Summary
Aquí, presentamos un método para el cribado de agentes virales antihepatitis B que inhiben la interacción HBx-DDB1 utilizando un sistema de ensayo de luciferasa dividida. Este sistema permite una fácil detección de interacciones proteína-proteína y es adecuado para identificar inhibidores de dichas interacciones.
Abstract
Existe una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). Aunque los nucleos(t)ide análogos disponibles actualmente inhiben poderosamente la replicación viral, no tienen ningún efecto directo sobre la expresión de proteínas virales transcritas a partir de un ADN circular covalentemente cerrado viral (CCCDNA). Como la alta carga de antígenos virales puede desempeñar un papel en esta carcinogénesis crónica y relacionada con el VHB, el objetivo del tratamiento del VHB es erradicar las proteínas virales. La proteína reguladora del VHB X (HBx) se une a la proteína de unión al daño del ADN huésped 1 (DDB1) para degradar el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), lo que resulta en la activación de la transcripción viral de cccDNA. Aquí, utilizando un sistema de ensayo de complementación de luciferasa dividida, presentamos un sistema de cribado compuesto integral para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1. Nuestro protocolo permite una fácil detección de la dinámica de interacción en tiempo real dentro de las células vivas. Esta técnica puede convertirse en un ensayo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por VHB.
Introduction
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud pública en todo el mundo, con estimaciones anuales de 240 millones de personas infectadas crónicamente con vhVH y 90.000 muertes por complicaciones de la infección, como cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC)1. Aunque los agentes terapéuticos anti-HBV actuales, análogos de nucleos(t)ide, inhiben suficientemente la transcripción inversa viral, rara vez logran la eliminación de proteínas virales, que es el objetivo clínico a largo plazo. Su pobre efecto sobre la eliminación de proteínas virales se debe a su falta de efecto directo en la transcripción viral de los minicromosomas de ADN circular covalentemente cerrado (cccDNA) episómico en el núcleo de hepatocitos2.
La transcripción del VHB se activa mediante la proteína X reguladora del VHB (HBx)3. Estudios recientes revelaron que HBx degrada el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), un factor de restricción del host que bloquea la transcripción del VHB de cccDNA, mediante el secuestro de un complejo de ligasa de ubiquitina DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Por lo tanto, se cree que un paso crucial en la promoción de la transcripción viral de cccDNA es la interacción HBx-DDB1. Los compuestos capaces de inhibir la unión entre HBx y DDB1 pueden bloquear la transcripción viral, y de hecho nitazoxanida fue identificado como un inhibidor de la interacción HBx-DDB1 a través de un sistema de cribado desarrollado en nuestro laboratorio7.
Aquí, presentamos nuestro conveniente sistema de cribado utilizado para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1, que utiliza un ensayo complementario de luciferasa dividida7,8. Las subunidades de luciferasa divididas se fusionan a HBx y DDB1, y la interacción HBx-DDB1 acerca a formar una enzima funcional que genera una señal luminiscente brillante. Como la interacción entre las subunidades es reversible, este sistema puede detectar proteínas HBx-DDB1 que se disocian rápidamente (Figura 1). Usando este sistema, una gran biblioteca de compuestos se puede examinar fácilmente, lo que puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos capaces de inhibir eficientemente la interacción HBx-DDB1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: En la Figura 1Ase muestra una representación esquemática del ensayo de luciferasa dividida , y el proceso de ensayo se describe en la Figura 1B. La dinámica de interacción se puede medir en tiempo real sin lisis celular.
1. Preparación celular
- Mantener las células HEK293T cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementada con suero bovino fetal 10% v/v (FBS), 1x penicilina/estreptomicina a 37oC en 20% O2 y 5% CO2.
- Semilla 5 x 106 células en un plato de 100 mm con 10 mL de DMEM e incubar a 37oC durante la noche.
- Transfecto transitorio 1 g de HBx y DDB1 con luciferasas divididas en las células de acuerdo con el siguiente método.
NOTA: La cantidad del plásmido ADN transctado puede depender del regente de transfección utilizado. La posición óptima de la luciferasa dividida fusionada con la proteína diana debe determinarse de antemano. En este caso, HBx fusionó a LgBit en el Término C de HBx (HBx-LgBit) y DDB1 fusionado a SmBit en el N-terminus de DDB1 (SmBit-DDB1) proporcionó los mejores resultados (es decir, las señales de luciferasa más brillantes). Este proceso se ha informado previamente en detalle7.- Diluir 1 g de HBx-LgBit expresando plásmido de ADN y 1 g de Plásmido de ADN(Tabla de Materiales)en el tampón de condensación de ADN(Tabla de Materiales)a un volumen total de 300 l.
- Añadir 16 l de solución potenciadora(Tabla de materiales)y mezclar mediante vórtice durante 1 s.
- Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 3 min.
- Añadir 60 l de reactivo de transfección(Tabla de materiales)a la muestra y mezclar mediante vórtice durante 10 s.
- Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 8 min.
- Durante la incubación, aspirar el medio de cultivo del plato (preparado en el paso 1.2), y lavar las células con 5 ml de solución salina con fosfato (PBS). Retire PBS por aspiración y agregue 7 mL de DMEM.
- Añadir 3 ml de DMEM al tubo que contiene los complejos de transfección. Mezclar pipeteando y añadir los complejos de transfección a la celda en el plato de 10 cm.
- Incubar las células a 37oC en una incubadora de menos del 5% deCO2 durante 10 h.
- Resembrar las células en una placa blanca de 96 pocillos a 5 x 104 células/bien en 50 oL de medio/bien de acuerdo con el siguiente método.
- Retire el medio de cultivo celular gastado y lave las células con 5 ml de PBS.
- Retire el PBS por aspiración, agregue 1 mL de 0.25% trypsin-EDTA, e incuba a 37 oC durante 5 min para separar las células.
- Añadir 4 mL de DMEM y dispersar el medio mediante pipeteo sobre la superficie de la capa celular varias veces. Transfiera la suspensión celular a un tubo.
- Células centrífugas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Diluir el pellet celular con medio de cultivo celular tamponado(Tabla de Materiales)complementado con 10% FBS a una densidad de semilla de 1.0 x 106 células/ml.
- Pipetear 50 l de suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos y devolver las células a la incubadora.
- Incubar células a 37oC por debajo del 5% deCO2 durante 10 h.
2. Detección de compuestos
- Durante la incubación, diluir los compuestos de cribado(Tabla de materiales)y el disolvente (dimetil sulfóxido [DMSO]) a una concentración de 13,5x. Por ejemplo, si el stock es de 10 mM y la concentración de cribado es de 10 m, añada 1 l de solución de stock a 73,1 l de medio de cultivo de celdas tamponadas.
- Añadir 12,5 éL de sustrato luminiscente(Tabla de Materiales)a cada pocal e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: Como controles negativos, los pozos en ambos extremos de la placa (es decir, las columnas 1 y 12) no deben contener ningún sustrato luminiscente. - Mida la luminiscencia basal utilizando un luminómetro(Tabla de materiales).
- Inmediatamente después de la medición inicial, añadir 5 s l de compuestos y controlar DMSO diluido en el paso 2.1 a cada poca.
NOTA: La concentración final será de 10 m. - Mida los valores de luminiscencia cada 30 min durante 2 h.
NOTA: La placa debe ser incubada en la oscuridad a temperatura ambiente. - Calcule los efectos inhibitorios en comparación con el tratamiento de DMSO de control después de la normalización con las señales basales.
NOTA: La detección de cada compuesto en duplicado o triplicado puede reducir la variación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los resultados representativos después del uso de este protocolo se muestran en la Figura 2A,B. La relación señal-fondo fue mayor que 80 y el factor Z9 (el índice de calidad estándar de oro para el cribado de alto rendimiento) fue mayor que 0,5, lo que indica que este sistema de ensayo era aceptable para el cribado de alto rendimiento. Con el umbral establecido en >40% de inhibición en comparación con el control (DMSO solamente), identificamos nitazanida como un fármaco candidato7. Usando este sistema, se pueden encontrar mejores medicamentos para candidatos mediante la detección de otras bibliotecas compuestas más grandes.
Figura 1: Representación esquemática del análisis de luciferasa dividida de la interacción HBx-DDB1. (A) El principio subyacente a la detección de unión HBx-DDB1 utilizando el sistema de ensayo complementario de luciferasa dividida. Las subunidades de luciferasa separadas, LgBit y SmBit, se fusionan con HBx y DDB1, respectivamente. La interacción HBx-DDB1 acerca a las subunidades para formar una enzima funcional que genera una señal luminiscente. La interacción entre las subunidades es reversible. (B) Ensayo de luciferasa dividida. Después de co-transfectar los plásmidos para la expresión de HBx fusionado a LgBit y DDB1 fusionado a SmBit, las células fueron re-sembradas en una placa de 96 pozos. La adición de sustrato luminiscente permite medir la actividad de la luciferasa sin un paso de lisis celular. Las actividades de Luciferase se pueden medir después de añadir los compuestos de cribado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados exitosos del ensayo de luciferasa dividida. (A) Señales luminiscentes de línea de base representativas de una placa de 96 pocillos. La intensidad de la Luciferasa está representada por números y colores. Las columnas 1 y 12 son controles en los que no se ha añadido el sustrato luminiscente. El factor Z' fue mayor que 0,5. (B) Resultado representativo de la serie temporal de los niveles relativos de actividad luciferasa después de la adición de compuestos de cribado a una placa de 96 pozos. El eje x representa los efectos inhibitorios calculados en comparación con el control (DMSO) después de la estandarización a la actividad de la luciferasa basal. El compuesto más eficaz fue nitazoxanida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desarrollamos un método de cribado conveniente utilizando un ensayo de luciferasa dividida para encontrar inhibidores de unión HBx-DDB1. La dinámica de interacción se puede detectar en tiempo real en células vivas sin necesidad de lisis celular. La inhibición de la interacción HBx-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción viral, la expresión de proteínas y la producción de ADNcccc7. Este novedoso mecanismo de acción antiviral puede superar las insuficiencias de las terapias actuales contra el VHB.
Aunque hay varios métodos disponibles para investigar las interacciones proteína-proteína en las células vivas, examinar estas interacciones sigue siendo difícil10. Nuestro procedimiento es simple y requiere sólo un corto tiempo para la pantalla de una placa de 96 pozos. Además, la calidad de cribado fue satisfactoria con una alta puntuación Z', el índice de calidad estándar de oro para el cribado de alto rendimiento9. Nuestro ensayo puede ser adecuado para la automatización robótica11 y es un ensayo eficiente para el descubrimiento de fármacos.
Mientras que el protocolo descrito aquí utilizaba la línea celular HEK293T porque su alta eficacia de transfección y alta capacidad de proliferación son adecuados para el cribado de alto rendimiento, este método de cribado se puede realizar utilizando otras líneas celulares (por ejemplo, HepG2) sin modificaciones7. Como estrategia realista para los compuestos de cribado, las células HEK293T se pueden utilizar en el primer cribado seguido de las células HepG2 en un segundo cribado de validación. Algunos compuestos pueden no mostrar resultados significativos en diferentes líneas celulares cuando los efectos dependen de mecanismos indirectos.
Como nuestra intención era desarrollar un método de cribado de alto rendimiento, los estudios de validación posteriores son necesarios para confirmar si los compuestos identificados funcionan como inhibidores de la interacción. La disminución de los niveles de señales luminiscentes en este ensayo no siempre se corresponde con la inhibición de la interacción HBx-DDB1. Las pruebas de citotoxicidad, los estudios de coinmunoprecipitación y otros experimentos anti-HBV son importantes para confirmar los efectos7.
Aunque previamente identificamos nitazoxanide como un inhibidor de la interacción HBx-DDB1 mediante el cribado de una biblioteca compuesta relativamente pequeña 7 , se pueden realizar estudios adicionales que implican el cribado de bibliotecas de compuestos mucho más grandes para identificar compuestos novedosos que son capaces de inhibir las interacciones proteína-proteínademanera más eficiente. Al realizar este tipo de cribado adicional, el nitazoxanida se puede utilizar como un control positivo para el ensayo. Además, el sistema descrito aquí se puede aplicar a otras interacciones proteína-proteína. Las interacciones proteínas y proteínas son una clase importante de objetivos de fármacos12. De hecho, muchos otros virus interactúan con factores de host para replicar o expresar su patogenicidad13,14. El ensayo dividido basado en la luciferasa descrito aquí, que se dirige a las interacciones entre las proteínas virales y del huésped, puede proporcionar una nueva estrategia para desarrollar curas para el VHB y otras enfermedades infecciosas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (#19H03430 y #17K09405 a M.O., y #19J11829 a K.S.), por una Subvención en Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras (#18H05024 a M.O.), por el Programa de Investigación sobre Hepatitis de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico, AMED (a M.O., #JP19fk021005), por programa sobre el Desarrollo Innovador y la Aplicación de Nuevos Medicamentos para la Hepatitis B (#JP19fk0310102 a K.K.) la Fundación Japonesa para la Enzimología Aplicada y de la Fundación Kobayashi para la Investigación del Cáncer (a M.O.), por GSK Japan Research Grant 2018 (a K.S.), y por una subvención de la Miyakawa Memorial Research Foundation (a K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
