Summary
Este protocolo describe una evaluación completa de la hemocompatibilidad de los dispositivos de contacto con la sangre mediante implantes neurovasculares cortados por láser. Se aplica un modelo de bucle de flujo con sangre humana fresca y heparinizada para imitar el flujo sanguíneo. Después de la perfusión, se analizan varios marcadores hematológicos y se comparan con los valores obtenidos directamente después de la recolección de sangre para la evaluación de la hemocompatibilidad de los dispositivos probados.
Abstract
El uso creciente de dispositivos médicos (por ejemplo, injertos vasculares, stents y catéteres cardíacos) con fines temporales o permanentes que permanecen en el sistema circulatorio del cuerpo exige un enfoque fiable y multiparamétrico que evalúe las posibles complicaciones hematológicas causadas por estos dispositivos (es decir, la activación y destrucción de los componentes sanguíneos). La prueba integral de hemocompatibilidad in vitro de los implantes que contactan con la sangre es el primer paso hacia una implementación in vivo exitosa. Por lo tanto, un análisis exhaustivo según la Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) es obligatorio antes de la aplicación clínica. El bucle de flujo presentado describe un modelo sensible para analizar el rendimiento hemostático de los stents (en este caso, neurovascular) y revelar efectos adversos. El uso de sangre entera humana fresca y un muestreo suave de sangre son esenciales para evitar la preactivación de la sangre. La sangre se perfunde a través de un tubo heparinizado que contiene la muestra de ensayo mediante el uso de una bomba peristáltica a una velocidad de 150 ml/min a 37 oC durante 60 min. Antes y después de la perfusión, los marcadores hematológicos (es decir, recuento de células sanguíneas, hemoglobina, hematocrito y marcadores plasmáticos) que indican la activación de leucocitos (polimorfonucleares [PMN]-elastasa), plaquetas (-tromboglobulina [-TG]), el sistema de coagulación (thombin-antitrombina III [TAT]), y la cascada de sc- En conclusión, presentamos un modelo esencial y fiable para extensas pruebas de hemocompatibilidad de stents y otros dispositivos de contacto con la sangre antes de la aplicación clínica.
Introduction
La aplicación in vivo de implantes y biomateriales, que interactúan con la sangre humana, requiere pruebas preclínicas intensas centradas en la investigación de varios marcadores del sistema hemostático. La Organización Internacional de Normalización 10993-4 (ISO 10993-4) especifica los principios centrales para la evaluación de los dispositivos de contacto con la sangre (es decir, stents e injertos vasculares) y considera el diseño del dispositivo, la utilidad clínica y los materiales necesarios1.
La sangre humana es un líquido que contiene varias proteínas plasmáticas y células, incluyendo leucocitos (glóbulos blancos [WBCs]), eritrocitos (glóbulos rojos [RBR]), y plaquetas, que llevan a cabo funciones complejas en el cuerpo humano2. El contacto directo de materiales extraños con la sangre puede causar efectos adversos, como la activación del sistema inmunológico o de coagulación, que puede conducir a inflamación o complicaciones trombóticas y problemas graves después de la implantación3,4,5. Por lotanto, la validación de la hemocompatibilidad in vitro ofrece una oportunidad antes de la implantación para detectar y excluir cualquier complicación hematológica que pueda inducirse al contacto de la sangre con una superficie extraña6.
El modelo de bucle de flujo presentado se estableció para evaluar la hemocompatibilidad de stents neurovasculares y dispositivos similares mediante la aplicación de un caudal de 150 ml/min en tubos (diámetro de 3,2 mm) para imitar las condiciones de flujo cerebral y los diámetros de las arterias2,7. Además de la necesidad de un modelo in vitro óptimo, la fuente de sangre es un factor importante para obtener resultados fiables e inalterados al analizar la hemocompatibilidad de un biomaterial8. La sangre recogida debe utilizarse inmediatamente después del muestreo para evitar cambios causados por un almacenamiento prolongado. En general, se debe realizar una suave acumulación de sangre sin éxtasis utilizando una aguja de 21 G para minimizar la preactivación de las plaquetas y la cascada de coagulación durante la elaboración de sangre. Además, los criterios de exclusión de los donantes incluyen a aquellos que fuman, están embarazadas, están en mal estado de salud o han tomado anticonceptivos orales o analgésicos durante los 14 días anteriores.
Este estudio describe un modelo in vitro para las extensas pruebas de hemocompatibilidad de implantes de stent en condiciones de flujo. Al comparar stents recubiertos sin recubrimiento con fibrina heparina, los resultados de las pruebas de hemocompatibilidad integrales reflejan una hemocompatibilidad mejorada de los stents recubiertos con fibrina-heparina9. Por el contrario, los stents sin recubrimiento inducen la activación de la cascada de coagulación, como lo demuestra un aumento de las concentraciones de thombin-antitrombina III (TAT) y la pérdida de números de plaquetas en sangre debido a la adhesión de plaquetas a la superficie del stent. En general, se recomienda integrar este modelo de hemocompatibilidad como prueba preclínica para detectar cualquier efecto adverso en el sistema hemostático causado por el dispositivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El procedimiento de muestreo de sangre fue aprobado por el Comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad de Tuebingen (código de identificación del proyecto: 270/2010BO1). Todos los sujetos proporcionados por consentimiento informado y por escrito para su inclusión antes de la participación.
1. Preparación de Monovettes cargados de heparina
- Mezclar la heparina sin diluir (5.000 UI/ml) con cloruro de sodio (NaCl, 0,9%) solución y preparar una solución con una concentración resultante de 15 UI/ml de heparina.
- Añadir 900 ml de la solución de heparina diluida a cada monovette neutro (9 ml) para obtener una concentración final de heparina de 1,5 UI/ml después del muestreo de sangre. Preparar tres monovettes por donante más tres monovettes de reserva y almacenar los monovettes cargados de heparina a 4oC hasta el muestreo de sangre.
2. Muestreo de sangre
- Saque los monovettes cargados de heparina del refrigerador 30 minutos antes del muestreo de sangre.
- Recoger una muestra de sangre de 27 ml de cada donante sano (n.o 5) por venopunción para el bucle de flujo. Sólo aplicar un torniquete liso para evitar la activación prematura de las plaquetas y la cascada de coagulación de la sangre.
- Recoger muestras de sangre en tres monovettes que contienen 900 ml de la solución de heparina (1,5 UI/ml) y agrupar los tres monovettes en un recipiente de plástico para garantizar que todos los componentes se distribuyen uniformemente.
- Transfiera directamente la sangre heparinizada agrupada en tres monovettes diferentes que contienen EDTA (1,2 ml), citrato (1,4 ml) o una mezcla de citrato, teofilina, adenosina y dipyridamole (CTAD, 2,7 ml) para recoger valores basales. Continúe con las muestras como se describe en las secciones 5 a 8.
NOTA: Para garantizar un comportamiento de coagulación sin influencias, los donantes deben evitar la ingesta de medicamentos que afectan a la hemostasis (por ejemplo, ácido acetilsalicílico, naproxeno y carbenicilina) en los últimos 14 días, así como anticonceptivos orales y tabaquicillos.
3. Preparación del bucle de flujo
- Cortar tres tubos de cloruro de polivinilo recubiertos de heparina con una longitud de 75 cm y un diámetro interior de 3,2 mm. Cargue los tubos con los implantes neurovasculares cortados con láser con o sin el recubrimiento de fibrina-heparina. Recuerde dejar una bañera descargada como control.
- Coloque un extremo del tubo en un depósito lleno de NaCl al 0,9%, conecte el tubo al cabezal de la bomba e inserte el otro extremo en un cilindro de medición.
- Ajuste los ajustes de la bomba peristáltica para lograr un caudal de 150 ml/min utilizando un temporizador mientras comprueba el nivel de llenado en el cilindro de medición.
4. Rendimiento de las pruebas de hemocompatibilidad
- Utilice una jeringa de 12 ml para llenar los tubos de sangre. Deje que 6 ml de sangre fluyan suavemente en cada tubo que contenga una muestra o un control descargado.
- Forme un circuito y cierre los tubos firmemente usando una longitud de 0,5 cm de tubo de conexión de silicona. Colocar los tubos en un baño de agua de 37oC e iniciar la perfusión durante 60 min.
5. Análisis de recuento de sangre completa
- Poner 1,2 ml de sangre después del muestreo (línea de base) o después de la perfusión en un monovette que contenga EDTA e invierta cuidadosamente el tubo 5x.
- Inserte el monovette en el analizador de sangre y realice un análisis de hemograma para cada muestra. A continuación, incubar las monovettes en hielo durante 15 a 60 minutos después de la medición del hemograma para su posterior análisis, como se describe en la sección 7.
6. Colección de plasma de citrato
- Llenar los monobetes que contienen citrato con 1,4 ml de sangre (recién dibujado o después de la circulación) e invertir cuidadosamente 5x.
- Centrifugar los tubos durante 18 min a 1.800 x g a temperatura ambiente (RT). Aliquot tres muestras de 250 ml de la fracción plasmática en tubos de reacción de 1,5 ml y congelar las muestras plasmáticas en nitrógeno líquido. Guárdelos a -20 oC hasta su análisis.
7. Colección de EDTA Plasma
- Incubar los monovettes en hielo durante 15 a 60 minutos después de la medición del hemograma. A continuación, centrifugar los tubos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
- Alícuota tres muestras de 250 ml de la fracción plasmática en tubos de reacción de 1,5 ml después de la centrifugación y congelar los tubos en nitrógeno líquido. Guárdelos a -80 oC hasta su análisis.
8. Colección de plasma CTAD
- Llenar los monobetes que contienen la mezcla CTAD con 2,7 ml de sangre (recién dibujado o después de la incubación) e invertir cuidadosamente 5x. Después, incubar los monovettes sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar los tubos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
- Transfiera 700 l de la fracción plasmática media a un tubo de reacción de 1,5 ml y centrifugar los tubos de reacción llenos durante 20 min a 2.500 x g y 4 oC.
- Alícuota dos muestras de 100 ml de la fracción media en tubos de reacción de 1,5 ml después de la centrifugación y congelar los tubos en nitrógeno líquido. Guárdelos a -20 oC hasta su análisis.
NOTA: La recolección de plasma EDTA y plasma CTAD se puede realizar juntas porque las condiciones de funcionamiento son las mismas.
9. Medición del TAT humano a partir de plasma de citrato
- Descongelar el plasma citrato en un baño de agua de 37oC.
- Utilice el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas TAT (ELISA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Reconstruya las normas de plasma y controle y diluya la solución de lavado, el anticuerpo conjugado con peroxidasa antihumana-TAT (POD) y la solución cromómica. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter a RT (15-25 oC) durante 30 minutos antes de iniciar la prueba.
- Pipet 50 l del tampón de muestra en cada pocal de la placa de microtíter y añadir 50 l del tampón de muestra (en blanco), estándar de plasma, control de plasma y muestra de plasma sin diluir en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a 37oC durante 15 min con un suave temblor. A continuación, lave la placa 3x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 100 l del anticuerpo anti-humano-TAT conjugado POD a cada poca. Sellar la placa e incubar a 37oC durante 15 min con un suave temblor. A continuación, lave la placa 3x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 100 l de la solución de cromógeno recién preparada a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 30 min.
- Retire la película de sello y agregue 100 sl de solución de tope a cada poca. Lea la densidad óptica (OD) con un fotómetro a 490 a 500 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.
10. Medición de PMN-elastasa de Plasma citrato
- Descongelar el plasma de citrato en un baño de agua a 37 oC.
- Utilice el kit ELISA polimorfonuclear (PMN)-elastasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante: reconstruya el control de PMN-elastasa y el estándar PMN-elastasa para preparar una curva estándar utilizando el tampón de dilución del kit.
- Diluir la solución de lavado de acuerdo con la descripción del fabricante. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba. Diluir las muestras de plasma de citrato a 1:100 con el tampón de dilución.
- Añadir 100 l del tampón de muestra (en blanco), curva estándar PMN-elastasa (15,6 x 1.000 ng/mL), controles de PMN-elastasa (concentraciones altas y bajas) y muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 minutos con suave temblor. Después, lave la placa 4x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 150 l del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 minutos con suave temblor. Después, lave la placa 4x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 200 l de la solución de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) a cada pocal. Selle la placa e incubar a RT durante 20 minutos en la oscuridad. A continuación, retire la película de sellado y agregue 50 sl de la solución de tope a cada poca.
- Lea el OD con un fotómetro a 450 nm con una lectura de referencia a 630 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.
11. Medición del Complejo de Complementos terminales (TCC) de EDTA Plasma
- Descongelar el plasma EDTA en un baño de agua a 37 oC y almacenar en hielo después de la descongelación.
- Utilice el kit ELISA en cascada de complemento SC5b-9 de acuerdo con las instrucciones del fabricante: diluir la solución de lavado tal como se describe en el protocolo del fabricante. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba. Diluir las muestras de plasma EDTA a 1:10 con el tampón de dilución del kit.
- Añadir 300 l de solución de lavado a cada pocal para rehidratar la superficie y aspirar después de 2 min. Añadir 100 l del tampón de muestra (en blanco), estándares SC5b-9, controles SC5b-9 (altas y bajas concentraciones), y las muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo.
- Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. A continuación, lave la placa 5x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 50 éL del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 30 min. A continuación, lave la placa 5x con 300 sal de solución de lavado.
- Añadir 100 l de la solución de sustrato TMB a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 15 minutos en la oscuridad.
- Retire la película de sello y agregue 100 s de la solución de tope a cada poca. Lea el OD con un fotómetro a 450 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.
12. Medición de la tromboglobulina de CTAD Plasma
- Descongelar el plasma CTAD en un baño de agua a 37 oC.
- Utilice el kit ELISA de la tromboglobulina de conformidad con las instrucciones del fabricante: reconstruya el control de la TG y el estándar de la TG y diluya la solución de lavado utilizando H2O. Reconstruir el anticuerpo conjugado POD utilizando el tampón de fosfato proporcionado. Deje todos los reactivos y la placa de microtíter en RT durante 30 minutos antes de iniciar la prueba.
- Prepare la curva estándar y el control de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el tampón de fosfato proporcionado. Diluir las muestras de plasma CTAD a 1:21.
- Añadir 200 l del tampón de fosfato (en blanco), los estándares de TG, los controles de TG (altas y bajas concentraciones) y las muestras de plasma diluidas en duplicados a la placa del pozo. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. Después, lavar la placa 5x con 300 sl de solución de lavado.
- Añadir 200 l del anticuerpo conjugado enzimático a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 60 min. Después, lavar la placa 5x con 300 sl de solución de lavado.
- Añadir 200 l de la solución de sustrato TMB a cada poca. Sellar la placa e incubar a RT durante 5 minutos en la oscuridad. Retire la película de sello y detenga la reacción añadiendo 50 ml de ácido sulfúrico de 1 M (H2SO4) a cada poca.
- Deje la placa durante 15 a 60 minutos y, a continuación, lea el OD con un fotómetro a 450 nm. Ajuste los datos de curva estándar como una línea de tendencia y calcule la concentración de las muestras.
13. Preparación de muestras para escanear microscopía electrónica
- Retire el implante del tubo con fórceps y enjuague brevemente el implante sumergiéndolo en una solución de NaCl al 0,9% 3 veces.
- Conservar en solución de glutaraldehyde (2% glutaraldehyde en solución salina con fosfato [PBS-buffer sin Ca2+/Mg2+]) durante la noche a 4oC.
- A continuación, incubar los implantes en PBS-buffer durante 10 min. Deshidratar las muestras incubando en etanol con concentración creciente durante 10 min cada una: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, y 100%. Almacene las muestras deshidratadas en etanol 100% hasta que se pueda seguir analizando.
- Realizar el secado de punto crítico de acuerdo con las instrucciones del dispositivo de secado o la literatura10 justo antes de escanear la microscopía electrónica (SEM).
14. Microscopía electrónica de barrido
- Fije los implantes secos a un portador de muestra para el microscopio de exploración y saltee las muestras con paladio dorado.
- Introducir los implantes sputtered en la cámara de muestra. Tome fotografías en aumento de 100, 500, 1.000 y 2.500 veces de las áreas con la adhesión representativa de la superficie y la célula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brevemente resumido, la sangre entera humana se recogió en monovettes cargados de heparina y luego se agruparon y se utilizaron para evaluar los niveles basales de recuento celular, así como los marcadores de hemocompatibilidad plasmática.
Posteriormente, se llenó el tubo que contiene las muestras de implante sneurovascular, y la sangre se perfundió durante 60 minutos a 150 ml/min y 37 oC utilizando una bomba peristáltica. Una vez más, se analizó el número de células en todos los grupos, y las muestras de plasma se prepararon para análisis ELISA(Figura 1). La cuantificación de las células sanguíneas y los parámetros sanguíneos, como la hemoglobina y el hematocrito, se realizó directamente después de la recolección de sangre, así como después de la perfusión en el modelo de bucle de flujo para todos los tipos de muestras y el control. No se detectaron cambios con respecto al número de CMB(Figura 2A),RBO(Figura 2B) o los valores de hematocrito(Figura 2C). Sin embargo, se detectó una disminución en los niveles de hemoglobina después de la incubación de sangre en el modelo de bucle de flujo en comparación con los valores basales, que se debió a la perfusión de sangre en el sistema de bucle de flujo(Figura 2D). Además, se observó una disminución en el número de plaquetas debido a la perfusión de sangre. Además, este efecto se incrementó cuando un stent sin recubrimiento estaba presente en el tubo, lo que indica la adhesión de las plaquetas al biomaterial. No obstante, se demostró claramente que la pérdida de plaquetas era significativamente mayor cuando el stent no recubierto fue incubado con sangre, a diferencia del stent recubierto de fibrina heparina(Figura 2E).
También se investigaron posibles alteraciones de los marcadores plasmáticos hematológicos en los grupos de prueba después de la perfusión y se compararon con los valores basales de la sangre recién extraída. La concentración compleja de TAT, que refleja el estado de activación del sistema de coagulación, se incrementó ligeramente debido a la perfusión de sangre(Figura 3A). En el grupo de stents de metal desnudo, sin embargo, se detectó un aumento significativo en el TAT, lo que indica una activación profunda del sistema de coagulación. El stent recubierto de fibrina heparina impidió la activación del sistema de coagulación, ya que no se determinó ningún aumento en el TAT.
La perfusión condujo a una mayor activación de la cascada de complemento, que se determinó midiendo SC5b-9(Figura 3B). Sin embargo, la incubación con stents sin recubrimiento o recubiertos de fibrina heparina no aumentó aún más la concentración de SC5b-9. Se obtuvieron resultados similares al analizar la activación de los granulocitos neutrófilos mediante la cuantificación de las concentraciones de PMN-elastasa(Figura 3C).
La visualización de la superficie del stent se realizó utilizando SEM. Se detectaron claras diferencias entre los dos grupos de stents después de la incubación de sangre. Mientras que en la superficie del stent sin recubrimiento había una densa red de células sanguíneas y proteínas, no se detectó ninguna adhesión de proteínas o células en la superficie del stent recubierto de fibrina-heparina(Figura 4).
Figura 1: Visión general esquemática de la evaluación de la hemocompatibilidad de stents en un modelo de bucle de flujo bien establecido. La sangre entera humana fresca se recoge de donantes sanos en tubos sanguíneos que contienen heparina para la anticoagulación. Para cada donante, un tubo vacío, así como los tubos precargados con el material de la muestra se llenan posteriormente con sangre fresca y se incuban en el bucle de flujo a una velocidad de 150 ml/min a 37 oC durante 60 min. Además, las muestras de plasma se preparan a partir de sangre recién extraída para obtener los valores basales de cada donante. Después de la incubación, las muestras de plasma del tubo de ensayo, con y sin materiales de muestra, se preparan y analizan utilizando un ELISA específico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de diferentes tipos de células y parámetros sanguíneos antes y después de la incubación de diferentes implantes de stent en el modelo de bucle de flujo. Se realizó la determinación de glóbulos blancos (A), glóbulos rojos (B), hematocrito(C),hemoglobina (D) y plaquetas (E). Los datos se muestran como medias : SEM (n a 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación de los marcadores de activación plaquetaria o del sistema inmunitario antes y después de la incubación con implantes neurovasculares. Los marcadores para la activación(A) de la coagulación de la sangre (TAT), (B) el sistema de complemento (SC5b-9) y (C) neutrófilos (PMN-elastasa) se cuantificaron utilizando ELISA. El análisis se realizó en muestras plasmáticas obtenidas de sangre recién extraída o incubada con diferentes stents en el modelo de bucle de flujo. Los datos se visualizan como medias de SEM (n a 5, p* < 0,5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis microscópico electrónico de barrido de stents después de la incubación con sangre. Se observó la agregación de proteínas plasmáticas sanguíneas y plaquetas en material de stent sin recubrimiento. En comparación, los materiales de stent con el recubrimiento de fibrina-heparina no demostraron la adhesión de las células u otros componentes sanguíneos en la superficie (aumento de 500, 1.000 y 2.500 veces). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo presentado describe un método completo y confiable para la prueba de hemocompatibilidad de implantes que contactan la sangre de acuerdo con la ISO 10993-4 en un modelo de flujo de cizallamiento que imita el flujo sanguíneo humano. Este estudio se basa en la prueba de implantes neurovasculares cortados por láser, pero se puede realizar con una variedad de muestras. Los resultados demuestran que este método permite el análisis amplio de diversos parámetros como el recuento de células sanguíneas, la prevalencia de varios marcadores de hemocompatibilidad y la visualización microscópica de la superficie del dispositivo después del contacto con la sangre. Usando este protocolo, se pueden detectar posibles diferencias con respecto a la hemocompatibilidad de diferentes dispositivos.
Una alternativa a la evaluación de la hemocompatibilidad in vitro consiste en ensayos con animales in vivo, que se asocian con varias desventajas, como una mayor variabilidad y distorsión de los efectos relacionados con el dispositivo debido a los abrumadores efectos a corto plazo de las lesiones tisulares6.
Para las pruebas de hemocompatibilidad in vitro, hay tres tipos de modelos disponibles: (1) modelos estáticos de incubación de sangre, (2) modelos de incubación de sangre agitada y (3) modelos de flujo de cizallamiento. El modelo estático proporciona un método simple y rápido para determinar la trombogenicidad incubando el dispositivo directamente con sangre, pero sólo conduce a resultados rudimentarios con respecto a la hemocompatibilidad11. Para superar las principales desventajas de los modelos estáticos (es decir, la sedimentación de células sanguíneas y la gran superficie de contacto con el aire), se puede utilizar el modelo de incubación de sangre agitadora, en el que se llena de sangre e incuba una cámara de ensayo12. Sin embargo, estos tipos de modelo siguen siendo inferiores en comparación con los modelos de flujo de cizallamiento existentes, como el bucle de flujo que se presenta aquí. La quintaesencia de estos modelos es que el flujo sanguíneo humano vascular puede ser imitado; por lo tanto, una representación cercana de la interacción real entre el implante y las células sanguíneas se puede mostrar13. Además del modelo de bucle de flujo, existen modelos como el bucle Chandler o varias cámaras de flujo perfundidas14,15,16.
El bucle Chandler es un sistema de tubo cerrado que se llena parcialmente de aire y se sujeta en un dispositivo giratorio, lo que resulta en la circulación sanguínea a través de la tubería17. En el sistema de bucle de flujo actual, el tubo está completamente lleno de sangre, y el flujo se fuerza mediante el uso de una bomba peristáltica. Cuando se utiliza el modelo de bucle Chandler, los operadores se enfrentan a dos desventajas importantes debido a la necesidad de incluir aire en el tubo de prueba. En primer lugar, se sabe que la interacción constante de la sangre y el aire desencadena la agregación de leucocitos y plaquetas, así como la desnaturalización de proteínas18,19. En segundo lugar, la tasa de circulación sanguínea es limitada, porque el aire siempre permanece en el punto más alto del bucle20.
Estos inconvenientes se pueden superar cuando se utiliza el sistema de bucle de flujo. Dado que no hay interfaz aire-líquido presente en el sistema, no se produce ninguna activación plaquetaria. Por lo tanto, el modelo tiene un fondo bajo para eventos trombóticos de modo que una baja concentración de anticoagulantes, típicamente 1 UI/ml o 1,5 UI/ml de heparina, es suficiente para evitar la coagulación, incluso si se aplican altas tasas de flujo6. El caudal sanguíneo regulable de la bomba ajustable y el diámetro del tubo libremente seleccionable permiten al operador imitar las condiciones fisiológicas de una vena o arteria, que corresponden al implante a probar, y lograr los resultados de la prueba pertinentes21. Sin embargo, esta ventaja es al mismo tiempo una limitación, debido al estrés mecánico aplicado a la sangre a través de la bomba, y la destrucción de eritrocitos (es decir, hemólisis) puede ocurrir2. Este daño sanguíneo intrínseco que surge reduce la sensibilidad del método e impide la exposición prolongada a la sangre21. Sin embargo, varios estudios han demostrado el uso eficaz del modelo de bucle de flujo para la evaluación de hemocompatibilidad22,23,24.
Sin embargo, la brecha principal entre todos los modelos in vitro y los mecanismos in vivo incluye el endotelio que falta, que expresa citoquinas, componentes antitrombóticos y moléculas de adhesión; por lo tanto, este componente juega un papel crucial en la interacción del implante y la sangre circulante25. En conclusión, el modelo de bucle de flujo es ajustable, eficiente, confiable y rentable para evaluar la hemocompatibilidad de los implantes antes del uso clínico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Por el desempeño de la microscopía electrónica de escaneo, agradecemos a Ernst Schweizer de la sección de Ciencia y Tecnología de Materiales Médicos del Hospital Universitario tuebingen. La investigación fue apoyada por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes del CR dentro del Programa Nacional de Sostenibilidad II (Proyecto BIOCEV-FAR LQ1604) y por el proyecto No 18-01163S de la Fundación Checa de Ciencias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W.
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
