Summary
이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.
Abstract
C. 예쁜꼬마선충은 배아 발달 중 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 체계적으로 분석하기 위한 최고의 시스템입니다. 한 가지 과제는 배아 발생이 약 13시간 동안 동적으로 전개된다는 것입니다. 이 반나절 긴 기간 척도는 이미지화 할 수있는 배아의 수를 제한하여 실험의 범위를 제한했습니다. 여기에서는 중간 시간 해상도에서 최대 14개의 다른 조건에서 단일 하룻밤 실행에서 80-100개의 배아에서 동시에 3D 시간 경과 이미징을 허용하는 반 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 간단하며 지점 방문 용량을 갖춘 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 세균 층 명세서 및 형태 형성의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 표현하는 두 개의 맞춤형 균주를 이미지화하는 데 사용함으로써 입증됩니다. 데이터를 분석하기 위해 모든 채널, z-스텝 및 타임포인트에서 개별 배아를 더 넓은 시야에서 자르는 사용자 지정 프로그램을 구축하고 각 배아에 대한 서열을 별도의 티프 스택으로 저장합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 이 프로그램은 시각화 또는 자동화된 분석을 준비하기 위해 개별 배아를 분리, 전처리 및 균일하게 방향을 지정하여 데이터 처리를 간소화합니다. 또한 각 배아의 최대 강도 형광 투영 및 각 배아의 밝은 필드 이미지를 표시하는 다중 패널 파일로 개별 배아 데이터를 컴파일하는 ImageJ 매크로가 제공됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜 및 도구는 이전에 기술된 40개의 발달 유전자의 노크다운 에 따른 배아 발달을 특성화하기 위해 이를 사용하여 검증되었다; 이 분석은 이전에 추가된 발달 표현형을 시각화하고 새로운 표현형을 밝혔습니다. 요약하면, 이 작품은 유익한 형광 마커를 표현하는 균주와 결합될 때, 분석하기 위한 실험을 크게 가속화하는 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구와 결합된 반고처리량 이미징 방법을 자세히 설명합니다. 배아 발달.
Introduction
상기 C. elegans 배아는 기계론적 세포 생물학 및 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건의 분석을 위한 중요한 모델 시스템으로 배아발달을 유도하는 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. 현재까지, 배아에서 세포 수준 사건 및 세포 운명 명세둘 다의 특성의 다량은 상대적으로 높은 시간 별 화상 진찰 실험을 사용하여 달성되었습니다 (즉, 10-100 s마다 취득) 배아발 발현 형광 마커. 초에서 수십 분의 순서로 이벤트에 적합하지만 이 방법은 기술적으로 더 긴 프로세스의 특성화에 대해 몇 시간에서 며칠로 제한됩니다. 연신장의 끝에 첫번째 절단에서 배아 발달은 대략 10 시간 걸립니다. 이 시점에서, 동시 낮은 시간 해상도 이미징을 허용 하는 반 높은 처리량 방법 (즉, 5-20 분 시간 간격에서 취득) 배아의 더 큰 코호트, 다른 조건에서, 실험의 새로운 범위를 열 것 이다; 예를 들면, 체계적인 대규모 검열 노력을 가능하게 하고 분자 섭란의 결과의 비교를 위한 태아의 충분한 수의 분석.
여기에서, 우리는 C. elegans 배아 발생을 감시하기 위한 반 높은 처리량 방법을 기술합니다 80-100배아에 있는 발달의 동시 3D 시간 경과 화상 진찰을 가능하게 하는, 14개의 다른 조건까지, 단 하나 밤새 실행에서. 이 프로토콜은 구현이 간단하며 포인트 방문 기능이있는 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 배아는 관심의 형광 마커를 발현하고 젊은 배아 (2-8 세포 단계)를 화상 진찰을 위한 384 웰 판의 우물로 옮기는 gravid 성인에게서 해부됩니다. 이 형식에서는, 상대적으로 작은 잘 크기는 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 배아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 좁은 지역으로 배영을 깔때기. 배아 의 코호트에 걸쳐 대략 동기 발달을 유지하기 위해, 해부는 차가운 매체에서 수행되고 플레이트는 1 시간 긴 해부 시간 기간 동안 중요한 발달을 방지 얼음에 개최됩니다. 플레이트는 현미경으로 이송되고 배아는 60x 오일 침지 1.35 NA 렌즈를 사용하여 20 분 간격으로 밤새 온도 제어 실에서 촬영되어 2 μm 단계에서 전체 z 범위를 수집합니다. 1-5개의 배아를 포함하는 각각 50개의 필드는, 한 번의 하룻밤 실행에서 심상됩니다. 원하는 실험에 따라 이미지 필드 수를 비례적으로 줄임으로써 시간 해상도(예: 5-10분 간격으로 이미징)를 늘릴 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하면 하룻밤 동안 실행해도 상당한 양의 데이터(50개 필드에 분산된 80~100개의 배아)를 생성하며, 더 큰 실험은 데이터 분석과 관련하여 빠르게 관리하기 가 불가능해질 수 있습니다. 이 데이터의 처리, 시각화 및 분석을 용이하게 하기 위해 배아를 자르고 방향을 조정하고 전처리 단계(선택 사항)를 수행하고 데이터를 컴파일하여 보기를 단순화하는 ImageJ 매크로를 수행하는 프로그램이 구축되었습니다. 이러한 프로그램은 이미징 방법과 무관하므로 단일 브라이트필드 평면만 필요로 하기 때문에 기존의 접근 방식을 사용하여 수집된 이미지를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 프로그램은 여러 배아 (GUI 옵션 또는 소스 코드 embryoCrop.py) 또는 여러 배아 (screenCrop.py)를 포함하는 여러 4D 필드를 포함하는 4D 필드에서, 단단히 배아를 작물과 전방 후방 구성에서 방향을 지정합니다. 또한 이러한 프로그램은 사용자에게 배경 감속, 드리프트 보정 및 감쇠 보정을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다. 결과 파일은 자동화된 이미지 분석으로 수정가능한 각 배아에 대해 균일하게 사전 처리되고 단단히 잘려진 티프 스택입니다. 각 조건에 대한 모든 배아를 더 간단하게 볼 수 있도록 ImageJ 매크로(OpenandCombine_embsV2.ijm)가 작성되어 주어진 상태의 모든 배아를 단일 티프 스택으로 조립하고 밝은 필드 이미지와 최대 강도 프로젝션 색상을 배열합니다. RGB) 각 배아에 대해 나란히 오버레이합니다. 이 방법은 배아 층의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 발현하는 한 쌍의 사용자 정의 내장 균주에서 40 개의 이전에 설명 된 발달 유전자를 노크 한 후 배아 발달을 특성화하는 데 사용함으로써 검증되었습니다. 사양 및 형태 형성10,11. 함께, 세미 높은 처리량 배아 이미징 프로토콜 및 이미지 처리 도구는 개발 프로세스를 이해하기위한 더 높은 샘플 수 실험및 대규모 선별 노력을 가능하게 할 것이다. 또한, 이러한 균주는 또한 배아 발생에 대한 분자 교란의 효과를 검사하기위한 효율적인 수단을 제공 할 것입니다.
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Protocol
1. 세미 하이 처리량 이미징을 위한 C. 예쁜꼬마선충 배아 준비
참고: 프로토콜의 이 부분의 목표는 반 동기화 (2 to 8 세포 단계) C. 예쁜꼬마선의 집단을 적절한 마커 균주로부터 해부하는 것입니다(그림 2),이미징을위한 유리 바닥 384 웰 플레이트. 그밖 격판덮개 는 또한 작동할 수 있었습니다, 그러나 작은 우물 크기가 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 태아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 상대적으로 작은 지역에 태아의 퍼짐을 제한하기 때문에 384 웰 플레이트는 바람직합니다. 대략 배아를 동기화하는 것은 발달의 전체 과정이 필드에 있는 각 태아를 위해 붙잡히도록 합니다.
- 얼음 차가운 M9 배지에 용해된 테트라미솔 염산염(TMHC)의 5-10 mL 용액을 준비합니다(0.45 M Na2HPO4∙7H2O, 0.11 M KH2PO4,0.04 M NH4Cl) 동안 사용 해부 및 이미징. 이 매체는 부화한 유충을 움직이게 하는 것이 초기 발달 단계에서 태아의 화상 진찰을 방해하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 마취를 포함합니다.
참고: 자르기 및 시각화 도구를 사용하여 표준 아가로즈 패드 장착 방법을 사용하여 수집한 데이터를 분석하는 경우 아래 섹션 3으로 건너뜁니다. - 유리 바닥 384 웰 플레이트의 개별 웰로 제조된 용액의 Aliquot 70 μL은 각 조건에 대해 하나의 웰을 가지며; 가장자리 효과를 방지하기 위해 플레이트의 바깥쪽 두 행을 피하십시오.
참고: 접착성 PCR 플레이트 호일을 사용하여 주변 우물을 마스크하는 것이 유용합니다(그림 1D의예 참조)이 향후 실험을 위해 인접한 웰을 보존하고 해부 현미경 아래에서 적절한 웰을 쉽게 찾을 수 있도록 합니다. 용액이 부록이 되면, 판과 남은 용액을 해부 전체에 걸쳐 얼음 위에 보관하십시오. - 우울증 슬라이드에서 배아를 전달하기 위한 입 피펫을 생성합니다(gravid hermaphrodites가 해부되는 곳). 모세관 파이펫(25 μL 보정된 파이펫)을 화염 위로 당기고 파손하여 미세한 테이퍼 엔드를 생성합니다(그림1D). 교차 오염을 방지하기 위해 조건당 하나의 파이펫이 필요합니다. 사용 후에는 파이펫을 폐기하십시오.
- 미세 핀셋을 사용하여 ~ 10 그라비드 성인을 해부 범위 하에서 얼음 차가운 TMHC 용액의 150 μL로 각 조건에 대한 우울증 슬라이드에 aliquoted. 핀셋과 메스를 사용하여 벌레를 해부하여 배아를 풀어 놓습니다.
- 당겨진 모세관 피펫을 피펫에 포함된 흡기 부착물 로 적재하고, 입 피펫을 모두 2~8세포 단계배아를 제조된 플레이트의 개별 우물로 이송한다(도1D). 후기 배아와 해부 파편을 옮기지 마십시오. 해부 범위에서 검사하고 배아의 응집체가 존재하는 경우, 입 파이펫 위아래로 또는 파이펫 팁과 배아의 덩어리를 두드려 분산.
참고: 교차 오염을 방지하기 위해 해부 장비를 청소하고 조건 사이를 이동하는 동안 신선한 구강 파이프를 사용하십시오. 해부 사이에 얼음에 접시를 저장합니다. - 일단 모든 조건에서 벌레가 해부되고 배아가 적당한 우물에 두면, 배아를 정착시키기 위하여 600 x g에서 1 분 동안 384 웰 플레이트를 돌이기.
- 에탄올에 적신 물티슈로 플레이트 바닥을 닦아 잔류물을 제거하고 온도 제어 환경에서 플레이트 홀더가 장착된 공초점 현미경에 플레이트를 놓습니다.
참고: 다음 단계는 랩 설정을 사용하여 이 메서드를 자세히 설명합니다. 실험 요구 및 장비에 맞게 수집 조건을 수정하십시오. 여기서는 마이크로렌즈가 강화된 듀얼 Nipkow 회전 디스크가 장착된 공초점 스캐너 박스, 512 x 512 EM-CCD 카메라, 고정밀 자동 XY-Stage(지정 해상도 0.1 μm) 및 전동 z축 제어(지정 해상도 0.1 μm)가 사용됩니다. 이 시스템은 16°C 방에 보관되며, 이는 밤새 이미징 동안 21~23°C 사이의 현미경 온도를 유지한다. - 적합한 배아를 가진 필드를 확인하기 위하여는, 10x 0.4 NA 객관적이고 적당한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 각 우물의 사전 검사를 능력을 발휘합니다. 최적 필드는 다른 배아와 동일한 초점 면에 있는 하나 이상의 초기 단계 배아를 포함하고 이상적으로 인접한 태아 사이 최소한의 접촉을 가질 것입니다. 적합한 영역의 위치를 표시합니다.
- 이미징 필드를 선택하려면 60x 목표로 전환하고 각 지점 방문시 초점 평면을 조정하여 배아를 적절하게 단면화합니다. 우물당 1-4개의 필드가 이미지화되어 있으며, 14개의 우물에서 총 50개의 필드가 있으며, 각 필드는 1~5개의 배아를 포함할 수 있습니다. 전반적으로, 4 에서 15 배아는 고해상도 화상 진찰을 위한 각 조건에서 선택됩니다.
참고: 이 단계에서 핵심 변수는 충분한 오일의 사용입니다. 목표에 오일을 배치, 각 우물의 방문 포인트는 모든 우물의 표면 주위에 오일을 확산 한 다음 필드의 선택하기 전에 목표에 오일의 추가 방울을 적용합니다. - 60x 1.35 NA 목표를 사용하여 선택한 필드를 이미지화하여 10시간 동안 20분마다 2 μm 간격으로 18z 섹션을 획득합니다. 세균층 및 형태형성 리포터 균주를 이용한 이미징 조건은 다음과 같다: 브라이트필드, 90% 파워, 25 ms, 20% 이득; 488 nm, 100 % 전력, 200 ms, 60 % 이득; 568 nm, 45 % 전력, 150 ms, 60 % 이득.
- 이미징이 완료된 후, 야간 이미징시작 후 저배율(10x 0.4 NA 목표) 전체 의 밝은 시야 스캔 ~20-24h를 수행하여 배아 치사율을 평가한다.
2. 배아 치사 점수
- 사후 실행 10x 스캔 필드를 사용하여, 각 우물에 대한 부화 벌레와 해치되지 않은 배아를 계산하여 배아 치사및 애벌레 결함을 평가합니다.
- 배아 치명적인 으로 부화되지 않은 배아 점수. 젊은 해부 된 배아가 때때로 난자 껍질 형성을 완료하지 못하고 (만이제증 II가 아직 완전하지 않은 경우) 투과성 결함이 처음 두 개 동안 삼투성 합병증으로 이어질 수 있기 때문에 치사 수에서 체포 된 1 - 4 세포 단계 배아를 제외하십시오. 부문.
- '비정상적인 애벌레'로, 부분적으로 부화하거나 완전히 부화한 벌레의 신체 형태 또는 행동 결함(예: 덤프 또는 마비)을 점수화합니다.
3. 자동 자르기(그림 3A)
참고: 이 소프트웨어는 두 위치에 보관되어 있습니다 : (1) Zenodo는 프로그래밍 전문 지식이 필요하지 않은 소프트웨어(12)의 사용자 친화적 인 버전을 보유하고 있습니다. (2) Github는 파이썬에 능숙해야 하는 embryoCropUI.py 및 screenCrop.py 소프트웨어13의소스 코드를 포함합니다. 두 버전의 프로그램을 모두 다운로드하고 운영하기 위한 자세한 지침은 아래에서 확인할 수 있습니다.
- 배아CropUI 실행 버전을 사용하여 자동 자르기 (사용자 친화적 인 버전)
- 배아CropUI 프로그램을 사용하려면 먼저 제노도(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12에서프로그램을 다운로드합니다.
- 프로그램의 MacOS 또는 Windows 형식 버전을 다운로드합니다(MacOS 버전에는 MacOS X10.11 이상이 필요합니다).
- 배아CropUI 프로그램을 테스트하고 사용하기 위한 단계별 지침을 제공하는 지침파일(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx)을다운로드합니다.
- test_files.zip을 다운로드하여 프로그램이 플랫폼에서 제대로 작동하는지 테스트합니다(지침 참조).
- 일단 다운로드, 압축을 풀고 배아를 찾기 위해 탐색자르UI 실행 (...\배아CropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe)또는 (...\배아CropUI\_MacOS\배아CropUI\embryoCropUI\embryoCropUI\exe). 두 번 클릭하여 시작하거나 '열기' 터미널을 선택하고 배아CropUI 실행 을 실행합니다.
- GUI 실행 은 한 번에 하나의 4D 시야를 작물. 왼쪽 위 모서리에서 열린 단추를 선택하여 특정 필드를 자르기(다중 티프)로 로드합니다. 여러 차원(예: z, 시간, 채널)을 가진 tiff 계열을 자르는 경우 폴더 내의 시리즈의 첫 번째 이미지만 로드합니다(폴더당 하나의 tiff 계열).
- 이미지가 로드되면 z-슬라이스 수(Z), 시간 점 수(T), 채널 수(C), DIC 또는 브라이트필드에 해당하는 채널(첫 번째=1, 두 번째=2 등)을 지정합니다.
- 이미지에서 실행하려면 추가 처리를 선택합니다. 이 프로그램은 드리프트 보정, 배경 뺄셈 및 감쇠 보정을 제공합니다.
- GUI 프롬프트의 처리 노력을 안내하기 위해 백그라운드 빼기 및 감쇠 보정에 대한 매개 변수를 지정합니다. 배경 빼기의 경우 의미 있는 신호의 크기를 반영하도록 가장 큰 피쳐 크기를 정의합니다. 이 피쳐 크기는 배경으로 간주해서는 안 되며 홀수 값이어야 합니다. 감쇠 보정에 대한 0-1에서 값을 입력합니다. 감쇠 보정 값은 이미지되는 오브젝트의 가장 먼 깊이에 남아 있는 원래 강도의 백분율을 반영합니다.
참고: 배경 빼기 및 감쇠 보정을 함께 실행해야 합니다. - 이미지 수집 순서(예: 채널-z-시간(czt) 또는 z 채널 시간(zct))을 지정합니다.
- 사용 중인 카메라를 기반으로 이미지의 픽셀당 미크론을 지정합니다.
참고: 픽셀 크기가 제대로 정의되지 않은 경우 이미지 자르기가 잘못 발생합니다. - 왼쪽 하단 모서리에서 실행을 선택합니다. "자르기"라는 새 하위 폴더가 자르지 않은 폴더와 동일한 경로에 만들어집니다. 잘라낸 버전이 이 위치에 저장됩니다. 파일 크기에 따라 자르기는 몇 초에서 몇 분 안에 완료되어야 합니다.
- 배아CropUI 프로그램을 사용하려면 먼저 제노도(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12에서프로그램을 다운로드합니다.
- screenCrop.py 사용하여 자동 자르기 (전술한 배아작물 GUI에 대한 배치 버전 대안;파이썬에 정통한 사용자만)10,13
- screenCrop.py 사용하려면 Python 소프트웨어 버전으로 더 큰 데이터 세트를 일괄 형식으로 자르거나 Github(github.com/renatkh/embryo_crop.git)에서소스 코드를 복제하거나 다운로드합니다.
- 적절한 가상 환경을 구성하기 위한 지침을 읽고 설명된 파일 이름 지정 시스템을 따릅니다. 둘 다 Github 리포지토리의 README 파일에 자세히 설명되어 있습니다: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
- 환경 변수와 명명 규칙이 제대로 설정되면 parameters.py 열고 screenCrop.py.
- 소스 코드를 건드리지 않고 조정 가능한 매개 변수를 수정하려면 parameters.py 파일을 편집합니다.
참고: screenCrop.py 헤더 내에서 매개 변수를 직접 변경할 수도 있습니다.- parameters.py 구성 파일을 사용하는 경우 use_configure 설정을 True로 변경합니다. screenCrop.py 내에서 직접 편집을 사용하는 경우 false에서 using_configure 설정을 그대로 둡니다.
- parameters.py 파일 내에서 다음 정보를 찾아 원하는 이미징 매개 변수 및 파일 구조에 맞게 수정합니다.
- loadFolder(9줄): 파일이 저장되는 드라이브로 변경(예: Z:/, D:// 등)
- 날짜(7줄): 이미징 세션에 대한 파일이 포함된 폴더로 변경합니다. CSV 추적 파일에서 '실험 폴더 이름'이라고 합니다(지침 참조).
- trackingFile(11줄): 실험 정보가 저장되는 CSV 파일의 경로를 변경합니다.
- z(13줄): z 평면의 수로 설정합니다.
- nT(line14): 타임포인트 수로 설정합니다.
- nWells(19호선): 사용된 웰 수로 설정합니다.
- 점방문(20줄): 최대 포인트 방문 횟수(웰당)로 설정합니다.
- 10줄에서 현재 'CV1000/'가 차지하는 위치를 찾아 파일 경로에 사용된 외부 폴더를 입력합니다. 문제를 방지하려면 다음 규칙을 사용하십시오.
- 줄 12에서 잘라진 데이터에 대한 종횡비 데이터를 저장하기 위한 유효한 파일 경로를 입력합니다.
- 줄 15, 16, 17 및 18 입력 True/False에서 이미지가 다음 처리를 거치는지 여부:
- 15호선의 드리프트 보정을 위한 트루 또는 거짓 입력.
- 배경에 대한 True 또는 False 입력은 16줄에서 뺍니다. 피처 크기는 다양한 마커 변형 및 픽셀 크기에 대해 경험적으로 결정해야 합니다. 여기서 구성에서, 특징 크기는 세균층 균주에 대해 41, 모포제네시스 균주에 대해 201로 정의되었다. 배경 빼기는 감쇠 보정과 함께 수행해야 합니다.
- 17호선의 감쇠 보정에 대한 True 또는 False 입력.
- 18호선의 전방 후방 회전에 대한 입력 참 또는 거짓.
- 모든 변경 사항이 완료되면 자르기 시작할 수 있습니다. 이렇게하려면 screenCrop.py 전환하고 드롭 다운 메뉴에서 실행 으로 실행 > 파이썬 실행을 선택하여 도구 모음에서 재생 아이콘을 선택합니다.
- 자르기는 큰 데이터 집합(50포인트 방문 18z 단계, 3채널, 31개 시점)을 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있기 때문에 콘솔 창에서 자르기 진행 상황을 추적할 수 있습니다. 자르기 작업이 완료되면 저장하기 전에 작은 창에 자른 이미지의 미리 보기가 표시됩니다. 각 이미지에는 3가지 옵션이 있습니다.
- 저장: 스페이스 바를 눌러 이미지가 잘리지 않고 잘리지 않으면 이미지를 저장합니다.
- X: 이미지에 관심 영역이 잘려 있는 것으로 나타나면 X를 누릅니다. 이미지는 이름 앞에 X로 저장되어 다른 이미지와 분리됩니다.
-
삭제: 이미지가 제대로 자르지 않거나 배아가 만족스럽지 않은 경우 D를 눌러 자른 이미지를 삭제합니다.
참고: 이미지는 로드 폴더의 "자른 자른" 하위 폴더에 저장됩니다(프로그램의 9줄에 정의됨).
4. 시각화(그림 4)
참고 : OpenandCombine_embsV2.ijm10,12는 특정 변형 및 조건에 대한 모든 이미지에서 티프 파일을 쉽게 볼 수있는 ImageJ 매크로입니다. FIJI/ImageJ14,15의 설치가 필요합니다. 이 매크로는 파일 구조에 따라 실행됩니다. 다른 파일 구조와 함께 작동하도록 수정해야 합니다. 적절한 파일 구조에 대한 가이드와 중요한 고려 사항에 대한 자세한 설명은 Zenodo 리포지토리의 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx 파일 의 끝에서 찾을 수있습니다. 이 매크로와 가장 잘 인터페이스하기 위해 제대로 이름과 구조 파일을 이미징하기 전에 완전히이 지침을 읽어보시기 바랍니다. 참조하기 위해 파일 위치 구조는 다음과 같습니다.
Z:\크롭\대상\변형률\Emb#\Target_Emb#_15 자리 고유 식별자 _W##F#_T##_Z##_C#.tif
즉, Z:\크롭\EMBD0001\GLS\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
- 제노도 (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)에서 OpenandCombine_embsV2 및 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx를 다운로드합니다.
- 다음 정보를 준비합니다.
- 이미지 폴더가 저장된 위치 (자르기 다음).
- 처리될 특정 조건에 대한 이미지 폴더 이름(즉, EMBD0002)입니다. 이를 위의 예에서 "대상"이라고 합니다.
- 주어진 하룻밤 실험에 특정 15 자리 알파 숫자 고유 식별자-이 식별자는 데이터 수집 폴더 이름 (즉, 20140402T140154) 및 고유 식별자가 개별 tiff 파일 이름 (EMBD0002_Emb1_)에 포함 됩니다. 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) 당일 촬영된 모든 배아에 대해. 매크로는 이 식별자를 사용하여 동일한 날짜에 획득한 배아를 확인하고 별도의 날짜와 함께 반복되는 조건을 별도의 ImageJ 파일로 조합할 수 있습니다. - ImageJ를 열고 매크로 파일 OpenandCombine_embsV2.ijm을ImageJ 막대로 끌어서 놓거나 매크로를 직접 엽니다.
-
매크로가 열리면 3번과 4줄을 찾습니다. 다음 단계에 따라 수집된 정보를 입력합니다(섹션 4.2).
- 3번(RNAL)에서 처리할 이미지의 대상 이름을 입력합니다. 입력 다음 구조 newArray("XXXXXXXX/")에 각 대상을 입력합니다. 인용문을 포함합니다. 한 번에 여러 조건을 실행하려면 쉼표로 분리하고 괄호 안에 모든 대상 이름을 유지합니다 (예 : newArray ("EMBD0000/","EMBD0001 /","EMBD0002/").
- 4줄(날짜)에서 인용부호에 15자리 알파 숫자 고유 식별자를 입력합니다(예: newArray("20140402T140154").
- 매크로 창의 왼쪽 하단에서 실행을 누릅니다. 창이 나타나고, 이 프롬프트는 잘라진 이미지 폴더(4.4.1에 지정)를 포함하는 외부 폴더로 이동하라는 메시지를 시작합니다.
-
일단 선택되면, 이미징 매개 변수의 사양을 허용하는 다른 창이 나타납니다.
- 채널 수, Z 조각 수, 컴파일된 이미지에 레이블을 지정하는 데 사용되는 텍스트의 글꼴 크기 및 각 채널의 색상을 입력합니다.
- 모든 채널에서 자동 대비를 켜고 끄세요.
- 모든 매개 변수가 지정되면 창 하단에서 확인을 클릭합니다. 복합 파일이 어셈블되기 시작합니다. 이 작업을 완료하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 완료되면 원하는 경우 열려 있는 파일을 검토합니다. 매크로가 이미 다음과 같은 방식으로 명명 된 새로 만든 폴더에 파일을 저장 으로 저장 하지 않고 닫을 수 있습니다.: 외부 폴더 이름 (섹션 4.5의 프롬프트에 지정) + "-피지 처리 출력" (즉, Z:\ 크롭 피지 처리 출력\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).
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Representative Results
C. 예쁜꼬마기 배아 발달에 대한 분자 교란의 효과를 특성화하는 데 있어 중요한 과제는 배아가 첫 번째 절단에서 연신기 의 끝에서 20°16에서진행되기까지 약 10 시간이 걸린다는 것입니다. 배아의 큰 코호트가 동시에 이미지화될 수 있는 세미 하이 처리량 방법은 각 조건에 대한 충분한 앙상블 크기와 병렬로 여러 조건의 이미징을 허용하기 때문에 이 시간 규모의 이벤트에 유용합니다. 정량분석(그림1A).
세미 하이 처리량 이미징 방법 및 다중 마커 균주
여기에 설명된 반고처리량 이미징 방법(그림 1B에설명됨)은 384웰 유리 바닥판을 채용한다; 멀티 웰 포맷은 최대 14개의 조건을 병렬로 배열할 수 있게 해주며, 우물의 작은 크기는 검색 영역을 제한하여 고해상도 이미징을 위해 배아를 포함하는 필드의 식별을 단순화합니다. 여기서 는 마이크로렌즈가 강화된 듀얼 Nipkow 스피닝 디스크, 512 x 512 EM-CCD 카메라, 고정밀 자동 XY 스테이지(지정 해상도 0.1 μm) 및 전동 z축 제어(지정 해상도 0.1 μm)가 장착된 공초점 스캐너 박스를 사용했습니다. 그러나 이 프로토콜은 정밀한 포인트 방문 기능과 멀티 웰 플레이트를 수용할 수 있는 스테이지 어댑터를 갖춘 모든 공초점 현미경에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 방법을 개발하는 데 있어 중요한 과제는 동일한 발달 단계에서 배아판을 생성하는 수단을 고안하여 각 분야의 모든 배아에 대해 전체 적인 발달을 포착할 수 있도록 하는 것이었습니다. 이것은 화상 진찰 격판덮개에 배열된 태아가 나중에 견본이 해부되는 동안 발전하는 것을 계속할 것이기 때문에 도전입니다, 우물을 가로질러 발판의 구배를 초래하. 이 문제를 우회하기 위해, 초기 단계 배아 (2-8 세포 단계)를 선택하고 해부 매체 및 이미징 플레이트를 얼음 위에 유지합니다. 이는 배아 생존가능성에 크게 영향을 미치지 않고 모든 조건이 배열될 때까지 해부된 배아에 대한 배아 발생을 현저히10. 배아가 얼음에 앉는 시간을 1 시간으로 제한하기 위해 두 명의 연구원이 동시에 해부를 수행하여 약 50 분 안에 14 가지 조건을 설정할 수 있습니다. 해부 후, 플레이트는 600 x g에서 1 분 동안 배아및 우물을 퇴적시키기 위해 낮은 배율로 미리 스캔하여 고배율 이미징을위한 적합한 배아 그룹과 함께 필드를 찾습니다. 포인트 방문 위치가 표시됩니다. 배아는 60x 오일 침지 1.35 NA 렌즈를 사용하여 밤새 온도 조절 실에서 촬영됩니다. 샘플은 실험에 사용되는 플레이트의 표면적이 22 x 22mm2 표준 커버슬립과 비교할 수 있도록 4 웰 x 4 웰 영역으로 구성되므로 60x 오일 목표를 사용할 수 있습니다. 이미징이 시작되기 전에 이 지역에 걸쳐 오일을 균일하게 확산하는 것은 성공적인 장기 이미지 수집에 매우 중요합니다. 개발 배아는 마취제를 함유하는 용액에서 이미지화됩니다. 이것은 우물 해치 내의 오래된 태아가, 그들의 운동이 심상되고 있는 인접한 젊은 태아의 위치를 방해하지 않는다는 것을 확인합니다. 달걀 껍질의 꿰 뚫을 수없는 특성으로 인해 마취제는 부화 하기 전에 운동에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 조건하에서, 3D 타임랩스 데이터는 단일 하룻밤 실험에서 총 80-100개의 배아에 대해 3채널로 수집된다(아래에서 더 자세히 설명함).
C. 예쁜꼬마기 배아 발달은 2단계에서 발생합니다. 먼저, 세포 분열의 10라운드는 6시간 동안17에걸쳐 3개의 배아층(ectoderm, mesoderm, 및 내배엽)을 생성한다. 다음 7 시간에서, 형태 유전학 이벤트는 분화 한 조직의 형성을 구동8,16. 개발의 이 두 가지 양상을 포착하기 위하여는, 우리는 사용자 정의 긴장의 쌍을 건설했습니다, 세균 층 및 Morphogenesis 긴장10 (그림 2A)및, 두 긴장에서 심상 배아에 반 높은 처리량 프로토콜을 이용했습니다. 생식층 균주는 이방인, 중배엽 및 내배엽의 핵을 적색, 노랑 및 녹색으로 표시하는 이식유전자 인코딩 형광 단백질을 표현합니다. 이 균주는 세 가지 리포터 종족을 포함: (1) PHA-4를 발현하는 이식유전자::GFP는 내장과 인두에 핵을 표시 (녹색 내배엽)10,18,19,(2) 이식 유전자를 발현 mCherry-histone 융합표피와 ~1/3 뉴런의 (붉은 외피; 도2A)및 (3) 바디 벽 근육(yellow mesoderm)에서 mCherry 및 GFP 태그가 있는 히스톤을 동시에 발현하는 이식유전자. 모포제네시스 균주는 2개의 전형유전자를 발현한다: (1) 표피에서 녹색 상피 접합 마커(DLG-1::GFP)와 (2) mCherry 태그가 달린 혈장 막 마커, ~1/3 뉴런(Pcnd-1 프로모터; 그림 2A). RNAi의 효과를 향상시키기 위해, 두 균주는 또한 RNAi 과민성 돌연변이(nre-1(hd20) 린-15b(hd126)20쌍을 포함하도록 설계되었다. 이들은 배아 발달에 필요한 ~2,000개의 유전자의 대규모 RNAi 계 스크린을 수행하는 것을 목표로 건설되었다. 그러나, 긴장의 이 쌍은 또한 돌연변이에 있는 발달 결함을 평가하기 위한 광범위하게 유용한 표준화한 플랫폼을 구성할 것입니다, 및 개발에 있는 다른 단백질의 역할의 더 상세한 분석을 위해.
이러한 균주, 녹색, 적색 및 밝은 필드 z 시리즈 (18 x 2 μm2 간격)를 가진이 반 높은 처리량 형식의 데이터 수집을 위해 16 °C 온도 제어 실에서 10 시간 동안 매 ~ 20 분마다 수집됩니다. 이것은 달리는 동안 21-23 °C 사이 현미경을 유지합니다. 20분 의 시간 간격을 통해 실험당 50개의 배아 분야(포인트 방문)를 이미지화할 수 있습니다. 사용자는 더 적은 포인트 방문으로 더 짧은 간격으로 수집을 조정하거나, 더 많은 포인트 방문을 통해 더 긴 간격으로 실험 목표에 가장 잘 맞출 수 있습니다. 이러한 균주에 대해, 초기 발달 시점은 조직 별 기자 구동 마커 발현이 중후반 위축까지 발현되기 시작하지 않기 때문에 영상화되지 않는다. 이 초기 단계에서 는 저배율(10x)으로 우물을 스캔하고 고배율 이미징을 위해 필드를 선택했습니다. 하나 이상의 초기 단계 배아를 포함하는 필드를 선택하는 것이 좋습니다, 그러나 배아가 부분적으로 겹치는 필드를 피하는 것이 좋습니다, 지나치게 혼잡, 또는 우물의 극단적인 가장자리에서 발견되는. 하룻밤 60x 이미징 에 이어, 낮은 배율 (10x) 전체 잘 검사는 배아가 정상적인 외관 (WT)와 부화 여부를 결정하기 위해 수행, 눈에 보이는 이상으로 부화 (애벌레 이상), 또는 평가 된 각 조건에 대한 배아 치명적인 ( 그림 1B). 이 단계는 더 큰 인구에 걸쳐 치사성을 평가하기 위해 병렬로 플레이트를 설정하는 쉬운 대안역할을합니다. 전체 잘 10x 사후 검사는 조건 당 50-80 배아에 배아 치사 데이터를 제공합니다. 이 측정값을 사용하여 실행 간의 제어를 위한 인구 배아 치사성 데이터를 비교하는 것은 균주의 건강 및 환경 조건 및 처리 단계에 대한 일관성을 보장하는 유용한 제어입니다. 두 개의 맞춤형 리포터 균주가 함께 이미지화될 때, 세포 운명 명세서, 등쪽 간질, 표피 인클로저, 신장 및 신경 발생을 포함한 대부분의 주요 발달 사건에 대한 유익한 판독을 제공합니다(대표 제어 이미지는 그림 2B에표시되며 Wang 외10참조도 있습니다.
데이터 처리: 자동화된 배아 자르기 및 방향
우리의 화상 진찰 프로토콜을 사용하면, 각 고해상도 화상 진찰 필드는 1과 5 배아 사이에서 포함합니다; 이 태아는 무작위로 배향되고 자주 서로 인접하여 위치됩니다. 기존의 배아 장착 기술을 사용하여 수집된 데이터는 동일한 과제를 안고 있습니다. 후속 시각화 및 분석을 위해 데이터를 준비하려면 배아 서열을 자르고 방향을 조정하고 배경을 빼고 드리프트를 수정하며 신호 감쇠를 보정하기 위해 상당한 실습 조작이 필요합니다. 깊이와 함께. 이 과정을 간소화하기 위해, 사용자 정의 배아 자르기 프로그램은 더 넓은 필드에서 각 배아를 분리하고 방향을 지정하는 것으로 만들어졌습니다(그림 1C, 그림 3). 이 프로그램은 배아 분야의 3D 타임랩스 시퀀스를 취하고 개별 티프 시리즈로 처리할 수 있는 그래픽 사용자 인터페이스(대부분의 이미징 플랫폼의 데이터와 호환)가 있는 사용자 친화적인 독립실행형 프로그램으로 패키지화되었습니다. 필드의 각 배아에 대해(그림 3B, https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w 에서 사용 가능)10,12. GUI (embryoCropUI.py)에 대한 파이썬 소스 코드와이 프로그램의 배치 버전 (screenCrop.py)은 GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)10,13에서숙련 된 파이썬 사용자도 사용할 수 있습니다. 이 프로그램의 핵심 기능은 전방 후방 축을 따라 배아를 찾고 자르고 방향을 조정하는 것입니다. 동시에, 배경 감속, 감쇠 보정 및 드리프트 보정은 선택적 조정 가능한 설정을 사용하여 데이터 세트에서 수행 할 수 있습니다.
간략하게, 자동화된 자르기 소프트웨어는 밝은 필드 심상에서 얻은 이진 마스크에 있는 개별 배아를 반복적으로 검출하고 모든 채널에서 배아를 순차적으로 자르고 전방 후방 축을 따라 이미지를 방향을 지정합니다(그림3) B, 먼저 왕 외10)에기재되어 있다. 자르기 전에 소프트웨어는 드리프트를 보정하고 배경을 빼고 각 형광 채널에서 깊이 감쇠 보정을 수행합니다(선택 사항). 이진 마스크를 얻기 위해, 소프트웨어는 밝은 필드 이미지에 캐니 에지 감지(21)를 적용, 세 개의 중앙 평면의 최대 강도 투영을 수행하고 작은 구멍을 채웁니다. 이 알고리즘은 Cassini 타원형을 이진 마스크 윤곽선의 섹션에 끼여 개별 배아를 검출합니다(그림 3B, 3C참조). 주 축을 따라 타원형을 정렬한 후, 소프트웨어는 분리된 배아의 각 절반에서 적색 형광 강도를 측정하고 배아를 회전하여 적색 강도가 왼쪽을 향하도록 하여 배아를 왼쪽에 두는 다. 이 작업에 사용되는 기자 균주(그림 3D). 이 소프트웨어의 조종은 대부분의 배아가 예상대로 효율적으로 자른 것으로 나타났습니다. 배아 드리프트, 일시적인 초점 비행기 손실(기름기포로 인한) 또는 배아의 붐비는 들판과 같은 사소한 이미징 문제는 일반적으로 성공적인 자르기를 방해하지 않았습니다. 그러나, 배아의 큰 덩어리가 있었다 필드에 대한 (z에서 다소 겹치는), 크게 이미징 평면 내에서 기울어진 배아 (Z), 장기 초점 평면 손실, 또는 부분적으로 절단 된 배아, 성공적인 자르기는 항상 아니었다 달성. 이러한 문제는 데이터 수집 단계에서 더 나은 필드 선택을 통해 쉽게 회피할 수 있습니다. 전반적으로, 이 반 높은 처리량 방법으로 수집된 전처리 데이터 또는 기존의 장착 방법을 사용하는 것은 배아 데이터 세트를 시각화하고 분석하기 위한 유용한 첫 번째 단계입니다.
이미지 수집 및 데이터 처리 방법의 검증: 이전에 설명한 40개의 유전자를 무너뜨린 후 배아 발달을 시각화
이 반 고처리량 이미지 수집 방법 및 사용자 정의 자르기 정권의 유효성을 검사하기 위해, 작은 RNAi 스크린은 세포 운명 명세 및 형태 형성에서 이전에 설명한 기능을 가진 40 개의 유전자에 대해 지시된 사용자 정의 균주에서 수행되었습니다. 왕, 오초아, 칼리우린과 동료 에 의해 설명10,11). 이를 위해, dsRNA는 각 표적에 대해 생성되었고, 각 균주로부터 L4 동물을 주입하고, 20-24h를 기다린 다음, 전술한 프로토콜을 사용하여 배아를 해부하고 이미지화하였다(완전한 데이터 세트10,11). RNAi에 의하여 발달 표현형을 달성하는 것은 모계 및 zygotic 유전자 발현 둘 다의 억제를 요구합니다. 발달 유전자는 모성적으로 발현될 수 있고, 생성된 단백질 생성물이 배아 내로 적재되거나, 또는 배아에서 분현적으로 발현되거나, 또는, 많은 경우에, 모두10,22,23. 주사와 배아 촬영 사이의 시간은 모계 및 석고 표현 인구를 효과적으로 타겟팅하는 중요한 변수입니다. 타이밍은 접합발현24를 방지하기 위해 배아에 적재되는 주입된 dsRNA의 양과 모계 단백질 고갈 정도를 모두 결정한다. dsRNA 주사 후, 표적 유전자에 대응하는 모계 mRNA가 저하되고 관련 시간 간격으로 회복되지 않는다. 기존의 단백질 고갈은 배아를 형성하는 배아로 적재하여 생식기 조직에서 모계 단백질을 배출하는 배아 생산을 필요로 합니다. 20°C에서 20-24시간 일관된 모계 고갈을 허용하는 가장 짧은 인큐베이션 시간; 모성 고갈은 나중에 시점에서 더 좋아집니다 (즉, 주사 후 36-42 시간). 배아내로 적재되는 주입된 dsRNA의 양은 접합성 유전자 발현의 예방이 얼마나 효과적인지를 지시한다. 주입 된 물질을 가진 배아가 먼저 수정될 때 로드 된 RNA의 양은 주입 후 약 5-10 시간 피크, 그 후 감소. 우리의 경험에서, 주입 후 24 시간은 모계 단백질 고갈과 zygotic 유전자 발현의 억제가 모두 효과적인 최적의 시간대입니다. 40개의 시험 유전자의 세트를 통해 이 일에 사용된 사용자 정의 리포터 긴장에 있는 표현형의 분석은, 우리의 결합한 프로토콜이 세포 운명에서 관련시킨 유전자의 광범위한 스펙트럼에 걸쳐 뚜렷한, 높게 재현가능한 서명 표현형을 산출했다는 것을 보여주었습니다 명세서 및 형태 형성(왕 외10참조); 전체 데이터 집합을 사용할 수있습니다 11). 이러한 데이터의 일예로서, 제어를 위한 4개의 상이한 배아의 정지 이미지, pha-4(RNAi), pal-1(RNAi)및 멕스-3(RNAi) 세균층 리포터 균주에 는 도 4A에도시되어 있다. 40 유전자 RNAi 스크린에서 관찰된 표현형의 보다 포괄적인 토론을 위해, 왕 외10를 참조하십시오
ImageJ 매크로: 지정된 조건에 대한 모든 데이터의 컴파일 및 시각화
개별 티프 스택에서 많은 수의 배아를 시각화하는 것은 지루하고 작업하는 데 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 우리의 초기 노력에서, >400 개별 배아는 위에서 설명한 사용자 정의 자동화 된 자르기 프로그램을 사용하여 격리되었다. 첫 번째 패스 분석 속도를 높이기 위해 주어진 변형 배경에서 주어진 RNAi 조건에 대해 이미지화된 모든 배아의 배열을 생성하는 ImageJ 매크로를 구축했습니다(그림4B). 어레이의 각 배아에 대해 밝은 필드 이미지와 최대 강도 투영 이미지가 각 시점마다 나란히 표시되어 합성 동영상 파일을 생성합니다. 이 매크로는 파일 구조와 함께 작동하도록 작성되었지만 사용자의 파일 구조를 수용하도록 편집할 수 있습니다. 그러나 최상의 결과를 얻으려면 사용자는 프로토콜에 명시된 이름 지정 및 파일 구조 규칙을 따라야 합니다(Python 및 ImageJ 응용 프로그램 명명 규칙에 대한 자세한 내용은 Zenodo 또는 Github README 파일 참조). 모든 ImageJ 처리 데이터를 보고 40유전자 테스트 세트에 대해 관찰된 표현형에 대한 보다 심층적인 분석을 얻으려면, Dryad 데이터베이스10,11에증착된 데이터를 참조하십시오. 이 ImageJ 시각화 형식은 전체 표현형과 침투성을 신속하게 평가할 수 있게 해주며, 파편의 존재 또는 초점 평면 손실과 같은 데이터 품질 문제를 쉽게 표시할 수 있습니다. 전반적으로, 반 높은 처리량 데이터 수집 방법, 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구의 조합, 사용자 정의 기자 균주와 결합, 크게 배아 개발을 연구하기 위해 더 큰 규모의 노력을 용이하게.
그림 1. 고콘텐츠 이미징 방법, 데이터 처리 절차 및 필수 도구개요 (a)여기에 설명된 반고처리량 멀티웰 이미징 접근법에 C. elegans 배아를 장착하기 위한 표준 아가로즈 패드 기반 방법의 특징을 비교한다. (B)배아 발달을 모니터링하기 위한 반고처리량 방법의 개요. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. (C)종래의 아가로즈 패드 기반 장착 절차 또는 본 원에 기재된 반고처리량 멀티웰 플레이트 기반 방법을 사용하여 획득한 데이터에 사용될 수 있는 데이터 처리 및 시각화 도구의 개요. 하나의 필드(왼쪽) 또는 다중 3 채널에서 단일 3 채널 타임랩스 배아 서열, 배아 데이터의 4차원 필드(오른쪽)는 대부분의 이미징 플랫폼에서 캡처된 데이터와 호환되는 사용자 지정 자르기 프로그램을 사용하여 처리될 수 있습니다. 프로그램의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 버전은 사용자 친화적이며 프로그래밍 전문 지식이 필요하지 않습니다. screenCrop.py 응용 프로그램에는 Python 전문 지식이 필요하지만 일괄 처리 형식으로 자르기 수 있는 기능을 추가했습니다. 이 단계의 출력은 단단히 자른, 전방 후방 지향 배아 티프 스택. 단일 조건에서 모든 데이터를 시각화하기 위해 ImageJ 매크로가 구축되어 각 시점에서 각 배아에 대해 밝은 필드 이미지와 최대 강도 투영을 표시하기 위해 잘리고 회전된 티프 스택을 컴파일합니다. (D)패널은 세미 고처리량 이미징 형식의 해부 및 설정에 필요한 필수 도구를 보여줍니다. 일부 그림 구성 요소는 왕 등의 허가와 함께 재현10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. C. 예쁜꼬마선충배생성의 고함량 영상을 위해 생성된 맞춤형 균주. (A)회로도는 세균층(상부) 및 모형성(아래) 균주를 구성하는 데 사용되는 종족을 예시한다. (B)최대 강도 프로젝션 패널은 모포제네시스(위)와 세균층(아래) 균주에서 의 발달 시간 과정을 보여준다. 도식(왼쪽)에 도시된 바와 같이 복부 도면이 도시된다. 시간은 두 균주에서 쉽게 식별할 수 있는 쉼표 단계(t = 0)를 기준으로 합니다. 배율 막대 = 10 μm. 그림 왕 외 의 허가와 함께 재현10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 사용자 지정 자르기 프로그램은 개별 배아를 이미징 필드에서 분리하고 방향을 지정합니다. (A)회로도는 사용자 정의 배아 자르기 프로그램의 기능을 설명하고이 프로그램에 액세스하기위한 두 가지 옵션을 강조 : 프로그래밍 전문 지식이 필요하지 않고 Zenodo (왼쪽)에서 사용할 수있는 사용자 친화적 인 GUI 인터페이스 파이썬 경험이 필요하고 Github (오른쪽)에서 사용할 수있는 프로그램의 일괄 자르기 버전. (B)그래픽은 자동화된 자르기 알고리즘을 요약합니다 - 8비트 브라이트필드 이미지에서 이진 마스크가 생성되고 개별 배아가 감지되고, 잘라내고, 전방 후방 축을 따라 배향됩니다. 스케일 바는 10 μm.(C)회로도는 이진 마스크에서 배아를 반복적으로 검출하는 데 사용되는 절차를 상세히 설명한다. (D)회로도는 전방 후방 축을 따라 배아의 방향을 지정하는 데 사용되는 방법을 예시한다. 패널 B-D는 왕 등의 허가를 받아 재현10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 사용자 정의 ImageJ 매크로는 각 조건에 대한 합성 파일을 생성하여 RNAi 스크리닝 데이터의 시각화를 가능하게합니다. (A)40-유전자 검사 세트로부터의 3가지 예 RNAi 조건에 대한 배아(전체 데이터 집합에 대한 Wang et al.10,11 참조)는 각각에 대해 수득되는 뚜렷한 시그니처 표현형을 강조하는(오른쪽)로 표시됩니다. 조건 및 각 조건 내의 표현형의 재현성. 패널은 왕 외10의허가로 적응되었다 . (B)패널은 사용자 정의 ImageJ 매크로 (OpenandCombine_embsV2.ijm)가 주어진 RNAi 조건에서 배아를 각 시점에서 각 배아에 대한 밝은 필드 및 최대 강도 투영을 배열하는 복합 ImageJ 파일로 배열하는 방법을 보여줍니다. 하나의 예제만 강조 표시되어 있지만 이 매크로는 여러 RNAi 조건에 대한 데이터를 한 번에 컴파일할 수 있습니다. ImageJ 매크로는 제노도12에서사용할 수 있습니다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 C. elegans에있는 배아 발달에 있는 유전자의 기능을 프로파일링하기 위하여 더 큰 규모의 노력을 가능하게 하기 위하여 개발된 공구 및 방법의 제품군을 기술합니다. 우리의 반 높은 처리량 방법은 단일 실험에서 80-100 배아에 대한 20 분 해상도에서 배아 발달의 3D 시간 경과 이미징을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원하는 마커 균주와 함께 사용하도록 적응 될 수 있지만,이 작품은 배아 발생 중 이벤트를 모니터링하기 위해 개발 된 두 가지 사용자 정의 균주를 사용하여 방법의 잠재력을 보여줍니다 : (1) 조직 특정하는 세균 층 기자 변형 프로모터는 내배엽, 중배엽 및 외피핵을 표시하기 위해 형광 히스톤의 발현을 유도하고, (2) 세포 접합부에서 형광 마커의 발현을 유도하기 위해 표피 및 뉴런 프로모터를 사용하는 형태 형성 리포터 균주 및 플라즈마 멤브레인. 두 균주를 이미징함으로써 세포 운명 사양 및 형태 유전학 적 사건에 대한 분자 교란의 결과를 놀라운 세부 사항으로 캡처 할 수 있습니다. 이 방법으로 생성된 데이터의 양이 발생하는 문제를 해결하기 위해 데이터 처리 및 시각화를 간소화하기 위해 사용자 지정 도구가 개발되었습니다. 첫 번째 도구는 3D 타임랩스 서열로 배아 의 필드에서 개별 배아를 자르고 배아를 표준 전방 후방 방향으로 회전시키고 배경 감산, 드리프트 보정 및 감쇠 보정을 수행합니다. 이 프로그램은 사용자 친화적 인 GUI (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)로 패키징되었으며 소스 코드및 파이썬에 정통한 사용자 (github.com/renatkh/embryo_crop.git)에 대한 프로그램의 고급 일괄 처리 버전이10,12,13으로제공됩니다. 마지막으로 이 처리된 데이터를 의미 있는 형식으로 시각화하기 위해 ImageJ 매크로가 고안되었습니다. 이를 통해 사용자는 각 시점에서 각 배아에 대한 밝은 필드 및 최대 강도 투영을 보여주는 다중 패널 영화에서 주어진 RNAi 조건에서 모든 배아를 시각화 할 수 있습니다. 함께, 균주, 프로토콜, 및 데이터 처리 도구, 더 큰 규모의 C. elegans 배아 발생을 연구하기 위해 노력을 더 실현 가능한 노력.
전체적으로 구현하기는 쉽지만 여기에 설명된 반고처리량 획득 방법은 아래에 설명된 몇 가지 중요한 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 사용자는 멀티 웰 플레이트 홀더를 장착할 수 있는 정밀 한 포인트 방문 용량을 가진 공초점 현미경에 액세스할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 대한 가장 중요한 고려 사항은 현미경이 온도 제어 실에서 유지된다는 것입니다. 많은 현미경은 가열 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 대부분은 안정적으로 냉각 할 수 없습니다, 따라서 환경 온도는 일정한 C. 예쁜 꼬마 친화적 인 온도를 유지하기 위해 조정되어야한다. 이를 달성하기 위해, 이미징 룸은 16 °C에서 개최됩니다. 기기의 샘플 영역은 이미징 중에 최대 21-23°C까지 가열됩니다. 실온의 변동은 개발 타이밍에 영향을 미칠 수 있으며 점 방문 중에 초점 평면 정확도를 미묘하게 변경할 수 있으며 가능한 한 피해야 합니다. 23 °C 이상의 온도에서 실행하면 제어 조건에 대한 배아 치사도가 상당히 급증할 수 있으며 권장되지 않습니다. 또 다른 주요 고려 사항은 해부 도중 배아 선택 및 분산입니다. 동물부화 시 인접한 배아를 시야에서 벗어나게 하는 경향이 있기 때문에 오래된 배아를 이미징 우물로 옮기지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 이것의 부각은 매체에 마취제의 포함에 의해 감소됩니다. 배아의 큰 덩어리를 피하기 위해 배아의 분산도 중요한 변수입니다. 응집은 배아가 너무 얇게 그려진 모세관 파이펫의 우물로 옮겨지거나 해부 중에 배아가 충분히 분산되지 않은 경우에 발생하는 경향이 있습니다. 또 다른 고려 사항은 점 선택과 초점 평면 튜닝에 시간이 걸린다는 것입니다. 이 과정에서 플레이트가 얼음 위에 있지 않으므로 배아가 즉시 발달하기 시작합니다. 이 연구에 사용된 사용자 정의 마커 균주에 대해, 마커가 표현되기 시작하기 전에 플레이트 스캐닝 및 포인트 선택을 달성하기 위해 플레이트가 얼음에서 제거 된 후 약 90 분 창이있다. 이것은 이 긴장을 가진 우리의 계측기에 설치를 위한 충분한 시간입니다, 그러나 그밖 현미경 및 긴장은 문제 해결을 요구하는 추가 시간 도전을 제안할 수 있습니다. 마지막으로, 우리가 설명하는 방법은 20 분 시간 간격으로 50 필드의 z 스택을 수집하기 위해 60 배 오일 목표를 사용합니다. 우리가 강조 하 고, 이미지 된 필드의 수를 줄여 시간 해상도 증가 시킬 수 있습니다. 예를 들어 10개의 필드를 4분 의 시간 해상도로 이미지화할 수 있습니다. 시간 해상도를 높이기위한 두 번째 대안은 낮은 배율, 높은 수치 조리개 목표를 사용하는 것입니다; 이 경우, 더 큰 시야는 공간 해상도의 적당한 감소만으로 더 높은 시간 해상도에서 많은 수의 배아를 이미징할 수 있게 합니다.
대규모로 데이터 처리 및 시각화를 활성화하기 위해 사용자 지정 도구를 구축하고 자유롭게 사용할 수 있도록 했습니다. 가장 광범위하게 유용한 도구는 사용자 정의 자르기 GUI이며, 프로그래밍 전문 지식이 필요하지 않습니다. GUI는 개발의 모든 단계에서 배아를 자르고 방향을 지정하는 데 사용할 수 있으며 모든 마커와 호환되므로 발달 생물학자뿐만 아니라 초기 배아의 과정을 연구하는 연구자에게도 유용합니다. GUI의 출력은 정확하게 잘라, 방향, 배율, 드리프트 보정, 데이터를 정확하게 자르기 때문에 데이터를 자동화 된 분석 파이프 라인으로 쉽게 유입 할 수 있으므로이 도구를 과거 및 미래의 데이터 분석에 유용하게 사용할 수 있습니다. 적절한 균주가 사용되는 경우, 결과 데이터 파일은 배아 제네시스 정렬 도구(25)와같은 기존의 자동화 된 분석 정권에 대한 입력으로 사용할 수 있습니다. 프로그램을 사용하려면 자르기 알고리즘에 각 단계 및 시간에 대해 밝은 필드 또는 DIC 이미지를 수집해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 사용자는 전방 후방 방향 알고리즘이 이 작품에 나타난 배아층 리포터 및 형태 생성 보고서 균주에서 적색 신호의 분포에 기초하여 구조화된다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 다른 마커 균주에서 AP 배향의 정확도는 사례별로 평가되어야 할 것이다. GUI는 세 가지 서로 다른 공초점 이미징 플랫폼에서 수집된 데이터로 테스트되었으며 다중 티프 스택 및 티프 계열에 대해 보드 전체에서 호환됩니다. 사용자 친화적인 버전 외에도 GUI 및 이 프로그램의 일괄 버전에 대한 소스 코드도 제공되었으며 프로그래밍 환경이 필요하며 파일 구조 및 명명 규칙을 따라야 합니다. 마지막으로 ImageJ 처리 매크로는 각 RNAi 조건에서 모든 배아에 대한 원시 이미지 스택을 취하고 각 시점에서 밝은 필드 및 형광 최대 강도 프로젝션에서 해당 상태에 대한 모든 배아를 표시하는 유익한 배열을 컴파일하도록 제작되었습니다. 이 도구는 사용자의 사양에 맞게 조정할 수 있으며 데이터 탐색 및 품질 관리 평가를 보다 간단하게 만드는 데 유용한 매크로입니다.
함께, 본원에 기재된 배아 자르기 및 이미지 처리 도구와 함께 반고처리량 촬영 방법은 다양한 돌연변이체, 교란 및 마커 균주를 이용한 C. 예쁜꼬마기 발달의 분석을 용이하게 할 것이다. 우리 자신의 실험실에서는, 개발에 필요한 ~ 2,000의 유전자의 녹다운 후에 여기에서 기술된 2개의 사용자 정의 공학한 긴장에서 배아를 포기위하여 이 방법을 채택하는 대규모 스크린은, 현재 진행되고 있습니다. 마지막으로, 이러한 노력의 데이터는 배아 발생 시 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 이해하기 위한 노력을 강화하기 위한 추가적인 자료로 작용할 것이다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
S.D.O.는 캘리포니아 샌디에이고 대학이 후원하는 국립 의학 연구소의 지원을 받았습니다 (NIH / IRACDA K12 GM068524). A.D.와 K.O.는 루드비히 암 연구소의 지원을 받았으며, 이 연구소는 이 연구를 지원하는 데 사용되는 연구 자금을 제공했습니다. 우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 그의 조언에 대한 앤드류 Chisholm에 감사드립니다, 초기 방법 개발 단계 후이 프로젝트에 기여에 대한 로널드 빅스, 지원 및 소분자 발견에 대한 액세스 데이브 젠킨스와 앤디 시아우 고콘텐츠 이미징 시스템.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25 mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4 NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C.
- Wang, J. T., Seydoux, G.
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. Zenodo. , (2018).
- Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J.
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
