Summary
Denne protokollen ble generert som et middel til å produsere hjerneorganoider på en forenklet, rimelig måte uten eksogene vekstfaktorer eller kjellermembranmatrise samtidig som mangfoldet av hjernecelletyper og mange funksjoner i cellulær organisasjon opprettholdes.
Abstract
Menneskelige hjerneorganoider differensiert fra embryonale stamceller gir den unike muligheten til å studere kompliserte interaksjoner av flere celletyper i et tredimensjonalt system. Her presenterer vi en relativt grei og rimelig metode som gir hjerneorganoider. I denne protokollen er menneskelige pluripotente stamceller brutt inn i små klynger i stedet for enkeltceller og dyrket i grunnleggende medier uten en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer, slik at de iboende utviklingssignaler kan forme organoid vekst. Dette enkle systemet produserer et mangfold av hjernecelletyper, inkludert glial- og mikroglialceller, stamceller og nevroner i forhjernen, midbrain og bakhjernen. Organoider generert fra denne protokollen viser også kjennetegn på passende temporal og romlig organisasjon demonstrert av brightfield-bilder, histologi, immunofluorescens og sanntids kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon ( qRT-PCR). Fordi disse organoider inneholder celletyper fra ulike deler av hjernen, kan de brukes til å studere en rekke sykdommer. For eksempel, i en nylig artikkel demonstrerte vi bruk av organoider generert fra denne protokollen for å studere effekten av hypoksi på den menneskelige hjernen. Denne tilnærmingen kan brukes til å undersøke en rekke ellers vanskelige å studere tilstander som neurodevelopmental handicap, genetiske lidelser, og nevrologiske sykdommer.
Introduction
På grunn av utallige praktiske og etiske begrensninger har det vært store problemer med å studere den menneskelige hjernen. Mens studier som bruker gnagere har vært avgjørende for vår forståelse av den menneskelige hjerne, har musehjernen mange ulikheter1,2. Interessant, mus har en nevronal tetthet som er minst 7 ganger mindre enn primat hjernen3,4. Selv om primater er nærmere mennesker enn gnagere fra et evolusjonært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere å jobbe med dem. Formålet med denne protokollen var å rekapitulere mange viktige trekk ved den menneskelige hjerne ved hjelp av en forenklet og billigere metode uten behov for en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer samtidig som hjernecellemangfold og cellulær organisasjon opprettholdes.
Formativt arbeid fra Sasai-laboratoriet brukte serumfri kultur av embryoidorganer (SFEBq) metode for å generere to- og tredimensjonale nevronale celletyper fra signaliserte embryonale stamceller (ESCs)5,6. Mange menneskelige hjerneorganoide metoder har fulgt en relativt lignende vei fra signaliserte ESCs7,8. I motsetning starter denne protokollen med klynger av frittliggende humane ESCer (hESCs), lik de første trinnene i banebrytende arbeid av Thomson og Zhang laboratorier før plating trinn9,10 samt det første trinnet i hjernen organoid protokollen av Pasca laboratoriet før tillegg av eksogene vekstfaktorer11. Kjellermembranmatriser (f.eks. matrigel) har blitt brukt i mange hjerneorganoidprotokoller, og det har vist seg å være et effektivt stillas8. Men, mest brukte kjeller membran matriser kommer ikke uten komplikasjoner som de co-purifisere med ukjente mengder vekstfaktorer med batch til batch variabilitet under produksjon12. I tillegg kan disse matrisene komplisere bildebehandling, og øke risikoen for forurensning og kostnader.
Mens menneskelige hjerneorganoider kan brukes til å svare på mange spørsmål, er det visse begrensninger å huske på. For det første, fra embryonale stamceller, organoider ligner nærmere umodne hjerner enn alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sykdommer som oppstår i alderdommen, som Alzheimers sykdom. For det andre, mens vår protokoll fant markører for forebrain, midbrain og hindbrain utvikling som er nyttige for å studere effekten av en behandling eller sykdom på celler fra flere hjerneregioner i konsert, andre protokoller kan følges for å konsentrere seg om bestemte hjerneregioner13,14. Til slutt, en annen begrensning av organoid modeller er at av størrelse, mens den gjennomsnittlige lengden på en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjerneorganoider laget med bruk av agitasjon vokse opp til 4 mm8 og organoider dannet av denne protokollen vokse til 1-2 mm av 10 uker. Likevel gir denne protokollen et viktig verktøy for å studere menneskelig hjernevev og samspillet mellom flere celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stamcellevedlikehold
- Vedlikehold H9 hESCer på et lag med vekstfaktor redusert kjeller membran matrise (se Materialbordet, heretter bare referert til som matrise) i henhold til produsentens instruksjoner.
- For å belegge en 6-brønns tallerken eller en 10 cm tallerken, kombiner 100 μL matrise med 5,9 ml iskald Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) / F12 media. Pakk plater i parafinfilm og oppbevar over natten ved 4 °C. Bruk dem neste dag for å passere celler etter at overflødig matrise / media er aspirert.
- Kultur cellene uke til uke på omtrent en 1:12 delt ratio hver 7 dager. Vedlikehold cellene ved hjelp av mTESR-1-mediet i en 37 °C, lavt oksygeninkubator (5 % O2, 5 % CO2). Oppdater medier daglig. Luke ut differensierende celler fra kulturen mellom passasjer ved hjelp av glassverktøy.
- H9 celler bør passeres fire til seks dager før du bruker dem til å produsere organoider. Cellene skal passeres med omtrent 1:8-forhold mellom celleklynger. For å gjøre dette, start med å skylle cellene med DMEM F12 media og dissosiere cellene med en nøytral protease (f.eks. ulike, heretter referert til bare som protease), skyll med DMEM / F-12, og plate som 30-60 celleklynger på tvers av 4 plater (6-brønn eller 10 cm) på ~ 20% samflyt. To dager før høsting, overgang dem til en vanlig inkubator (21% O2, 5% CO2). Plater bør nå ~ 80% samflyt ved oppstart av organoid dannelse.
2. Dissosiasjon av hESCs for organoid kultur
- Aliquot protease lagerløsningen (5 U/ml).
MERK: Vi fryser vanligvis ned 1 ml aliquots ved -20 °C for bruk over flere måneder. - Fortynn proteaselagerløsningen til arbeidskonsentrasjonen ved å legge til 1 ml av lagerløsningen pluss 5 ml DMEM/F12 for hver 6-brønn eller 10 cm plate med hESCer.
- Aspirer og fjern cellekulturmedier, og dekk deretter hESCene med proteaseløsningen. Legg platene i inkubatoren i 10-15 min eller til kantene på koloniene rundes opp og begynner å skille seg fra matrisen.
- Vipp platen, aspirer proteaseoppløsningen, og vask cellene forsiktig med DMEM/F12 tre ganger. Bruk 2 ml/brønn for hver vask ved bruk av en 6-brønnsplate og 6 ml når du bruker en 10 cm plate. Sørg for at kolonier forblir festet til matrisen når du utfører dette trinnet.
- Tilsett tilbake ca 1,5 ml friske mTESR-medier til hver brønn (eller 5 ml for en 10 cm plate) og skyll cellene av platen ved hjelp av skånsom pipettering.
- Bruk en 10 ml pipette, forsiktig aspirer og dispenser hESC i platen til de når ca 1/30th av sin opprinnelige størrelse. Koloniklynger bør ligne ~ 250-350 μm størrelse firkanter ved ferdigstillelse av disse trinnene.
3. Generasjon av organoider
- Overfør celler til en enkelt ultra-lav vedlegg T75 kolbe som inneholder 30 ml mTESR media uten grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF).
- Neste dag, vippe kolbe(e) slik at levende celler bassenget i hjørnet (dette kan ta 5-10 min på den første dagen, men vil bli raskere som klyngene blir større).
MERK: Hvis det er et stort antall celler som har holdt seg til bunnen av kolben på dette trinnet eller eventuelle påfølgende trinn, overfører du cellene til en ny kolbe. Det er normalt å ha en høy befolkning av døde celler for de to første dagene. Når du utfører medieendringer, må du fjerne så mye av celleavfallet som mulig. - Når cellene bosetter seg, aspirerav media og døde celler forlater ca 10 ml medier som inneholder levende celler.
- Legg ~ 20 ml lav bFGF media (DMEM/F12 supplert med 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, 0,05% storfe serum albumin (BSA), og 0,1 mM monothioglycerol (MTG) supplert med 30 ng / mL bFGF).
- Sjekk cellene på dag 2. Hvis de fleste cellene ser sunne og lyse ut, er det ikke nødvendig å gjøre noe. Men hvis mer enn en tredjedel av cellene ser mørkt ut, erstatte media (ved hjelp av samme vippeteknikk som i trinn 3.2) med ~ 20 ml lav bFGF media supplert med 20 ng / ml bFGF.
- På dag 3, erstatte halvparten av media (ved hjelp av vippeteknikk i trinn 3.2) med 20 ml lav bFGF media supplert med 10 ng / ml bFGF.
- På dag 5, erstatt halvparten av mediet (ved hjelp av vippeteknikken i trinn 3.2) med 20 ml nevrale induksjonsmedier (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparin).
MERK: Hvis det er noen store klynger av celler eller organoider som er mye større enn de andre, bør de fjernes fra kulturen. Størrelsen er estimert etter utseende under mikroskopet; for eksempel ved hjelp av et okular med reticle. De fleste organoider er tilsvarende størrelse (omtrent 100 ± 20 μm). Vi fjernet organoider som var omtrent 2ganger mindre eller større enn de andre. - Erstatt halvparten av mediet (~ 15 ml) (ved hjelp av vippeteknikken) med NIM annenhver dag.
- Etter 3 uker i kultur, legg til 100x penicillin / streptomycin til media (NIM: DMEM / F12, 1x N2 supplement, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg / ml heparin) ved en endelig konsentrasjon på 1x hvis ønskelig. Oppdater mediene annenhver dag.
MERK: På denne måten opprettholdt vi organoidene i opptil 6 måneder i kultur.
4. RNA ekstraksjon og forberedelse
- Trekk forsiktig ut ca. 15 organoider (avhengig av størrelse) fra kolben ved hjelp av en 10 ml pipette og legg den i et 1,5 ml rør.
- Pellet organoidene i sentrifugen (200 x g i 1 min), og skyll med 1x Dulbeccos PBS (DPBS) tre ganger.
- Trekk ut RNA ved hjelp av validert system eller protokoll (f.eks. RNeasy-sett).
- Mål den optiske tetthetsverdien for hver prøve ved 260 og 280 nm.
- Klargjør cDNA ved hjelp av et validert system eller protokoll (f.eks. iScript cDNA-syntesesett).
- Utfør qRT-PCR ved hjelp av forhåndsvaliderte primere (tabell 1) inkludert minst ett rengjøringsgen.
5. Immunhistokjemi
- Fiksering
- Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning og plasser den ved 4 °C.
- Bruk en steril barberhøvel, kutt spissen av en steril overføringspipett.
- Trekk forsiktig ut organoider ved hjelp av kuttoverføringspipetten, da de lett kan brytes fra hverandre, spesielt når de blir store, og plasserer dem i en 6-brønnsplate med ekstra medier eller DPBS.
- Vipp platen, aspirere med imedia, og erstatt med 1x DPBS. Skyll cellene med 1x DPBS to ekstra ganger.
- Skift ut DPBS med 4 % PFA-oppløsning og sett på en shaker ved 4 °C.
MERK: Mens vi fikset i 2 dager (for små organoider) til 7 dager (for organoider > 3 måneder), kan kortere tider (f.eks. 16-24 timer) også være mulig. - Forbered 30%, 20% og 10% sukroseløsninger i DPBS.
- Etter fiksering i PFA, erstatt med 10% sukroseoppløsning og legg på en shaker ved 4 °C i 24 timer.
- Erstatt 10% sukrose med 20% sukrose og legg på en shaker ved 4 ° C i 24 timer.
- Erstatt 20% sukrose med 30% sukrose og legg på en shaker ved 4 ° C i 24 timer.
- Frosne seksjoner
- Forbered et flatt lag med tørris og legg en merket plastform på toppen av den.
- Hell et tynt lag med optimal skjæretemperaturmedium (OCT) i formen og la det begynne å herdes (innen få sekunder).
- Plasser noen organoider på toppen av OCT i formen ved hjelp av en overføringspipett med spissen kuttet av og vær oppmerksom på plasseringen av organoidene.
- Legg sakte i OCT til formen er full og organoidene er dekket. La det herdehelt i ytterligere 10 min.
MERK: Mens frysing over 10 min bidrar til å sikre ideell relativ plassering av flere organoider for snitting, er det mulig å bruke en etanoltørr isblanding eller flytende nitrogen for å fryse raskere. - Merk den relative plasseringen av organoider med en markør for å gjøre det lettere å finne dem når du kutter.
- Legg formene i en pose eller boks og oppbevar ved -80 °C til de er klare til å kutte delene.
- Ved hjelp av en kryostat, skjær 10 μm seksjoner og plasser vevet på merkede, positivt ladede lysbilder.
- Flekker
- Forbered blokkeringsoppløsningen (0,3 % Triton X-100, 4 % normalt eselserum i PBS).
- Bruk en hydrofob pap penn for å tegne rundt omkretsen av vevet.
- Skyll lysbildene med PBS 3 ganger i 5 min hver.
- Bytt PBS med blokkeringsoppløsning i 1 t ved romtemperatur.
- Skift ut blokkeringsoppløsningen med antistoffoppløsning (antistoff ved egnet konsentrasjon, 0,1 % Triton X-100, 4 % normalt eselserum i PBS) ved 4 °C over natten.
- På følgende dag, vask lysbildet 3 ganger med PBS i 10 min hver.
- Skift UT PBS med egnet sekundærantistoff (ved egnet konsentrasjon) fortynnet i antistoffoppløsning i 1 t ved romtemperatur.
- Skyll 3 ganger i 10 min hver gang med 1x PBS.
- Påfør 4',6-diamidino-2-fenylindzol (DAPI) flekkog skyll tre ganger i 10 min hver med 1x PBS.
- Feste forførelseslapper til forsiden av lysbildene med monteringsoppløsning, la tørke ved romtemperatur i mørket, og oppbevar ess i mørket ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser representative brightfield-bilder av flere tidspunkter for å demonstrere hvordan cellene/organoidene ser ut gjennom de forskjellige stadiene av protokollen. HESCs ble fjernet fra vevkulturplaten, brutt i små biter, og plassert i en T75 ultra-lav festekolbe hvor de dannet kuler. Det er viktig å merke seg at cellene ser lyse og like ut i størrelse, uten mørke, døende celler i sentrene i disse klyngene. Cellene ble gradvis avvennet av bFGF. På dag 5 ble de plassert i nevrale induksjonsmedier, og de forble i denne media gjennom hele kulturperioden. Selv om organoider blir større og dermed mørkere over tid, er det viktig å merke seg nevrale rosettlignende strukturer (svarte piler) som er tilstede i hjernen organoid utvikling og utvide. Rosetter indikerer initiering av neural differensiering og inneholder trekk ved det embryonale nevrale røret, som viser epitelegenskaper og omgir en apical lumen15.
Farging av organoider med hematoksysin og eosin ved 5 måneder i kultur indikerte at det ikke var store mengder nekrose selv i sentrene, som var av første bekymring gitt stillestående kultursystem (Figur 2A). Disse organoidene demonstrerte en histologisk morfologi som ligner på den menneskelige cortex basert på lys mikroskopisk evaluering av en erfaren nevropatolog (Figur 2B). Ved histologi ble mange unike cellemorfologier observert som ligner glia (blått pilhode), nevroner (rød pilhode), celler med Cajal-Retzius morfologi (svarte piler) og neuropil (oransje pilhode) (Figur 2B,C).
For å ta en mer grundig titt på genuttrykk i cellene, ble qRT-PCR utført. For resultatene som vises i figur 3, representerer hver stolpe 3 separate grupper celler dyrket uavhengig og høstes på det angitte tidspunktet. Disse prøvene ble deretter kjørt i triplicate med et primerpar til det angitte genet i tillegg til rengjøringsgenet GAPDH. Glutamattransportøren, Vglut1 (Figur 3A),ble uttrykt ved 2,5 uker, økt ved 5 uker, og forble konsekvent gjennom 5 måneder i kultur. En forhjernen markør, Foxg1 (Figur 3B),ble uttrykt på lave nivåer til 5 uker i kultur. Den dype lagmarkøren, Tbr1 (Figur 3C),nådde rundt 5 uker og ble redusert senere, mens den øvre lagmarkøren, Satb2 (Figur 3D), økte over tid.
Uttrykket for ventrale markør Engrailed1 (Eng1) (Figur 3E),bakhjernen / ryggmargsmarkøren Hoxb4 (Figur 3F),samt oligodendrocyte-markøren, Olig2 (Figur 3G), økte over tid. I motsetning, stamcellemarkøren, Sox2 (Figur 3H),redusert over tid. Glial markøren, FAP (Figur 3I), toppet seg på 5 uker og forble relativt konstant senere. I tillegg var immunfluorescensdata i samsvar med qRT-PCR-dataene. Ved 10 uker var det et robust uttrykk for Foxg1 (Figur 4A). Sox2 uttrykket var mer begrenset til områder som ligner subventrikulær sone (SVZ) (Figur 4B,C). Interessant, det var også noen uttrykk for ytre radial glial celle markør, HopX (Figur 4D).
Figur 1: Oversikt over organoidvekstforhold og morfologi. (A) Skjematisk av medieendringer. - Jeg har ikke noe åsi. Representative bilder av organoider som de modnet. - Jegharikke noe åsi. H9 hESCs (B) ble brukt til å danne hjernen organoider. Organoider på (C) dag 2 i 20 ng / ml bFGF media, og (D) dag 3 og (E) dag 4 i 10 ng / ml bFGF media. - Jeg har ikke noe åsi. Organoider i nevrale induksjonsmedier (NIM) på dag 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K) og 70 (L,M). Pilene peker på nevrale rosetter. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Organoider delte histologiske likheter med menneskelig hjernevev. H&E farging av organoider ved 5 måneder (A) med noen lagdeling som ligner den menneskelige cortex (B). Ved høyere forstørrelse ble mange cellemorfologier observert, inkludert glia (blått pilhode), nevroner (rødt pilhode), neuropil (oransje pilhode) og celler med Cajal-Retzius morfologi (svarte piler) (B,C). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Uttrykk for nevroutviklingsgener i hjerneorganoider over tid. Kvantitative RT-PCR-data ved hjelp av SYBR grønn som evaluerer uttrykket for Vglut1 (A),Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) og GFAP (I). Feilfelt = gjennomsnittlig ± standardavvik (n ≥ 3). Dette tallet er endret fra16. Se tabell 1 for primerinformasjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Uttrykk for nevroutviklingsproteiner i hjerneorganoider ved 10 uker. Immunofluorescence avslørte et robust uttrykk for Foxg1 (A), lokalisert uttrykk for Sox2 (B,C) og tilstedeværelsen av HopX (D). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Genet | Sekvens (5' til 3') | Amplicon (andre betydninger) | Ekson | |
| En1 (andre) | F | Ggacaatgacgttgaaa CGCAGCA (Andre) |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT Ggctaga (nær Ggctaga) |
2 | ||
| Foxg1 (andre) | F | Agaagaacggcaagtac Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC (andre) |
1 | ||
| GAPDH (andre) | F | ACCACAGTCCATGCCAT (ANDRE) Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT Agcc (andre) |
9 | ||
| GFAP (andre) | F | AGAGATCCGCACGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5 til april | ||
| Hoxb4 (andre) | F | AAAGCACCCTCTGACTG Ccagata (andre) |
80 | 2 |
| R | Atgggcacgaaagatga GGGAGA (andre) |
2 | ||
| Olig2 (andre) | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA Gcg (andre) |
451 | 1 |
| R | Gcggctgttgatcttga Gacgc (andre) |
2 | ||
| Satb2 (andre) | F | Tagccaaaagaatgccct Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG TTG (andre) |
7 | ||
| Sox2 (andre) | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | Cctcccatttccctcgt TTT (andre) |
1 | ||
| Tbr1 (andre) | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | Acagccggtgtagatcg Vs |
6 | ||
| Vglut1 (andre) | F | Cagagttttcggctttg CTATTG (andre) |
183 | 5 til april |
| R | Gcgactccgttctaagg GTG (andre) |
6 |
Tabell 1: Primer sekvenser som brukes for kvantitative RT-PCR i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I likhet med andre organoidmodeller er dette et kunstig system som kommer med flere advarsler. Selv om det var lite batch til batch variasjon i form av generelle uttrykknivåer, individuelle organoider viste forskjeller. For eksempel var plasseringen av Sox-2 positive områder ikke identiske i hver organoid (Figur 3). Mens qPCR er egnet til å se etter generelle endringer i grupper av celler, vil flere teknikker som encellet RNAseq bli brukt i fremtidige studier for å samle inn mer informasjon på celle-for-celle-basis. En annen begrensning av dette systemet, er at det ikke integrerevaskulaturen i organoider som har blitt gjort i noen av de nyerestudiene 17,18,19. Imidlertid kan overgangen av hESCer fra et lavt til høyt oksygenmiljø ligner på anaerob til aerob overgang i et utviklende embryo.
De kritiske trinnene i denne protokollen er dannelsen av nevrosfærene, samt riktig vedlikehold, inkludert medieendringer med riktig kulturmedia for å sikre friske celler og tilstrekkelige næringsstoffer til de voksende organoidene uten overbefolkning . For å feilsøke utilstrekkelig cellespredning eller differensiering anbefaler vi å starte med en ny gruppe lavpassasje-ESCer og nylagde medier, inkludert kosttilskudd. Av og til kan det være batch variasjon av reagenser og materialer. Dermed anbefaler vi å kjøpe flere flasker reagenser som N2 og ultra-lave festeflasker som er fra samme mye så lenge de kan brukes på en rimelig tidsperiode.
I motsetning til mange andre hjerneorganoidprotokoller, bruker denne metoden ikke en bioreaktor; i stedet forblir cellene relativt stillestående bortsett fra medieendringer. Dette ligner på tidligere arbeid med nevrosfærer, som til slutt ble brutt fra hverandre for å lage 2D nevronale kulturer20. I denne modellen cellene holdes i et 3D-format og lov til å vokse i opptil 6 måneder i kultur. Det ble funnet at når du bruker små klynger i stedet for å aggregere enkeltceller som organoidene så lysere ut, som vi tolket som mindre nekrotisk. Som tidligere rapportert, når hjerneorganoidklyngene ble evaluert av histologi og immunofluorescens ved 5 måneder, var det ingen åpenbare områder av nekrose16. Selv om fra små klynger av celler introduserer litt variasjon i størrelsen på organoider dannet, var flertallet av organoider av omtrent samme størrelse.
Bruken av en heterologøs kjellermembranmatrise og en bioreaktor har både fordeler og ulemper. Visse celletyper, eller større hjerneorganoider kan foretrekke vekst under en eller annen tilstand. Kjellermembranmatriser eller andre hydrogeler kan være gunstige for selektivt å legge til vekstfaktorer i bestemte regioner eller lage spesifikke former. Selv om kjellermembranmatriser har vist seg å støtte tredimensjonal organisasjon og differensiering15,er det verdt å understreke at noen av disse produktene har en dårlig definert og variabel sammensetning som inkluderer mengder vekstfaktorer12. I tillegg til å forenkle arbeidsflyten mens du kuliterer hjerneorganoider, kan fraværet av en kjellermembranmatrise også forbedre tredimensjonale bildeteknikker.
Utviklingen av dette hjerneorganoidmodellsystemet tilbyr en ny tilnærming for mange potensielle applikasjoner. For eksempel kan giftige fornærmelser som hypoksi, hyperglykemi, hyperkapni og infeksjon blant andre, testes med dette systemet. I tillegg kan neurodevelopmental lidelser studeres med dette systemet ved å starte med enten genmodifiserte stamceller eller pasientspesifikke humane induserte pluripotente stamceller (hPSCer). Evnen til å legge til forskjellige celletyper under organoid kultur gir også mulighet til å studere tumor-hjerne interaksjoner. Gitt enkelheten i protokollen og mangel på dyre, spesialitet materialer vi håper at denne tilnærmingen kan vurderes av laboratorier både innenfor og utenfor feltet som en potensiell metode med sine egne unike fordeler for å fremme dette raskt utviklende og spennende disiplin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. er SAB-medlem for Dansar IT og Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for å få hjelp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans nevropatologi gjennomgang. Dette arbeidet ble støttet av Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en sjenerøs ubegrenset gave fra Joseph og Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G.
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U.
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al.
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
