Summary
ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。
Abstract
Nd:YAGレーザーは、数十年前からカプロートミーなどの非侵襲的な眼内手術を行うために使用されてきました。切開効果は、レーザーフォーカスでの光学的破壊に依存します。音響衝撃波とキャビテーション気泡が発生し、組織が破裂する原因となります。バブルサイズと圧力振幅は、パルスエネルギーと焦点の位置によって変化します。本研究では、生核ブタの目を市販のNd:YAGレーザーの前に配置した。可変パルスエネルギーならびに角膜後方の焦点スポットの異なる位置が試験された。結果として生じる病変を2光子顕微鏡および組織学によって評価し、最小の副次的損傷を伴う角膜内皮細胞(CEC)の排他的剥離に対する最良のパラメータを決定した。この方法の利点は、CECの正確な切り取り、担保損傷の減少、そして何よりも非接触治療です。
Introduction
角膜の透明性は、光をレティナおよびその光受容体1に伝達するために不可欠である。この点に関して、脱水の相対的な状態は、角膜間質内のコラーゲン線維を正しく整列させるために重要である。この恒常性は、デセメットの膜(DM)2に位置する角膜内皮細胞(CEC)によって維持される。内皮は最も内側の角膜層である。それは重要な障壁およびポンプ機能を有し、角膜の透明性3にとって極めて重要である。上皮とは対照的に、内皮は自己更新できない4.したがって、疾患または外傷によって引き起こされる細胞損傷は、残りの内皮細胞を刺激して拡大および移動し、生じる欠陥をカバーし、角膜機能を維持する5。しかし、CEC密度が臨界閾値を下回ると、内皮の代償不全が浮腫につながり、視力がぼやけ、不快感や重度の痛み4を生じる。症状を緩和する薬剤が利用可能であるにもかかわらず、現在、これらの症例における唯一の決定的な治療法は角膜移植であり、これは全厚移植片または薄膜内皮移植の形で行うことができる。後者の手順は、デシェメットの膜内皮角膜形成術(DMEK)ならびにデスセメットのストリッピング自動内皮角膜形成術(DSAEK)6として利用可能である。6しかし、残りのCECの保護とその生存率の向上は、潜在的な治療薬をテストするのに十分な疾患モデルを必要とする代替ターゲットとなり得る。
現在のCEC損失疾患モデルは、前房への毒性物質(例えば、塩化ベンザルコニウム)の注入を介した内皮の破壊に焦点を当てるか、侵襲的なデセメトヘキシス法77,88を用いて細胞の機械的摩耗によって。これらのモデルは十分に確立されていますが、一般的な炎症反応や不正確な担保損傷などの欠点があります。したがって、これらのモデルは、上記の外科的選択肢が避けられない場合に、疾患の最終段階を表す可能性が高い。
幹細胞や遺伝子治療などの細胞治療戦略の進歩に伴い、これらの細胞療法の適用はCEC損失9の初期段階で有用であり得る。その後、これらの疾患の初期段階をより適切に表すモデルが必要です。この点で、細胞培養モデルは過去10年間で改善されたが、インビトロの細胞が角膜10内の異なる細胞型間で起こる複雑な相互作用を複製することに近づくことができないため、その有効性は依然として制限されている。したがって、ex vivoおよびin vivo疾患モデルは依然として高い需要があり、既存のものを改善することは最大の関心事です。
ネオジムを用いた光破壊による非侵襲的な眼内手術:YAG(Nd:YAG)レーザーは、1970年代後半11年に導入されて以来、世界中の眼科医にとって日常的な処置となっている。光破壊は、液体環境12に位置する場合は常に、プラズマの形成、音響衝撃波の発生、およびキャビテーション気泡の生成につながる非線形光吸収に依存する。一般に、これらのプロセスは、正確な組織切断の意図された効果に寄与する。しかし、それらはまた、レーザー手術13の局所的な閉じ込めを制限する不必要な担保損傷の源であり得る。
衝撃波伝搬とキャビテーションコースの特性評価により、機械的効果の予測が大幅に向上しました。私たちの目標は、CECの損失の初期段階のための非侵襲的な、レーザー支援実験疾患モデルを提供するために、周囲の組織への損傷をできるだけ少なくしてCECを標的にすることです。そのためには、レーザーの焦点スポットの最適なパルスエネルギーと位置を決定する必要があります。
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Protocol
動物組織に関するすべての手順は、地元の動物管理倫理委員会のガイドラインに従います。
1. 臓器培養とレーザー治療の準備
- 地元のアバトワールから新鮮なブタの目を得る。Lグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、血清(10%)を添加した高グルコースを有するダルベックコの改変Eagle培地(DMEM)で冷却(4°C)を保ち、今後この記事ではフル培地と呼ばれる。
- はさみで細胞外組織を取り除き、5%ポビドネヨウ素眼球溶液に目を浸し、使用するまで殺菌されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。
- 角膜瘢痕化、浮腫、およびスペクトル領域光学コヒーレンス断層撮影装置を有する他の不透明度などの主要な前部セグメント病理のためのスクリーン目 (材料表)
- 波長1,064nm、焦点の直径10μmのNd:YAGレーザー(材料表)を搭載したスリットランプユニットの前に目を置きます。
注:最適な位置に3Dプリント保持装置が使用され、眼をしっかりと保持するように設計されており、あまり圧力をかけない(図1)。 - 12xの倍率を使用し、個々の角膜層を視覚化するために照明をそらす。
- 内皮細胞の選択的切り出しのためにパルスエネルギー(例えば、1.6 mJ)とフォーカスポイント(例えば、0.16mm)を設定します。
- 手足の近くに透明な角膜パラセンテーゼを置き、前房を安定させるために粘弾性(材料表)を注入します。
- レーザー処理された中央角膜を8mmトレフィンで物品切りする。
- 切除した角膜を12ウェルプレートのウェルに入れ、内皮部位を上向きにして、37°Cのフル培地で3mLで最大3日間培養します。
注: 潜在的な細胞保護剤は、このステップ中に培地に添加することができます。
2. ヒストロジーの準備
- 19.6 mL の 19.6 mL 133 mM KH2PO4および 80.4 mL の 133 mM Na2HPO4を含む 7.4 の pH でソレンセンのバッファーを準備します。
- 角膜含有ウェルから培地を取り出し、メタノールフリーパラホルムアルデヒド(4%)を使用して室温(RT)で20分間組織を固定するソレンセンのバッファに入っています。
- 組織が沈むまでPBSで20%スクロースに組織を入れ(1時間)、次いでRTで一晩PBSで30%スクロースに組織を入れる。気泡や空気表面の界面との接触を避けるように注意してください。最適な切断温度(OCT)化合物に組織を埋め込み、-80 °Cで保存します。
- -27°Cのクライオスタットを使用して、厚さ10μmのセクションをカットします。
注意:ラクダのヘアブラシは、ナイフブレードの上に新興セクションを導くのに役立ちます。 - 切削した1分以内にスライドを組織に触れ、組織の凍結乾燥を避けて、切り落としを行い、切り替え用のスライドに切り替えます。スライドは-80°Cで保管してください。
3. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
- 空気乾燥した切片は、湿気を除去するために数分間乾燥します。
- 50 mLチューブで10分間、0.1%マイヤーヘマトキシリンを濾過したステイン。
- コプリンの瓶では、クールランニングddH2Oで5分間リンスし、0.5%のエオシン10倍に浸します。
- eosinがストリーキングを停止するまでddH2Oに浸し、50%(10倍)と70%(10倍)のEtOHに浸します。
- エチレンに数回浸漬する前に95%EtOH(30 s)および100%EtOH(60 s)で平衡化する。
- 最後に、光顕微鏡を使用して画像を撮る前に、標本を取り付け、カバースリップします。
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Representative Results
ここで示した手順を用いて、Nd:YAGレーザーで眼を処理し、異なるパルスエネルギー(1.0-4.6 mJ)と焦点の位置(角膜後面からの距離:0.0-0.2mm)を評価し、最適なパラメータを見つけました。複数の反復(n=3)を、レーザーパラメータの各星座について評価した(12 x 21)。
上記のプロトコルに加えて、試料を、固定およびH&E染色前に2光子顕微鏡で分析した。2光子顕微鏡は、690-1b040 nmのチューニング範囲と800nmの平均レーザ出力>900 mWの固体モードロック80 MHz Ti:サファイアレーザーを光源として使用しました。それはサンプルにおよそ150 fsの幅の脈拍を送達した。画像は、730 nmおよび30 mWのレーザーパワーの波長で顕微鏡目的(20x/0.95)で撮影した。
2光子画像と光顕微鏡画像は、実験設定に目がくらみ、(1)損傷なし、(2)損傷が多すぎる、または(3)適切な損傷量(図2および図3)の3つのカテゴリに画像を割り当てなければならなかった3人のレビュー者によって独立してレビューされた。その評価に基づいてヒートマップが計算されました (図 4)。このヒートマップを使用すると、レーザーパラメータの右の星座を選択して、周囲の組織(緑色)へのダメージを最小限に抑えてCECを選択的にアブレーションすることができます。結果は、レーザーの焦点がテストされた最も低い脈拍エネルギー(1.0 mJ)のために角膜内皮の後ろに少なくとも0.15mmでなければならないことを示した。パルスエネルギーが2.9mJを超える場合、テストされた最も長い焦点距離(0.2mm)は、まだ内皮に近すぎます。
図1:実験用セットアップ(A)目は部分的に3Dプリントされた保持装置に固定され、レーザービームに対して正確な位置合わせを可能にした。(B)レーザー治療の前に、組織を前部の光学コヘレンス断層撮影装置で評価し、主要な前部セグメント病理を検査した。焦点レーザーポイントの位置は、0.0 mm(黒いアスタリスク)、0.1 mm(赤いアスタリスク)、0.2 mm(青いアスタリスク)の例示で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:二光子顕微鏡。結果は、全く損傷なしから及んだ (A), 広範な巻き添え損傷 (B) 内皮細胞の選択的アブレーション (C).赤い矢印は破裂したデスセメットの膜を示し、緑色の矢印はCECクラスターの選択的アブレーションを示す。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒストロジーヘマトキシリンおよびエオシン染色は、損傷範囲を全く損傷しない(A)、広範な副次的損傷(B)から内皮細胞の選択的アブレーション(C)まで確認した。赤い矢印は破裂したデスセメットの膜を示し、緑色の矢印はCECクラスターの選択的アブレーションを示す。スケールバー= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:選択的CEC損傷の確率を示すヒートマップ。この点に関して、パルスエネルギーとNd:YAGレーザー焦点の位置を考慮する必要があります。過度の損傷は赤で示され、損傷の所望の部分は緑色で示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この試験試験研究の結果は、エネルギー線量および焦点点位置に適切なパラメータが選択された場合に、Nd:YAGレーザーを使用して角膜内皮細胞を選択的にアブレートできることを示している。
内皮機能は角膜の透明性と角膜浮腫からの保護にとって重要であるため、内皮機能不全のモデルは抗浮腫薬または外科的処置の開発において重要な役割を果たす。インビボシチュエーション,10、14、15,14を模倣するためのいくつかの確立されたインビトロモデルがありますが、一般的に知られているように、in vitroモデルは酵素およびサイトカインの影響または細胞細胞相互作用の影響を完全に模倣することはできません。15対照的に、この新しく開発された内皮細胞喪失のex vivoモデルは、自然環境における疾患および角膜脱代償の異なる状態を監視する可能性を提供する。
我々のモデルの角膜はレーザー処置の後にトレフィンで切除され、角膜の生理学は変化し、インビトロの状況と同様に、地域的相互作用が著しく妨げられる。しかし、局所界面はそのまま残っており、特に角膜内の他の細胞への細胞通信は持続する。我々の研究は、このような状況下で角膜が培養中の3日間その機能を維持し、潜在的な治療薬を観察し評価するのに十分な時間を提供することを明らかにした。一方、長年の治癒プロセスは調査できません。
我々のモデルでは、大量のブタの目を簡単に得ることができるので使用しました。さらに、ブタの目は人間の目を非常によく模倣します。実験に定期的に使用されるウサギとは対照的に、ブタの目はボウマンの膜を持っています。それにもかかわらず、ブタの目の角膜の厚さは、人間の目とはかなり異なります。特に、ブタの間質は、はるかに厚く、ブタの角膜16中枢と周辺の厚さの間に違いはない。また、人間のCECは、この再生機能は、ブタやウサギ17、18などのいくつかの動物で報告されている間、18任意の治癒能力を持っていないことを考慮する必要があります。我々の研究は創傷治癒プロセスに焦点を当てなかったが、この違いは結果を翻訳する際に心に留めるべきである。動物CECの創傷治癒は4日間を超えないので、たとえそれらが3日間しか続かなくても、それは私たちの培養組織でまだ観察されるかもしれません。
実験のセットアップと以前の研究を比較すると、適用されたエネルギーレベルは19と同様であった。内皮だけに焦点を当てる代わりに、焦点の異なる位置を評価した。したがって、以前の研究に対する私たちのセットアップの主な違いは、DMまたは間質組織のいずれかを損傷することなく、特定の内皮損傷を誘発する可能性です。エネルギー線量と焦点位置を正確に監視することで、角膜の他の部分に衝撃波損傷を引き起こすことなく、選択的CECアブレーションを可能にします。また、レーザー処理20の直後に間質や上皮下浮腫に気づいていない。
以前の研究では、〜40°Cの温度がCEC損傷21につながる可能性があることを示しました。誘導温度は測定しませんでしたが、さらなる研究には興味深いかもしれません。さらに、異なる種類のレーザーシステムの効果を評価する必要があります。以前の研究では、レーザー誘発性の外接CEC損傷と他のCEC傷害19,22との間に差が22見られた。レーザー誘発損傷は異なる疾患開発プロセスに続いているように見えるので、これはまた、人間の組織や病気との比較可能性を制限する可能性があります。興味深いことに、レーザー塗布後の創傷治癒は、以前の研究で燃焼したDMで停止した19.DM がそのまま残っている場合、損傷の原因はあまり重要でない場合があります。
より高いエネルギーレベルは、延長傷害のリスクが高くなる可能性があります22.我々の結果は、選択的なCEC損傷のためにより高いエネルギーレベル(<2.9 mJ)を使用するには、より厳しい焦点範囲を必要とすることを示している。CECへの損傷は、以前の研究で機械的に適用されました17,ここで使用されるレーザー誘発損傷は、病変のより正確なドージングを有し、簡単に生体内研究で使用することができます.
このプロトコルに従って少数の眼のみが治療され、検査されたことに留意すべきである。前述したように、レーザー処理に対する反応や、異なる動物種の角膜間の違いには、個人間の違いがある可能性があります。CECの損傷は異なる焦点位置で発生する可能性があるため、拡張損傷を避けるために、特定のしきい値を超えてはならない。
最後に、この研究で発生した病変を中央部に配置した。ブタの目の以前の研究は、ブタの目の角膜の厚さが領域間で異ならないので、四肢幹細胞17に近いことが原因である可能性がある角膜周辺における加速創傷治癒を示した。角膜の中心から周辺に切り替える際にレーザーパラメータを調整すべきかどうかを、将来の研究で評価する必要があります。
結論として、我々の研究は、CEC機能不全に関するさらなる調査のための非侵襲的モデルを導入する。ヒト組織の代わりに動物の使用法の観点からex vivoまたはin vivo研究の限界が残っており、結果を解釈する際に考慮する必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
クリスティーン・オリュンとヤン・A・M・ソチュレックの実験方法に対する支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
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