Summary
Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.
Abstract
Inzicht in de interacties tussen genen, het milieu en het beheer in de landbouwpraktijk zou een nauwkeurigere voorspelling en beheer van productopbrengst en kwaliteit mogelijk kunnen maken. Metabolomics gegevens biedt een uitlezing van deze interacties op een bepaald moment in de tijd en is informatief van de biochemische status van een organisme. Verder kunnen individuele metabolieten of panelen van metabolieten worden gebruikt als nauwkeurige biomarkers voor opbrengst- en kwaliteitsvoorspelling en -beheer. De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen die een kans voor een biochemisch inzicht in fysiologische eigenschappen en biomarker ontdekking bieden bevatten. Om dit te benutten, een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers is om zo veel van de fysischchemische diversiteit mogelijk vast te leggen binnen een enkele analyse. Hier presenteren we een vloeibare chromatografie-massaspectrometrie gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van veldgekweekte tarwekorrel. De methode maakt gebruik van de vloeibare chromatograaf quaternary oplosmiddel manager om een derde mobiele fase te introduceren en combineert een traditionele omgekeerde fase gradiënt met een lipide-vatbaar gradiënt. Korrelvoorbereiding, metabolietextractie, instrumentele analyse en workflows voor gegevensverwerking worden in detail beschreven. Goede massanauwkeurigheid en signaalreproduceerbaarheid werden waargenomen en de methode leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionisatiemodus op. Verder werden aanzienlijk verschillende metaboliet- en lipidefunctiesignalen tussen tarwevariëteiten bepaald.
Introduction
Inzicht in de interacties tussen genen, omgeving en management praktijken in de landbouw zou kunnen toestaan dat een nauwkeurigere voorspelling en beheer van de opbrengst en kwaliteit van het product. Plantenmetabolieten worden beïnvloed door factoren zoals het genoom, het milieu (klimaat, regenval, enz.), en in een landbouwomgeving, de manier waarop gewassen worden beheerd (d.w.z. toepassing van kunstmest, fungicide enz.). In tegenstelling tot het genoom wordt het metabolome beïnvloed door al deze factoren en daarom biedt metabolomics gegevens een biochemische vingerafdruk van deze interacties op een bepaald moment. Er zijn meestal een van de twee doelen voor een metabolomics-gebaseerde studie: ten eerste om een dieper begrip van de biochemie van het organisme te bereiken en te helpen verklaren het mechanisme van de reactie op verstoring (abiotische of biotische stress) in relatie tot de fysiologie; en ten tweede, om biomarkers te associëren met de verstoring in studie. In beide gevallen is het resultaat van het hebben van deze kennis een nauwkeurigere managementstrategie om het doel van een betere rendementsgrootte en kwaliteit te bereiken.
De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden1 van kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen bevatten. Momenteel kunnen geen metabolomics platforms (voornamelijk massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie) het hele metabolome in één analyse vastleggen. Het ontwikkelen van dergelijke technieken (monstervoorbereiding, metabolietextractie en -analyse), die een zo groot mogelijke dekking van het metabolome binnen één enkele analytische run bieden, is een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers. Eerdere ongerichte metabolomics analyses van tarwekorrel hebben gegevens gecombineerd van meerdere chromatografische scheidingen en acquisitiepolariteiten en/of instrumentatie voor een grotere metabolomedekking. Hiervoor moeten echter monsters voor elke modaliteit afzonderlijk worden bereid en verworven. Beleggia et al.2 hebben bijvoorbeeld een gederivatiseerde steekproef voorbereid voor de GC-MS-analyse van polaire analyten naast de GC-MS-analyse van de niet-polaire analyten. Das et al.3 gebruikten zowel GC- als LC-MS-methoden om de dekking in hun analyses te verbeteren; Deze aanpak vereist echter over het algemeen afzonderlijke monsterpreparaten zoals hierboven beschreven, evenals twee onafhankelijke analytische platforms. Eerdere analyses van tarwekorrel met GC-MS2,3,4 en LC-MS3,5 platforms hebben 50 tot 412 (55 geïdentificeerde) functies opgeleverd voor GC-MS, 409 voor gecombineerde GC-MS en LC-MS en enkele duizenden voor een LC-MS lipidomics analyse5. Door ten minste twee modi te combineren in één analyse, kan een uitgebreide metabolomedekking worden gehandhaafd, waardoor de rijkdom van biologische interpretatie toeneemt en tegelijkertijd besparingen in zowel tijd als kosten worden bespaard.
Om de efficiënte scheiding van een breed scala van lipidesoorten door omgekeerde-fase chromatografie mogelijk te maken, gebruiken moderne lipidomics methodologieën vaak een hoog percentage isopropanol in het elutionoplosmiddel6, die beakeerbaarheid aan lipideklassen verstrekt die anders door de chromatografie zouden kunnen worden onopgelost. Voor een efficiënte lipidescheiding is de beginmobiele fase ook veel hoger in organische samenstelling7 dan de typische omgekeerde fasechromatografische methoden, die andere klassen van moleculen overwegen. De hoge organische samenstelling aan het begin van de gradiënt maakt deze methoden minder geschikt voor vele andere klassen van moleculen. Met name, omgekeerde fase vloeibare chromatografie maakt gebruik van een binaire oplosmiddel gradiënt, te beginnen met een meestal waterige samenstelling en toenemende organische inhoud als de elutie sterkte van de chromatografie wordt verhoogd. Hiertoe probeerden we de twee benaderingen te combineren om de scheiding van zowel lipide- als niet-lipideklassen van metabolieten binnen één analyse te bereiken.
Hier presenteren we een chromatografische methode die een derde mobiele fase gebruikt en een gecombineerde traditionele omgekeerde fase en lipidomics-geschikte chromatografiemethode mogelijk maakt met behulp van een enkele monstervoorbereiding en één analytische kolom. We hebben veel van de kwaliteitscontrolemaatregelen en gegevensfilterstappen genomen die eerder zijn geïmplementeerd in voornamelijk klinische metabolomics studies. Deze benaderingen zijn nuttig bij het bepalen van robuuste kenmerken met een hoge technische reproduceerbaarheid en biologische relevantie en sluiten degenen uit die niet aan deze criteria voldoen. We beschrijven bijvoorbeeld herhaalde analyse van het samengevoegde QC-monster8, QC-correctie9,gegevensfiltering9,10 en toerekening van ontbrekende functies11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze methode is geschikt voor 30 monsters (ongeveer 150 zaden per monster). Drie biologische replica's van tien verschillende veldgekweekte tarwevariëteiten werden hier gebruikt.
1. Bereiding van granen
- Monsters (volle granen) ophalen uit -80 °C opslag.
OPMERKING: Het bevriezen van zaden wordt kort na de oogst aanbevolen als monsters worden verzameld van meerdere seizoenen. Dit minimaliseert eventuele veranderingen in de metabolietconcentratie die kunnen optreden na verschillende perioden van opslag. Om dit te doen, breng zaden naar een 15 mL plastic centrifuge buis (ongeveer 300 zaden zal de buis vullen) en dek af met aluminiumfolie. Doorboor de folie twee-drie keer met behulp van een pin en vries droog de volle korrels 's nachts (ongeveer 24 uur). Monsters kunnen in dit stadium worden teruggegeven aan de vrieskist -80 °C of de volgende stap kan worden uitgevoerd. - Maal de zaden met behulp van een laboratorium blender voor twee runs op hoge modus voor 20 s.
OPMERKING: De blender die voor dit protocol wordt gebruikt, vereist minimaal ongeveer 150 zaden om de blender tot bladhoogte te vullen en een relatief homogeen gemalen graanmonster te geven. - Haal de blender van de basis en tik op de zijkant van de blender om grof gemalen graan naar het oppervlak van het monster te brengen. Grof materiaal kan worden weggegooid of opgeslagen.
- Breng poederachtig fijn gemalen materiaal van de blender over naar een 2 mL plastic microcentrifugebuis.
LET OP: Was de blender met gedeïoniseerd water en spoel met LC-MS-grade MeOH tussen de monsters. Zorg ervoor dat de blender volledig droog is voordat u doorgaat naar het volgende monster. - Breng fijngemalen graanmonsters terug naar de vriezer of ga door naar de volgende stap (metabolietextractie).
2. Bereiding van extractiemiddel
OPMERKING: Bereid extractieoplosmiddel voor op dezelfde dag als het uitvoeren van de extracties.
- Bereid ten minste 2 mL van 1 mg/mL van elke norm. Gebruik acetonitril (ACN) om 2-aminoanthracene, miconazool en d6-transcinmineuszuur voor te bereiden. Gebruik water om 13C6-sorbitol voor te bereiden.
- Neem 2 mL van elke 1 mg/mL standaard en voeg toe aan een 100 mL volumetrische kolf.
- Vul de volumetrische kolf aan de lijn met acetonitril. Zorg ervoor dat 100 mL acetonitril 20 μg/mL van elk van de interne normen bevat: 2-aminoanthracene, miconazool, 13C6-sorbitol, d6-transcinmineuszuur.
3. Metabolietextractie
- Weeg 200 mg fijngemalen graan in een microcentrifugebuis van 2 mL.
- Voeg 500 μL extractieoplosmiddel toe aan 200 mg fijngemalen graanmonster.
- Meng met behulp van een homogenisator voor 2 runs van 20 s bij 6.500 rpm.
- Centrifugebij 4 °C gedurende 5 min bij 16.100 x g.
- Breng de supernatant over op een 2 mL plastic buis.
- Herhaal deze procedure van stappen 3.1 tot 3,5 twee maal meer om een totaal supernatant volume van ongeveer 1,5 mL te geven.
- Vortex om de supernatant te mengen.
- Breng een gelijk volume (55 μL) van elk extract over op een afzonderlijke buis van 2 mL om een gepoold korrelextractmonster te maken.
- Breng een aliquot van 50 μL van het extract over op een glazen flacon.
OPMERKING: Extracten kunnen op dit punt worden bevroren (-80 °C) of doorgaan naar de volgende stap en doorgaan tot de LC-MS-analyse.
4. Voorbereiding van oplossingen voor LC-MS-analyse
LET OP: Voor geconcentreerd zuur, voeg altijd zuur toe aan water / oplosmiddel.
- Bereid 50 mL ammonium formate stock oplossing voor 50 mL. Weeg 3.153 g ammoniumformate en breng over op een volumekolf van 50 mL. Vul volumetrische kolf aan de lijn met LC-MS rang H2O.
- Bereid 1 L van de mobiele fase A bestaande uit 10 mM ammoniumformate, 0,1% mierenzuur. Voeg hiervoor ongeveer 500 mL LC-MS-kwaliteit water toe aan een 1 L volumetrische kolf. Voeg 10 mL ammoniumformatebouillon en 1 mL mierenzuur toe. Vul volumetrische kolf aan de lijn met LC-MS grade H2O. Breng over op een 1 L fles en sonicate gedurende 15 min op ontgassen.
- Bereid 1 L van mobiele fase B bestaande uit 10 mM ammoniumformate in 79:20:1 acetonitril:isopropyl alcohol:water, 0,1% formic acid ratio. Voeg 200 mL isopropanol toe aan een 1 L volumetrische kolf. Voeg 10 mL ammoniumformatebouillon en 1 mL mierenzuur toe. Vul volumetrische kolf aan de lijn met acetonitril. Breng over op een 1 L fles en sonicate voor 15 min op ontgassen.
OPMERKING: Verdun de 1 M ammoniumformate in de isopropylalcohol (IPA) voordat u de ACN toevoegt. Ammoniumformate is onoplosbaar in CAN. - Bereid 1 L van mobiele fase C bestaande uit 10 mM ammoniumformate in de verhouding van 89:10:1 isopropyl alcohol:acetonitril:water. Voeg hiervoor ongeveer 500 mL isopropanol, 10 mL ammoniumformatebouillon en 100 mL acetonitril toe aan een 1 L volumetrische kolf. Vul aan de lijn met isopropanol. Breng over op een 1 L fles en sonicate voor 15 min op ontgassen.
- Bereiding van LC-MS systeemwasmiddelen
- Vervang de pompkopwasoplossing door een verse oplossing. Gebruik 50% methanol, 10% isopropyl alcohol of andere zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Bereid sterke en zwakke naaldwasoplossingen voor het wassen van de injectievloeistoffen vóór en na monsterinjectie. Voeg voor de sterke wasbeurt gelijke volumes ACN en IPA toe. Voor de zwakke wasbeurt, bereiden een oplossing van 10% ACN (die ongeveer 500 mL en 1 L van elk van de sterke en zwakke wasbeurten respectievelijk voor dit protocol en het aantal monsters) in afzonderlijke flessen.
- Stel de naaldwasvolumes in op respectievelijk 600 μL en 1800 μL voor de sterke en zwakke wasbeurten.
5. Voorbereiding van monsters voor lc-ms-analyse
- Volgens de fabrikanten standaard werkprocedure voor de bereiding van 400 ng/μL leucine enkephalin, pipet 7.5 mL water in de 12 mL leucine-enkephalin flacon met 3 mg leucine-enkephalin. Bevries bij -80 °C in 50 μL aliquots.
- Bereid 100 mL van 5% ACN met 200 ng/mL leucine-enkephalin (50 μL van 400 ng/μL leucine enkephalin). Bereid je voor op dezelfde dag als LC-MS-analyse.
- Voeg 950 μL van 5% acetonitril met de injectiestandaard leucine-enkephalin toe aan het 50 μL monster aliquot dat vanaf stap 3 is bereid.
- Vortex om het voorbereide monster te mengen.
6. LC-MS-installatie
OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving van de installatie van de instrument- en aanschafmethode wordt beschreven in de gebruikershandleiding van de fabrikant. Een algemene gids en de details die specifiek zijn voor dit protocol worden hieronder beschreven. De volgende stappen kunnen op elk moment worden voltooid voordat de gegevens worden verkrijgt.
- Open een LC-MS hardwareprofiel.
- Stel de chromatografische methode in zoals beschreven in tabel 1. Zorg ervoor dat het LC-systeem is uitgerust met een quaternary oplosmiddel manager om dit verloop in te stellen.
OPMERKING: IPA is een stroperig oplosmiddel. Het moet worden ingevoerd bij een lage stroomsnelheid en een voldoende evenwichtstijd moet worden gebruikt voordat de samenstelling wordt verhoogd tot 98,0%. Deze stappen voorkomen dat het LC-systeem te veel onder druk komt te staan en te stoppen. - Stel de massaspectrometer acquisitie methoden voor elk van de positieve en negatieve ToF-MS modi over de m / z bereik 50-1.300.
OPMERKING: Het instrument dat voor het hier gepresenteerde werk wordt gebruikt, vereist dat positieve en negatieve methoden worden gekalibreerd en individueel worden uitgevoerd (d.w.z. polariteitsswitching binnen een methode is niet mogelijk). - Als de LC-column nieuw is, moet je de kolom op basis van de aanbeveling van de fabrikant weer geven.
OPMERKING: De volgende stappen moeten direct voor het verkrijgen van gegevens worden voltooid. - Kalibreer de massaspectrometer in een 'MS only'-hardwareprofiel volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voltooi deze stap voorafgaand aan elke overnamewijze, zodat het systeem zich in elke bepaalde modaliteit heeft gestabiliseerd vóór kalibratie.
- Verwijder en spoel het LC-fluidics-systeem met behulp van LC-MS-grade oplosmiddelen, waaronder mobiele fase- en wasoplosmiddelen.
- Equilibrate het LC-systeem met behulp van de LC-methode startomstandigheden, ervoor te zorgen dat kolomdruk is gestabiliseerd.
- Injecteer natriumformate (0,5 mM in 90% IPA) aan het begin van de monstersequentie (hieronder beschreven) om de kalibratie van het instrument te controleren.
- Stel de instrumentensequentietabel zo in dat oplosmiddelen en voorbereidende (extractie)spaties eerst worden geanalyseerd; gevolgd door gepoolde QC-monsters (6-10) voor systeemconditionering; vervolgens wordt de gerandomiseerde steekproeflijst met QC-monsters regelmatig (bijvoorbeeld elke vijfde injectie) uitgevoerd als technische replicaties. Voer twee QC-monsters uit aan het einde van de reeks.
OPMERKING: Het is handig om de datum- en injectie-/overnamevolgorde op te nemen in de voorbeeldbestandsnaam en de voorbeeld-ID. Bijvoorbeeld: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological repliceren. Zorg ervoor dat de LC-kolomdruk stabiel is en dat de LC is aangesloten op de MS voordat u op start drukt.
7. Gegevensverwerking
OPMERKING: Een algemene werkstroom voor gegevensverwerking wordt gepresenteerd in figuur 1.
- Controleer de gegevenskwaliteit (interne standaardmassanauwkeurigheid (berekening hieronder) en signaalreproduceerbaarheid) terwijl de reeks wordt uitgevoerd. Om de reproduceerbaarheid van het signaal te controleren, moet visuele inspectie van bedekte spectra volstaan.
OPMERKING: Massafout (ppm) = ((Theoretische massa – gemeten massa) / theoretische massa) x 106 - Genereer een uitgelijnde piekintensiteitsmatrix met monsters x interne standaarden (uitgelijnd op bewaartijd en m/z-waarden).
- Open de gegevensverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen). Klik onder Start > Openenop Gegevens. Navigeer naar de juiste bestandslocatie en open alle gegevensbestanden.
- Selecteer Kwantificering onder Start > Volgorde > Verwerkingstypede optie Kwantificering in het vervolgkeuzemenu.
- Klik onder Start > Methode > Quanop Kalibratiecomponenten. Vul elk veld in met behulp van de gegevens in tabel 2. Klik op OK.
- Vul in het linkerdeelvenster in de kolommen naast de gegevensbestanden het voorbeeldtype in door met de rechtermuisknop op de cel te klikken en Onbekendte selecteren. Vul het niveau in als n/a.
- Selecteer Onder Start > Verwerkingde optie Reeks. Kies een locatie om de reeks op te slaan en klik op Proces.
- Selecteer Onder Start > Resultatende optie Quan. Selecteer in de Quan-viewer De optie Uitvoer naar matrixanalyzer. Quan
- Klik in de viewer Matrix Analyzer Results op Exporteren naar csv. Sla het bestand op als een spreadsheetbestand.
- Bereken in spreadsheetsoftware de gemiddelde, standaarddeviatie en relatieve standaarddeviatie van de intensiteit (piekgebied) van elke interne standaard.
- Een uitgelijnde piekintensiteitsmatrix genereren met monsters x ongerichte functies (uitgelijnd op bewaartijd en m/z-waarden).
- Open de detectieanalysesoftware voor kleine moleculen (zie Tabel met materialen)en selecteer Bestand > Nieuw om een nieuw experiment te maken. Geef het experiment een naam en kies de locatie om experimentbestanden op te slaan en op te slaan. Klik op Volgende.
- Selecteer het gebruikte type instrument (hoge resolutie massaspectrometer), gegevensformaat (profiel) en de polariteit (positief of negatief). Klik op Volgende. Selecteer alle adducts die beschikbaar zijn in de bibliotheek en bewerk naar behoefte adduct library. Klik op Experiment maken. Er wordt een nieuwe pagina geladen waar de rest van de gegevensverwerking wordt voortgezet/uitgevoerd.
- Gegevensbestanden importeren. Selecteer de bestandsindeling en selecteer importeren. Blader naar de gegevenslocatie en selecteer de te importeren gegevensbestanden. De voortgang wordt weergegeven voor elk bestand in het linkerdeelvenster van de pagina.
- Zodra gegevensbestanden zijn geïmporteerd, selecteert u Automatische verwerking starten. Kies een methode voor het selecteren van een uitlijningsverwijzing. Laat de software alle runs beoordelen op geschiktheid, geef een lijst met geschikte monsters (d.w.z. QC-monsters) of kies de referentie die het meest geschikt is, d.w.z. een mid-sequence QC-monster. Selecteer Ja, lijn mijn runs automatisch uit > Volgende.
- Selecteer Volgende op de ontwerppagina van het experiment (dit kan later worden ingesteld).
- Selecteer Piekpicking uitvoeren en stel parameters in. Selecteer onder het tabblad Piekkieslimieten de optie Absolute ionintensiteit en voer 100in . Selecteer een minimumpiekbreedte toepassen en voer 0,01 min in. Selecteer OK > Voltooien. Wanneer de verwerking is voltooid, selecteert u Sluiten.
OPMERKING: Piekkieslimieten kunnen zo nodig worden geoptimaliseerd voor andere gegevensbestandstypen. - Selecteer onderinvan het scherm sectie voltooid . Bekijk uitgelijnde uitvoeringen en controleer of elk voorbeeld is uitgelijnd op de verwijzing. De uitlijningscores waren >90% voor de hier gepresenteerde gegevens. Selecteer Sectie voltooien.
- Selecteer op de volgende pagina tussen onderwerpontwerp. Noem het ontwerp. Selecteer De uitvoeringen handmatig groeperen en ontwerp maken. Voeg voorwaarde toe, klik op Voorwaarde 1 en geef de groep de juiste naam. Klik op Sectie voltooien.
OPMERKING: Blijf voorwaarden toevoegen om statistieken binnen de software te gebruiken. Omdat we de software alleen gebruikten om een ongerichte matrix te genereren, gebruikten we één voorwaarde met het label 'all'. - Selecteer op de volgende pagina Sectie voltooien. Niet opnieuw doen piek plukken.
- Bekijk de deconvolutie en klik op Sectie voltooien.
- Ga naar Bestand > Samengestelde metingen exporteren. Schakel de optie op eigenschappen die niet gewenst zijn in de uitvoer uit. Klik op OK. Kies een locatie om het CSV-bestand op te slaan. Klik op Opslaan > Bestand openen > Map openen of Sluiten.
- Filter de gegevens met behulp van de extractiespaties om artefacten (spreadsheetsoftware) te verwijderen.
- Bereken voor elke RT x m/z-functie in een nieuwe kolom de gemiddelde respons in extractiespaties.
- Bereken voor elke RT x m/z-functie de gemiddelde respons in alle andere monsters (inclusief QC-monsters).
- Bereken de % piekintensiteit van blanco's in monsters (gemiddelde respons in blanco/gemiddelde respons in monsters x 100).
- Sorteer de kolom percentagebijdrage van laagste naar hoogste waarden.
- Verwijder functies met een intensiteitsbijdrage van >5% uit spaties.
- Filter ontbrekende waarden en corrigeer de functiesignalen voor signalen in samengevoegde QC-monsters.
- Open de gegevensverwerkingssoftware (Tabel met materialen). Klik op de knop Matrixanalyzer weergeven. Klik op de knop Gegevensbestand openen.
- Navigeer naar de csv-bestandslocatie met de piekintensiteit van RT x m/z-functies voor elk voorbeeld (ongerichte matrix). Selecteer Openen.
- Vul onder het tabblad QC-monsters elke parameter in zoals vereist. Gebruik voor de hier beschreven gegevensset QC category=QC, ignore categories=empty, impute type=none, coverage threshold=80, scale using=no scaling, uncheck log transform, correct using=smoothing spline, smoothing=0.25.
- Klik rechtsboven in het matrixpaneel op de QC-correctievan de afspeelknop.
- Nadat de correctie rechtsboven in het matrixpaneel is uitgevoerd, klikt u op Resultaten opslaan. Navigeer naar een geschikte locatie en sla het CSV-resultatenbestand op.
- Filter de gegevens om functies te verwijderen die >20% RSD in QC-samples hebben.
- Schik de gegevens zodat de voorbeelden zich in rijen bevinden en de functies zich in kolommen bevinden.
- Bereken in een nieuwe kolom de gemiddelde piekintensiteit voor QC-monsters.
- Bereken in een nieuwe kolom de standaarddeviatie van de piekintensiteit voor QC-monsters.
- Bereken de relatieve standaarddeviatie van de piekintensiteit voor QC-monsters: (QC-standaarddeviatie/QC-gemiddelde) x 100.
- Sorteer de functies van de laagste tot hoogste %RSD en verwijder functies met een QC RSD >20%.
- Filter de gegevens om functies te verwijderen met lageRSD-sample/RSD QC-ratio's (bijvoorbeeld <1).QC
- Bereken in een nieuwe kolom de gemiddelde piekintensiteit voor monsters.
- Bereken in een nieuwe kolom de standaarddeviatie van de piekintensiteit voor monsters.
- Bereken de relatieve standaarddeviatie van de piekintensiteit van de monsters: (gemiddelde monsternormdeviatie/monster) x 100.
- Verdeel in een nieuwe kolom de samples RSD door de QC RSD.
- Sorteer de waarden(RSD-sample/RSD QC-ratio's) van hoog naar laag en verwijder functies met een ratio <1.QC
- Impute ontbrekende waarden (verschillende methoden online beschikbaar).
- De spreadsheet zo opmaken dat de voorbeelden zich in rijen bevinden en de functies zich in kolommen bevinden. De eerste kolom moet de bestandsnaam van de monsters zijn. Maak een extra kolom naast de bestandsnamen en voer de voorbeeldgroepen in. In dit geval werden de monsters gegroepeerd op variëteit.
- Sla de spreadsheet op als een CSV-bestand.
- Ga naar de startpagina voor de webgebaseerde analytische pijplijn voor metabolomica met hoge doorvoer (zie Tabel met materialen)en klik op Klik hier om te beginnen.
- Klik op Statistische analyse. Selecteer onder Uw gegevens uploadende optie Gegevenstype: tabel met piekintensiteit, Opmaak: Voorbeelden in rijen (ongekoppeld) en kies bestand.
- Navigeer naar CSV-bestand, selecteer Openen en selecteer Verzenden.
- Selecteer op de volgende pagina Schatting ontbrekende waarde. Schakel stap 1 uit (dit werd uitgevoerd in AnalyzerPro XD). Kies in stap 2 een methode om ontbrekende waarden te schatten.
LET OP: Voor de hier gepresenteerde gegevens is gekozen - 'schatting van ontbrekende waarden' met 'KNN'. - In dit stadium kan de gegevensmatrix worden gedownload (selecteer Downloaden in het linkerdeelvenster van de webpagina) of ga verder met het uitvoeren van verdere statistische analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De plant metabolome wordt beïnvloed door een combinatie van zijn genoom en omgeving, en bovendien in een agrarische omgeving, het gewas management regime. We tonen aan dat genetische verschillen tussen tarwerassen kunnen worden waargenomen op het metabolietniveau, hier, met meer dan 500 gemeten verbindingen die significant verschillende concentraties tussen rassen in het graan alleen laten zien. Goede massanauwkeurigheid (<10 ppm fout) en signaalreproduceerbaarheid (<20% RSD) van interne normen (figuur 2) werden waargenomen voor zowel negatieve als positieve ionisatiemodi (Tabel 3). De beschreven monstervoorbereiding en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde analyse leverde >900 deconvoluted eigenschappen in negatieve ionisatiewijze en >1300 deconvoluted eigenschappen in positieve ionisatiewijze. Voorbereidende blanco's(figuur 3)werden opgenomen om te bepalen of de monsterbereidings- en analysemethoden artefactkenmerken introduceerden, en dus alle niet-biologische invloeden die uit de gegevensmatrix werden geëlimineerd. Het bleek dat 421 signalen in de negatieve modus en 835 signalen in de positieve modus signaalintensiteiten hadden gelijk aan of groter dan 5% van de gemiddelde signaalintensiteit in graanmonsters. Deze functies werden verwijderd en na verdere gegevens filtering stappen (stap 7 en figuur 1),de negatieve modus terug 483 functies en de positieve modus terug 523 functies, de vorming van de metabole momentopname. De methode was succesvol in het detecteren van functies, die aanzienlijk verschillende intensiteiten tussen tarwevariëteiten(figuur 4)hadden met >500 belangrijke functies in beide ionisatiemodi. In de negatieve ionisatiemodus waren de meeste belangrijke functies in de omgekeerde fasegradiënt en in de positieve ionisatiemodus waren de meeste belangrijke kenmerken in de lipidegradiënt(figuur 4).
Figuur 1: De werkstroom die in deze analyse wordt gebruikt voor gegevenscontrole, verwerking en filtering. Stap 1 wordt uitgevoerd met behulp van de data-acquisitie/kijksoftware op het instrument, zodat 'on-the-fly' beoordelingen kunnen worden uitgevoerd. Dit omvat het berekenen van de massafout (ppm) van interne normen en het overleggen van interne standaardpieken voor visuele beoordeling van de reproduceerbaarheid van gegevens. Stap 2-7 beschrijft de gegevensverwerkingsprocedure die in het protocol is beschreven, stap 7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Geëxtraheerde ionchromatogrammen. Geëxtraheerde ionchromatogrammen van 13C6-sorbitol (donkerblauw), leucine-enkephalin (roze), d6-trans-cinnamic acid (orange), 2-aminoanthracene (groen) en miconazool (lichtblauw) interne standaarden in positieve (boven) en negatieve (bodem) elektrospray ionisatie (ESI) modi. De interne standaardretentietijden en -intensiteiten worden weergegeven. ESI + en ESI - Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Totale ionenchromatogram (TIC) overlay van voorbereidende blanks met negatieve modus (roze) en positieve modus (blauw) acquisities. Een interne standaard, miconazool, wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Totale ionchromatogram (TIC) overlay, met negatieve modus (roze) en positieve modus (blauw) acquisities en het aantal functies aanzienlijk verschillend tussen tarwe ras over de chromatografische gradiënt. In de negatieve modus werd het grootste aantal belangrijke functies gevonden toen de samenstelling van mobiele fase B hoog was. In positieve modus werd het grootste aantal belangrijke functies gevonden toen de samenstelling van mobiele fase C hoog was. Een interne standaard, miconazool, wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Segment | Tijd | Debiet | %A | %B | %C | Curve |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Eerste | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabel 1: Liquid chromatografie getimed programma van mobiele fase composities.
| Parameter | Interne standaard | ||||
| 13. C6-sorbitol | Leucine-enkephalin | d6-transcinemisch zuur | 2-amino-anthracene | Miconazool Miconazool | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Massatolerantie (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Bewaartijd | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Tijdvenster voor bewaartijd | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Detectietype | Hoogste | Hoogste | Hoogste | Hoogste | Hoogste |
| Antwoordtype | Gebied | Gebied | Gebied | Gebied | Gebied |
| Gebiedsdrempel | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Breedtedrempel | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Hoogtedrempel | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Signaal-ruisverhouding | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Smoothing | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabel 2: Piekdetectieparameters voor interne standaarden in positieve (en negatieve) acquisitiemodi.
| Massanauwkeurigheid (ppm) | %RSD Vóór QC correctie | %RSD na QC correctie | ||
| Negatieve modus | 13. C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-transcinmineuszuur | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucine-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Positieve modus | 13. C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucine-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-transcinmineuszuur | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazool Miconazool | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabel 3: Monster(n=30) interne standaardmassanauwkeurigheid (ppm) en signaalreproduceerbaarheid vóór en na QC-correctie, uitgedrukt als relatieve standaarddeviatie (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een LC-MS-gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van tarwekorrel. De methode combineert vier acquisitiemodi (omgekeerde fase en lipide-ontvankelijke omgekeerde fase met positieve en negatieve ionisatie) in twee modi door een derde mobiele fase in het omgekeerde faseverloop te introduceren. De gecombineerde aanpak leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionpolariteit op, waarvan ongeveer de helft aanzienlijk verschilt in intensiteit tussen tarwevariëteiten. Significante veranderingen in de metabolietconcentratie in de korrel van verschillende tarwevariëteiten duiden op veranderde biochemie, die kan worden gekoppeld aan ziekteresistentie, stresstolerantie en andere fenotypische eigenschappen die belangrijk zijn voor de graankwaliteit en -opbrengst. Bijvoorbeeld, metabolomics benaderingen zijn gebruikt om nieuwe afweermechanismen te beschrijven12 en de rol van metabolieten in droogte tolerantievoorstellen 13. Toekomstige toepassingen van dit protocol kunnen biochemische profielen van bepaalde variëteiten verder koppelen aan genetische eigenschappen die wenselijk zijn voor bepaalde omgevingen en beheerspraktijken. Dit zou op zijn beurt de productie van optimale graankwaliteit en opbrengst voor geselecteerde genotypen mogelijk maken.
Het opnemen van interne standaarden is van cruciaal belang voor dit protocol om de gebruiker in staat te stellen veranderingen in signaal, retentietijdverschuivingen en als indicatoren van massanauwkeurigheid te bepalen. Veranderingen in het signaal kunnen bijvoorbeeld duiden op suboptimale extractie, injectie (inclusief vloeistofsysteemblokkades) of detectorprestaties. Retentietijdverschuivingen kunnen duiden op slechte pompprestaties, ongepaste mobiele fasegradiëntequilibratie of dat de lc-kolomstationaire fase is verslechterd. Slechte massanauwkeurigheid kan wijzen op een afgedreven kalibratie en dat het systeem opnieuw moet worden gekalibreerd. In alle bovenstaande gevallen moet het systeem worden gestopt en moet het juiste onderhoud/vervanging van onderdelen worden uitgevoerd. We hebben vier normen opgenomen in de extractieoplossing die wordt gebruikt om graan te bereiden en een standaard in het uiteindelijke monster dat vóór de injectie is toegevoegd. Er werd voor gezorgd dat de normen vatbaar waren voor elke ionisatiemodus en een reeks bewaartijden dekten; We erkennen echter dat dit scala aan standaarden kan worden verbeterd met de opname van een gelabelde lipidestandaard. Het is aangetoond dat tarwekorrel honderden triacylglycerolen (TAGs)5bevat, die elk een geschikte aanvulling op dit protocol zouden zijn. De opname van voorbereidende blanks en gepoolde QC-monsters8 zijn ook kritieke stappen in dit protocol. Duizenden ionenkenmerken worden gedetecteerd in ongerichte massaspectrometriemethoden en het is belangrijk om functies uit te sluiten die alleen in blanco monsters aanwezig zijn en ook die welke niet reproducibly worden gedetecteerd (d.w.z. hoge %RSD) gedurende de gehele analyse.
Hoewel de huidige methode veel tijd en middelen bespaart, kunnen, als er geen quaternaire oplosmiddelbeheerder beschikbaar is, standaard omgekeerde fase- en lipidemethoden worden gebruikt om dezelfde resultaten te bereiken. Het winningsvolume dat in dit protocol wordt gebruikt, zou volstaan voor de analyse van aanvullende acquisitiemodi. Dit protocol beschrijft een acetonitrilextractie. Hoewel succesvol, zal een alternatief extractiemiddel, of een combinatie van oplosmiddelen, een andere metabolietdekking bieden, die op zijn beurt meer eigenschappen kan leveren en/of een betere (of mindere) extractie-efficiëntie van sommige verbindingen kan geven. We hebben niet geprobeerd de metabolietidentiteit vast te stellen van de statistisch significante metingen die in dit protocol zijn opgelost; er zijn echter massaspectrale databases voor plantenmetabolieten en lipiden beschikbaar en ontwikkelen5,14,15. Om de metabolieten te identificeren, zouden naast volledige scangegevens ook tandemmassaspectra (MS/MS) moeten worden verzameld. Deze kunnen tijdens de eerste run worden verzameld met behulp van gepoolde monsters en een passende MS/MS-methode of op gereserveerd extract (opgeslagen bij -80 °C) zodra metabolieten van belang zijn vastgesteld. We zagen grote plooiveranderingen van verbindingen tussen variëteiten, dus we raden aan om beide en in tweede instantie te doen, met behulp van een ras waarvan bekend is dat het een hoge concentratie van de verbinding van belang bevat om het ms/MS-spectrum van de hoogste kwaliteit te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen het West-Australische Premier's Agriculture and Food Fellowship-programma (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) en de Premier's Fellow, professor Simon Cook (Centre for Digitale landbouw, Curtin University en Murdoch University). Veldproeven en graanmonsterverzameling werden ondersteund door de regering van het Western Australia's Royalties for Regions-programma. We erkennen Grantley Stainer en Robert French voor hun bijdragen aan veldproeven. De door NCRIS gefinancierde Bioplatforms Australië wordt erkend voor de financiering van apparatuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
