiques et sociales détaillées recueillies au fil des ans. La force d’ABB découle précisément de cette origine distinctive. En effet, l’étude d’un groupe de personnes socialement et génétiquement apparentées qui partagent des caractéristiques biologiques et des expositions environnementales améliore l’analyse statistique. En outre, l’étude comprend les avantages suivants : 1) S’occuper des besoins de la communauté (l’acte de « donner avant de demander ») : les personnes reçoivent un contrôle périodique gratuit dont le médecin généraliste est informé, un numéro de téléphone de notre secrétaire est fourni pour les consultations, et les personnes gravement handicapées sont visitées à la maison; 2) Engager les participants, les personnes ayant des rôles publics et les omnipraticiens dans des activités éducatives par l’organisation de séminaires périodiques (liés à la santé du cerveau, au don du cerveau et à la santé générale) et la planification de cours thématiques (p. ex. l’utilisation de dispositifs de technologie de l’information pour les personnes âgées); 3) Rencontrer des gens et adopter une approche en personne. Tous ces éléments constituent la force du projet ABB. De plus, le projet améliore les capacités cliniques du personnel médical impliqué, car il acquière de l’expérience dans les évaluations antemortem et les évaluations neuropathologiques postmortem. À cet égard, nous aimerions mentionner l’expérience très particulière de « l’étude de recherche sur le vieillissement des minorités ». Cette étude a porté sur un nombre limité et sélectionné d’Afro-Américains résidant dans la région de Chicago (784 sur 1 357 sujets admissibles : taux de réponse de 57 %). Les participants ont été visités chaque année à la maison et on leur a demandé de se joindre au programme de don de cerveaux. Cette étude est basée sur une approche inhabituelle avec certaines similitudes avec la nôtre obtenir des pourcentages élevés de réponse positive au programme de don de cerveau (352 donneurs sur 784 participants étaient inscrits: 44%), bien que le taux d’autopsie n’était pas tout à fait satisfaisant (53%)74. Tout comme dans « L’étude de recherche sur le vieillissement des minorités », nous offrons des activités éducatives et une approche empathique, obtenant d’excellents résultats. En particulier, notre taux de réponse est de 93%, le pourcentage d’inscription est de 28,7%, et le taux d’autopsie à l’heure actuelle est de 67%. Ces taux montrent que les projets qui engagent directement les gens ont un pourcentage plus important de dons. D’autres programmes de don de cerveau, avec moins d’attention dans l’établissement d’une relation avec les donateurs potentiels, ont généralement un faible pourcentage d’inscription, étant d’environ 10-15% ou moins73,75.
Il y a peu d’études de cohorte précédentes se terminant par une analyse neuropathologique. En outre, la majorité des banques de cerveaux et des dépôts sont centrés sur la maladie et il ya une pénurie de cerveaux « témoins » de donneurs en bonne santé par rapport au nombre de cerveaux « malades ». Seul un nombre limité de BB sont basés sur des études de population impliquant des sujets malades et normaux afin d’étudier les trajectoires de vieillissement73,74,76,77,78,79,80. Certaines études telles que « L’étude de recherche sur le vieillissement des minorités » aux États-Unis74 et « L’étude Vantaa 85 + » en Finlande76 sont semblables à la nôtre, mais elles ont tendance à s’épuiser avec la fin de la cohorte. Au lieu de cela, le programme de dons d’ABB devrait se poursuivre pendant une longue période à l’avenir, enrôlant les donateurs potentiels et en programmant des suivis même après la fin de l’étude longitudinale InveCe.Ab. Cette approche rend notre méthode de recrutement semblable à celle du programme de don de cerveau de l’Institut de recherche en santé solaire (IRS) qui vise une communauté de retraités73. Le protocole SHRI pour le don de cerveau est très efficace avec l’intervalle post mortem moyen le plus court dans le monde (3,92 heures). Semblable aux plus grands BB dans le monde, le protocole SHRI a simplement coupé le cerveau, le cervelet et le tronc cérébral dans la ligne médiane (plan sagittal), puis une moitié est disséquée fraîche et congelée pour des études biochimiques, tandis que l’autre est fixé en formaline pour l’évaluation histopathologique. Cependant, l’une des forces du protocole de dissection SHRI est la fixation de tranches individuelles au lieu de l’hémisphère entier. En effet, fixer un hémisphère dans son ensemble n’est pas optimal, en raison des différents gradients de fixation entre la surface et le noyau. En outre, les protéines corticales peuvent être affectées par une exposition prolongée à la solution de formaline. Ainsi, la raison pour laquelle nous avons décidé de fixer des tranches individuelles.
La décision quant à quel côté est fixé ou gelé, dépend de la banque singulière (toujours la même, aléatoirement assignée ou assignée selon que le jour de la dissection est impair ou même)31,32,33,34,35. Ainsi, l’analyse biochimique et histopathologique est menée séparément sur chaque hémisphère. Comme de nombreuses maladies neurologiques sont asymétriques, notre BB offre un protocole unique pour trancher des spécimens frais : des sections alternatives du tronc cérébral et de chaque hémisphère de cervelet et de cerveau sont conservées comme matière fixe ou congelée ; une tranche fixe sur un hémisphère correspond à une tranche congelée sur l’autre hémisphère. Notre méthode donne l’occasion d’obtenir une caractérisation histologique complète de tous les matériaux congelés et de comparer les résultats de toutes les zones des deux côtés. Comme dit dans l’introduction, la méthode décrite nous permet d’obtenir autant d’informations que possible à partir du tissu cérébral. En outre, la méthode d’ABB donne une caractérisation neuropathologique de base mais complète, y compris presque toutes les protéines cérébrales connues et la pathologie vasculaire. En raison du rôle controversé des lésions vasculaires dans la détermination des troubles cognitifs, nous avons décidé d’utiliser une double notation pour le fardeau vasculaire30,53.
Comme expliqué dans le protocole, nous utilisons une approche multidisciplinaire. Bien qu’il s’agisse d’une méthode longue et laborieuse, nous croyons qu’elle offre plusieurs avantages pour la recherche. Par exemple, dans un travail précédent, nous avons démontré que le tHcy élevé en soi, ou MTHFR C677T TT associé à l’allèle APOE-ε4, peut être lié à des dysfonctionnements exécutifs plutôt que la perte de mémoire81. Par conséquent, il peut être intéressant d’évaluer les sujets avec ce profil génétique particulier au niveau neuropathologique. Il s’agit d’un exemple de la façon dont un tel suivi approfondi est utile pour créer de nouvelles hypothèses de recherche vérifiables par l’étude des matériaux biologiques recueillis dans notre banque. Une autre démonstration de l’avantage de notre approche est l’inclusion du QEEG dans les évaluations que nous effectuons régulièrement, pour son originalité et la relative facilité d’utilisation. En effet, EEG détecte l’activité synaptique du cortex cérébral en enregistrant les potentiels électriques des dendrites appartenant aux neurones pyramidaux corticaux82. QEEG peut être considéré comme un biomarqueur pour l’estimation de l’activité synaptique corticale qui est liée à la cognition83. En particulier, une diminution des rythmes alpha dans la partie postérieure du cerveau avec une augmentation générale des fréquences inférieures (rythmes theta et delta) a été liée à la rupture de connexion corticale. Il convient de considérer que la plupart des études de corrélation diagnostique ont été basées sur un diagnostic clinique qui n’est qu’un diagnostic probable et non un diagnostic défini84,85,86,87. Seules très peu d’études ciblées ont comparé les données du QEEG à l’image neuropathologique pour étudier la corrélation entre les variantes QEEG et LTS88,89, et la distinction entre FTLD et AD83. En terminant notre étude par une définition du diagnostic neuropathologique, il est alors possible d’interpréter correctement les observations faites sur l’activité électrique cérébrale. En outre, l’exécution de QEEG série dans chaque sujet, nous pouvons suivre la trajectoire intra-individuelle des ondes EEG et leurs corrélations avec l’image neuropathologique. Suivre des modifications individuelles de l’activité électrique corticale au fil du temps peut conduire à une meilleure compréhension de sa signification en tant que biomarqueur pour la démence naissante.
Applications futures et orientation de la méthode
La mise en œuvre de la distribution des tissus est l’un de nos principaux objectifs potentiels. Pour ce faire, nous venons de mettre sur pied une commission scientifique comprenant le directeur de la Fondation GC (gériatre), un universitaire en neurologie de l’Université de Pavia, un neurologue et un pathologiste de la Fondation GC et de l’Hôpital gériatrique ASP Golgi-Redaelli. Lors de la distribution de tissus cérébraux, de diapositives histologiques et d’autres échantillons biologiques, il est important de se rappeler que les donateurs ont accepté le don pour des raisons de recherche. La distribution des documents devrait donc avoir lieu avec prudence, comme le décrit le Code de conduite BNE40. Toute partie qui présente une demande de documents doit indiquer le type et la quantité de l’échantillon nécessaire, fournir une description du projet de recherche et comment les échantillons seront utilisés et, dans la mesure du possible, fournir des preuves de publications antérieures (pour l’accord de transfert, voir la figure 9). La banque de cerveaux ne fonctionne pas pour un gain financier. Ainsi, les frais payés par les chercheurs ne devraient couvrir que les dépenses de l’approvisionnement, du traitement, de l’entreposage et de la distribution de tissus.
Les plans pour commencer à analyser les cas avec le séquençage d’exome et les techniques d’omics, telles que la protéomique et la transcriptomique, sont en mouvement. Notre méthodologie d’échantillonnage alternative permettra d’effectuer des études d’omics sur des tissus histologiquement bien définis des deux hémisphères. Grâce à cette approche, il sera possible de comparer le modèle d’activation des gènes dans différentes zones du cerveau d’un même hémisphère et dans les zones correspondantes de l’autre hémisphère, et d’être en mesure de corréler l’activation des gènes avec l’histopathologie. Dans ce domaine, les applications d’apprentissage profond seraient d’un grand intérêt, y compris l’analyse informatisée des diapositives histologiques et la corrélation de pointe des données cliniques, histologiques et omiques. D’autres corrélations entre de nombreuses variables différentes peuvent être identifiées ainsi que d’autres applications technologiques possibles. La disponibilité de matériaux congelés des deux hémisphères permettra une topographie précise de l’activation des gènes et de la distribution des protéines. Cela sera d’un intérêt particulier, même pour les sujets sains, étant donné que les fonctions cérébrales et certaines maladies sont asymétriques.
En outre, nous pouvons obtenir des cultures cellulaires de donneurs de cerveau bien caractérisés. En effet, les cultures cellulaires des leptomeninges des cerveaux récoltés fournissent des cellules vivantes qui peuvent être utilisées pour une étude plus approfondie de la maladie ou des mécanismes de vieillissement, au moyen de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) qui consiste à reprogrammer les fibroblastes leptomeningés et à les différencier en cellules neuronales dans les modèles avancés90.
À mesure que le cerveau vieillit, différents profils de changement peuvent se produire au niveau moléculaire, cellulaire et tissulaire. Chaque cerveau est unique. Chacun a sa propre façon de répondre aux facteurs de stress internes et externes; certains résistent tandis que d’autres succombent et affichent des pathologies distinctes. Des écarts entre la présentation clinique et l’image neuropathologique existent souvent parce que la topographie des lésions, plutôt que leur nature moléculaire, détermine la présentation clinique. Le diagnostic correct et défini ne pouvait être réalisé qu’en combinant le syndrome clinique avec les résultats neuropathologiques qui ajoutent souvent des indices étiologiques importants nécessaires pour démêler la pathogénie des maladies. En Europe, il y a un effort pour créer une approche standard du diagnostic neuropathologique. Notre protocole de diagnostic suit presque complètement les lignes directrices récemment publiées sur le diagnostic neuropathologique pour les banques de cerveau91. Cela nous permettra de collecter et de partager des tissus cérébraux bien documentés, dans le but potentiel d’établir la première banque italienne de cerveaux. En effet, en Italie, il existe des dépôts cérébraux, mais pas des banques de cerveaux basées sur des études de cohorte. Notre objectif est de développer une méthode de récolte des tissus cérébraux qui peut être mise en œuvre dans toute l’Italie, afin d’établir un réseau qui utilise un protocole commun et partage des matériaux comparables. Pour ce faire, la participation d’autres centres de recherche et la création d’un site web spécifique sont parmi les principaux objectifs pour l’avenir.
Des technologies innovantes sont constamment utilisées pour l’analyse de la nature moléculaire des maladies neurodégénératives et pour l’identification des biomarqueurs. Dans ce contexte, il y aura un besoin croissant de cerveaux accompagné d’informations sur les trajectoires cognitives et de vieillissement obtenues par le biais d’études longitudinales, soulignant l’importance d’une approche épidémiologique vérifiée neuropathologiquement92.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous souhaitons dédier ce travail au Dr.ssa Michela Mangieri. Avant de mourir prématurément, elle a conçu et lancé le projet Abbiategrasso Brain Bank.
Nous sommes reconnaissants à nos donneurs de cerveau, qui contribuent généreusement à la recherche en faisant don de l’organe le plus noble de leur corps; sans eux, cette recherche ne serait pas possible.
Nous sommes reconnaissants à Valeria Marzagalli pour son travail précieux dans le projet ABB.
Les auteurs remercient le Professeur Johannes Attems, le Dr Paolo Fociani et le Dr Giorgio Giaccone pour leurs précieux conseils et leurs sages conseils.
Nous tenons à remercier la Dre Alice Cirrincione et Mlle Giulia Bortone pour leur précieuse aide tout au long du projet.
Un grand merci à Mme Tere Cassani pour son soutien et à « Federazione Alzheimer Italia » pour sa collaboration.
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Matteo Moretti et au Professeur Antonio Marco Maria Osculati, Département de santé publique, médecine expérimentale et médico-légale de l’Université de Pavia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
| Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
| Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
| Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
| Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
| Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
| Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
| Cutting board | BD | 352070 | |
| DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
| Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
| Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
| Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
| EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
| EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
| Ethylether | SMI | 8401530 | |
| Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
| Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
| Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
| Gloves | CEA | 01.28.14 | |
| Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
| Head supporter | Lacor | 60456 | |
| L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
| Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
| Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
| Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
| Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
| Sterile scalpel with n°21 blade | |||
| Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
| Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
| Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
| Feather | M130RC |
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