Summary
היצרות לרינגוקנה התוצאות מתוך התצהיר צלקת פתולוגית כי באופן ביקורתי מצמצמת את דרכי הנשימה הקנה וחסר טיפולים רפואיים יעילים. באמצעות PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% pvc) סטנט כמערכת שילוח סמים מקומי, טיפולים פוטנציאליים המיועדים להפחתת התפשטות הצלקת בקנה הנשימה ניתן ללמוד.
Abstract
היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של תת-הבית וקנה הנשימה המוביל לחסימה מחוץ לבית החזה וקוצר נשימה משמעותי. התוצאות של המנהיג מפציעה מגוף זר בקנה הנשימה, המובילה לפגיעה ברקמות ותגובה דלקתית מקומית אשר משתבש, המובילה לתצהיר של רקמת צלקת פתולוגית. הטיפול עבור הארה הוא כירורגי עקב חוסר טיפולים רפואיים יעילים. מטרת שיטה זו היא לבנות סטנט תואם ביולוגי זה יכול להיות מיניאטורי למקום עכברים עם הארה. הדגמנו כי PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% polycaprolactone) בונה היה חוזק ביומכאני אופטימלי, היה ביולוגי תואם, מעשית עבור vivo מיקום סטנט, ומסוגל להתחמק תרופה. שיטה זו מספקת מערכת העברת תרופות לבדיקת סוכנים אימונומודולטוריים שונים כדי לעכב את הדלקת באופן מקומי ולהפחית פיברוזיס של דרכי הנשימה. ייצור סטנטים לוקח 28 שעות וניתן לשכפל בקלות ולאפשר ניסויים עם כנופיית גדולים. כאן אנו שילב את rapamycin התרופה בתוך סטנט כדי לבדוק את יעילותו בהפחתת פיברוזיס והתצהיר קולגן. התוצאות התגלו כי האוהלים PLLA-PCL הראו לשחרר rapamycin אמין, היו יציבים מכנית בתנאים פיסיולוגיים, היו תואמים ביולוגית, וגרימת תגובה דלקתית קטנה בקנה הנשימה. נוסף על כך, הפחתת הצלקת של היווצרות הצלקות בקנה הנשימה בvivo.
Introduction
היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של קנה הנשימה לרוב בשל פציעה הפוסט-צנרור. השילוב של הקולוניזציה החיידקית, תגובת גוף זר למעי הגס או צינורית אנדוקנה, וגורמים ספציפיים למטופל מובילים לתגובה דלקתית חריגה. זה התגובה החיסונית מסתגלת מוביל התצהיר של קולגן בקנה הנשימה, וכתוצאה מכך היצרות הלומיאל של קנה הנשימה ואת היצרות הבאים1,2. כמו הטיפול הנוכחי עבור מחלה זו היא כירורגית בעיקר, פיתוח אלטרנטיבה רפואית מבוססת טיפול הפרדיגמה מיקוד מסלולים דלקתיים והפרופיברוטיים להוביל התצהיר קולגן מוגזם נחקרו. Rapamycin, אשר מעכב את מתחם ה-mTOR איתות, הוכח כי יש אפקטים חיסוני מדכאים, כמו גם אפקט אנטיפיברוסט חזק. עם זאת, כאשר rapamycin הוא מנוהל באופן מערכתית, תופעות לוואי נפוצות (למשל, hyperlipidemia, אנמיה, תרומבוציטופניה) יכול להיות מבוטא3. מטרת המתודולוגיה שלנו היא לפתח רכב עבור משלוח סמים מקומי מעשית לשימוש בדרכי הנשימה כי היה להפחית את ההשפעות הללו מערכתית. ההערכות שלנו מתמקדות בחקירת התגובה החיסונית המקומית לבניית משלוח הסמים, כמו גם יכולתו לעכב את התפקוד הפיברוהפיצוץ ולשנות את הסביבה החיסונית המקומית. תוצאות ספציפיות למחלות כוללות בדיקות vivo כי הערכת סמנים של פיברוזיס.
סטנטים מתכלים לתרופות מתכלה שימשו במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכות איברים מרובות, כולל נתיב האוויר4. לניהול היצרות בדרכי הנשימה או קריסה, החקירות הקודמות השתמשו סיליקון מצופה סמים וסטנטים מבוססי ניקל5. בניית PLLA-PCL נבחרה עבור שיטה זו מסוימת בגלל הפרופיל שלה משחרלי התרופה וחוזק מכני בתנאים פיסיולוגיים במשך תקופה של 3 שבועות, אשר הוכח במחקרים הקודמים שפורסמו6. PLLA-PCL הוא גם חומר ביולוגי תואם ומתכלה כבר אושרה על ידי ה-FDA4. משחררי סטנטים ביולוגיים ו-MMC נבדקו בדגמי בעלי חיים גדולים כגון ארנבים וכלבים. עם זאת, במודלים אלה של בעלי חיים, סטנטים לא הושמו במודל בעל חיים של מחלות והושתל השתלת עצמות. מחקר זה מספק שיטה ייחודית להערכת סטנט ביולוגי משחררי התרופות ממוקם transorally במודל העכבר של פציעה בדרכי הנשימה והיצרות לרינגוקנה. סטנט תואם ביולוגי המפריש תרופה חיסונית מקומית והוא יכול להיות מיניאטורי למחקר במודל murine הוא בעל ערך עבור מחקר טרום המחקר הקליני. נסיונות קודמים לניצול סטנט עם מבנה חומרים אחרים שנוצר תגובות גוף זר חזק החמרה הדלקת הבסיסית המבדיל את הארה ב7. מתודולוגיה זו, לידיעתנו, היא הראשונה מסוגו ללמוד את ההשפעות האימונומודולטיות והאנטי פיברופטיים של מערכת העברת תרופות מבוססת-סטנט במודל של מורטין. המודל המורין עצמו מציע מספר יתרונות לחקר ההשפעות של סם אימונומודוללי על קנה הנשימה. עכברים מהונדסים גנטית וגדודים ניסיוני של עכברים בריאים וחולים ניתן ללמוד, אשר יכול להוביל לשינוי ניסיוני ולשפר עלות יעילות. יתר על כן, המסירה של סטנט העברת לתוך קנה הנשימה של העכבר מחקה משלוח קליני של סטנט כזה בבני אדם, אשר עוד מדגיש את היתרון הטרנסלייתי של שיטה זו. לבסוף, הקלות היחסית שבה הסטנט PLLA-PCL עם התרופה ניתן לייצר מאפשר שינויים כדי לספק טיפולי סמים חלופיים מכוון להפחתת צלקת היווצרות בקנה הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (MO12M354).
1. הכנת רפצין ב-PLLA-PCL
- הכינו שתי בקבוקים מזכוכית (עם כמוסות) של 70:30 PLLA-PCL פולימר פתרונות (צמיגות הגלום 1.3 כ 1.8 DL/G; רשימת חומרים) פתרונות, עם בקבוקון אחד המכיל 1.0% rapamycin והשני ללא rapamycin.
- לעשות 1.0% rapamycin המכיל פתרון פולימרי על ידי הוספת 6 מ"ג rapamycin ל 600 מ"ג של 70:30 PLLA-PCL בבקבוקון זכוכית.
- עבור פתרון פולימרי ללא rapamycin (שליטה), רק להוסיף 600 mg של 70:30 PLLA-PCL לבקבוקון זכוכית.
- מתחת למכסה המנוע, הוסיפו 6 מ ג של דילורומתאן לכל בקבוקון זכוכית.
התראה: Diלורומתאן הוא חומר מאכל רק בפיפטות זכוכית יש להשתמש. אמצעי זהירות מתאימים לבטיחות כוללים הגנת עיניים אישית וכפפות. - הוסף 120 μL של גליצרול לכל בקבוקון זכוכית (עבור 2% גליצרול הפתרון).
הערה: התוספת של גליצרול מאפשרת גמישות מוגברת ונוקשות מצומצמת במבנה סטנט. - לסכם את מבחנות זכוכית ולאפשר 70:30 PLLA-PCL עם וללא rapamycin להתמוסס המגון עבור 6-12 h.
הערה: ניתן להניח מבחנות זכוכית גם על פלטפורמת טלטול מסתובבת לפירוק מהיר יותר.
2. בדיקת הימנעות rapamycin
- פיפטה 1 מ ל של 70:30 התמיסה PLLA-PCL המכילה 1% rapamycin לתוך צלחת פטרי זכוכית.
הערה: נפח זה של 70:30 PLLA-PCL פתרון המכיל 1% rapamycin יכיל 120 μg של rapamycin ומייצג את הסכום הכולל של rapamycin בכל מבנה. ניתן להשתמש באמצעי אחסון חלופיים ובריכוזים. - אפשר 70:30 PLLA-PCL עם 1% rapamycin להתקשות לתוך דיסק שטוח בצלחת פטרי זכוכית.
- מוקשח פעם, מניחים את הדיסק ב 2 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS, pH 7.4) ו דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בחדר.
- לאסוף ולהחליף את PBS (2 מ ל) כל 24 h ולהשתמש אסף PBS עבור ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה (בדיקות) ניתוח של התוכן rapamycin.
- השתמש בדוגם אוטומטי ובעמודת כיול של C18 4.6 ס"מ x 250 מ"מ כדי להפעיל דגימות באמצעות מזרק לדוגמה אוטומטית יחד עם דילול סדרתי של rapamycin כדי ליצור עקומת סטנדרטי מכויל. הפעל כל דוגמה בטרילקטה.
הערה: דילול סדרתי של rapamycin להיבדק כוללים 10%, 1%, 0.1%, ו 0.01%. - השתמש בשלב נייד של המים בכיתות ובאמצעות מערכת השמע וה10/90 עם נפח הזרימה של 2.0 mL/min. הגדרת ספיגת במהלך השימוש במיניצין ל-280 nm.
הערה: איור 1 מציג את הימנעות rapamycin במשך 14 יום.
3. יצירת rapamycin-משחררי PLLA-PCL מורטין סטנטים לדרכי הנשימה
הערה: בצע את השלבים 3.2-3.9 באמצעות חומרים סטריליים וטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום שישפיע בvivo וביישומים החוץ-גופית.
- הכינו פתרונות PLLA-PCL המכילים rapamycin כפי שמתואר בסעיף 1.
- באמצעות זכוכית פסטר הצינורות עם בלון גומי, להחיל 1 מ ל של הפתרון PLLA-PCL המכיל 1% rapamycin על צינורית ורידים של 22 פרופילן G fluorinated המבוסס על אתילן הקטטר (טבלת חומרים). החזיקו את הקטטר ביד אחת והשתמשו בפיפטה זכוכית כדי להוריד את התמיסה PLLA-PCL על הקטטר. סובב לאט את הקטטר כדי להבטיח כיסוי הומוגנית של הקטטר עם פתרון PLLA-PCL.
הערה: בהתחלה, הפתרון PLLA-PCL יהיה דק, אבל כמו diלורומתאן מתאדה במהלך היישום על הקטטר האנגיו, הפתרון יהיה יותר צמיל עובש על ה-אנגיוצנתר. באופן רציף מפנה את הקטטר במהלך היישום הוא מועיל. שלב זה חייב להיעשות לאט ובקפדנות כדי להבטיח את עובי עקבי של סטנט. - השען את הקטטר היצוק עם קצה הקטטר הפונה כלפי מטה והניצב בקצה צלחת פטרי מזכוכית לייבוש.
- אפשר סטנטים לייבוש במשך 24 שעות במכסה ואקום בטמפרטורת החדר (איור 2א).
- להסיר את המבנה סטנט מתוך הקטטר הבסיסי הבסיס ידי פיתול בעדינות את הקטטר הבסיסי חינם והחלקת אותו מתוך סטנט יצוק (איור 2ב).
- בדוק את הסטנט בדרך לפגמים שאולי הביאו במהלך תהליך הליהוק. אם יש פגם בסטנט הקיים, מחק אותו.
- חתוך כל קצה של סטנט באמצעות מספריים ישרים דקים כך הקצוות הם צירית.
- באמצעות מספריים ישרים משובחים, גזור 3 מקטעי ציר מילימטר של סטנט יצוק לשימוש במודל העכבר של הארה (איור 2ג).
הערה: כ-8 סטנטים ניתן לעשות מקטטר אחד של אנגיוסטד, עם כל סטנט 3 מ"מ המכיל 120 μg של rapamycin. - לטעון את הסטנט 3 מ"מ על צנתר חדש 22 ורידי לשימוש במודל העכבר של הארה (איור 1).
4. לרינגוקנה היצרות אינדוקציה של עכברים
- לפני ניצוח בvivo העכברים לקבל אישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש.
- הC57BL זכר בן 9 שבועות על ידי מתן הזרקה תוך-הצפק של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine (5-10 מ"ג/ק"ג).
הערה: זנים אחרים של עכברים ניתן להחליף, אבל מומלץ כי משקל עכברים להיות בין 20-27 g. - אקראי עכברים לתוך קבוצה ניסיונית (פציעה כימית עם מיקום של 1% rapamycin המכילים סטנט PLLA-PCL) ושתי קבוצות שליטה: 1) פציעה כימית עם מיקום של סטנט PLLA-PCL, 2) פציעה כימית ללא יקום של סטנט.
- מניחים עכבר על מצע כירורגי במצב פרקדן. השתמש לולאה קטנה של חוט המוצמדת לחלק העליון של הפלטפורמה כדי להאריך את עמוד השדרה הצווארי על ידי לולאה אותו סביב חותכות המרכזי.
- לצרף את הידיים והרגליים של העכבר על השולחן באמצעות 2 אינץ ' חתיכות של קלטת. צביטה כף העכבר כדי להבטיח כי יש לו הרדמה נאותה.
- . האתר הכירורגי מוכן את הפרווה שמעליה יש להסיר את העור יש לנקות (יוד לסירוגין או לקרצף כלוראידין עם אלכוהול או חיטוי העור מדולל) שלוש פעמים. האזור צריך להיות עטוף כפפות סטרילי להיות שחוקים. הכלים הסטריליים יש לשכב על משטח סטרילי כאשר לא בשימוש.
- הפוך 1.5 ס מ לחיתוך אנכי באמצע הדרך בצוואר של העכבר באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדין. לחלק את התימוס מעל ולאחד את שתי האונות וכתוצאה מכך לדמיין את קנה הנשימה. חלק את לשון הלשון ואת סטרנותריס (רצועה) השרירים בבקיעים המצורף העליון.
הערה: מתחם האנדוסקופי כולו צריך להיחשף לחלוטין לאחר מכן. - העבירו צנתר באורך 22 גר'. דרך הגרון לתוך קנה הנשימה השתמש מלקחיים קטנים כדי להחיל לחץ על הגרון הקדמי של העכבר כדי לסייע במיקום הנכון של הקטטר אנגיו. דמיינו את הצנתר הלבן אנגיוקטטר דרך קנה הנשימה כדי להבטיח מיקום נכון (לא הוושט).
הערה: קנה הנשימה של העכבר הוא דק מאוד והקטטר לבנה אנגיוזה יהיה לדמיין דרך קנה הנשימה שקוף. - להעביר מברשת חוט מצופה ליאומיצין באמצעות הקטטר שנוספו האנגיו.
- לסגת לאט באיטיות את הקטטר כך שרק מברשת התיל תישאר בקנה הנשימה.
- להחיל לחץ מונה באמצעות מלקחיים עדינים על קנה הנשימה כדי לשבש מכנית את הקנה לומן עם מברשת התיל.
- הכנס את הקטטר לקנה הנשימה. מעל מברשת התיל
- הסר את מברשת התיל והחלה מחדש ליאומיצין.
- חזור על שלבים 4.8-4.12 סך של 5x. החל ליאומיצין על המברשת בין כל יישום.
הערה: ניתן למצוא את האימות והתיאור של מודל זה בהלל ואח '8. - הסירו את הקטטר. מקנה הנשימה של העכבר
הערה: אם אין סטנט להציב, החתך יכול להיות סגור עם דבק רקמות.
5. מיקום סטנט בעכברים
- טען אחד 3מילימטרהקשד הסטנט אל מרוקן 22 G אנגיוצנתר (איור 3א).
הערה: הסטנט צריך לנוח 5 מ"מ מקצה הקטטר. - לצייר קו דק שחור אנכי על סטנט 3 מ"מ הקשד.
הערה: קו זה מאפשר ויזואליזציה משופרת של סטנט בקנה הנשימה. - Transorally העכבר עם הצנתר אנגיוזה כבר טעונה מטעון עם סטנט.
- המחש את הסטנט על הקטטר בקנה הנשימה דרך החתך החוצה (איור 3ב).
הערה: קנה הנשימה הוא דק מאוד, ומאפשר לצבוע שחור על סטנט להיות מדמיין דרך קנה הנשימה. השתמש באפשרות זו כדי לאשר את מיקום הקנה הנכון. - להחזיק את הסטנט במקום על ידי מחזיק את קנה הנשימה דרך החתך החוצה עם מלקחיים עדינים.
- הסר את ההמרה אנגיוקטטר בעוד שמירה על אחיזה על סטנט עם מלקחיים עדינים.
הערה: חשוב מאוד לא להחיל כוח רב מדי כדי סטנט לא למחוץ את לומן כאשר הקטטר אנגיול מוסר. עם זאת, מספיק כוח נדרש כדי להבטיח סטנט לא מוסר עם הקטטר אנגיו. Sialendoscope 0.8 mm יכול לשמש כדי להמחיש את המיקום ואת המיקום של סטנט בקנה הנשימה. - סגור את החתך החוצה. עם דבק רקמות
- אפשר לכל עכבר להתאושש לרמת הפעילות המקורית שלו לפני שתמקם אותו חזרה בכלוב שלו.
6. הכנה היסטולוגית של דגימות
- עכברים מורדם עם שאיפה הרדמה ועכברים להקריב עם פריקה צוואר הרחם לכל פרוטוקול בעלי חיים לאחר 7, 14, או 21 ימים.
הערה: מבוסס על המתעד של המחקר, מרווחי זמן שונים ניתן להשתמש (למשל, 28, 30 ימים, וכו '). - הצב עכבר על הפלטפורמה כירורגית כפי שמתואר בשלבים 4.4 ו 4.5.
- פתח מחדש את החתך הצוואר על העכבר באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדין.
- לחשוף את קנה הנשימה לשלב 4.6.
- לחלק את קנה הנשימה המרוחק מתחת לרמה של סטנט באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדינה.
- לחלק את קנה הנשימה הקודם מתחת לגרון ומעל סטנט באמצעות מספריים קשתית עדין מעוקל.
הערה: חשוב לחלק תחילה את קנה הנשימה המרוחק כדי למנוע את המשך הנשימה לתוך החזה. - הפרד את קנה הנשימה מחולק מן הוושט פוקטילי ולהסיר את קנה הנשימה מהעכבר.
הערה: סטנטים יישמרו עדיין בתוך קנה הנשימה של העכבר. - להסיר סטנט מקנה הנשימה ולתקן 10% פורמלין עבור 24 h.
- הטמע formalin-קנה הנשימה של העכבר קבוע בתוך פרפין עם הקצה המרוחק מונחה מוכוונת כך חתכים צירית של קנה הנשימה ניתן לעשות בשלב הבא.
- גזור 5 יקרומטר סעיפים של קנה הנשימה פרפין עכבר מוטבע באמצעות microtome.
הערה: יש לגזור את הדגימות באופן שמתחיל מקנה הנשימה המרוחק. - להשיג מקטע מייצג 5 יקרומטר כל 250 יקרומטר לאורך הדגימה.
- השלם H & E כתם על כל סעיף נציג.
- לחלק את השקופיות על ידי הצבת ב-קסילן 2x לכל שקופית עבור 3 דקות.
- מניחים את השקופיות ב 100% אתנול עבור 2 דקות, 95% אתנול עבור 2 דקות, ו 70% אתנול עבור 2 דקות כדי לשחזר.
- שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 2 דקות.
- הכתם את השקפים במטאוקסילין במשך 3 עד 5 דקות.
- שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 5 דקות.
- מניחים את השקופיות ב 1% חומצת אלכוהול במשך 1 דקות.
- שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 1 דקות.
- לשטוף ב 0.2% אמוניה מים עבור 30 s.
- לשטוף את השקופיות בריצה מי ברז עבור 5 דקות. לטבול ב 95% אתנול 10x.
- אאוזין כתם על ידי הצבת שקופית ב אאוזין phloxine עבור 30 s.
- מייבשים את השקופיות על ידי הצבת 95% אתנול עבור 5 דקות, ואחריו אתנול מוחלט 2x עבור 5 דקות.
- מקום ב קסילן 2x עבור 5 דקות.
- טעינת השקופיות באמצעות מדיום הרכבה מבוסס קסילן.
- למדוד את העובי של האמינה כמתואר בהלל ואח '.8.
7. התאמה ביולוגית סטנט בvivo
- הכינו חתכי רקמה בשלבים 6.1-6.4. אין להסיר סטנט מתוך אלה מקטעי הקנה כדי להמחיש את השינויים בדלקת ביחס למיקום של סטנט בתוך לומן של קנה הנשימה.
- כדי לקבוע את תגובת גוף זר חריפה סטנט, להתבונן מקרופאג ו-T פעילות התא באמצעות CD3 ו F4/80 סמנים.
הערה: סמנים אחרים יכולים לשמש גם כדי לקבוע תגובה דלקתית חריפה סטנט. - השג 5 יקרומטר לגזור סעיפים של הפרפין מוטבע קנה הנשימה על הידרופילי זמין מסחרית בתוספתשקופיות (טבלת חומרים). מקם שני מקטעים בכל שקופית.
הערה: מקטעים אלה צריכים להיות מאזור קנה הנשימה שבו הוצב סטנט PLLA-PCL.
- כדי לקבוע את תגובת גוף זר חריפה סטנט, להתבונן מקרופאג ו-T פעילות התא באמצעות CD3 ו F4/80 סמנים.
- מקם את השקופיות ב-קסילן 2x עבור 5 דקות כל אחת.
- מניחים את השקופיות ב 100% אתנול 2x עבור 3 דקות כל אחד.
- מניחים את השקופיות ב 95% אתנול עבור 1 דקות.
- מניחים את השקופיות בארון כתמים היסטולוגיה כך שהם שקועים מאגר אחזור אנטיגן (טבלת חומרים) ולאחר מכן מניחים בסיר ירקות עם מים רותחים במשך 20 דקות.
- להסיר את המדפים מכתים מן הקיטור ולמחוק את מאגר אחזור אנטיגן.
- החלף את המאגר באמצעות 1 mL של PBS.
- מקם את השקופיות בתיבה מכתימה רטובה עבור 1 דקות.
- התעלם מערוץ ה-PBS והעבר את השקופיות עם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS במשך 30 דקות.
- השמט את DMEM והוסף תערובת של שני נוגדנים עיקריים שהועלו במינים שונים. כסו את השקופיות עם סרט פרפין והמשך הלילה ב -4 ° c בחדר חשוך.
הערה: בפרוטוקול זה הארנב anti-CD3 ועכבר anti-F4/80 (טבלת חומרים) שימשו. - שוטפים את השקופיות ב-PBS 3x עבור 5 דקות.
- מודלת את השקופיות עם נוגדנים משני ספציפיים מינים הנוגדן העיקרי (טבלת חומרים) מדולל ב-dmem עם 10% fbs עבור 0.5-1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
- שוטפים את השקופיות ב-PBS 3x עבור 5 דקות בחושך.
- הר את השקופיות על כיסוי עם טיפה של בינוני הרכבה עם 4 ' 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI). אחסן את השקופיות בחשיכה ב-20 ° צ' או 4 ° c.
- שימו לב לשקופיות המוכתמות על מיקרוסקופ וצילום של סריקת לייזר.
- לכמת את המספר הכולל של תאים מכתים עם DAPI ונוגדנים של עניין להשוואה לקנה הנשימה לא נפגע.
8. קנה הנשימה כמותי ניתוח ביטוי גנים
- לאסוף את קנה הנשימה של העכבר כפי שמתואר בשלבים 6.1-6.7 ו להסיר סטנט.
הערה: שנקטפו קנה הנשימה של העכבר כפי שניתן לאחסן במקפיא של 80 ° c עד 2 שנים. - התייבשות רקמת הקנה שנקטפו בשלב 8.1 באמצעות מספריים עדינים ועוד הומוגון באמצעות מטחנת חרוז הומוגניצר עם 1.4 מ"מ חרוזים קרמיקה (טבלה של חומרים) כחלק מסחרית זמין טור מבוסס מערכת החילוץ של RNA (טבלת חומרים).
הערה: חרוז במיל הגדרות הגדרה = 1 40 s מחזור ב 6 מטרים לשנייה. - לחלץ RNA מן הקנה אל ליפוסט באמצעות החילוץ מבוסס עמודה ערכת טיהור (טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן.
- לכמת RNA מכל מדגם באמצעות ספקטרוסקופיה (טבלת חומרים).
הערה: הטוהר RNA מוערך באמצעות היחס 260/230 ננומטר עם מדגם RNA טהור הקריאה 2.0. - יצירת דנ א משלים מ-RNA מופק באמצעות היפוך הטרנסקריפטאז (שולחן חומרים) והציקלניה עם ההגדרות הבאות: 5 דקות ב -25 ° צ' (הטרמה), 46 ° c עבור 30 דקות (שעתוק הפוך), ולאחר מכן 95 ° c עבור 1 דקות (הפעלה של היפוך הטרנסקריפטאז).
- לדלל דגימות DNA משלימים עם RNase מים ללא תשלום לריכוז של 10-25 ng/mL לשימוש כמותי בזמן אמת-PCR.
- מערבבים 1 μL של ה-DNA המשלים (10/25 ng/mL) עם 10 μL של שילוב מאסטר של ה-PCR (טבלת חומרים), 8 Μl של ddh2O ו-0.5 Μl של 10 μm קדימה והפוך התחל עבור הגן של עניין אחד טוב של הצלחת 96-היטב PCR (טבלת חומרים).
הערה: הנפח הכולל בכל טוב צריך להיות 20 μL. כל טוב על 96 צלחת הבאר צריך להכיל רק דוגמה אחת גן אחד של עניין. - חזור על שלבים 8.1 – 8.7 עבור כל הגנים של עניין ולהפעיל כל מדגם עבור כל גן בטרילקאט.
הערה: היסוד הגנטי הקדמי והפוך (טבלה של חומרים) עבור קולגן 1, קולגן 3, ואת הגן התייחסות β-actin משמשים בדרך כלל כדי לחקור סמנים של פיברוזיס. - מניחים את הצלחת 96 על מכונת ה-PCR כמותי בזמן אמת וליזום את הפרוטוקול הבא: השעה 95 ° צ' עבור 15 s ו-להאריך ב 60 ° צ' עבור 60 s עבור 40 מחזורים.
- לנרמל את ערך הסף של המחזור (CT) עבור זיהוי מוצר גנטי של כל גן של עניין (הגוי) לערך ה-CT עבור הגן ההפניה β-actin עבור כל הדגימות כדי לקבל ΔCT עבור כל האלה. לאחר מכן, השווה את ערכי ΔCT עבור כל הגוי עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים כדי ליצור ΔΔCT.
הערה: סף המחזור הוא הנקודה בעקומת הגברה כאשר כמות קבועה מראש של מוצר גנטי קיים (ΔRn). הערך ΔRn עבור כל תגובה צריך להיקבע עבור כל גן של עניין, צריך ליפול על החלק הליניארי של עקומת הגברה.
הערה: ΔCT (CT) – CT (גן התייחסות); ΔΔCT = ΔCT (מטופל) – ΔCT (לא מטופל). - חשב את השינוי היחסי בביטוי הגנים בין דגימות שטופלו ללא טיפול כביטוי של שינוי קיפול על-ידי חישוב 2ΔΔCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתכלה PLLA-PCL סטנט לבנות טעון עם rapamycin בשימוש במחקר זה היה מסוגל להתחמק rapamycin בצורה עקבית וצפויה בתנאים פיסיולוגיים (איור 1). איור 2 מראה את הסטנט של plla-PCL בסביבות 22 G אנגיוקטטר לשימוש במודל murine של הארה. כדי לקבוע אם ההשפעות של הימנעות rapamycin בקנה הנשימה היא יעילה פיברוזיס מחליש, שינויים מדודים פיברוזיס ביטוי גן הקשורים וסמנים של דלקת חריפה ניתן להעריך באמצעות ביטוי גנים ניתוח, הזרמת cy, החיסונית, immunofluorescence, ו-אליסה. מיקום מוצלח של סטנט מיניאטורי לתוך קנה הנשימה של העכבר באמצעות השיטה המתוארת לעיל הוכח. תרשים סכמטי של השיטה מוצג באיור 3. איור 4 מציג את סטנט תואם ביולוגי מיניאטורי באתרו בקנה הנשימה כפי שצוין על ידי סמן שחור על סטנט, אשר הוא דמיינו דרך קנה הנשימה שקוף העכבר. בניסויים הראשוניים, באמצעות sialendoscope 0.8 mm כדי לאשר מיקום של סטנט בקנה הנשימה היה מועיל. לאחר 21 ימים, כדי לאשר כי מיקום transoral של סטנט היה יעיל הסטנט לא העביר מהמיקום המקורי שלה, חתך הצוואר נפתח מחדש כדי לקבוע את המיקום של סטנט. כפי שמוצג באיור 4B, הסמן צבע שחור של סטנט הראה סטנט שמר את מיקומו בקנה הנשימה. כריתת קנה הנשימה לאחר 21 ימים של טיפול עם סטנט מוצג באיור 4ג.
תמונות מייצגות של בדיקות תאימות באמצעות כתמים immunofluorescent לסמנים של דלקת חריפה כרונית מוצגים באיור 5. זה הוכיח כי בניית סטנט PLLA-PCL (ללא rapamycin) לא היה immunoreactive שנקבע על ידי מספר מינימלי של תאים חיסוניים נוכח לאחר המיקום. חשוב לציין כי בשיטה זו, קנה הנשימה בלתי נפגעים נורמלי כפי שנעשה בשימוש, סטנט PLLA-PCL ללא rapamycin הוצב כדי לקבוע את התגובה הדלקתית למבנה עצמו.
הבא, כדי לקבוע אם ראפצין-משחררי הסטנט PLLA-PCL היה יעיל בצלקות מקלים, בעבר הפגינו שינויים גנים ביטוי סמנים של דלקת חריפה פיברוזיס6. באופן ספציפי, יש הפחתת קיפול 90.3 (SEM ± 26.0; n = 4; p < 0.01) הפחתת col1a1 ביום 4, כמו גם סמנים דלקתיים חריפה INF-γ, CD11b, arg-1, ו-IL-1b6. למרות ההבדלים בשינוי קיפול עבור גנים מסוימים לא היו משמעותיים, ייתכן כי עם קבוצה גדולה יותר של עכברים, המשמעות יכולה להיות מושגת. כדי לקבוע אם היו שינויים בקנה הנשימה עקב משחררי התרופות באופן היסטולוגית, או אם היו שינויים בקנה הנשימה עקב מאמץ כוח רדיאלי על ידי סטנט, הדגמנו כי יש ירידה ברוחב של לאמינה בקנה מידה אלה כמו מטופלים עם סטנטים rapamycin לעומת אלה ללא rapamycin משחררי סטנטים6.
איור 1: ראפצין PLLA-הימנעות PCL. בניית PLLA-PCL המכיל 1% rapamycin הפגינו שחרור עקבי וצפוי של rapamycin במשך 14 יום. נקודות נתונים מייצגות את ממוצע ± SEM של הימנעות מדגימה (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השלכת סטנט. (א) הורשה פתרון plla-PCL להתייבש בסביבות 22 גר' אנגיוצנתר. (ב) הגבס הוסר מהקטטר. (ג) סטנטים נחתכו לאורך 3 מ"מ לשימוש בדגם העכבר6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום הסטנט הטרנס הצבת בעכברים. (א) סטנט הוטען על קטטר ריק והניח מעבר לקנה הנשימה. (ב) הצבע השחור סימון על סטנט ניתן לראות דרך חתך החוצה כדי לאשר את מיקומו בקנה הנשימה של העכבר. (ג) הנציג של הסטנט באתרו את קנה הנשימה של העכבר החולה6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: באתרו תמונות של סטנט. (א-ב) סטנט עם סימון צבע שחור ניתן לראות באתרו בקנה הנשימה murine. (ג) דימוי של סטנט ומתחם הטיפול בקנה הנשימה של מורטין לאחר המסיק ב -21 יום6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תאימות ביולוגית סטנט. Immunofluorescent כתמים עבור F4/80 (מקרופאגים, כרומופור אדום) ו CD3 (כרומופורירוק, T-לימפוציטים) ביום 4 חשף תאים דלקתיים מינימלי ב (א) קנה הנשימה הבלתי נפגע ו (ב) קנה הנשימה של plla-PCL סטנט. זה ניגודים עם (ג) קנה הנשימה נפגע, עם מעובה לאמינה ונוכחות של תאים רבים עם חיובי F4/80 ו CD3 צביעת6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעדים הקריטיים ביותר עבור בהצלחה בנייה ושימוש סטנט משחררי התרופה ב vivo הם 1) קביעת היחס האופטימלי של PLLA-PCL עבור שיעור התרופה הרצוי, 2) קביעת הריכוז המתאים של התרופה כדי להיות משתמט, 3) ליציקת סטנטים סביב הקטטר לשימוש vivo, ו 4) מעביר את הסטנט לתוך העכברים לאחר האינדוקציה של הארה ב מבלי לגרום לחסימת דרכי הנשימה קטלנית.
בעוד ישנן מספר שיטות להעברת סמים באמצעות סטנטים בדגמי בעלי חיים של מחלת דרכי הנשימה, פיתוח סטנט תואם ביולוגי המסוגל לשלוח סמים במודל מורטין חולה הוא הראשון. בפיתוח שיטה זו למסירת סמים, נעשו מספר שינויים בשיטה. חשוב היה לקבוע את הרכב PLLA-PCL המתאים להכנת סטנטים שהיו נוקשים מכנית מספיק כדי להניחה לקנה הנשימה ולהישאר בקנה הנשימה למרות הפרשות פיזיולוגיות. 70:30 הרכב של PLLA-PCL הוחלט על הבנייה סטנט עם הפלסטיק אנגיוקטטר משום שהוא יכול בהצלחה elute rapamycin בטבע מסוגל, להציב בצורה בטוחה ואמינה במודל העכבר שלנו, ולא לבזות הפיסיולוגית תנאים. חלק קשה פוטנציאלי היצרן של שיטה זו הוא מעצבים את סטנט סביב אנגיוקטטרים. בתחילה, בבניית סטנטים vivo, 22 ג'י-אנגיוקטונים הונחו בתוך קצה של פיפטה זכוכית והפתרון הפולימרי נשפך לחלל שבין הקטטר והפיפטה של הזכוכית, ויצרו את החלל שבין הצינורות. עם זאת, הקיר של סטנטים כתוצאה משיטה זו לעתים קרובות היו דקים מדי ולא היה מסוגל להיות ממוקם באופן אמין לתוך קנה הנשימה. מגבלה של השיטה הנוכחית ליצירת סטנטים על הקטטר היא התלות ביצרן לצורך עקביות, והצורך בתשומת לב קפדנית לפרטים כדי להבטיח הומוגניות בייצור סטנטים. הפוטנציאל לשונות בעובי בין סטנטים בלבד צריך להיות ממוען במחקרים עתידיים. עם מחקרים נוספים, אנו מקווים לעצב עובש עבור 22 G אנגיוקטטר מוקף בזכוכית אחרת או חומר לא מאכל כזה, כי הרווח בין הקטטר המרכב הזכוכית הוא 50 μm, אשר אנו נחושים להיות עובי הקיר נאותה של סטנט להנחה קלה בקנה הנשימה.
ישנם מספר יתרונות כדי להשתמש סטנט תואם ביולוגי ללמוד משלוח סמים לקנה הנשימה המושפע. באופן כללי, סטנטים המורכבים ממתכת או סיליקון שהיו מצופים בפולימר המכיל את התרופה, הוכחו לייצר רקמת גרנולציה ותגובה דלקתית נוספת לחלק מצולק כבר מקנה הנשימה. שיטה זו, שחוקר את השימוש בסטנט שנעשה כולו מסוג ביולוגי התואם גם לתרופה החיסונית באופן אמין, היא יתרון. סטנט PLLA-PCL מוצג גם ביולוגי תואם במודל murine ואינו מעורר תגובה דלקתית חריפה. במחקר תרופות שיכולות להילחם פיברוזיס, באמצעות סטנט מורכב לחלוטין של חומר ביולוגי כגון PLLA-PCL כפי שמתואר בשיטה זו הוא מועיל.
היתרון והקלות של שימוש בשיטה זו לבניית סטנטים שמישים הוא שהרכב של PLLA-PCL יכול להיות מגוון, ומאפשר הבדלים בפרופילי השחרור עבור התרופה המעורבת בקומפוזיציה. המחקרים הקודמים של החומר PLLA-PCL להראות כי וריאציה בתערובות PLLA-PCL יכול להוביל לירידה גדולה יותר של החומר, המאפשר שחרור סמים מהיר יותר9. יתר על כן, שימוש בשיטה זו לבניית סטנטים שניתן להניחה בעכברים הוא יתרון, כמו רוב מחקרי סטנט למחלות דרכי הנשימה נעשו בעלי חיים גדולים יותר10,11,12. השימוש במודל העכבר שניתן לשנות לתבניות מחלות שונות ולאפשר בדיקות של סטנט משחררי סמים במצב חולה הוא אידיאלי. בדיקת סטנט משחררי תרופות במצב חולה והיכולת להשוות את יעילותה לאלה בעלי חיים ללא מחלה מאפשר הקשיחות ניסיונית יותר. שיטה זו מראה גם כיצד סטנט משחררי התרופה עבור נתיב האוויר ניתן להציב, בניגוד למחקרים קודמים שבהם סטנטים הושתל בניתוח.
מחקר זה מדגים פלטפורמה שמיש מאוד לפיתוח סטנטים ובדיקות במודל בעל חיים קטן. עם זאת, יש לשקול גורמים אחרים לשימוש בנושאים אנושיים. בהינתן המשרד והאופי הנוקשה של סטנט זה נראה לא יכול להיות ממוקם דרך ברונסקופ גמיש מתועל אך יהיה צורך להציב באופן מונחה עם ברונגוסקופיה ישירה ו הסימפיוסקופיה נוקשה. באופן אידיאלי, סטנט ימוקם לאחר התרחבות בלון של נתיב האוויר כדי לסייע להפחתת היצרות מחדש. מן הפוטנציאליים של בטיחות החולה, הפוטנציאל סטנט להעביר היא דאגה גדולה כפי שהוא עלול לגרום לסכנת חיים להתפשר בדרכי הנשימה. שנית, הפוטנציאל של חסימה סטנט משני להצטברות של ריר או דם חייב להיחשב גם. בדיקות ופיתוח נוספים נחוצים כדי למזער סיכונים אלה.
מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לבדוק תרופות שונות בתערובת PLLA-PCL כדי להבין עוד איך טיפולים מדכאים שונים יכול להפחית את היווצרות צלקת בקנה הנשימה. בגלל סטנטים כאלה ניתן להציב עכברים, באמצעות קבוצה גדולה יותר של עכברים או עכברים עם שינויים גנטיים כדי ליצור צלקת הגנים יכולים גם להיבדק. ניסויים עתידיים יכולים גם לכלול הבנה של השינויים בקנה הנשימה שיכול להתרחש לאחר השרשה כרונית של סטנט (3 – 6 חודשים) ואת השינויים לומן הקנה, כמו גם את הפרופיל ביטוי גנים של סמנים דלקתיים פיברוזיס סמני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרס 1K23DC014082 ו 1K23DC014082 (אלכסנדר הלל). מחקר זה היה גם נתמך מבחינה כספית על ידי האגודה הטריולוגית והמכללה האמריקנית למנתחים (אלכסנדר הלל), קרן האגודה האמריקנית לרפואה, שיקגו, IL (Madhavi Duvvuri) ו מענק הכשרה T32 נדבך (קווין Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
