Summary
Этот протокол детализирует клинически реализуемую подготовку высококачественных бионамплов PBMC и плазмы на месте клинического испытания, которые могут быть использованы для анализа трансляционных биомаркеров.
Abstract
Анализ биомаркеров в периферической крови становится все более важным в клинических испытаниях, чтобы установить доказательство механизма оценки эффектов лечения и помочь определить дозу и график терапевтических средств. Из одного забора крови мононуклеарные клетки периферической крови могут быть выделены и обработаны для анализа и количественной оценки белковых маркеров, а образцы плазмы могут быть использованы для анализа циркулирующей опухолевой ДНК, цитокинов и метаболомики плазмы. Продольные образцы из лечения предоставляют информацию об эволюции данного белкового маркера, мутационном статусе и иммунологическом ландшафте пациента. Это может быть достигнуто только в том случае, если обработка периферической крови эффективно проводится в клинических центрах и образцы должным образом сохраняются от постели до скамейки. Здесь мы представляем оптимизированный протокол общего назначения, который может быть реализован на клинических площадках для получения гранул PBMC и образцов плазмы в многоцентровых клинических испытаниях, что позволит клиническим специалистам в больничных лабораториях успешно предоставлять образцы высокого качества, независимо от их уровня технической экспертизы. Также представлены альтернативные варианты протоколов, оптимизированные для более конкретных последующих аналитических методов. Мы применяем этот протокол для изучения белковых биомаркеров против реакции на повреждение ДНК (DDR) на рентгеновской облученной крови, чтобы продемонстрировать пригодность подхода в онкологических условиях, где практиковаются препараты DDR и / или лучевая терапия, а также на доклинических стадиях, где требуется механистическая проверка гипотез.
Introduction
Разработка лекарств направлена на предоставление новых терапевтических средств, удовлетворяемых неудовлетворенным медицинским потребностям, и более целенаправленной, персонализированной медицины. В настоящее время активно исследуются многочисленные лекарственные механизмы, включая ферментативное ингибирование, такое как киназа1,протеаза2или ингибиторы поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP)3,деградация белка4,терапевтические антитела5и антитело-конъюгированные препараты (АЦП)6,среди многих других. Примером усилий по получению лучшего лечения в онкологии является использование ингибиторов киназы с целью остановки сигнальных каскадов, которые удерживают пролиферирование раковых клеток1,7. Измерение уровней субстратного фосфорилирования, специфичных для этих киназ, является лучшим фармакодинамическим биомаркером для количественной оценки механизма действия этих ингибиторов8. Другие препараты могут модулировать экспрессию данного белка, и в этом случае возможность количественной оценки изменений концентрации их целевого белка продольно на протяжении всего курса лечения имеет первостепенное значение. Поэтому, независимо от характеристик лекарственного средства или патологии, оценка биомаркеров для установления фармакокинетической (ПК)/фармакодинамической (ФД) взаимосвязи между воздействием лекарственного средства и целевой модуляцией является наилучшей практикой в ранней клинической разработке и позволяет определить безопасную и переносимую фармакологически активную дозу/список9.
В то время как в онкологических клинических разработках анализ биомаркеров в биопсии может быть лучшим средством для установления доказательства механизма лекарственного средства, количество доступных биопсий в исследовании обычно довольно ограничено10,11. В качестве альтернативы, образцы периферической крови очень ценны для клинических испытаний, поскольку они включают минимально инвазивную процедуру, быстро и легко получить, облегчая продольный анализ, дешевле, чем биопсия, и предоставляют обширную информацию для мониторинга результатов лечения в режиме реального времени. Дополнительным преимуществом оценки биомаркеров БП в периферической крови является возможность использования биопроста для количественной оценки ПК, что позволяет точно определить количественные соотношения ПК/ФД и последующее моделирование ПК/ФД12,13. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) из цельной крови могут быть выделены для изучения белковых маркеров, которые испытывают либо изменения в уровне их экспрессии, либо в их постперекьерных модификациях. Кроме того, PBMCs могут быть использованы для иммунофенотипирования14,15,анализов иммунной функциональности, таких как оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)16 и эпигенетический анализ посредством выделения РНК. Аналогичным образом, плазма из цельной крови может быть использована для количественной оценки цитокинов для характеристики иммунологического ответа пациента, для выполнения метаболических исследований, а также для выделения и секвенирования циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) для мониторинга клональной эволюции заболевания при отборе из терапевтического агента, часто обеспечивая механистическую основу для резистентности к лечению17,18,19, позволяя разработать последующие поколения терапевтических средств20. Наконец, выделение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из периферической крови позволяет оценить прогрессирование заболевания путем продольного перечисления, секвенирования ДНК/РНК и анализа белково-биомаркеров21. Хотя эта изоляция совместима с протоколом, описанным в настоящемописании 22,низкое содержание ЦОК во многих типах рака и на ранних стадиях заболевания делает использование специализированных трубок более подходящим для минимизации деградации CTC23.
В последние годы использование жидких биопсий улучшило информацию, полученную в клинических испытаниях, и коллекции PBMC были включены во многие исследования для мониторинга взаимодействия с мишенью и доказательства механизма либо непосредственно в опухолевых клетках для некоторых типов гематологических злокачественных новообразований, либо на самих НБМК в качестве суррогатов БП опухолевых клеток24,25,26. Подготовка высококачественных образцов положительно влияет на определение наиболее безопасного и эффективного лечения данной патологии, но, по нашему опыту, качество препаратов PBMC, полученных из разных клинических объектов, подвергается широкой вариабельности качества, в результате чего образцы не подходят для целей последующего анализа. Это повлияло на объем данных о БП, которые могут быть собраны из этих исследований.
Здесь мы подробно описываем простой в использовании протокол, который показывает, как эффективно изолировать как PBMCs, так и образцы плазмы из одного забора крови в клинических условиях. Протокол основан на инструкциях, предоставленных производителем пробирок для подготовки мононуклеарных клеток, которые включают в себя модификации, в которых реальный опыт выявил трудности в выполнении протокола, о которых сообщают клинические центрифугирование, такие как проблемы центрифугирования, задержки обработки и передача образцов криовиалам. Существуют альтернативные коммерчески доступные способы применения пробирок для подготовки мононуклеарных клеток на основе разделения градиентов плотности с использованием растворов полисахаридов с барьером или без него, отделяющих раствор от крови27. Если соответствующий клинический центр уже имеет хороший опыт работы с этими альтернативными методологиями, этот протокол может быть приемлемо заменен ими. В таких случаях можно учитывать два фактора: некоторые альтернативные методы требуют переноса цельной крови из пробирки для сбора в отдельную пробирку для подготовки, где дополнительная передача первичного биологического материала человека может представлять несколько повышенный риск безопасности, и успех методов без барьеров, отделяющих кровь от раствора полисахарида, зависит от критических этапов, таких как наслоение образца крови на среде градиента плотности, требующей развития уточненного уровня технических знаний, не всегда встречающихся в лабораторных условиях больницы. Несмотря на вышеуказанные моменты, общая жизнеспособность и восстановление клеток сопоставимы между этими методами15,28. Таким образом, выбор методологии в некоторой степени зависит от предыдущего технического опыта, но в наших руках трубки для подготовки мононуклеарных клеток могут успешно использоваться в широком клиническом контексте и являются нашей рекомендацией.
В то время как одной из конечных точек этого протокола является производство гранул PBMC для дальнейшей переработки в лизаты, могут быть реализованы другие конечные применения сбора PBMC, такие как выделение нуклеиновых кислот или производство мазков PBMC или блоков PBMC, подходящих для методов иммуногистохимии (IHC). Важно отметить, что, поскольку каждый биопроигрок, взятый у пациентов, представляет собой инвазивную процедуру, по крайней мере, на некотором уровне, этот протокол максимизирует полезный материал из каждого образца, также выделив плазму, которая может быть использована для анализа цитокинов, метаболомных исследований или секвенирования ctDNA.
Анализ периферических биомаркеров в онкологических исследованиях является одним из многих применений лизатов PBMC. Одним из примеров является оценка ответа на повреждение ДНК (DDR) в таких методах лечения, как химиотерапия, лучевая терапия или использование ингибиторов ферментов, участвующих в DDR, таких как киназы, связанные с фосфатидилинозитол-3 (PIKKs)7 и PARPs3,13. Целью этих методов лечения является увеличение повреждения ДНК в пролиферирующих клетках, что создает высокую токсичность в клетках с нарушенными механизмами DDR и контрольными точками клеточного цикла, такими как раковые клетки. Здесь мы представляем пример с исследованием биомаркеров ГДР в периферической крови, подвергаемой рентгеновским лучам.
Protocol
Информированное согласие пациента и полное соблюдение соответствующих национальных этических требований в каждой юрисдикции, например, Закон о тканях человека (HTA - Соединенное Королевство, 2004 год) и Закон о переносимости и подотчетности медицинского страхования (HIPAA - Соединенные Штаты, 1996 год) являются обязательными. Обязательно получите полностью документированное этическое одобрение, прежде чем начинать какую-либо работу над материалами, полученными от человека. Кровь, используемая для оптимизации этого протокола, была предоставлена с соответствующего согласия Группы добровольцев по продвижению медицины (VAMP) (этическая справка 16/EE/0459, исследование CRF494, подэтюд 001), управляемой NiHR Cambridge Clinical Research Facility, Кембридж, Соединенное Королевство, в соответствии с соглашением о поставке биологических образцов человека с Национальным институтом исследований в области здравоохранения (NIHR) Кембриджского центра биомедицинских исследований. Биобанк «АстраЗенека» в Великобритании лицензирован Управлением по тканям человека (лицензия No 12109) и имеет одобрение Национального комитета по этике исследований (NREC) в качестве банка исследовательских тканей (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. Общее руководство по подготовке
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа с нефиксированными человеческими материалами, такими как кровь, плазма и PBMCs в этом протоколе, должна осуществляться исходя из предположения, что эти материалы могут нести потенциально инфекционные агенты, и поэтому должна выполняться в соответствии с соответствующими мерами предосторожности в области биобезопасности. Для пациентов, которые были протестированы как отрицательные на известные патогены, не предполагайте, что образцы не являются инфекционными, и поэтому все еще должны применяться соответствующие меры предосторожности. Отходы, образующиеся из этих материалов, должны обрабатываться с теми же мерами предосторожности в области биобезопасности и утилизироваться в соответствии с местными правилами.
- Выберите один из двух типов пробирок для подготовки мононуклеарных клеток, которые используют либо цитрат натрия, либо гепарин натрия в качестве антикоагулянтов. Для многих последующих применений эти два антикоагулянта могут использоваться взаимозаменяемо, но оба антикоагулянта должны быть протестированы, прежде чем выбрать один для испытания.
- Нанести метку на одну 8 мл 8 мл для подготовки мононуклеарных клеток, которая будет использоваться для сбора крови, с кодовым идентификатором пациента. Держите трубки при комнатной температуре (18-25 °C).
- Хранить 1x PBS при комнатной температуре (18-25 °C). Используйте 30 мл на препарат.
- Убедитесь, что пробирки для отдельных образцов плазмы и криовиал для образца PBMC точно маркированы уникальными идентификаторами, как указано в соответствующем разделе руководства по эксплуатации.
- Если PBMCs собираются использовать для мониторинга фосфорилированных белков, приготовьте PBS с добавлением ингибиторов фосфатазы: смешайте 5 мл PBS с 50 мкл коктейля ингибиторов фосфатазы 2 + 50 мкл коктейля ингибитора фосфатазы 3. Приготовить свежим и держать на льду до использования.
- Если НБМК будут криоконсервироваться, приготовьте 1 мл морозильной смеси на образец, перемешав 90% FBS + 10% DMSO.
2. Коллекция PBMC(Рисунок 1A)
- Втягивайте 8 мл крови в пробирку для подготовки мононуклеарных клеток с использованием стандартной методики, описанной производителем. Осторожно перевернить пробирку от 8 до 10 раз, чтобы смешать антикоагулянтную добавку с кровью. Не встряхивайте, чтобы избежать гемолиза. Запишите время, в которое была взята кровь.
- После сбора храните трубку в вертикальном положении при комнатной температуре до центрифугирования. Обработайте образцы как можно скорее, в идеале в течение одного часа после этого сбора крови, но не позднее 4 часов после сбора. Запишите сроки при начале обработки крови.
- Непосредственно перед центрифугированием перемешивать образец крови, осторожно переворачивая трубку еще 8-10 раз.
- Центрифугировать пробирки/пробирки для отбора проб крови в горизонтальном роторе (откидной головке) при 1 500 – 1 800 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (18-25 °C). Убедитесь, что все трубки сбалансированы должным образом.
Рисунок 1: Общий обзор протокола и репрезентативные изображения центрифуги. (A) Схематический обзор протокола для приготовления МПК и плазмы. *При наличии временных ограничений шаг 2.4 может быть сокращен до 20 минут, а шаги с 3.3 по 3.6 могут быть удалены. ** Возьмите аликвоту для подсчета клеток, если это необходимо. 2 дополнительных шага центрифугирования, необходимых для анализа/метаболомики(В)изображения центрифуги с откидной головкой ротора, установленной для этапа 2.4. (C) Изображение ротора, который включает в себя два ведра, содержащих адаптеры для отжима мононуклеарных клеток для подготовки трубок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ПРИМЕЧАНИЕ: x g (также называемый RCF, относительные центробежные единицы) и RPM (обороты в минуту) являются различными единицами. Обязательно установите центрифугу на x g (RCF). Используйте онлайн-калькулятор (см. Таблицу материалов)для конвертации. Если доступен только ротор с фиксированным углом, выполните этот шаг в течение 10 мин при 1 500 – 1 800 x g.
- После центрифугирования проверьте наличие темно-красного слоя под барьером (содержащего в основном эритроциты) и 2 слоев над барьером. Верхний слой - это плазма (соломенного цвета), а беловатый слой под ним - пухлый слой, содержащий PBMCs. Эти слои можно легко различить при просмотре трубки на темном/черном фоне.
Рисунок 2: Трубки для изоляции НБМК. (A) Изображение пробирок перед центрифугированием (этап 2.4), либо пустых (слева), либо содержащих кровь (справа). (B)Успешное разделение слоя PBMC после центрифугирования (этап 2.5). (C)Изображение слоя PBMC после центрифугирования и немного плазмы, оставшейся для обеспечения сбора всех PBMC (шаг 2.7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти слои не видны, это, вероятно, указывает на ошибку в настройке центрифугирующих установок. Убедитесь, что используется правильный адаптер центрифуги и установлен правильный «x g». Повторите шаг 2.4.
- Сразу после центрифугирования используйте серологическую пипетку для переноса примерно половины плазмы в меченую коническую центрифужную трубку размером 15 мл с колпачком, стараясь при этом не нарушать слой PBMC (примерно 4-5 мл). Временно храните эту трубку с плазмой на влажном льду для использования позже на этапе 4. Пока отложите в сторону.
- Соберите весь слой PBMC с помощью пипетки Пастера, поместив пипетку в слой ячеек и переместив в коническую центрифужную трубку размером 15 мл с колпачком. Допустимо также взять небольшое количество плазмы, при необходимости полностью получить весь слой PBMC. Объем обычно составляет 1-2 мл. Сразу же перейдите к шагу 3 ниже.
3. Ступени мойки PBMC
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этапов промывки является разбавление и удаление остаточных тромбоцитов и плазмы из гранул PBMC. Все этапы центрифугирования должны выполняться при комнатной температуре (18-25 °C).
- Добавьте PBS комнатной температуры в трубку PBMC, чтобы довести объем до 15 мл. Закутка трубки. Перемешайте клетки, осторожно перевернутый трубкой 5 раз.
- Центрифуга в течение 15 мин при 300 х г. Обратите внимание, что это гораздо более мягкое центрифугирование, чем начальное центрифугирование.
- Визуализируйте гранулу, рассматривая трубку на темном/черном фоне. Удаляют супернатант вакуумной аспиративной аспиративной или пипеткой(рисунок 3А). Отбросьте надотворитель, оставив объем примерно на 500 мкл выше гранулы PBMC беловатого цвета.
Рисунок 3: Гранулы PBMC. (A)Гранулы, полученные на первом этапе промывки 3.3. (B)Гранулы, изолированные во время второй промывки (этап 3.7). (C)Гранулы с высоким уровнем гемолиза, полученные из крови, обработанной позднее 4 ч из забора крови, выделенной во второй промывке (этап 3.6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Повторно суспендируйте гранулу ячейки, осторожно пипетируя вверх и вниз остаточный супернатант.
- Добавьте дополнительно 1x PBS, чтобы увеличить объем до 10 мл. Закутка трубки. Перемешайте клетки, аккуратно инвертив трубку в 5 раз. Если подсчет клеток требуется в протоколе исследования, перейдите к шагу 3.5.1, если это не требуется, перейдите непосредственно к шагу 3.6.
- Возьмите 40 мкл аликвоты повторно взвешенных клеток и смешайте с 40 мкл трипанового синего. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
- Центрифугируют суспензию со ступени 3,5 в течение 10 мин при 300 х г. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки.
- Осторожно удалите и выбросьте все оставшиеся супернатанты над гранулой ячейки путем пипетки с использованием тонкого наконечника пипетки Пастера или микропипетки, не нарушая гранулу ячейки. После завершения этого шага оставляйте мало или сразу не оставляйте жидкости над гранулой. Если конечной точкой этого протокола является гранула PBMC, перейдите к шагу 3.8; если конечной точкой является криоконсервируется НБК, перейдите к шагу 3.10.
- Добавьте 50 мкл нового PBS (или дополненного PBS, приготовленного на этапе 1.5, если это применимо к вашей конечной точке) к грануле и пипетку вверх и вниз осторожно, используя микропипетку, чтобы однородно повторно высовывать все клетки. Переложите всю клеточную суспензию на меченый криовиал объемом 1,5 мл и немедленно поместите на влажный лед до замораживания образцов.
- Заморозьте маркированные образцы, поместив их в жидкий азот или непосредственно в сухой лед. Клетки также могут быть заморожены при -80 °C морозильной камеры с использованием коробок для замораживания клеток. В этом случае предварительно отсылайте коробки полностью при -80 °C перед добавлением клеточных пробирок. Запишите время, в которое гранулы клеток были заморожены. Как только клетки замерзнут, хранят при -80 °C, корабль замерзает на сухом льду.
- Необязательно криоконсервировать НБМК повторно суспендировать гранулу в 1 мл морозильной смеси (этап 1.6) и перенести в меченую криовиаль. Продолжайте, как описано в шаге 3.9, но в этом случае допустимо использовать только ячейки для замораживания образцов. Переложить на жидкий азот для транспортировки и хранения после нахождения в морозильной камере в течение не менее 24 ч.
4. Этапы приготовления плазмы(рисунок 1А)
- После хранения гранул PBMC при -80 °C теперь подготовьте плазменную аликвоту, которая временно хранилась на влажном льду на этапе 2.6. Выполните следующие этапы центрифугирования для уточнения плазмы, если целью образца является анализ ctDNA, в противном случае перейдите непосредственно к шагу 4.2.
- Центрифугировать плазму в течение 10 мин при 1,600 - 2,000 х г при 4 - 8 °C в роторе с фиксированным углом наклона (или 15 мин в откидном роторе).
- Осторожно выньшите плазменный супернатант, позаботьтесь о том, чтобы не потревожить гранулы и переложить в новую трубку объемом 15 мл. Выбросьте трубку, содержащую гранулированный материал.
- Центрифугировать плазму в течение 10 мин при 1,600 - 2,000 х г при 4 - 8 °C в роторе с фиксированным углом наклона (или 15 мин в откидном роторе).
- Осторожно перенесите плазменный супернатант в новую трубку объемом 15 мл, не потревожая гранулированный материал. Выбросьте трубку, содержащую гранулированный материал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлажденный центрифуга недоступна, держите ячейки на льду в течение 5 минут между каждым вращением или образцами центрифуги в холодной камере.
- Перенос плазмы в 1 мл аликвот в 5 свежих 2 мл микротрубок. Используйте менее 5 флаконов, если плазмы недостаточно для заполнения 5 флаконов 1 мл аликвот, и ожидается, что последний флакон будет содержать менее 1 мл плазмы. Если имеется более 5 мл плазмы, отбросьте оставшуюся часть. Запишите общий объем плазмы в каждой трубке.
- Немедленно заморозьте аликвоты плазмы в вертикальном положении, запихивая их при -80 °C.
5. Отгрузка образцов
- Отгрузка как гранул PBMC, так и образцов плазмы на сухом льду.
- Убедитесь, что образец не разморажен до и во время отгрузки. Упакуйте достаточное количество сухого льда с образцами, чтобы гарантировать, что они остаются замороженными в течение всего процесса отгрузки, учитывая возможные задержки, которые могут произойти при транспортировке.
6. Облучение цельной крови и вестерн-блот анализ биомаркеров ГДР(рисунок 4А)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это лечение ex vivo, которое не потребуется в большинстве случаев в клинике, но эти эксперименты являются ценной исследовательской стратегией для поиска подходящих клинических биомаркеров. Образцы крови должны быть обработаны как можно скорее после сбора, чтобы обеспечить наилучшие результаты.
- Разогрейте рентгеновский кабинет. Наклейте три пробирки по 15 мл как 0, 0,2 и 7 Гр соответственно.
- Возьмите три пробирки для подготовки мононуклеарных клеток, содержащих свежеприбранную кровь от одного человека, и после осторожной инвертирования пробирок от 8 до 10 раз перенесите кровь в три пробирки по 15 мл.
- Поместите трубку 0,2 Гр в рентгеновский шкаф, закройте дверцу и нанесите дозу 0,2 Гр на трубку, выбрав номер полки и дозу. Нанесите дозу облучения 7 Гр на трубку 7 Гр, регулируя дозу, выбранную в шкафу.
- Высиживают три трубки при 37 °C в течение одного часа.
- Перенесите кровь обратно в пробирки для подготовки мононуклеарных клеток и выполняйте протокол подготовки PBMC в клинических условиях от стадии 2.4 до стадии 3.8.
- Добавьте объем лизисного буфера, дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы, равный объему клеточных гранул (в данном случае 70 мкл буфера RIPA) к каждой из клеточных гранул, пипетки вверх и вниз и инкубируют на льду в течение 10 мин. Обрабатывайте образцы ультразвуком, если имеется ультразвуковой аппарат (3 цикла, 30 с ON / 30 s OFF, 4 °C), альтернативно шприц для разрыва нуклеиновых кислот для устранения вязкости в образце.
- Центрифугировать образцы в течение 10 мин при ≥ 15 000 х г,при 4 °C. Перенесите каждый супернатант в новую трубку 1,5 мл, качественно оцените уровень гемолиза (визуальный осмотр) и измерьте концентрацию белка любым предпочтительным методом.
- Смешайте 40 мкг общего лизата с буфером загрузки образца, содержащим SDS и восстановителем образца. Варить образцы в течение 5 мин в тепловом блоке.
- Загрузите 20 мкг каждого образца на полосу в двух экземплярах в 4-12% бис-трис протеиновый гель и запустите SDS-PAGE.
- После разделения переносят белки на нитроцеллюлозную мембрану с помощью коммерчески доступной системы (20 В, 10 мин) и блокируют 5% молоком в TBST.
- Разрезают мембрану при соответствующих молекулярных размерах и инкубируют с первичными антителами в течение ночи при 4 °C (см. Таблицу материалов для антител и разведений).
- Удалить первичные антитела и промыть мембраны 3 раза ТБСТ в течение 5 минут при комнатной температуре. Инкубировать с HRP-конъюгированными вторичными антителами в течение 45 минут при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза с TBST в течение 5 мин.
- Применяют реагент ECL и анализируют полученные изображения относительно сигнала HRP.
Representative Results
Чтобы улучшить качество препаратов PBMC в наших клинических испытаниях, мы создали протокол с краткими, четкими шагами, которые могут быть выполнены специалистами лаборатории больницы, независимо от их опыта молекулярной биологии и лабораторных навыков. Мы адаптировали протокол производителя, включив изменения на тех этапах, где проблемы с выполнением были выявлены или сообщены из клинических центров, участвующих в различных многоцентровых клинических испытаниях. Тем не менее, протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения конкретных требований, таких как временные ограничения в клиническом центре или тип последующих анализов (см. Дополнительный файл). Мы демонстрируем, что ГДР может быть проанализирована в НБМК, глядя на конкретные биомаркеры повреждения ДНК, вызванного радиацией.
Наиболее распространенные запросы, которые мы получили от клинических площадок, относятся к этапам центрифугирования, которые непосредственно влияют на возможность успешного выделения PBMC и получения конечной гранулы PBMC. Использование соответствующего типа центрифуги ротора с откидной головкой(рисунок 1B,C)является ключом к успеху протокола. Однако, когда в клинической площадке доступна только центрифуга ротора с фиксированным углом, мы предлагаем выполнять шаг 2.4 в роторе с фиксированным углом наклона на том же RCF, что и для откидного головного ротора, но только в течение 10 минут. Это гарантирует, что слой PBMC отделен от плазмы (см. Рисунок 2B, C). В то время как наслоение крови на среду разделения градиента плотности требует центрифугирования тормозов, кровь в пробирках для подготовки мононуклеарных клеток может быть центрифугирована тормозами благодаря наличию в трубке гелевого барьера, обеспечивающего сохранение слоя ПБМЦ, отделенного от более плотных компонентов крови27,28.
По меньшей мере 4 мл высококачественной, неразбавленной плазмы получали из центрифугирования крови в пробирочном формате 8 мл, что можно было дополнительно уточнить для ее использования в специализированных анализах, таких как секвенирование ктДНК или метаболомические исследования29,30 (факультативные этапы 4.1.1-4.1.4). Количество изолированных PBMCs, размер гранул и гемолиз или загрязнение эритроцитов были другими проблемами, поступающими из клинических площадок и опыта анализа образцов. Количество клеток, полученных из 8 мл крови, варьировалось в зависимости от пациента и настроек заболевания, но в целом полученная гранула невелика по размеру и прозрачной/белой окраски(рисунок 3А,В). Из-за этих характеристик важно визуализировать гранулу на темном фоне, чтобы избежать ее случайного аспирации во время этапов промывки (2,5 и 3,3). Иногда гранулы могут иметь некоторую красную окраску из-за загрязнения эритроцитами(рисунок 3С),а это негативно сказывается на качестве препарата. Чтобы избежать потери небольших гранул, таких как показанные на рисунке 3,перенос гранулы PBMC в криовиал облегчается этапом 3.7, где гранула PBMC повторно суспендируется в 50 мкл PBS.
Типичный выход при использовании этих пробирок и крови здоровых людей колеблется от 7 до 21 х10 6 клеток на 8 мл, а восстановление клеток от 70 до 80%, как это наш опыт и как было ранее показано27,28. Это зависит как от количества отдельных ячеек, так и от оператора и сопоставимо с номерами ячеек и значениями восстановления клеток, полученными другими методами с использованием градиента плотности (включая системы, использующие трубки с разделительным барьером)15,27,28. Наглядным примером вариации количества ПБМК, выделенных этим методом, в зависимости от состояния заболевания является анализ маркеров ПБМК у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ). Количество клеток, извлеченных из 8 мл мононуклеарной клеточной препаратной трубки при применении этого протокола, варьировалось от 1,62х 10 4 до 1,99 х 109 в 45 образцах, полученных от 7 пациентов в исследовании NCT0332827331 (таблица 1). Родственным параметром является концентрация белка лизатов PBMC, полученных этим методом, и это зависит от количества выделенных клеток и эффективности экстракции белка. Гранулы клеток, лизированные в секции 6, были получены с буфером RIPA и ультразвуком (этап 6.6). Повторное суспендирование клеточных гранул в их одинаковом объеме буфера лизиса обычно приводит к диапазону концентраций от 3 до 10 мг/мл, и в данном конкретном примере концентрации лизата составляли 6,8, 8,3 и 8,6 мг/мл для 0, 0,2 и 7 Гр соответственно. Однако это подвергается высокой вариабельности при получении образцов из клинических центров, которые не были оптимально подготовлены, заболеванию пациента и наличию гемоглобина от загрязнения эритроцитами. Например, очень маленькие гранулы должны быть повторно суспендированы в объеме буфера лизиса, превышающем объем гранул клетки, чтобы можно было измерять как концентрацию белка, так и последующий анализ биомаркеров, что приводит к большему разбавленности образцов. В таком случае, если концентрация образца ниже 1 мг / мл, это может представлять проблему для выполнения анализов, таких как вестерн-блот из-за этого высокого коэффициента разбавления. Напротив, в ранее упомянутых образцах ХЛЛ объем лизисного буфера, добавленного для повторного суспендирования клеточных гранул, варьировался от 50 до 500 мкл, а концентрация белка охватывала от 1,62 до 19,77 мг/мл(таблица 1).
Когда в образцах присутствует загрязнение эритроцитами или гемолиз(рисунок 3C),концентрация белка лизата PBMC становится завышенным из-за включения гемоглобина из эритроцитов. Именно по этой причине следует проводить визуальный осмотр и аннотирование таких образцов, как описано в шаге 6.7 протокола. Загрузка образца в избытке может компенсировать наличие гемоглобина при выполнении анализа биомаркеров, поскольку контроль нагрузки включен в анализ. Могут быть реализованы другие, более количественные методы измерения гемолиза, такие как измерение поглощения при 414 нм32.
DDR был проанализирован в МПК, полученных по этому клиническому протоколу. Чтобы проиллюстрировать ситуацию, которая имитирует повреждающие ДНК клинические методы лечения, такие как лучевая терапия или химиотерапия, цельная кровь здоровых добровольцев была ex vivo подвергнута рентгеновскому излучению(рисунок 4A). Ионизирующее излучение (ИК), такое как рентгеновские лучи, вызывает различные типы повреждений ДНК, включая двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Распознавание повреждений ДНК этих поражений активирует PIKK, такие как ataxia-telangiectasia mutated (ATM), ATM и Rad3-related (ATR) и ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK), которые задействуют механизмы репарации ДНК, такие как гомологичная рекомбинация (HR) или негомологичная конечная присоединение (NHEJ). Активация АТМ при наличии ОЦБ происходит путем его включения в места повреждения комплексом MRN (MRE11-RAD50-NBS1), вызывая автофосфорилирование АТМ на нескольких остатках, включая Ser1981. В свою очередь, активированный ATM фосфорилирует компоненты комплекса MRN и других белков, таких как вариант гистина H2AX на Ser139 (где pSer139-H2AX также известен как γH2AX), чтобы способствовать структурным изменениям в хроматине, охватываемом DSB, что облегчает набор других факторов DDR33. НБМК реагируют на ионизирующее излучение, несмотря на их низкую скорость распространения, а методы масс-спектрометрии позволили количественно оценить регуляцию фосфорилированного Ser635 на RAD50 с помощью ATM. Это фосфорилирование снижается в присутствии ингибиторов ATM, и RAD50 pS635 был дополнительно подтвержден в качестве фармакодинамического биомаркера для клинического лечения ингибиторами ATM в опухолях иммуногистохимией8. Для оценки реакции МПК на радиацию кровь здоровых добровольцев подвергали различным ИК-дозам и собирали образцы после 1-часовой инкубации при 37 °C(рисунок 4A). С этой целью кровь переносили в пластиковые пробирки, чтобы избежать снижения выхода выделения ПБМК из-за высокой температуры (этап 6.2). Мы проанализировали, как atm был активирован не только путем просмотра ранее сообщенных RAD50 pS635, но и ATM pS1981 и γH2AX. В трех исследованных случаях увеличение этих постпереводных модификаций наблюдалось при более высоких дозах ИК(рисунок 4B). Интересно, что фосфорилирование ATM и RAD50 было существенным при низкой дозе 0,2 Гр, что говорит о том, что эти посттрансляционные модификации могут быть реально изучены как биомаркеры БП для лечения, включающего генерацию ДНК DSB с хорошим динамическим диапазоном, не только в образцах опухолей, но и в периферической крови. Это позволяет контролировать реакцию БП на лечение путем получения продольных образцов в ходе лечения. Время от забора крови до обработки образцов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы эти сигнальные каскады все еще были активны, поскольку задержки в обработке будут влиять на кинетику таких каскадов, и можно пропустить события фосфорилирования, используемые в качестве фосфомаркеров.
Рисунок 4: PBMCs, выделенные из облученной ex vivo крови в соответствии с настоящим клиническим протоколом, отображают биомаркеры для информирования о степени повреждения ДНК, вызванного лечением. (A)Схематический обзор протокола подготовки ПБМК и анализа ГДР при облучении цельной крови. *2 дополнительных шага центрифугирования, необходимых для анализа/метаболомики ctDNA. (B)Вестерн-блот, показывающий дозозависимую регуляцию фосфобиомаркеров ГДР в МПК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Образец | Количество PBMCs / 8 мл крови | Дополнительный объем буфера RIPA (мкл) | Конечная концентрация (мг/мл) |
| А.1 | 39100000 | 70 | 12.16 |
| А.2 | 97400000 | 100 | 4.54 |
| А.3 | 233000000 | 150 | 7.63 |
| А.4 | 316000000 | 150 | 16.87 |
| А.5 | 387000000 | 150 | 12.60 |
| А.6 | 459000000 | 150 | 12.71 |
| А.7 | 414000000 | 200 | 15.67 |
| А.8 | 253000000 | 150 | 14.56 |
| А.9 | 509000000 | 300 | 10.67 |
| В.1 | 15200000 | 70 | 2.96 |
| В.2 | 10500000 | 50 | 4.59 |
| В.3 | 13200000 | 50 | 3.99 |
| В.4 | 34800000 | 100 | 10.41 |
| В.5 | 1620000 | 70 | 7.11 |
| В.6 | 70200000 | 100 | 9.26 |
| В.7 | 65400000 | 100 | 12.10 |
| В.8 | 91100000 | 150 | 11.82 |
| С.1 | 6330000 | 70 | 4.04 |
| С.2 | 4400000 | 150 | 19.77 |
| С.3 | 68000000 | 100 | 8.96 |
| С.4 | 35100000 | 50 | 9.30 |
| С.5 | 35400000 | 70 | 10.55 |
| С.6 | 99200000 | 100 | 16.19 |
| Д.1 | 402000000 | 70 | 7.23 |
| Д.2 | 826000000 | 300 | 16.95 |
| Д.3 | 1990000000 | 300 | 14.87 |
| Д.4 | 1000000000 | 300 | 18.34 |
| Д.5 | 1160000000 | 400 | 16.13 |
| Д.6 | 806000000 | 400 | 19.40 |
| Е.1 | 302000000 | 300 | 13.86 |
| Е.2 | 990000000 | 500 | 19.04 |
| Е.3 | 1200000000 | 400 | 17.13 |
| Ф.1 | 4010000 | 50 | 1.62 |
| Ф.2 | 5170000 | 50 | 2.84 |
| Ф.3 | 2810000 | 50 | 3.69 |
| Ф.4 | 3700000 | 75 | 3.62 |
| Ф.5 | 3460000 | 70 | 4.03 |
| Ф.6 | 7060000 | 50 | 3.32 |
| Г.1 | 60700000 | 70 | 6.57 |
| Г.2 | 82100000 | 150 | 7.78 |
| Г.3 | 30500000 | 70 | 8.28 |
| Г.4 | 134000000 | 100 | 15.14 |
| Г.5 | 91900000 | 100 | 8.61 |
| Г.6 | 372000000 | 150 | 15.88 |
| Г.7 | 574000000 | 200 | 15.01 |
| Продольные образцы PBMC, соответствующие 7 пациентам | |||
Таблица 1: Количество клеток и концентрация белка гранул ПБМК у пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ). Данные, представленные в этой таблице, соответствуют 45 образцам PBMC от 7 пациентов с ХЛЛ, участвующих в исследовании NCT03328273, собранных в пробирках для подготовки мононуклеарных клеток. Это исходные данные, сгенерированные с использованием образцов из цитируемого исследования31.
Дополнительный файл: Альтернативные параметры протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Высококачественные препараты PBMCs и плазмы, которые могут быть надежно и воспроизводимо приготовлены в местах клинических испытаний, неоценимы для информирования периферических прогностических и фармакодинамических трансляционных биомаркеров конечных точек клинических испытаний. Здесь мы предоставили короткий, четкий протокол, который рассматривает типично проблемные шаги, которые до сих пор были уязвимы для ошибок выполнения в условиях клинических испытаний. Тем не менее, протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения конкретных требований, таких как временные ограничения в клинической площадке или тип последующих анализов (см. Дополнительный файл).
С этой целью мы показали, как изолировать как PBMCs, так и плазму из цельной крови с использованием пробирок для подготовки мононуклеарных клеток для получения замороженных гранул PBMC и замороженной плазмы, подходящей для различных последующих анализов. Мы обратили внимание на особенно важные этапы протокола, включающие центрифугирование и идентификацию слоя PBMC на этапе 2.5 и гранул PBMC на этапах 3.3 и 3.6. Исторически сложилось так, что клинические центры часто ошибались в установке центрифуги на правильные единицы (путая значение RCF или x g со значением RPM), задерживая обработку образцов крови, температуру и наличие больших объемов PBS над замороженными гранулами клеток. В большинстве роторов центрифуг ошибочное внесение значения x g в качестве настройки RPM приведет к значительному недоцентрифугированию с результатом плохо определенного или отсутствующего слоя PBMC и потенциальному непреднамеренному отбрасыванию PBMC во время этапов промывки из-за неэффективного гранулирования ячейки. Тем не менее, существует вероятность того, что слой PBMC не виден, несмотря на использование правильных настроек центрифугирования и адаптера ротора, если у пациента развилась лейкопения. Это состояние может повлиять на пациентов, включенных в онкологические испытания из-за химиотерапии или лучевой терапии, и его следует учитывать. Еще один критический момент, который был четко указан в протоколе, заключается в том, что образцы должны быть обработаны в течение 1-2 ч от забора крови, чтобы уменьшить возможность негативного влияния гемолиза на протокол. Кроме того, цель обработки образцов в течение первого часа забора крови снижает изменчивость ex vivo, что может оказать большое влияние на показания фармакокинетики и на биомаркеры, на которые влияет сохранение крови или активные сигнальные пути, такие как случай, показанный на рисунке 4. Задержки в обработке образцов также могут оказать пагубное влияние на жизнеспособность клеток, если клетки будут криоконсервироваться34. Другим фактором, который может повлиять как на выход, так и загрязнение эритроцитов, является температура хранения и центрифугирования, которую следует поддерживать при комнатной температуре (18-25 °C). Более низкие температуры увеличивают плотность среды градиента плотности, что приводит к более высокой степени загрязнения эритроцитов и гранулоцитов, поскольку эти клетки также не агрегируются. С другой стороны, более высокие температуры приводят к тому, что МПК попадают в ловушку между агрегированными эритроцитами, что снижает выход препаратана 15,27,28. И, наконец, крайне важно, чтобы в криовиальной грануле клетки присутствовало не более 50-100 мкл жидкости, так как это негативно влияет на концентрацию любых белковых лизатов, полученных при последующей переработке этих препаратов PBMC. Избыток жидкости приведет к чрезмерному размасливающим образцам, что приведет к лизатам с очень низкой концентрацией белка, не подходящим для анализа биомаркеров. Кроме того, будет нарушено сохранение любых постпереводных модификаций, а также значительно снизится эффективность лизиса.
Были выбраны пробирки для подготовки мононуклеарных клеток, поскольку они предлагают наиболее простой способ выделения как PBMCs, так и плазмы в одном заборе крови для клинических испытаний с отличной воспроизводимостью, по нашему опыту. Обработка крови не требует высококвалифицированных операторов, а использование одной трубки устраняет необходимость разбавления крови и ее переноса в другую пробирку, снижая риск опасности; сокращает протокол за счет выполнения этапов центрифугирования с включенными тормозами; и все реагенты находятся в пробирке, что снижает изменчивость. По нашему опыту, эти преимущества перевешивают более высокую стоимость этих трубок по сравнению с другими классическими методами, включающими только использование среды разделения градиента плотности27,28 (£ 410 за 60 единиц, в то время как лимфопрепная среда для 66 препаратов 50 мл составляет £ 215). Они доступны в двух типах антикоагулянтов, гепарине и цитрате, оба из которых сопоставимы при поддержании функциональности выделенных PBMCs35,поэтому выбор одного антикоагулянта над другим будет основываться на возможном влиянии гепарина или цитрата в последующих исследованиях биомаркеров. Хотя было показано, что трубки ЭДТА обеспечивают самый высокий выход изоляции PBMC по сравнению с гепарином или цитратом13,преимущество простоты использования манипуляции только с одной трубкой уравновешивает это соображение. Если цитокины будут проанализированы, антикоагулянты могут оказывать влияние на уровни, обнаруженные в плазме, следовательно, оба антикоагулянта должны быть протестированы перед выбором одного для клинического исследования36. Если плазма будет использоваться для метаболомных исследований, то использование гепарина в качестве антикоагулянта будетпредпочтительным 37. Таким образом, единственный вопрос, остающемся конечному пользователю или ученому-трансляционщику клинических испытаний, заключается в том, будут ли цитрат или гепарин более подходящими для их целей после оценки затрат.
Хотя преимущества использования пробирок для клеточного препарата многочисленны по сравнению с ограничениями, которые они представляют (более высокая стоимость и доступность ограниченного диапазона антикоагулянтов), основное ограничение использования МПК или плазмы для получения биомаркеров БП в клинических испытаниях, особенно в онкологии, может быть не связано с методом выделения. За исключением гематологических раковых заболеваний, где опухоль непосредственно отбирается из периферической крови, для других показаний рака плазма и МПК являются суррогатными тканями, которые не обязательно имитируют первичную опухоль. Периферическая ткань может не разделять геном и эпигеном с первичной опухолью, поэтому периферический анализ биомаркеров, зависящих от конкретной опухолевой мутации, в основном ограничивается анализом ctDNA (из плазмы) или CTC (путем последующей сортировки слоя PBMC). Кроме того, сигнальные каскады, приводящие к разрастанию опухоли или способствующие пролиферации опухоли, могут быть не такими активными в периферической крови. Эта проблема может быть преодолена путем применения подходов к обнаружению биомаркеров, нацеленных на кровь8, для выявления альтернативных биомаркеров или связи методов лечения ex vivo с выделением плазмы38 и препаратов PBMC26.
В текущем протоколе замороженные гранулы PBMC могут быть легко обработаны вне клинического центра с получением белковых лизатов, которые могут быть оценены с помощью методов вестерн-блоттинга или ИФА. Также были представлены альтернативные методы использования НБК для включения методов IHC (Дополнительный файл). Кроме того, мы также подробно описали возможность криоконсервирования PBMCs (см. Дополнительный файл)для мониторинга иммунных клеток, соответствующего применения в онкологии, с ингибиторами иммунных контрольных точек и АЦП, которые все чаще тестируются в клинических испытаниях. Оценка иммунных функций, таких как ADCC16 и иммунофенотипирование, являются приложениями, совместимыми с криоконсервируемыми PBMCs, выделенными из пробирок для подготовки мононуклеарных клеток15. Существует предостережение в отношении криоконсервации, поскольку она может способствовать понижению регуляции определенных поверхностных и внутренних маркеров и может ухудшить определенные функции клеток, однако криоконсервация PBMC является единственным возможным способом выполнения этих анализов из-за временных ограничений при обработке образцов из нескольких клинических объектов для обработки во внешних лабораториях14,15,и эти пагубные эффекты могут быть значительно преодолены хорошими методами оттаивания и периодами покоя39.
В заключение, протокол, представленный здесь, позволит надежно подготовить МПК и образцы плазмы в любом клиническом учреждении с общим оборудованием и материалами, чтобы трансляционные конечные точки из периферической крови могли быть надежно включены в глобальных клинических испытаниях.
Наконец, мы демонстрируем, как анализ лизатов PBMC может механистически информировать реакцию на повреждающие ДНК агенты, показывая дозозависимую постпереходную модификацию ключевых факторов DDR, которая может быть использована для формирования клинического развития. Перспективная реализация методов, которые являются более количественными, чем западное блоттинг (например, масс-спектрометрия40)и требуют меньшего количества входного материала (таких как капиллярное западное блоттирование и ИФА), поможет продвинуть эти доклинические результаты к более надежной, систематической оценке образцов пациентов PBMC.
Disclosures
Все авторы являются или были сотрудниками и акционерами компании «АстраЗенека». VM является сотрудником Acerta Pharma, владеет акциями AstraZeneca и Gilead Sciences.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов трансляционной медицины в AstraZeneca Oncology Research and Early Development за их отзывы о протоколе, особенно Хедли Карр, Тамми Йе и Натан Стэндифер за советы по подготовке плазмы к анализу ctDNA, по выделению PBMC и криоконсервации и иммунофенотипированию PBMC соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
| 15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
| 2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
| 20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
| 20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
| Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
| Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
| Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
| Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
| Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
| Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
| Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
| Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
| Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
| Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
| Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
| Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
| Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
| PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
| Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
| Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
| Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
| Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
| Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
| Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
| Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |
References
- Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
- Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254 (2016).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
- Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
- Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
- O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
- Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
- Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
- Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
- Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
- Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182 (2015).
- Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
- Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545 (2017).
- Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
- Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
- Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
- Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
- Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
- Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
- Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
- Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
- Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
- Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
- ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
- Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
- Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
- Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
- Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
- Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
- Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
- Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
- Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
- Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
- Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).
