Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen af Liposomer, og hvordan disse kan være immobiliseret på en overflade og afbildet individuelt i en massiv parallel måde ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Dette giver mulighed for kvantificering af størrelsen og kompositoriske inhomogenitet mellem enkelte Liposomer af befolkningen.
Abstract
De fleste forskning, der beskæftiger Liposomer som membran modelsystemer eller narkotika levering bærere er afhængig af bulk læse-out teknikker og dermed iboende antager alle Liposomer af ensemblet at være identiske. Nye eksperimentelle platforme, der kan observere Liposomer på enkelt partikel niveau, har imidlertid gjort det muligt at udføre meget sofistikerede og kvantitative undersøgelser af protein-membran interaktioner eller lægemiddel bæreegenskaber på individuelle Liposomer, således undgår fejl fra ensemble gennemsnit. Her præsenterer vi en protokol til forberedelse, påvisning og analyse af enkelte Liposomer ved hjælp af en fluorescens baseret mikroskopi analyse, der letter sådanne enkelt partikel målinger. Opsætningen giver mulighed for billeddannelse individuelle Liposomer i en massiv parallel måde og er ansat til at afsløre intra-stikprøvestørrelse og kompositoriske inhomogeniteter. Desuden, protokollen beskriver fordelene ved at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau, begrænsningerne af analysen, og de vigtige funktioner, der skal overvejes, når de ændrer det til at studere andre forskningsspørgsmål.
Introduction
Liposomer er sfæriske phospholipid-baserede vesikler, der er stærkt anvendt både i grundlæggende og anvendt forskning. De fungerer som fremragende membran modelsystemer, fordi deres fysisk-kemiske egenskaber let kan manipuleres ved at variere de lipid komponenter, der udgør Liposom1,2. Også, Liposomer udgør den mest anvendte Drug levering nanocarrier system, tilbyder forbedret farmakokinetik og farmakodynamik samt høj biokompatibilitet3.
I mange år, Liposomer er primært blevet undersøgt ved hjælp af bulk-teknikker, giver kun adgang til ensemble gennemsnitlige læse-out værdier. Dette har ført hovedparten af disse undersøgelser til at antage, at alle Liposomer i ensemblet er identiske. Sådanne ensemble-gennemsnitlige værdier er dog kun korrekte, hvis det underliggende datasæt er jævnt fordelt omkring middelværdien, men kan repræsentere en falsk og forudindtaget konklusion, hvis datasættet omfatter flere uafhængige populationer, f. eks. Derudover, forudsat at ensemble betyder at repræsentere hele befolkningen kan overse de oplysninger, der harkede sig i inhomogeniteten mellem Liposomer. Først for nylig har der vist sig kvantitative analyser, som er i stand til at sonde enkelte Liposomer, afslører store inhomogeniteter mellem individuelle Liposomer med hensyn til vigtige fysisk-kemiske egenskaber, herunder Liposom størrelse4, lipid sammensætning5,6, og indkapsling effektivitet7, fremhæver betydningen af at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau.
Et forskningsområde, hvor ensemble gennemsnit af Liposom egenskaber har vist sig at bias resultater er at studere Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner8,9. Traditionelt, forskere, der studerer sådanne processer har været begrænset til at forberede Liposomer med forskellige ensemble gennemsnitlige diametre ved ekstrudering gennem filtre med forskellige porestørrelser9. Men, udtrække diameteren af individuelle Liposomer ved hjælp af enkelt Liposom assays har afsløret store befolknings overlap, med Liposomer ekstruderet ved hjælp af 100 nm og 200 Nm filtre viser op til 70% overlap i deres størrelse fordeling4. Dette kunne alvorligt bias bulk målinger af Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner10. Udførelse af membran-protein interaktion undersøgelser ved hjælp af enkelt Liposom assay, forskerne i stedet benyttede sig af størrelsen-polydispersitet i prøven, giver dem mulighed for at studere en bred vifte af Liposom diametre inden for hvert enkelt eksperiment, lette nye opdagelser af hvordan membran krumning og sammensætning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et andet område, hvor anvendelsen af enkelt Liposom assays har vist sig instrumental er i Mekanistiske undersøgelser af protein-medieret membran fusion13,14. For sådanne kinetiske målinger linderede evnen til at studere individuelle fusions hændelser behovet for en eksperimentel synkronisering af fusionsprocessen, hvilket gav mulighed for ny mekanistisk indsigt, som ellers ville være gået tabt i den spatiotemporale gennemsnit udført i bulk ensemble målinger. Desuden er enkelt Liposomer blevet brugt som en membran stilladser, der gør det muligt at måle individuelle proteiner og tilbyde ny viden om transmembran protein strukturel dynamik15,16. Desuden gjorde sådanne proteoliposome-baserede opsætninger det muligt at studere funktionen af individuelle transmembran transportører17 og pore dannende protein komplekser18 samt mekanismen af bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt Liposomer er også blevet brugt som bløde stof nanofluidics med overflade-immobiliseret enkelt Liposomer tjener som kamre til enzymatiske reaktioner i mængder på 10-19 L, øge gennemløb og kompleksiteten af screening assays med minimalt produkt forbrug20.
For nylig, enkelt Liposom assays har været brugt til at karakterisere Drug levering Liposomer på et tidligere forældet niveau af detaljer. Forskerne var i stand til at kvantificere væsentlige inhomogeniteter i mængden af polymer fastgjort til overfladen af individuelle Liposomer21. Den enkelte Liposom assays også tilladt målinger af Drug levering Liposomer i komplekse medier, såsom blodplasma, afslørende hvordan elementer forankret til liposomoverfladen gennem lipid ankre kan være modtagelige for dissociation når Liposomer er udsat for betingelser efterligne dem, der opleves under in vivo cirkulation22. Samlet set er alsidigheden og nytten af de enkelte Liposom assays underbygget af de mange forskellige problemer, som disse opsætninger har været ansat til at løse, og vi forestiller mig, at metodologien fortsat vil blive udviklet og finde anvendelse på nye videnskabelige områder.
Her beskriver vi en fluorescens Microscopy-baseret enkelt Liposom-analyse, der tillader individuelle Liposomer at blive undersøgt i en høj gennemløb måde (figur 1). For at illustrere metoden bruger vi den til at kvantificere størrelsen og den kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer i et ensemble. Analysen anvender fluorescens mikroskop billeder af enkelt Liposomer immobiliseret på en passiveret glasoverflade. Vi beskriver først de kritiske trin i Liposom fabrikationsprocessen, der sikrer korrekt fluorescerende Liposom mærkning og immobilisering. Derefter beskriver vi den overflade forberedelse, der er nødvendig for at lette Liposom immobilisering, før den skitserer proceduren for at sikre passende Liposom overflade tæthed. Vi diskuterer mikroskopi parametre vigtigt for at erhverve høj kvalitet billeder og afgrænse, hvordan man udfører simple dataanalyse, tillader udvinding af Liposom størrelse og kompositoriske inhomogenitet. Denne generiske protokol bør give den interesserede forsker et godt grundlag for at udvikle analysen yderligere for hans eller hendes specifikke forskningsinteresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. præparation af liposome
Bemærk: forberedelse af Liposomer omfatter normalt tre afgørende trin: 1) tilberedning af tørre lipid-film af den ønskede lipid-sammensætning; 2) rehydrering af lipiderne til dannelse af Liposomer; og 3) kontrol af størrelsen og lamellaritet af Liposom populationen.
- Afvejes lipiderne og opløse dem i tert-butanol: vand (9:1) i hætteglas.
- Opløs POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin; MW = 760 g/mol) til 50 mM.
- Kolesterol opløses (MW = 387 g/mol) til 25 mM.
- Opløs DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-Atto488; MW = 1.316 g/mol) til 0,1 mM.
- Opløs DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-Atto655; MW = 1.368 g/mol) til 0,1 mM.
- DSPE-PEG2000-biotin (1,2-distearyl-SN-glycero-3-phosphatethanolamin-N-[biotinyl (polyethylenglycol)-2000] opløses. MW = 3.017 g/mol) til 0,1 mM.
Bemærk: varme lipiderne til 55 °C og brug magnetisk omrøring for at sikre fuldstændig opløsning af lipiderne. Alternativt kan du bruge et sonikering bad. Ubrugte lipidlagre kan opbevares ved-20 °C i flere måneder.
- Bland lipid bestande fremstillet i trin 1,1 til en molær ratio af POPC: kolesterol: DOPE-Atto488: DOPE-Atto655: DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0,05, ved at tilføje 138 μL af POPC, 120 μL af kolesterol, 500 μL af hver fluorescently mærket lipid, og 50 μL af DSPE-PEG-biotin til et frisk hætteglas.
Bemærk: den nøjagtige Liposom sammensætning kan nemt ændres for at løse det specifikke spørgsmål om interesse. Se diskussionen for flere detaljer. - Løsn låget på hætteglasset, og fastgør hætteglasset i flydende nitrogen.
- Lyophilize den frosne lipid blandingen natten over.
- Tilsæt 1 mL 200 mM D-sorbitol buffer (sorbitol buffer) til tørre lipiderne.
- Blandingen opvarmes til 45 °C og udsættes for magnetisk omrøring i mindst 1 time.
Bemærk: bufferen bør afspejle det specifikke spørgsmål, der behandles (f. eks. fysiologiske betingelser for at studere membran-protein interaktioner, eller en specifik klinisk godkendt buffer til at studere lægemiddel leverende Liposomer). Men hvis der ikke kræves en specifik buffer til studiet, kan der påføres en buffer uden ioner for rehydrering for at reducere liposomets multilamellaritet. - Frys lipidsuspensionen ved at dyppe hætteglasset i flydende nitrogen, og vent, indtil suspensionen er helt frosset.
- Dyp den frosne suspension i et opvarmnings bad ved 55 °C, indtil blandingen er helt optøet.
- Gentag trin 1,7 og 1,8, indtil Liposom-suspensionen har været udsat for i alt 11 fryse/tø-cyklusser.
Bemærk: gentagne fryse/tø cyklusser har vist sig at reducere Liposom multilamellaritet23, hvilket er altafgørende for nøjagtigheden af den enkelte Liposom-analyse, da multilamellar Liposomer vil skråtstille fluorescens intensitet versus Liposomer størrelsesforhold af Liposomer. Den multilamellaritet er normalt i sig selv lav, når der omfatter mere end 0,5% pegyleret lipid i formuleringen (såsom almindeligt udført i Liposomer for lægemiddel levering)24. - Ekstrudering af Liposom suspensionen en gang gennem et 800 nm polycarbonat filter ved hjælp af et mini ekstruderingssæt. Følg producentens anvisninger for montering af ekstruderingskit (Se tabel over materialer).
- Opbevar liposomerne ved 4 °C natten over.
2. overfladebehandling af billed kammer
- Forbered bovin serumalbumin (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotin (1 mg/mL) og streptavidin (0,025 mg/mL) i 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
Bemærk: for at forhindre liposomal burst skal den sorbitol buffer, der anvendes til rehydrering og den HEPES-buffer, der anvendes til overfladebehandling, være isotonisk. Det anbefales derfor at kontrollere buffere osmolaritet før eksperimentet. - Bland 1.200 μL BSA og 120 μL BSA-biotin, og tilsæt 300 μL af blandingen til hver brønd i en 8 brønd rutsjebane til mikroskopi.
Bemærk: her bruger vi en kommercielt tilgængelig 8 brønd mikroskop slide med en glasbund (Se tabel over materialer), men protokollen kan nemt tilpasses til tilpassede mikroskop kamre. - Inkuber diaset i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Vask sliden 8x med 300 μL HEPES-buffer.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at forlade brøndene uden buffer i mere end et par sekunder, da udtørring af overfladen vil beskadige den. Vær desuden omhyggelig med ikke at ridse overfladen med pipettespidsen, da dette også vil beskadige den. Således, når aspirerende buffer fra en brønd, gør det fra kanten eller hjørnet. - Tilsæt 250 μL streptavidin og Inkuber i 10 min ved RT.
- Gentag de 8 skyller, der er beskrevet i trin 2,4.
- Mikroskop-diaset opbevares med 300 μL sorbitol buffer i hver brønd ved 4 °C. Fordampning af opløsningsmidlet vil beskadige overfladen, så sæt mikroskopet glide i en Petri skål og forsegle det med parafilm, medmindre den forberedte slide anvendes straks.
3. liposome immobilisering
- Fortyndet Liposom suspension til ca. 20 μM total lipid i sorbitol buffer. Proceduren i punkt 1 vil give en Liposom suspension af ca 10 mm total lipid.
- Placer diaset på mikroskopet og Fokuser på overfladen af kammeret ved hjælp af det øgede laser refleksions signal fra glas/buffer-grænsefladen som vejledning.
- Vask kammeret 4X med 300 μL frisk HEPES-buffer.
- Der tilsættes 10 μL fortyndet Liposom bestand (20 μM total lipid) til et mikrocentrifuge glas.
- Tag 100 μL buffer ud af kammeret, tilsæt mikrocentrifuge røret fremstillet i trin 3,4, bland det ordentligt, og sæt 110 μL tilbage i kammeret.
- Sæt prøven under mikroskopet, og brug en mental mikroskop indstilling, der kan detektere signal fra liposomfluorophore (s) for at observere Liposomer, der bliver immobiliseret på overfladen.
- Mål for en Liposom overflade tæthed, der samtidig er sparsomme nok til at identificere individuelle Liposomer og tætte nok til, at det letter målinger med høj gennemløb. Typisk med et 50 μm x 50 μm synsfelt er 300 − 400 Liposomer pr. ramme optimalt (figur 2). Dette kan normalt opnås inden for 5 − 10 min.
Bemærk: Hvis kun hurtigt bevægende fluorescerende partikler detekteres i synsfeltet, en fravær eller for lav koncentration af nogen af de komponenter, der er kritiske for immobilisering proces (BSA-biotin, streptavidin, DOPE-PEG-biotin) kan være årsag. Hvis der ikke påvises Liposomer, kan det enten være relateret til en lav koncentration af Liposomer, ukorrekte indstillinger for fluorescens detektering eller potentielt billeddannelse med et brændings plan, der ikke er på glasoverfladen. - Når en passende Liposom overflade tæthed er nået, vaskes kammeret 3x med 200 μl Hepes buffer.
Bemærk: Vær opmærksom på, at immobilisering kinetik også afhænge af Liposom egenskaber såsom størrelse og ladning og bør derfor altid optimeres for hver Liposom formulering.
4. erhvervelse af billede
Bemærk: dette afsnit vil afhænge meget af mikroskop systemet til rådighed for forskeren, der udfører eksperimentet. Således, overordnede retningslinjer for, hvordan man udfører billeddannelse vil blive beskrevet. Men de nøjagtige indstillinger og hvordan man anvender dem vil variere mellem de forskellige mikroskop opsætninger. For eksempel tillader nogle systemer at vælge en hvilken som helst emissions filterkombination, mens andre mikroskoper er udstyret med specifikke, forudindstillede filtre.
- Konfigurer mikroskopet til billeddannelse af enkelte Liposomer. For at sikre optimal billedkvalitet og efterfølgende dataanalyse anvendes en høj gråtone opløsning og en pixel ordning, der giver mulighed for oversampling af individuelle Liposomer. En bitdybde på 16 og mindst 1.024 x 1.024 pixels for et 50 μm x 50 μm-område anbefales. Hvis det er muligt, kan der anvendes linje gennemsnit til at reducere støjen (f. eks. 3 scanninger pr. linje).
- Vælg en excitation laser kraft, der begge sikrer ikke-signifikant ramme-til-ramme blegning og stærkt nok signal til klart at diskriminere individuelle Liposomer fra baggrunden. Den optimale indstilling vil afhænge af det specifikke mikroskop, der anvendes, samt fluoroforet kombinationen. Sørg for, at detektorer ikke er mættet, da dette vil bias intensitet kvantificering.
- Imaging både DOPE-Atto488 og DOPE-Atto655 fluorophores i liposomerne kræver billeddannelse flere kanaler. Således, Sørg for hver kanal er afbildet sekventielt for at undgå Cross-excitation. For eksempel, først tage et billede ved spændende på 488 nm og aflæsning emission på 495 − 560 nm. Derefter tage et andet billede ved spændende på 633 nm men aflæsning emission kun ved 660 − 710 nm. Detaljerne vil afhænge af mikroskopet system (f. eks. hvilke lasere og filtre) til rådighed.
- Sørg for at dække forskellige områder af overfladen, erhverve mindst 10 billeder af prøven, således Imaging mindst 3.000 individuelle Liposomer. Hvis overflade tætheden er lavere end 300 Liposomer/frame, erhverve flere billeder. Sørg for at koncentrere mikroskopet igen for hvert nyt billede.
Bemærk: for to-kanals billeddannelse skal du sørge for at navngive billedfilerne, så par af billeder med de samme Liposomer i forskellige fluorescens kanaler nemt kan identificeres under dataanalyse. - For at kvantificere den eksperimentelle usikkerhed i forbindelse med måling af inhomogenitet i sammensætningen, billede det samme område af Liposomer før og efter refokusering (Se figur 3 og beskrivelsen i teksten).
- Eksporter billederne fra mikroskop-softwaren som. TIFF-filer. Eksporter de to kanaler af de samme Liposomer individuelt.
5. data analyse
Bemærk: specielt udviklede automatiserede 2D Gaussian fitting rutiner har tidligere været ansat6,11,12. Men for at øge anvendeligheden af metoden en dataanalyse proces, der let kan implementeres i alle laboratorier er beskrevet.
- Indlæs det tilsvarende par. TIFF-billeder af to forskellige fluorescens kanaler i det samme billedfelt til FIJI (FIJI er bare ImageJ) software.
- Vælg farvei menuen billede , og brug funktionen Flet kanal til at oprette en sammensætning af de to kanaler.
- Vær opmærksom på, om liposomerne i to forskellige kanaler udviser god samlokalisering, eller om der er synlige afdrift.
Bemærk: i tilfælde af drift mellem de to fluorescens kanaler (anerkendt som en systematisk og lige X-Y forskydning mellem signalet i de to kanaler), kan en af rammerne oversættes ved hjælp af Transform ≫ Translate funktion i menuen billede af Fiji. Dog bør man være forsigtig med sådan billedmanipulation. Det anbefales derfor i stedet at undgå at glide så meget som muligt ved billeddannelse af liposomerne. - Sørg for, at ComDet plugin (v. 0.3.6.1 eller nyere) er installeret, eller gøre dette i plugins menuen.
- Åbn comdet plugin til at detektere partikler ved at gå til plugins menuen og vælge comdet v. 0.3.6.1 ≫ detektere partikler.
- I ComDet, Sørg for at vælge detektere partikler på begge kanaler individuelt funktion. Indstil den maksimale afstand mellem Co-lokaliserede pletter svarende til de omtrentlige partikler størrelse. Normalt, 4 pixels er passende for de indstillinger, der er beskrevet her.
- Signal-til-støj-forhold bør gøre det muligt at påvise selv svage partikler med en lav mængde fluorescens. I ComDet, indstille dette forhold til 3 ved at indstille følsomheden af påvisning i begge kanaler til meget Dim partikler (SNR = 3).
Bemærk: mens denne SNR-værdi normalt er hensigtsmæssig, kan det være nødvendigt at indstille den højere (f. eks. Hvis der er en masse billedstøj, der kan identificeres som Liposomer og føre til falske positiver). - Sørg for, at kasserne med Beregn samlokalisering og plot detekterede partikler i begge kanaler er markeret, før du trykker på OK.
- Efter at have kørt analysen, to pop-up vinduer med resultater og Resumé vil vise. Eksporter datatabellen resultater , der indeholder samlokaliserings data (partikel koordinater og integreret intensitet af hver partikel detekteret) til en data håndterings software af valg ved at gemme tabellen som en. txt-fil og importere den til softwaren.
- Sørg for, at hver Liposom kun er inkluderet én gang i datasættet og ikke både channel1/Channel2 samt Channel2/channel1 ratio. Filtrer derfor kun dataene, så Abs_frame = 1 afbildes i trin 5,11.
Bemærk: ved at vælge Colokaliserede = 1, kan falske positiver fra støj i billederne fjernes fra analysen. Men, enhver Liposomer med kun én af de to fluorescerende komponenter til stede vil også blive udelukket fra analysen, således potentielt fjerne vigtige datapunkter fra analysen. - Plot et histogram af kolonnen med data, der indeholder intensiteten ratio for hver detekteret liposome.
- Graden af sammensætningen af inhomogeniteten for det studerede liposomale system er repræsenteret ved bredden af intensiteten ratio fordeling. For at kvantificere inhomogeniteten skal du tilpasse intensitets forholdet histogram med en Gaussian funktion og udtrække middelværdien (μ) og standardafvigelsen (Sigma). Se afsnittet om repræsentative resultater.
- En værdi for graden af inhomogenitet (DI) kan nu beregnes ved hjælp af variationskoefficienten defineret som DI = Sigma/μ.
6. liposome størrelse kalibrering
- Tag en del af Liposom bestanden, og Extrude 21x gennem et 50 nm polycarbonat filter som beskrevet i trin 1,10.
- Liposomer fortyndes ved at tilsætte 10 μL liposomsuspensionen til 800 μL sorbitol buffer i et mikrocentrifuge glas.
- Overfør den fortyndede Liposom prøve til en polypropylen engangs kuvette.
- Mål størrelsen ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Udfør mindst tre uafhængige kørsler for at måle størrelsen og polydispersitet af Liposom suspensionen.
Bemærk: brug om nødvendigt en mere koncentreret Liposom suspension til målingen. Alternativer til DLS (f. eks nanopartikel tracking analyse) kan også anvendes til måling af størrelsen af Liposomer. En beskrivelse af, hvordan man udfører en sådan bestemmelse af partikelstørrelse, ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. - Billede kalibrerings Liposomer på mikroskopet ved hjælp af nøjagtig de samme eksperimentelle indstillinger som defineret i trin 4,1 og 4,2.
- Udpak den integrerede intensitet for hver kalibrerings Liposom i kalibrerings billederne: udtræk det filtrerede resultatark indeholdende Liposom fluorescens intensiteter som beskrevet i trin 5.1 − 5.10. Udtræk kolonnen "IntegratedInt" fra resultattabellen.
- Fordi den samlede integrerede intensitet af en Liposom mærket i sin membran er proportional med overfladearealet af Liposom og er således proportional med kvadratet af dens diameter, plot en kvadratisk rod intensitet histogram af fluorescens intensitet af kalibrerings Liposomer.
- Tilpas den integrerede intensitets histogram, der produceres i trin 6,7, med en normal fordeling af loggen, og Udpak kalibrerings liposomes gennemsnitlige fluorescens intensitet.
- For at bestemme forholdet mellem kvadratroden intensitet (intsqrt) og Liposom størrelse, beregne korrektionsfaktoren (C) ved hjælp af den gennemsnitlige Liposom diameter (dia) vejet af antallet opnået fra DLS målinger: Dia = c x intsqrt svarer til c = dia/intsqrt.
- Beregn intsqrt -værdier for liposomerne i det kompositoriske inhomogenitets eksperiment, og Konverter disse til diametre ved at multiplicere med korrektionsfaktoren.
- Plot intensiteten ratio værdi som en funktion af diameter for kompositoriske inhomogenitet Liposomer, således at opnå inhomogeniteten som en funktion af Liposom størrelse for en population af Liposomer spænder fra ca. 50 nm − 800 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrevne protokol gør det muligt at afbilde enkelte Liposomer på en massiv parallel måde (figur 1). Den vellykkede overflade immobilisering af Liposomer bør straks ses ved tilsætning af liposomopløsningen til kammeret (trin 3,6 i protokollen) som diffraktion begrænset intensitet pletter bør vises i billedet (figur 1B og figur 1C).
For at opnå gode statistikker og udnytte de høje gennemløb evner af analysen, flere tusinde Liposomer bør imaged. For at gøre dette i et rimeligt antal billeder, anbefales det at immobilisere nok Liposomer at opnå en tæthed på 300 − 400 Liposomer pr frame, da dette vil bringe antallet af billeder pr prøve ned til ~ 10, hvilket begrænser antallet af billeder, der skal erhverves og analyseres. En lavere tæthed vil gøre dataanalysen mere tidskrævende, mens en højere tæthed kan gøre det udfordrende for billedanalyse software at skelne enkelt Liposomer. For at få et visuelt indtryk af, hvad 300 − 400 Liposomer ser ud, se figur 2a. Det skal dog bemærkes, at for nogle anvendelser (f. eks membran-protein interaktioner med et protein, der har tendens til at fremkalde stærk baggrund binding til BSA overflade) anbefales det at bruge en lidt lavere tæthed, såsom i figur 2a øverst til højre.
Lejlighedsvis, når de erhverver billeder er det svært at få hele synsfeltet i rette fokus, som illustreret i figur 2B. Sådanne problemer kan indikere, at prøvepladen hælder, hvilket kan skyldes, at pladen ikke anbringes korrekt på prøveholderen på mikroskopet. Også, hvis liposomerne synes store og slørede, kan bufferen i kammeret have fordampet og overfladen tørret ud. Det er især vigtigt at holde dette problem i tankerne, når billeddannelse i lange perioder eller ved udførelse af målinger ved temperaturer højere end RT. For at illustrere forskellen mellem korrekt opbevaret og tørret Liposomer vises et billede af den samme prøve før og efter udtørring af kammeret i figur 2C.
Efter at have sikret optimal billedkvalitet kan den integrerede intensitet for hver Liposom i de to billed kanaler ekstraheres ved at følge trinene i afsnit 5 i denne protokol. Dette vil skabe en liste over unikke intensitetsværdier, så vi kan beregne intensiteten ratio for hver enkelt liposome. Den sammensatte inhomogenitet evalueres fra histogrammer af intensitets forholdet, hvilket typisk afslører en gaussiske fordeling omkring en middelværdi ratio (figur 3a). Bemærk, at hvis der observeres kraftige afvigelser fra en Gaussian fordeling (figur 3B), indikerer det et problem med detekteringsfølsomhed for mindst en af billed kanalerne, hvilket tyder på, at en delmængde af Liposomer, der viser et svagere signal, er blevet udelukket. Dette kan skyldes både detektionsgrænsen for billed systemet eller med undtagelse af Liposomer i dataanalysen (f. eks. ved anvendelse af en bestemt minimumstærskel; se trin 5,7).
Beregning af DI-værdien som beskrevet i trin 5.11 − 5.13 i protokollen vil give et kvantitativt mål for den kompositoriske inhomogenitet mellem præparatets individuelle Liposomer. For det liposomale system undersøgt her, DI = 0,23 ± 0,01 (figur 3C). Denne værdi kan bruges til systematisk at sammenligne, hvor varierende Liposom egenskaber eller præparationsmetoder påvirker den kompositoriske inhomogenitet. For at konceptualisere betydningen af DI-værdien, henviser vi til den normale fordeling, der vises af intensitets forholdet histogram, hvilket betyder, at de vil adlyde den empiriske 68 -95-99,7 regel. Denne regel beskriver den procentdel af en population, der falder inden for en, to og tre standardafvigelser omkring middelværdien. For DI-værdien på 0,23 ± 0,01, der findes her, betyder det, at 32% af liposomerne i populationen vil have et intensitets forhold, der afviger med mere end 23% fra det gennemsnitlige molære forhold i ensemblet (figur 3D).
For kontrol eksperimentet billeddannelse de samme Liposomer før og efter refokusering (afsnit 4,6), den samme dataanalyse og resultat plot som for det faktiske eksperiment udføres. Dette gør det muligt at kvantificere den eksperimentelle usikkerhed for DI-værdien, som blev konstateret at væreusikker = 0,10 ± 0,01 (figur 3E). Selv om di-usikkerheds værdien vil afhænge af det anvendte billedbehandlingssystem, blev det konstateret, at konfokale mikroskop opsætninger konsekvent giver anledning til diusikkerheds værdier på omkring 0,105,6. DI-værdien af DI = 0,23 ± 0,01 fundet for liposomal-systemet her er mere end dobbelt så stor som den eksperimentelle usikkerhed, som antyder tilstedeværelsen af signifikant kompositorisk inhomogenitet mellem præparatets individuelle Liposomer.
Udførelse af det størrelses kalibrerings eksperiment, der er beskrevet i afsnit 6, vil gøre det muligt at forvandle de vilkårlige Liposom-intensitetsværdier til fysiske diametre i nanometer. Metoden er blevet valideret mod andre billedbehandlings teknikker25 såsom kryogen elektronmikroskopi, som har en evne til optisk at løse nanometer-størrelse Liposomer, selv med meget lavere gennemløb. Billedbehandling af kontrolprøven ved hjælp af de nøjagtige samme mikroskop indstillinger som anvendes til de faktiske eksperimenter, er det nu muligt at korrelere den gennemsnitlige Liposom intensitet til den gennemsnitlige Liposom diameter bestemt af DLS (figur 4A). Det næste skridt er at skildre den Liposom intensitet fordeling, som er baseret på de fysiske begrænsninger mod at skabe ekstremt små Liposomer, typisk vil vise en log normal fordeling (figur 4B). Hvis distributionen ikke er godt beskrevet af en log normal fordeling (oftest på grund af manglende Liposomer med lav intensitet værdier) det betyder, at en del af Liposom populationen blev udelukket enten på grund af lav mikroskop detektion følsomhed eller overdrevent strenge parametre under dataanalyse (figur 4C). Det er vigtigt at indhente og behandle disse spørgsmål for at sikre objektivdata fortolkning. Derefter kan intensitetsværdierne for hvert enkelt Liposom i figur 4B konverteres til faktiske diametre ved hjælp af korrektionsfaktoren, der er fastlagt i figur 4A (figur 4D). Efter bestemmelse af størrelsen af hver Liposom, di som en funktion af diameter kan nu undersøges ved at afbilde intensiteten forholdet versus diameter for hver enkelt Liposom (figur 4E). Denne tragt lignende datastruktur bekræfter tidligere fund, at di-værdien øges, når Liposom-størrelsen falder6. Det er vigtigt, at den symmetriske stigning i spredningen af intensitets ratioer omkring en middelværdi antyder, at der ikke er nogen systematisk størrelses afhængig variation i den gennemsnitlige sammensætning af Liposomer.
Figur 1: den enkelte Liposom-analyse. (A) Liposomer er formuleret med en ækvimolære indhold af fluorescently mærket lipider dope-Atto488 og dope-Atto655 og immobiliseret på en BSA overflade ved hjælp af en biotin/streptavidin sammenkædning. B) de immobiliserede Liposomer er afbildet ved hjælp af et Konfokal mikroskop, der gør det muligt at påvise fluorescens intensiteter fra de enkelte Liposomer. Skala stænger = 8 μm.C) Zoom af det grønne område i (B) afbildet som overflade intensitet plot for to tilstødende Liposomer viser inverteret fluorescerende signal mellem de to kanaler, der illustrerer begrebet kompositorisk inhomogenitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: optimering og faldgruber. (A) øverst til venstre viser 29 Liposomer immobiliseret i en 50 μm x 50 μm ramme. Disse er for få Liposomer pr frame for at udnytte muligheden for høj gennemløb undersøgelse af Liposom inhomogenitet. Øverst til højre viser 123 Liposomer pr. ramme. Dette er en suboptimal tæthed, men kan bruges, hvis mange billeder er erhvervet. Nederst til venstre viser 300 − 400 Liposomer pr. ramme. Dette er optimalt for den protokol, der er beskrevet her. Nederst til højre viser mere end 1.500 Liposomer pr frame, hvilket er for mange til at skelne individuelle Liposomer. Der er en høj risiko for, at et enkelt sted faktisk vil være to Liposomer immobiliseret inden for samme diffraktion begrænset spot. B) Hvis kammeret ikke anbringes korrekt i prøveholderen, vil det være umuligt at få hele synsfeltet i rette fokus. I venstre Mikrograf er pladen visker rundt om Traverse aksen, hvilket giver anledning til det nederste venstre hjørne er ude af fokus. I højre Mikrograf er pladen vippes rundt om længdeaksen, hvilket giver anledning til en tungere hældning. Både nederste venstre og øverste højre hjørne er ude af fokus. C) ved billeddannelse i lange perioder eller ved forhøjede temperaturer kan bufferen fordampe, hvilket fører til tørring ud af kammeret. Vi illustrerede dette scenario her ved billeddannelse Liposomer før og efter kammeret blev overladt til at tørre i 3 min, og derefter rewetted ved at tilføje frisk buffer til kammeret. De resulterende Liposomer er større, slørede, har lavere fluorescens intensitet, og synes at være spredt ud på pladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: intensitets forhold histogrammer til kvantificering af Liposom kompositoriske inhomogenitet. (A) intensiteten ratio af dope-Atto488 og dope-Atto655 fluorescens for hver enkelt Liposom afbildet som et histogram. B) en trunkeret Gaussian distribution, der illustrerer et potentielt følsomheds problem, enten under billeddannelse eller i trinnet til databehandling. C) montering af intensitets histogrammet med en Gaussisk funktion gør det muligt at udtrække den gennemsnitlige og standardafvigelse, der anvendes til beregning af di-værdien. D) en di-værdi på 0,23 kan oversættes til 32% af befolkningen, der afviger med mere end 23% fra det gennemsnitlige molære forhold i ensemblet. (E) kontrol eksperiment billeddannelse de samme Liposomer før og efter refokusering og derefter udføre den samme databehandling procedure som for det faktiske eksperiment. Dette gør det muligt at fastgøre den eksperimentelle fejl for DI-kvantificeringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: konvertere Liposom intensitet til fysisk diameter i nm. A) intensitets histogrammet for 50 nm ekstruderede kalibrerings Liposomer sammenlignet med DLS-data for at bestemme kalibreringsfaktoren. (B) et histogram af intsqrt værdi fra de eksperimentelle Liposomer typisk giver en log-normal fordeling på grund af de fysiske begrænsninger mod at skabe meget små Liposomer. (C) et ikke-log-normalt intsqrt -værdi histogram indikerer enten problemer med detekteringsfølsomhed, eller at små Liposomer blev udelukket under databehandlingen. (D) Liposom intensiteter i (B) omdannes til faktiske Liposom diametre ved hjælp af korrektionsfaktoren. (E) intensiteten ratio af hver Liposom plottet som en funktion af Liposom diameter kan nu vises tillader undersøgelse af kompositoriske inhomogenitet som en funktion af Liposom størrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at bemærke, at mens vi beskriver i detaljer, hvordan den enkelte Liposomer assay kan bruges til at studere kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer, platformen er meget alsidig. Som tidligere vist og diskuteret i indledningen, kan protokollen let tilpasses til at studere aspekter af membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomal Drug Carrier karakterisering. For alle videnskabelige spørgsmål, der behandles, kraften i den enkelte Liposom assay ligger i evnen til at detektere de enkelte komponenter i ensemblet og dermed have en kvantitativ udlæser, ikke forudindtaget af ensemble gennemsnitlige effekter.
Den enkelte Liposom-analyse er optimalt egnet til overflade billeddannelse, såsom total intern refleksion eller confokal mikroskop, hvor Z-retningen skæring kan eliminere uønsket baggrunds fluorescens fra opløsningen over Liposom laget. Men dette aspekt er vigtigst for undersøgelser, hvor fluorescently mærkede forbindelser, såsom peptider, proteiner, eller andre Liposomer tilsættes til opløsningen og forblive der under billeddannelse. For eksempel, hvis analysen anvendes i det format, der er beskrevet i detaljer her, hvor de fluorescerende farvestoffer er begrænset til de immobiliserede Liposomer, kan analysen i princippet udføres ved hjælp af mere bredt tilgængelige widefield mikroskoper, der giver påvisning systemet er følsomt nok.
A priori er der ingen begrænsninger med hensyn til den metode, der anvendes til at forberede de Liposomer, der anvendes i analysen. Her beskriver vi i detaljer brugen af en frysetørring teknik. Men, tidligere chloroform-baserede lipid rehydrering eller ethanol injektion-baserede teknikker har været ansat til at fabrikere Liposomer anvendes i analysen5,6. En kritisk parameter er medtagelsen af en minut fraktion af biotinylerede lipider i lipidblandingen for at sikre immobilisering (0,05 mol% anbefales). Et andet nødvendigt element er at inkludere en lille mængde fluorescently mærket lipid. Samlet set bør mængden af lipid-farvestof tilsættes så lavt som muligt for både at undgå dæmpning effekter og for at undgå lipid-farvestof fra væsentligt at ændre de fysisk-kemiske egenskaber af Liposom. Den nedre grænse for mængden af lipid farvestof er fastsat af koncentrationen, hvor stokastiske variation i antallet af individuelle lipid farvestoffer per Liposom bliver signifikant i forhold til den gennemsnitlige mængde af lipid-farvestoffer (Se Larsen et al.6 for en dybtgående diskussion). At gå under denne grænse vil introducere store usikkerhedsmomenter i de ekstraherede intensiteter. Endelig skal mængden af lipid farvestof være høj nok til nøjagtig påvisning af de enkelte Liposomer med et godt signal-til-støj-forhold. Selv om dette kriterium naturligvis stærkt afhænger af billed systemet, vi fandt, at lipid farvestof koncentrationer mellem 0,05 og 0,5 mol% arbejde godt i langt de fleste tilfælde.
At vælge hvilket lipid farvestof til at omfatte i liposome, den første forudsætning er, at excitation og emission egenskaber matcher belysning og afsløring kapaciteter af Imaging System. For det andet, for at øge følsomheden og nøjagtigheden af metoden anbefaler vi at bruge farvestoffer med både høje kvante udbytter og foto stabilitet, og vi har tidligere med held brugt farvestoffer med forskellige excitation bølgelængder6,11. Man bør være forsigtig med at vælge lipid-ankre med lignende fysisk-kemiske egenskaber for at sikre, at lipid-partitionering ikke fører til kunstigt høj inhomogenitet. For eksempel, for denne protokol, har vi forankret både fluorophores ved hjælp af dope, mens der en fluoroforet på dope og en anden på dppe kunne føre til fluoroforet fordeling forskelligartethed ikke relateret til den iboende inhomogenitet i Liposom befolkning. Især for dual Color Imaging er det vigtigt at vælge farvestoffer med smalle excitation og emission spektre og den mindste spektral overlap som muligt for at undgå betydelige blødninger, Crosstalk, og fluorescens resonans energioverførsel (FRET) mellem farvestoffer og kanaler. For at undgå artefakter relateret til variation i fluoroforet miljøet foretrækker vi at arbejde med farvestoffer, som er blevet dokumenteret eksperimentelt for at vise ekstremt lav membran interaktion tilbøjelighed som bestemt af Hughes et al.26. Endelig, hvis en specifik Liposom lipid sammensætning er ikke et hårdt krav for det eksperimentelle design, det kan være gavnligt at inkludere op til 10 mol% af negativt ladede lipider for at sikre, at individuelle Liposomer fraholder hinanden og er effektivt immobiliseret som enkelt Liposomer12.
En fordel ved den enkelte Liposom assay er den lille eksperimentelle volumen, som i høj grad kan reducere mængden af dyre eller sjældne forbindelser, der anvendes pr. eksperiment. Her beskriver vi brugen af standard og kommercielt tilgængelige kamre med en eksperimentel volumen mellem 150 – 300 μL. Der kan dog anvendes specialfremstillede mikroskop kamre, som kan reducere lydstyrken til et område på 50 – 80 μL. Også Liposom forbruget er meget lav, med en endelig koncentration omkring 2 μM total lipid.
En ulempe ved den enkelte Liposom assay er, at det er svært at kontrollere lipid koncentrationen i kammeret på grund af de variationer i immobilisering tendenser beskrevet ovenfor. Med hensyn til anvendelse af analysen til undersøgelse af membran-protein interaktioner er det desuden en udfordring at bestemme koncentrationen eller antallet af bundne proteiner direkte fra fluorescens intensitet.
Ved brug af Liposomer i analysen som membran modelsystemer (f. eks. for at studere membran interaktionen af fluorescerende forbindelser, peptider eller proteiner) er det vigtigt at sikre lav ikke-specifik binding til de protein komponenter, der letter Immobilisering. Hvis dette ikke er tilfældet, kan der påvises et højt baggrunds signal, som kan forhindre påvisning af den specifikke binding til liposomerne. Hvis der opdages høj ikke-specifik baggrund, har vi tidligere med held reduceret baggrunden ved at skifte fra streptavidin til Neutravidin eller avidin.
Udførelse af enkelt Liposom-detektion ved hjælp af andre teknikker som flow cytometri kan potentielt give en øget detektionsgennemstrømning sammenlignet med mikroskopet-baseret assay. Men da flow cytometre er optimeret til at studere meget større og lysere prøver som celler, er detekterings systemet for de fleste ikke følsomt nok til at detektere den relativt svage fluorescens fra en individuel Liposom. Så mens nye og mere følsomme flow cytometri er ved at blive udviklet mikroskop-baserede assay tilbyder den bedste løsning til at belyse Liposom inhomogeniteter, når de udføres effektivt og overvågning tusindvis af Liposomer pr eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af det danske råd for uafhængig forskning [tilskudsnummer 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
