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Bioengineering

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

유전코드 확장은 정의된 부위에서 담체 단백질에 바이오트호고날 기능군을 베어링하는 부자연스러운 아미노산의 도입을 위해 적용된다. 바이오트호고날 기능은 균질성 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 탄수화물 항원을 선별적으로 결합하는 데 더 많이 사용된다.

Abstract

유전 코드 확장은 부자연스러운 아미노산 (UAA)을 단백질에 도입하여 특성을 수정하거나 새로운 단백질 기능을 연구하거나 만들거나 단백질 컨쥬게이트에 액세스 할 수있는 강력한 도구입니다. 스톱 코돈 억제, 특히 앰버 코돈 억제는 정의된 위치에서 UAA를 유전적으로 도입하는 가장 인기있는 방법으로 부상했습니다. 본명에서 생물요르토곤 기능성 군을 수용하는 UAA를 함유하는 담체 단백질의 제조에 적용된다. 이 반응성 손잡이는 다음에 균일한 글리코콘주게이트 백신을 제공하기 위해 합성 올리고당카이라이드 햅텐을 구체적으로 효율적으로 이식하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 1:1 탄수화물 hapten/반송파 단백질 비율에서 글리코콘주게이트의 합성으로 제한되지만 수많은 바이오트호고날 기능성 군으로 만만치 않습니다. 글리코코콘주게이트 백신 균질성은 완전한 물리화학적 특성화를 보장하기 위한 중요한 기준이며, 이로 인해 점점 더 까다로운 약물 규제 기관의 권고, 고전적인 융합 전략에 의해 충족되지 않은 기준을 충족시다. 더욱이, 이 프로토콜은 실제 컨쥬게이트 백신의 구조를 미세하게 조정하여 구조-면역원성 관계를 해결하는 도구를 제공할 수 있게 한다.

Introduction

글리코콘주게이트 백신은 전염병의 예방 치료에 사용할 수 있는 백신 무기고의 필수 요소입니다. 그들은 젊은 유아를 포함하여 광범위한 연령 집단에서 안전하고, 잘 용납되고 능률적입니다. 그들은 수막구균, 폐렴구균 또는 혈우병 인플루엔자 형 b1과같은 캡슐화된 박테리아에 의한 감염에 대한 최적의 방어를 제공한다. 글리코코콘주게이트 백신은 담체 단백질에 공동으로 연결되는 이러한 표면 발현 다당류2를모방한 박테리아 또는 합성 올리고당류의 캡슐을 형성하는 정제된 세균다당류로 만들어집니다. 담체 단백질의 존재는 탄수화물 항원3에의해 표현된 항원 결정제에 대하여 지시된 보호적인 유머 면역 반응을 승진시키기 위하여 필수적이다 3. 탄수화물 항원의 신중한 선택 및 생산 외에도, 글리코콘주게이트 백신의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려진 특징은 담체 단백질의 성질, 융합 화학(사용되는 경우 링커의 성질 및 길이 포함), 또는 당캐라이드/단백질 비3이다. 명백하게, 사카라이드가 단백질에 접합되는 위치뿐만 아니라 연결점의 수는 면역원성에 관련이 있습니다. 현재까지, 이 두 매개 변수는 글리코콘주게이트의 준비가 주로 경험적으로 남아 있기 때문에 거의 연구되지 않았습니다. 그들의 합성은 일반적으로 담체 단백질 서열에 존재하는 리신 또는 아스파르트/글루타믹 산 측 사슬 잔류물의 아민 또는 카복실산 기능의 사용에 의존한다. 이것은 단일하지만 글리코콘주게이트의 이질적인 혼합물로 이어집니다.

단백질내 아미노산 잔류물의 반응성, 접근성 또는 분포에 재생하면 saccharide/protein 연결4의효과를 문서화하는 데 더 신뢰할 수 있는 보다 정의된 글리코콘주게이트가 발생합니다. 이러한 목표를 향한 한 걸음 앞으로 단백질 글리칸 커플링 기술, 세포 공장에서 제어글리코콘주게이트 백신의 생산을 허용하는 재조합 공정5,6. 그러나, 글리코실레이션은 전적으로 D/EXNYS/T 세쿤 내의 아스파라진 잔류물에서 일어난다(X는 20가지 천연 아미노산 중 하나임), 담체 단백질에 자연적으로 존재하지 않는다.

사이트 선택적 돌연변이 발생 및 특히 시스테인의 편입이 고도로 선택적 반응성을 악용하는 대안7,8로나타난다. 그들의 순서에 UAA를 통합하는 담체 단백질의 생산은 균일한 글리코콘주게이트 백신 준비를 위한 더 많은 융통성을 제공할 수 있습니다. 100개 이상의 UAA가 개발되어 다양한 단백질9,10에추가로 통합되었다. 그들 중 많은 사람들이 일반적으로 포스트 번역 수정을 수행하거나 생체 물리학 프로브(12 또는 약13)를 이식하는 데 사용되는 생물 ororthogonal 기능을 포함하지만 탄수화물 항원과의 추가 연상을위한 이상적인 핸들입니다. 성공적인 예는 세포 없는 단백질 합성을 사용하여 생명공학14에 의해 주장되었습니다15 그러나 이 전략에 따라 글리코콘주게이트 백신의 준비는 아직도 대중화되기를 기다립니다.

돌연변이 된 담체 단백질의 생산을 위한 생체 내 전략의 적용은 tRNA(도 1)16에 UAA의 전송을 구체적으로 촉매하는 특정 코돈, 코돈 및 아미노 아필 -tRNA 신디사이저 (aaRS)를 인식하는 tRNA를 포함하는 변형 된 번역 기계를 필요로한다( 도1) 16. pyrrolysine 앰버 스톱 코돈 억제는 UAA, 특히 propargyl-lysine (PrK)17을통합하는 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 후자는 아지도 기능성 탄수화물 햅텐과 반응하여 완전히 정의된 균일한 글리코코콘쥬게이트를 제공할 수 있습니다. 본 원고에서는 알킨 핸들을 운반하는 UAA인 propargyl-L-lysine을 합성하는 방법, 박테리아에서 번역하는 동안 표적 단백질에 통합하는 방법, 마지막으로 수정된 단백질과 클릭 화학을 사용하여 아지드 기능을 운반하는 햅텐 사이의 연상을 수행하는 방법을 설명합니다.

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Protocol

1. UAA의 합성 : propargyl-리신 (PrK)

  1. N α합성 -Boc-propargyl-리신18
    1. 500 mg의 Boc-L-Lys-OH(2.03 mmol)를 플라스크에 수성 1 M NaOH(5mL) 및 THF(5mL)를 혼합하여 블래스크에 넣고 플라스크에 실리콘 중격을 맞춥니다.
    2. 얼음 욕조에서 플라스크를 식힌 다음 교반하는 동안 미세한 고리를 사용하여 158 μL의 프로파일 클로로포메이트(1.62mmol)를 드롭와이즈(2-3분 동안)를 넣습니다.
    3. 반응 혼합물을 실온에 데우고 10 시간 동안 계속 저어줍니다.
    4. 디틸 에테르 50mL, 수성 1M 염산 50mL, 얼음 욕조에서 에틸 아세테이트 60mL의 냉각 솔루션을 식힙니다.
    5. 얼음 목욕에서 조잡한 반응 혼합물을 식히고 혼합물을 분리 깔때기에 붓습니다. 50mL의 다이틸 에테르로 혼합물을 추출한다. 유기 층을 폐기하십시오.
    6. 조심스럽게 분리 깔때기의 수성 상에 수성 1 M 염산을 추가합니다. 그런 다음 에틸 아세테이트 30mL를 사용하여 수성 층을 두 번 추출합니다. L2 Cl2-메탄올(9:1)을용출물로 사용하여 TLC에 의해유기상에서 N-Boc-propargyl-lysine의 존재를 확인합니다.
    7. MgSO4위에 결합된 유기 층을 건조시키고, 고체 위상을 걸러내고 회전 증발기에 압력을 줄인 후 여과를 농축한다.
    8. 유정 Nα-Boc-propargyl-lysine의 시료를 유정 클로로폼(CDCl3)에녹이고 1HNMR로 그 정체성을 제어합니다.
      주의: 추출은 압력이 축적될 수 있습니다. 압력 축적을 자주 해제합니다.
  2. 부자연스러운 아미노산 프로파질-L-리신의 합성 (PrK)
    1. Nα-Boc-propargyl-lysine을 원형 하단 플라스크에 중격이 장착된 다.
    2. Nα-Boc-propargyl-lysine를 용해시키기 위하여 아르곤 의 밑에 플라스크에 안수성 디클로로메탄 (CH2Cl2)의4mL를 추가합니다.
    3. 교반하는 동안 주사기를 사용하여 4mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 드롭방향으로 넣습니다.
    4. RT에서 1h에 대한 반응 혼합물을 저어주세요.
    5. 반응 혼합물을 감압 하에 농축합니다.
    6. 다이틸 에테르를 원유 잔류에 넣고 4°C에서 1h로 배양하여 PrK를 침전시합니다. 더 높은 규모로 작업할 때 PrK가 완전히 침전되지 않으면 삼중하여 침전시키고 필요한 경우 잠복 시간을 연장합니다.
    7. 프릿드 유리에 흰색 고체의 형태로 PrK를 필터링합니다.
    8. D2O에서 PrK의 알리쿼트를 녹입니다. 그런 다음 NMR 분석을 수행하여 ID와 순도를 제어합니다.
    9. 추가 사용을 위해, 100 mMM의 최종 농도에서 증류수에 부자연스러운 아미노산 PrK를 용해하고 -20 °C에서 1 mL 알리쿼트로 저장합니다.

2. PrK에 의해 변형 된 재조합 단백질의 생산

  1. 플라스미드 준비
    1. 표적 성숙한 폐렴구균 표면 접착제A(mPsaAA) 유전자(pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH)를 구성합니다. ET24d-mpPsaA-WT는 pET24d 플라스미드의 BamHI 및 XhoI 제한 부위 사이의 삽입을 복제하여 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 시퀀스를 따랐다. 이것은 단백질의 C 종자에서 그의6 태그를 소개합니다. 기존의 현장 지향 돌연변이 발생 기술을 사용하여 리신-32의 코돈을 호박 코돈(TAG)으로 교체한다.
    2. 메타노사르키나 미제이(MmPylRS)로부터 의 피롤리실-tRNA 합성제및 이전에 설명된19와같은 해당 tRNAPyr에 대한 유전자 코딩 유전자코딩유전자에 대한 코딩유전자의 2개의 사본을 포함하는 제2발현 플라스미드(pEVOL-MmPylRS)를 구성한다. UAA의 효율적인 통합을 위해 특별히 설계된 플라스미드 벡터 pEVOL을 사용합니다.
      참고: 자세한 플라스미드 정보는 보충 파일 1에설명되어 있습니다.
  2. 플라스미드를 표현 균주로 공동 변환
    1. 화학적으로 유능한 에체리치아 대장균 BL21(DE3)의 100μL 알리쿼트를 얼음 위에 5분 간 해동시다.
    2. 각 플라스미드(각 플라스미드의 50-100 ng)의 1μL을 세포에 넣고 얼음에 30분 동안 배양합니다.
    3. 42°C에서 42°C의 인큐베이터에서 해동된 유능한 셀로 1.5mL 마이크로튜브를 전송한 다음 2분 동안 얼음으로 다시 이동합니다.
    4. LB 배지의 900 μL을 추가하고 항생제 발현을 허용하기 위해 37°C에서 1시간 동안 흔들어서 배양합니다. 그런 다음 박테리아를 LB 한루에 카나마이신 25μg/mL, 클로람페니콜 30 μg/mL로 플레이트합니다. 37°C에서 하룻밤 사이에 박테리아의 성장을 허용하십시오.
  3. PrK로 변형된 단백질의 발현
    1. 항생제 (카나마이신의 25 μg /mL 및 클로람페니콜의 30 μg/mL)와 LB 매체의 5 mL에서 단일 공동 변형 식민지를 접종합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 흔들어 보시합니다.
    2. 1차 배양(5mL)을 항생제를 함유한 자동 유도 배지 500mL로 희석하고, L-아라비노스의 0.02%, 부자연스러운 아미노산 PrK의 1mMMM로 희석하여 24시간 동안 37°C에서 배양한다. wt 단백질을 함유하는 클론의 배양을 수행함으로써 프릭없이 배양하고 양성 대조를 이겨음으로써 음의 대조를 포함한다.
    3. 500mL 배양 배지 중에서 알리쿼트 5mL 및 원심분리기는 5,000 x g에서10분 동안. 상체를 버리고 펠릿을 -20 °C에서 동결하십시오. 나머지 495mL에서 5,000 x g에서10분 동안 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 상체를 버리고 펠릿을 -20 °C에서 동결하십시오.
  4. SDS-PAGE 및 서부 블롯 분석을 통해 5mL 배양 샘플에서 원유 세포 추출물 분석
    1. 5mL 셀 펠릿을 250 μL로 리시스 버퍼(50mM Na2HPO 4/NaH2PO4,150mM NaCl, pH 8, 5mM imidazole, 0.2 mM PMSF)로 재배치하여 1.5mL 마이크로튜브로 전송한다.
    2. 액체 질소의 튜브를 동결하여 세포를 lyse, 42 °C 목욕에 해동하고 30 s에 대한 고속으로 소용돌이. 이 단계를 3번 반복합니다.
    3. 원심분리기 샘플은 17,000 x g에서 10분 동안 세포 이물질을 제거합니다.
    4. 상체의 10 μL을 가지고 5 μL의 물과 5 μL의 적재 버퍼 (브로모페놀 블루, SDS, β-mercaptoethanol)를 추가합니다. 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열하고 SDS-PAGE 및 서부 블롯 분석을 수행합니다.
  5. 니켈-NTA 구슬을 이용한 중력 유동 벤치 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제
    1. 세포 펠릿(495mL 배양으로부터)을 20mL로 리시스 버퍼(50mM Na2HPO4/NaH2PO4,150mM NaCl, pH 8, 5mM imidazole, 0.2 mM PMSF)로 되돌리펜한다.
    2. DNase I(1 mg/mL)와 리소지메 500 μL(50 mg/mL)을 현탁액에 넣고 30분 동안 37°C에서 서스펜션을 배양하여 리시스를 허용합니다.
    3. 5 분 동안 세포를 초음파 처리 (5 s-5 s의 사이클, 진폭 50%) 그런 다음 30분 동안 20,000 x g에서 원심분리로 세포 이물질을 제거하고 0.45 μm 필터에 여과합니다.
    4. 서스펜션에 Ni-NTA 수지를 추가하고(세포 배양 500mL용 500 μL)를 넣고 4°C에서 1시간 동안 부드럽게 섞는다.
    5. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓고 언바운드 분수를 수집합니다.
    6. 수지 10mL의 세척 버퍼로 50m Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazole를 함유한 세척 버퍼로 세척하십시오. 수지 5mL(50m Na2HPO4/NaH2PO4,150mM NaCl, 20m mM imidazole)로 수지세척을 두 번째로 세척합니다. 세척 분획을 수집합니다.
    7. 용출 완충제 1mL(50mM Na2HPO4/NaH2PO4,150mM NaCl, 300 mM imidazole)로 태그된 단백질을 엘테. 이 단계를 4번 반복하고 모든 용출 분수를 수집합니다.
    8. 12% 아크릴아미드 젤로 SDS-PAGE의 7가지 정화 분획뿐만 아니라 원유 용액을 분석합니다.
    9. 순수히 그의 태그 단백질을 함유한 분획을 결합하고 투석막(컷오프 MW 6000-8000 Da)을 사용하여 하룻밤 사이에 TEV 프로테아제 버퍼(50m Tris-HCl, 0.5mM EDTA, pH 8)에 대해 투석합니다. mPsaA에 대한 37 360cm-1∙M-1의음어 멸종 계수와 34.14 kDa의 분자량으로 280 nm에서 단백질의 농도를 측정한다.

3. TEV 프로테아제 소화에 의한 히스티딘 태그 제거

  1. 단백질 샘플을 50mL 튜브로 수집하고 2 mg/mL 농도에서 최대 1mL까지 TEV 버퍼(50m Tris HCl, 0.5mM EDTA, pH 8)를 추가합니다.
    참고: 농도는 이전 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 우리가 테스트 한 단백질 농도는 전형적인 2-3 mg /mL 범위에 있습니다.
  2. TEV 프로테아제 100 μL을 추가하십시오(소화할 단백질 20μg에 10단위의 TEV 프로테아제 10단위를 함유한 1μL을 추가합니다).
  3. 0.1 M 디티오스리톨(DTT)의 50 μL을 추가합니다.
  4. TEV 버퍼(50m Tris HCl, 0.5mM EDTA, pH 8)를 최대 5mL로 완료합니다.
  5. 느린 흔들림으로 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    참고: 소화가 완료되지 않은 경우 TEV 프로테아제더를 더 추가하고, 더 오랜 시간 동안 또는 최대 30°C의 높은 온도에서 배양합니다.
  6. 소화단백질을 4°C에서 하룻밤 사이에 제거하고 인산염 완충액(50m MM Na2HPO 4/NaH2PO4,150mM NaCl, 150m MM NaCl, 5mm imidazole)을 사용하여 투석막(컷오프 6000-8000 Da)을 이용하여 밤새 EDTA를 제거한다.
  7. TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질을 제거하려면 Ni-NTA 구슬과 혼합을 배양하고 4°C에서 1시간 동안 부드럽게 섞습니다.
  8. 서스펜션을 폴리프로필렌 컬럼에 붓습니다. 언바운드 분획을 수집하고 5mL의 세척 버퍼로 컬럼을 세척(50mM Na2HPO4/NaH2PO4,150mM NaCl, 10mM imidazole)
    참고: 관심 있는 단백질은 언바운드 및 세척 분수에서 회복되어야 합니다.
  9. 열에 5mM ML의 용출 버퍼(50m MM Na2HPO 4/NaH2PO4,150mM NaCl, 300mM imidazole)를 추가하여 TEV 프로테아제와 소화되지 않은 단백질을 엘테우테한다. 280 nm및 SDS-PAGE 분석을 통해 단백질 함량의 분획을 확인하십시오.
  10. 소화되지 않은 단백질을 대조군으로 SDS PAGE에 소화된 샘플을 적재하여 소화효율을 확인합니다.
  11. 투석막(컷오프 6000-8000 Da)을 통해 하룻밤 사이에 4°C에서 1L의 클릭 버퍼(50mM Na2HPO4/NaH2PO4,pH8)에 대해 소화된 단백질을 투석하여 이미다졸을 제거하고 완충제교환, mPsaA의 mPsaA의 mPsaA(37 360cm-1∙M-1 및 MW 34.14 kDa)의 mm 소멸 계수 및 분자량으로 280 nm에서 단백질의 농도를 측정한다.

4. 클릭 화학에 대한 부자연스러운 아미노산 propargyl-lysine 접근성 및 기능의 평가

참고: 클릭 화학에 대한 Presolski 외20에 의해 설명된 프로토콜을 사용하여 6헥사클로로-플루오레세인 아지드로 MVPaA를 컨쥬게이트한다.

  1. 2mL 마이크로튜브에 57.8 μM의 농도에서 PrK 돌연변이 단백질의 432.5 μL을 복용하십시오.
    참고: 알키네의 최소 농도 2 μM은 허용됩니다. 단백질 농도가 낮으면 원심 농축기로 농축하거나 아지드/알킨 어어비를 증가시켜 반응의 균형을 선호한다.
  2. 5mM 6-헥사클로로-플루오레세인 아지드의 10μL을 추가한 다음 20mM에서 CuSO4 용액의 2.5 μL과 트리스(벤질트리아졸릴메틸)의 7.5μL(주용액 농도)의 프리믹스를 추가합니다.
    1. 수성 100mM 아미노구아니딘 염산염 25 μL을 추가합니다.
    2. 20 mg /mL의 25 μL을 추가하여 아스코바테 나트륨의 수성 용액을 현시대적으로 준비했습니다.
    3. 튜브를 닫고 여러 번 반전하여 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    4. 0.5 M EDTA의 50 μL을 추가하여 반응을 중지합니다.
    5. 반응 혼합물의 15 μL을 가지고 마이크로 튜브를 넣고, 적재 버퍼 (브로모페놀 블루, SDS, β-mercaptoethanol)의 5 μL을 추가, 5 분 동안 100 °C에서 혼합물을 가열 한 다음 12 % 아크릴아미드 젤로로드합니다. 이동 후 312 nm에서 UV 빛 아래 젤의 형광 회합을 시각화합니다.

5. 클릭 화학에 의해 아지도 기능성 탄수화물 항원 (Pn14TS-N3)와mpPsaA의 연상

  1. 커플링
    1. 57.8 μM에서 PrK 돌연변이 단백질의 432.5 μL을 2mL 마이크로튜브로 섭취하십시오.
    2. 물에 5mM Pn14TS-N 321의 10 μL을 추가한 다음 CuSO4 용액의 2.5 μL을 20mMM에, THPTA7.5 μL을 50mMMMM에 추가합니다.
      참고: Pn14TS-N3의합성, 연쇄상 구균 폐렴 혈청형 14 캡셀 폴리사카라이드를 모방한 테트라사카라이드, 참조 21에 기술되었다. 이론적으로, 아지드 기능을 함유하는 임의의 탄수화물 항원도 사용될 수 있다.
    3. 100mM 아미노구아니딘 염산염의 25 μL을 추가합니다.
    4. 20 mg /mL의 25 μL을 아스코바트 나트륨의 수성 용액을 익시적으로 준비했습니다.
    5. 튜브를 닫고, 여러 번 반전하여 혼합하고 2 시간 동안 RT에서 배양하십시오.
    6. 0.5 M EDTA의 50 μL을 추가하여 반응을 중지합니다.
    7. 15 μL의 샘플을 취하고 SDS-PAGE에서 분석하십시오.
  2. 글리코콘주게이트의 젤 여과 정제
    1. 글리코콘주게이트를 스테릭 배제 아가로즈 컬럼(15 x 600 침대 치수, 3,000-70,000 분수 범위)에 적용하여 글리코콘주게이트를 정화하여 100mM PBS 버퍼로 평형, pH 7.3은 280nm의 검출을 통해 0.8mL/min 의 흐름으로 평가된다.
    2. 글리코콘주게이트를 함유한 분획을 수집합니다.
      참고: 장기간 보관을 위해 글리코콘주게이트를 H2H의1L에 대해 2시간 동안 투석한 다음 4°C에서 투석막(절단 Mw 6000-8000 Da)을 사용한 다음 동결 건조하고 글리코콘주게이트를 -80°C에 보관합니다.

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Representative Results

이 프로젝트에서, 균일한 글리코콘주게이트 백신은 정의된부위(도 1)에서UAA를 도입하기 위한 호박스톱 코돈 억제 전략을 사용하여 제조하였다. 폐렴구균 표면 접착제 A는 담체 단백질 모이티로 선택되었다. 이 단백질은 염충균 폐렴22의모든 변종에 의해 높게 보존되고 표현된다. 그것은 고액 면역원성 및 이전에 폐렴구균 백신 제형21,23에서담체로서 사용된다. 개념 증명으로서, UAA propargyl-lysine 효율적으로 고고학 메타노사르키나 미제이의 야생 형 pyrlysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA 쌍에 의해 충전 조사되었다. propargyl-lysine는 시판되 게 가능하지만 두 개의 합성단계(그림 2)에서만 Boc-L-lysine로부터 유리하게 제조될 수 있다. 앰버 코돈은 pET24d 플라스미드에서 원하는 위치에서 생성되었다. 이 플라스미드는 프로파질-리신을 유능한 대장균 BL21(DE3) 균주로 통합하는 데 필요한 직교 도구를 포함하는 pEVOL 플라스미드(EMBL19)의종류 선물로 공동 변형되었다. 양성 동시 변형 클론은 25 μg/mL 카나마이신 과 30 μg/mL 클로람페니콜을 사용하여 선택되었다. 플라스미드 pEVOL은 원래 MmPylRS에 대한 코딩 유전자의 두 복사본을 포함하여 propargyl-lysine 잔류물을 통합합니다: 제1 사본은 구성 프로모터의 통제하에 있는 반면 다른 하나는 아라비노스의 존재하에서 유도할 수 없다. 그러나, 우리는 구성 프로모터의 통제 하에 MmPylRS 유전자가 억압되는 경우에 propargyl-lysine 통합의 극적인 감소를 주의했습니다.

propargyl-lysine는 PsaA의 N 종자 부근의 리신을 대체하기 위해 위치 32에서 도입되었습니다. 표면에 노출된 사이드 체인이 있는 잔류물은 추가 컨쥬게이션을 수행하기 위해 사실상 교환될 수 있습니다. 돌연변이 된 단백질은 C-종기에서 6-히스티딘 태그 서열을 포함하여 성숙한 형태 (mpPsaAK32PrK)로생산되었습니다. MPsaAK32PrK 생산의 효율은 항히스티딘 태그 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었으며, 성장이 UAA propargyl-lysine의 존재 또는 부재에서 수행되고 야생 형 mpPsa의 생산과 비교하여(그림 3). 시각화는 예상 분자량(Lanes 4, 도 3A 및3B)에서단백질 밴드를 밝혀냈습니다. 전체 길이 단백질의 존재는 강하게 MpK를 mpaA로 성공적으로 통합하는 것을 나타냅니다. 강도는, 그러나, 야생 형 의원에 대 한 관찰 보다 낮은 (차선 2, 그림 3A & 3B). 누출(즉, UAA의 통합 없이 전신 단백질의 생산) 및 번역 중 방출 인자 RF1에 의한 단백질의 조기 방출은 이 과정에서 자주 발생하는 두 가지 주요 단점이다. 한편으로는, 예상 분자량에서 어떤 밴드는 누출이 발생하지 않는다는 것을 의미하는 propargyl-lysine의 부재에서 시각화되지 않으며(차선 3, 도 3A&3B)및 차선 4에서 관찰된 밴드가 mpPsaAK32PrK에해당한다는 것을 간접적으로 확인하였다. 한편, 잘린 형태의 mpPsaA(도 3A의레인 4)에 대응할 수 있는 저분자량에서는 어떤 밴드도 볼 수 없다. mvpaAK32PrK는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 8 mg/L(야생형 단백질의 경우 12-20 mg/L에 비해) 및 프로파질-리신 잔류물의 통합이 마침내 대량 분광법(도4)에의해 확인되었다. 히스티딘 태그는 TEV 프로테아제(도4)를사용하여 프로테오리틱 골짜기 시 제거하였다. 이와 같이 수득된 의원의 안정성은 원형 이색증에 의해 평가되었으며, 이는 단백질의 구조가 리신(32)의 돌연변이에 의해 방해되지 않았다는 것을 보여주었다(데이터는 도시되지 않음).

mvpaAK32PrK를갖는, 클릭 화학에 대한 알키인의 반응성을 아지도 기능성 형광체를 사용하여 평가되고 합성 올리고당 항원 β-2-azidoe를 수렴하는 데 더 사용되었습니다. 틸 d-Galp-(1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS)(그림 5). 본 테트라사카라이드는 S. 폐렴형 14형과 관련이 있으며, 이전에는 상이한 컨쥬게이션 화학을 이용하여 MPaA에 공각되어 왔다8,21,24. 여기서 실험은 대조군으로 야생 형 mpaA에 비해 수행되었다. 히스티딘 태그는 TEV 프로테아제를 사용하여 프로테오리틱 골짜기에 처음 제거되었습니다. 소화된 의원K32PrK및 mpPsaA WT는 그 때 플루오로프로브(도6A)또는 Pn14TS(도6B)에컨쥬게이츠하였다. 반응은 SDS-PAGE에 의해 평가되었습니다. 차선 6과7(도 6B)사이의 샘플의 분자량이 작을수록 테트라사카라이드 Pn14TS와 성공적인 결합을 나타낸다. 마지막으로, 글리코콘주게이트는 겔 여과와 그 정체성에 의해 정제되었다 질량 분석법(도6C). 클릭화학에 의한 컨쥬게이션은 대부분의mvpK32PrK가 Pn14TS-N3과 공주되었다질량 분석 결과(도6C).

Figure 1
도 1: 직교 용실-tRNA 신디사이저/tRNA 쌍 및 TAG 코돈재할당(25)을이용하여 번역 중에 비례리신(PrK)을 mpPsaA로 편입한다. 번역 하는 동안, 내 인 성 신디사이저 아미노산과 해당 tRNAs 사이의 링크를 촉매. 이어서, 로드된 tRNA는 리보소말 기계에 의해 신합성 폴리펩티드를 생성하는 데 사용된다. 호박색 스톱 코돈 억제 전략에 따르면, 직교 아미노아틸-tRNA 신디사이저(aaRS)(본명 M. 미제이의피롤리실-tRNA 신디사이저)는 항코돈 코돈(TAGRNA)을 설계한 코그탄 tRNA에 UAA(이하 PrK)를 적재한다. 이러한 특정 인식은 표적 단백질에 대한 특정 부위에 UAA를 통합하는 것을 지시한다. 그림 왕 외에서 재현25. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 프로파질-리신 합성. (A)propargyl-lysine 합성의 단계. 삽입: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH 중급제의 보호 모니터링: 0.25mm 실리카 젤 플레이트의 얇은 층 크로마토그래피에 형광 표시기(GF254)가 함유되어 있으며 황산/에탄올(1.5:95 v/v)의 바닐라린을 적재하여 시각화합니다. 용출: CH2Cl2/MeOH (9:1), 왼쪽 차선: Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0.90), 오른쪽 차선: 원유 프로파질-리신,(Rf 0.38). D2O에기록된 프로파질-리신의 400MHz 1H(B) 및 13C NMR 스펙트럼(C)을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 조세포 샘플 분석. (A)SDS-PAGE 분석 및(B)조세포 샘플에 대한 서부 얼룩 분석. 레인 1: 스테인드 단백질 마커; 레인 2: 야생형 의 조세포 추출물; 레인 3: PrK의 부재에서 자란 mpPsaAK32TAG의 조세포 추출물; 레인 4: PrK. 조건의 존재에서 자란 mpPsaAK32TAG의 조세포 추출: 12% 아크릴아미드 젤, 100 V, 2 h. SDS-PAGE에서 실행 하 여 쿠마시 블루에 의해 염색; 웨스턴 블롯은 알렉사플루오르680과 결합 된 항 히스티딘 태그 항체 및 이차 항체를 사용하여 밝혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 히스티딘 태그 제거 및 질량 분광분석. (A)SDS 페이지 분석. 레인 1: 스테인드 단백질 마커; 레인 2: 조세포 추출물; 레인 3: 언바운드 분수; 레인 4: 10m m imidazole와 함께 분수 세척; 레인 5: 20mm 이미다졸로 분수; 조건: 12% 아크릴아미드 젤에서 실행 100 V 에 대 한 2 시간, 쿠마시 블루에 의해 염색; (B)MALDI-TOF-MS 스펙트럼 (상단) mpPsaA WT, 이론MW 33 103 다, 발견 33 106 다 와 (하단) mvpA K32PrK, 이론 33 184 다, 발견 33 192 다. 발견된 질량은 예상 마진 오류 내에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 클릭 화학에 의한 컨쥬게이션 전략의 회로도 표현. azide를 베어링 단일 테트라사카라이드는 특히 2.0 Å26의해상도와 함께 1PSZ PDB 파일을 기반으로 한 1PSZ PDB 파일에 대한 보완적인 바이오트호고날 알키네 그룹에 결합된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 히스티딘 태그 소화 및 (A) 형광 -N3 및 (B) Pn14TS와 함께 mpaA의 연상. (A)SDS 페이지 레인 1-3: WT 의원; 레인 4-6: 국회의원K32PrK; (B)레인 1: 얼룩이 없는 단백질 마커; 레인 2-4: WT 의원; 레인 5-7: 국회의원K32PrK. 2 μg 단백질 샘플/레인, 12% 아크릴아미드, 100 V, 2 시간; (C)Pn14TS-mPsaAK32PrK 이론MW 34 091 다의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼, 발견 34 088 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현장 지향 돌연변이 발생은 글리코콘주게이트 백신7,8,14를준비하는 것을 목표로 거의 사용되지 않는 단백질의 정의된 위치에 특정 아미노산을 통합하는 간단한 전략이다. 20가지 천연 아미노산 접근법에 기초한 고전적인 돌연변이 발생은 번역 기계의 수정이 필요하지 않으므로 매우 효율적입니다. 시스테인 돌연변이는 일반적으로 두단계(예를 들어,탈수알라아닌 중간체로 수정한 후, 번역 후 돌연변이 발생)라는 전략인27,28의고유한 티올 반응성을 더 탐구하기 위해 표적화된다. 유전 코드 확장은 아마도 훨씬 더 매력적이고 유연하기 때문에 다양한 기능9,10을가진 광범위한 UAA를 직접 통합 할 수 있습니다. 몇몇 UAA는 단백질29안에 동시에 통합될 수 있는 동안, 돌연변이의 수는 일반적으로 더 제한됩니다. 본 원에서 관련 앰버 스톱 코돈 전략을 적용하여 담체 단백질에 단일 프로파질-리신을 도입했습니다. 초기 아미노산의 사이드체인이 표면 노출, X선 결정구조 또는 실리코 모델링에서 쉽게 결정된 기준을 제공하는 임의의 위치에서 통합이 이루어질 수 있다. 더욱이, 프로파르질-리신에 국한되지 않고 나중에 들어오는 탄수화물 항원과 직교 aaRS/tRNA 쌍이 존재하는 생체 교호곤 기능으로 기능화된 모든 UAA로 확장될 수 있다.

전략의 단점 중 하나는 측면 제품으로 앰버 스톱 코돈을 읽을 때 펩디딜 사이드 체인의 방출로 인해 잘린 단백질의 생산이 가능하다는 것입니다. 우리가 여기에 어떤 잘린 형태를 관찰하지 않은 경우에도 (아마 매우 작은 크기 때문에 박테리아에 의해 저하), 히스티딘 태그는 불순물에서 예상 전체 길이 돌연변이 단백질의 정제를 용이하게하고 잘린 단백질에서 눈에 띄게 (본질적으로 그의 티딘 태그 순서를 표현하지 않습니다)에서 단백질의 C 종기에 추가되었습니다. 이는 UAA 편입이 단백질 C-terminus 근처에서 수행되는 경우 젤 여과와 같은 대체 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제를 시도할 수 없기 때문에 필수적일 수 있다.

대부분의 응용 프로그램에서 히스티딘 태그를 제거하는 것은 필수가 아닙니다. 그러나, 면역계통의 일환으로 글리코콘주게이트 백신의 설계에 대해 유용할 수 있다. 이러한 개념 증명을 위해, 소화 후 담체 단백질에 5개의 아미노산을 남기는 TEV 프로테아제에 의해 특별히 갈라진 아미노산 길이 서열을 삽입했습니다.

프로파질-리신의 알키네와 대표적인 합성 올리고당칼리드 Pn14TS 사이의 컨쥬게이션 단계는 프리솔스키 외에서 보고된 클릭 화학 프로토콜에 따라 상호 보완적인 아지드를 베어링하여 수행되었다.20 필요한 경우 반응 시간을 늘리거나 알키네, 아지드 및 구리 반응제 및 시약 사이의 비율을 수정하여 반응의 완성에 쉽게 도달 할 수 있습니다. 구리 염은 과도한 EDTA를 가진 처리에 의해 제거되고 황색 배제 크로마토그래피에 의하여 짧은 정화가 선행됩니다.

본 작업에서 기재된 기술로 얻은 글리코콘주게이트는 마우스를 예방접종하는 데 사용될 수 있다. 이러한 완전히 정의되고 쉽게 변조된 글리코콘주게이트를 손에 들고 있으면 햅텐/단백질 담체 연결이 면역 반응에 미치는 영향을 평가하는 귀중한 도구를 제공한다8. hapten/단백질 비율을 증가시키는 것은 종종 짧은 haptens30을사용할 때 향상된 항 햅텐 유머 반응과 상관관계가 있기 때문에, 하나는 여러 haptens와 함께 컨쥬게이트를 테스트하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 그러나 여러 UAA의 통합은 RF1 활성으로 인해 단백질 생산의 수율을 감소시키는 경향이 단백질에 UAA의 통합으로 프로토콜의 일부 조정이 필요합니다.

결정적으로, 이 방법은 그들의 physico-화학 특성화 및 추가 탄수화물 항원/담체 연결-면역원성 관계 연구 결과를 용이하게 하는 균일한 글리코콘주게이트 백신에 접근하는 강력한 공구입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

E.C. 감사라 레지온 지불 드 라 루아르 (Pari Scientifique 프로그램 "BioSynProt"), 특히 T.V.에 박사 펠로우십에서 재정 지원을 인정합니다. 우리는 또한 그의 소중한 기술 적 조언에 대한 박사 로버트 B. 쿼스트 (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, 툴루즈, 프랑스)를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

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References

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Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

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