Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو التعامل مباشرة مستقبلات منطقة tegmental البطني لدراسة مساهمتها في إطلاق الدوبامين تحت الثانوي.
Abstract
الدوبامين التدريجي (DA) الافراج عن منطقة البطنية (VTA) إلى نواة accumbens يلعب دورا محوريا في معالجة المكافأة وتعزيز التعلم. فهم كيف يمكن للمدخلات العصبية المتنوعة في VTA التحكم phasic الافراج عن DA توفير صورة أفضل للدوائر التي تتحكم في معالجة مكافأة وتعزيز التعلم. هنا، ونحن نصف الطريقة التي تجمع بين ضخ القنية داخل VTA من ناهضات الدوائية والخصوم مع التحفيز أثار الافراج عن DA التدريجي (ضخ المشتركة والتحفيز، أو CIS) كما تقاس في الجسم الحي سريع المسح الضوئي قياس فولتامتري دوري (FSCV). باستخدام CIS-FSCV في الفئران المخدرة ، يمكن استحضار استجابة DA التدريجية عن طريق تحفيز VTA كهربائيا مع قطب ثنائي القطب مزود بعلب أثناء التسجيل في نواة accumbens الأساسية. يمكن غرس ناهضات أو مضادات دوائية مباشرة في موقع التحفيز للتحقيق في أدوار مستقبلات VTA محددة في قيادة إطلاق DA التدريجي. فائدة رئيسية من CIS-FSCV هو أن وظيفة مستقبلات VTA يمكن دراستها في الجسم الحي، بناء على الدراسات المختبرية.
Introduction
الدوبامين التدريجي (DA) الإفراج من منطقة tegmental البطني (VTA) إلى نواة accumbens (NAc) يلعب دورا حيويا في السلوكيات المتعلقة بالمكافأة. VTA DA الخلايا العصبية التحول من إطلاق النار منشط مثل (3-8 هرتز) لاطلاق النار انفجار مثل (>14 هرتز)1، والتي تنتج الافراج عن DA phasic في NAc. وVTA يعبر عن مجموعة متنوعة من مستقبلات somatodendritic التي هي في وضع جيد للسيطرة على التحول من منشط لانفجار اطلاق النار2,3,4,5. تحديد أي من هذه المستقبلات، ومدخلات كل منها، والسيطرة على الافراج عن DA phasic تعميق فهمنا لكيفية تنظيم الدوائر ذات الصلة مكافأة. الغرض من المنهجية الموصوفة هنا ، والجمع بين التسريب والتحفيز مع قياس فولتامتري دوري سريع المسح الضوئي (CIS-FSCV) ، هو تقييم سريع وقوي لوظائف مستقبلات VTA في قيادة إطلاق DA التدريجي.
مصطلح ضخ المشتركة والتحفيز (رابطة الدول المستقلة) يشير إلى التلاعب الدوائي المستقبلات على مجموعة من الخلايا العصبية (هنا VTA) وتحفيز تلك الخلايا العصبية لدراسة وظيفة المستقبلات. في الفئران المخدرة، ونحن تحفيز كهربائيا VTA لاستحضار إشارة DA تدريجي كبير (1-2 ميكرومتر) في النواة NAc، كما تقاس بسرعة المسح الضوئي قياس فولتامتري دوري (FSCV). يمكن استخدام ضخ الأدوية الدوائية (أي ناهضات المستقبلات / الخصوم) في موقع التحفيز لقياس وظيفة مستقبلات VTA من خلال مراقبة التغيير اللاحق في إطلاق DA المرحلي. FSCV هو نهج الكهروكيميائية التي تتمتع كل من المكانية العالية (50-100 ميكرومتر) والزمنية (10 هرتز) القرار، ومناسبة تماما لقياس مكافأة ذات الصلة، والأحداث DA phasic6،7. هذا القرار هو أدق من غيرها في القياسات الكيميائية العصبية في الجسم الحي، مثل غسيل الكلى الدقيق. وهكذا, معا, CIS-FSCV هو مناسبة تماما لتقييم VTA مستقبلات تنظيم إطلاق الدوبامين phasic.
طريقة واحدة شائعة للتحقيق في وظيفة مستقبلات VTA باستخدام مزيج من النهج الكهربية التي تعالج كيف تغير تلك المستقبلات معدل إطلاق الخلايا العصبية1،8. هذه الدراسات هي قيمة للغاية في فهم ما هي المستقبلات التي تشارك في قيادة DA اطلاق النار عند التنشيط. ومع ذلك، يمكن أن تشير هذه الدراسات فقط إلى ما يمكن أن يحدث في المصب في محطة المحور (أي إطلاق ناقل عصبي). CIS-FSCV يبني على هذه الدراسات الكهربية من خلال الإجابة على كيفية إخراج VTA انفجار إطلاق النار، والإفراج عن DA phasic، وينظم من قبل المستقبلات الموجودة على dendrites VTA وأجسام الخلايا. وهكذا، فإن CIS-FSCV مناسبة تماما للبناء على دراسات الفيزيولوجيا الكهربية هذه. على سبيل المثال، يمكن تنشيط مستقبلات النيكوتينية تحفز انفجار إطلاق النار في VTA9، و CIS-FSCV في الفئران تخدير استخدمت لإظهار أن مستقبلات أستيل النيكوتين (nAChR) التنشيط في VTA تسيطر أيضا على الافراج عن DA phasic في NAc10،11.
كما يدرس الفحص الميكانيكي لتنظيم DA التدريجي عادة باستخدام مستحضرات الشرائح جنبا إلى جنب مع تطبيق حمام من الأدوية. هذه الدراسات غالبا ما تركز على تنظيم presynaptic للافراج عن DA phasic من محطات الدوبامين, كما غالبا ما تتم إزالة أجسام الخلايا منشريحة 12. هذه الاستعدادات هي قيمة لدراسة آثار مستقبلات presynaptic على محطات الدوبامين, في حين CIS-FSCV هو أكثر ملاءمة لدراسة آثار مستقبلات سوماتوديندريتيك على الخلايا العصبية الدوبامين, فضلا عن المدخلات presynaptic إلى VTA. هذا التمييز مهم, لأن تنشيط مستقبلات سوماتوديندريتيك في VTA قد يكون لها تأثير مختلف عن تنشيط مستقبلات NAc presynaptic. في الواقع, منع الدوبامين nAChRs presynaptic في NAc يمكن رفع إطلاق الدوبامين phasic خلال انفجار اطلاقالنار 13, في حين أن العكس هو الصحيح في VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV هو نهج مثالي لدراسة قدرة مستقبلات VTA على تنظيم إطلاق DA التدريجي. الأهم من ذلك، يمكن تنفيذ هذا النهج في الفئران سليمة، إما تخدير أو تتحرك بحرية. هذا النهج هو مناسبة للدراسات الحادة, لدراسة وظيفة مستقبلات في حالته خط الأساس10,14 فضلا عن الدراسات طويلة الأجل التي يمكن تقييم التغيرات الوظيفية في مستقبلات بعد التعرض للدواء أو التلاعب السلوكي11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام المختبر ووافقت عليها كل من كلية إليزابيث تاون واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ييل (IACUC). هذا البروتوكول خاص بإعداد الفئران المخدرة لاستخدام CIS-FSCV.
1. الاستعدادات السابقة للجراحة
- إعداد محلول القطب الكهربائي
- لجعل حل الردم القطب، وإعداد حل من خلات البوتاسيوم 4 M مع 140 M M كلوريد البوتاسيوم16.
- إعداد القطب الكهربائي
- باستخدام شفط الفراغ، أدخل ألياف الكربون T-650 (قطرها 7 ميكرومتر) في الشعيرات الدموية الزجاجية البوروسيليكات (الطول = 100 مم، القطر = 1.0 مم، القطر الداخلي = 0.5 مم).
- بمجرد وضع ألياف الكربون داخل الشعيرات الدموية الزجاجية ، ضع الشعيرات الدموية الزجاجية في سحب قطب عمودي ، مع عنصر الحرارة تقريبا في منتصف الشعرية. تعيين سخان إلى 55 مع المغناطيس إيقاف.
- بعد سحب الشعرية، ارفع حامل الشعرية العلوي بعناية بحيث لا يكون طرف القطب محاطا بعنصر التدفئة.
- باستخدام مقص حاد، وقطع ألياف الكربون التي لا تزال تربط قطعتين من الشعرية. وهذا سيؤدي إلى اثنين من الألياف الكربونية microelectrodes منفصلة.
- تحت المجهر الخفيف، وقطع بعناية ألياف الكربون المكشوفة مع مشرط حاد، بحيث تمتد ألياف الكربون ما يقرب من 75-100 ميكرومتر بعد نهاية الزجاج.
- باستخدام المجهر الخفيف، تأكد من خلو القطب الكهربائي من الشقوق على طول الشعرية. تأكد أيضا من أن الختم ، حيث تخرج ألياف الكربون من الشعيرات الدموية ، يصعب ملاحظته وخاليا من الشقوق.
ملاحظة: سيساعد الختم الجيد على تقليل الضوضاء أثناء التسجيلات. انظر الدراسات المنشورة17،18،19 لبروتوكول أكثر تفصيلا.
- تصنيع قطب مرجعي
- لحام دبوس الذهب إلى سلك الفضة 5 سم.
- إرفاق الأنود إلى مشبك ورق معدني أو موصل آخر، الكاثود إلى دبوس، وتطبيق الجهد (~ 2 V) في حين يتم غمر مشبك الورق والأسلاك الفضية في 0.1 M HCl.
- وقف الجهد مرة واحدة طلاء أبيض (AgCl) يظهر على السلك الفضي.
- إعداد القطب الكهربائي للزرع
- لحام دبوس الذهب إلى سلك معزول رقيقة (~ 10 سم في الطول، قطرها <0.50 ملم).
- إزالة ~ 5 سم من العزل من السلك المقابل لدبابيس الذهب.
- ملء القطب حوالي منتصف الطريق مع حل القطب.
- أدخل سلك معزول في القطب الكهربائي.
ملاحظة: يجب أن يتصل السلك بألياف الكربون داخل القطب الكهربائي.
2. زرع الأقطاب الكهربائية
- إعطاء الكبار والذكور والجرذان سبراغ داولي (250-450 غرام) حقنة داخل الصفاق (1.5 غرام / كغ أو 1 مل / كجم حجم) من 0.5 غرام / مل يوريثان حل في المالحة المعقمة. ابدأ بجرعة أولية من الإوريثان 1.0−1.2 غرام/كغ. إذا كان الحيوان لا يزال يستجيب لاختبار التحفيز الضار (قرصة الذيل) بعد 20 دقيقة من إعطاء يوريثان، قم بإعطاء جرعة إضافية 0.3−0.5 غرام/كجم يوريثان لجرعة إجمالية 1.5 غرام/كغ.
ملاحظة: لإعداد محلول يوريثان 0.5 غرام/مل، أضف 10 غ من الإوريثان إلى 10 غ (~10 مل) من المحلول الملحي. يوريثان مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بعناية. يوريثان هو مخدر مهم، لأنه لا يغير مستويات الدوبامين، كما تفعل التخدير الأخرى مثل الكيتامين / الإكسيلازين وهيدرات الكلورال20،21. - مرة واحدة يتم تخدير الحيوان بعمق وليس استجابة للمحفزات الضارة (على سبيل المثال، قرصة إصبع القدم)، وضعه في الإطار ستيريوتاكسيك. تطبيق مواد التشحيم العيون على كل عين من الفئران.
ملاحظة: هذه هي عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة، ولكن يتم تشجيع تقنية مطهر جيدة. - تنظيف فروة رأس الجرذ باستخدام فرك على مرحلتين (أي فرك iodopovidone تليها فرك الإيثانول 70٪؛ أداء مع تكرار دورة 3).
- قطع أنسجة فروة الرأس باستخدام ملاقط الأنف إبرة معقمة ومقص الجراحية. إزالة كمية كبيرة من الأنسجة لإفساح المجال لمختلف عمليات الزرع المبينة أدناه.
- تنظيف بلطف سطح الجمجمة باستخدام تعقيم القطن طرف التطبيقات. ثم تطبيق 2-3 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ للمساعدة في تحديد لامبدا وبريغما.
- باستخدام مثقاب ستيريوتاكسيك أو يدوي (1.0 مم، ~20,000 دورة في الدقيقة)، حفر حفرة قطرها 1.5 ملم 2.5 مم الأمامي إلى bregma و 3.5 ملم الجانبي إلى bregma. جزئيا (حوالي منتصف الطريق، حتى يتم بحزم في مكان) زرع المسمار (1.59 مم O.D.، 3.2 ملم طويلة) في هذا الثقب. من المستحسن استخدام المالحة المعقمة للري أثناء الحفر لمنع الإصابة الحرارية.
- بالنسبة للقطب المرجعي، حفر ثقب قطره 1.0 مم 1.5 مم الأمامي و3.5 ملم الجانبي إلى البريغما، في نصف الكرة الأيسر.
- باليد، إدراج ~ 2 مم من الأسلاك المرجعية في هذه الحفرة، في حين التفاف السلك المرجعي حول وتحت رأس المسمار المزروعة.
- زرع المسمار بالكامل، تعلق أسفل القطب المرجعي في مكان.
- في نصف الكرة الأيمن، حفر ثقب قطره 1.5 ملم 1.2 مم الأمامي و 1.4 ملم الجانبي إلى bregma.
- إزالة بلطف دورا باستخدام ملاقط.
- بالنسبة للقطب المحفز، حفر حفرة مربعة (2 مم أمامية- الخلفية، 5 مم متوسطة الجانبية) تركزت في 5.2 مم الخلفي و 1.0 ملم الجانبي إلى bregma.
- باستخدام أشرطة الذراع المجسمة، خفض القطب القطب تحفيز ثنائي القطب / دليل قنية 5 مم تحت دورا. في حالة النزيف أثناء زرع القطب الكهربائي، استخدم مسحات القطن المعقمة والشاش لتقليل النزيف.
ملاحظة: القطب ثنائي القطب تحفيز المستخدمة في هذا الأسلوب هو prefitted مع قنية دليل (جدول المواد). وينبغي مسح القنية الداخلية المستخدمة مع هذا البند مع شوكات على القطب تحفيز ثنائي القطب عند إدراجها بالكامل في قنية دليل. وهذا سيسمح للقنية الداخلية بالجلوس مباشرة بين شوكتي المحفز ، اللذين يجلسان على بعد حوالي 1 مم. ويرد وصف بروتوكول مماثل في مكان آخر14. - باستخدام أشرطة الذراع المجسمة، خفض microelectrode ألياف الكربون 4 مم تحت دورا. هذا الموقع هو في الجزء الأكثر الظهرية من المخطط.
- ربط الأسلاك المرجعية وألياف الكربون إلى potentiostat.
- تطبيق نموذج موجة مثلثة (-0.4−1.3 فولت، 400 V/s) لمدة 15 دقيقة في 60 هرتز، ومرة أخرى لمدة 10 دقائق في 10 هرتز.
ملاحظة: عادة، عند تطبيق الأشكال الموجية على الألياف الكربونية microelectrodes في الدماغ، تضاف مجموعات أكسيد إلى سطح ألياف الكربون. يجب التوصل إلى توازن رد الفعل هذا قبل التسجيل؛ خلاف ذلك سوف يحدث انجراف كبير19. ركوب الدراجات القطب في ترددات أعلى (60 هرتز) يسمح للألياف الكربونية لتحقيق التوازن بشكل أسرع.
3. تحسين ألياف الكربون وتحفيز القطب / دليل مواقع القنية
- تعيين المحفز لإنتاج الموجي الكهربائية ثنائي القطب، مع تردد 60 هرتز، 24 نبضة، 300 ميكرومتر تيار، وعرض نبضة من 2 مللي ثانية / مرحلة.
- خفض بلطف المحفز في زيادات 0.2 ملم من 5 ملم إلى 7.8 ملم تحت دورا. في كل زيادة، تحفيز VTA.
ملاحظة: في أعماق الظهر أكثر (5-6 ملم)، وتحفيز الدماغ عادة (~ 80٪ من الوقت) يسبب شعيرات من الفئران لنشل. وفي أعماق أخرى، ستتوقف الشعيرات عن الارتعاش، الذي يحدث بين 7.5-8.2 ملم تحت الدورا. عندما يتوقف الشعيرات عن الارتعاش، سيكون القطب المحفز قريبا أو في VTA. هذا لن يحدث في كل الفئران، وعدم وجود ارتعاش شعيرات لا ينبغي أن تؤخذ كعلامة على أن القطب القطب تحفيز ثنائي القطب / قنية التسريب في غير محله. قد لا يحدث ارتعاش الشعيرات لجميع التخدير (على سبيل المثال، isoflurane). - الاستمرار في خفض القطب القطب ثنائي القطب تحفيز / دليل cannula حتى التحفيز تنتج الإفراج عن DA phasic في microelectrode ألياف الكربون (حاليا في المخطط الظهري).
ملاحظة: إطلاق DA في المخطط الظهري لن يحدث دائما إذا تم زرع القطب ثنائي القطب في VTA ، ولكن ملاحظة إطلاق DA في المخطط الظهري عند تحفيز VTA عادة ما تكون علامة جيدة على أنه سيتم ملاحظة إشارة جيدة في نواة NAc. - خفض الألياف الكربونية microelectrode حتى يكون على الأقل 6.0 مم تحت دورا. هذا هو الجزء الأكثر ظهرية من نواة NAc.
- تحفيز VTA وتسجيل ذروة السعة من ذروة DA.
- خفض أو رفع microelectrode ألياف الكربون في الموقع الذي ينتج أعظم الافراج عن DA.
- تأكد من أن ذروة استجابة DA هي ذروة أكسدة واضحة عند 0.6 فولت وذروة تخفيض عند -0.2 V. هذه القمم هي مؤشر على DA.
4. مزيج ضخ وتحفيز تسجيل FSCV
ملاحظة: يظهر الشكل 1 الجدول الزمني للتسجيل قبل وبعد الالتخاء الدقيق VTA.
- بمجرد تحسين ألياف الكربون وموقع القنية المحفز للأقطاب الكهربائية/المرشد، يمكنك التحفيز لمدة 20-30 دقيقة تقريبا.
ملاحظة: تحت معلمات التحفيز الحالية، لا تحفز أي أكثر من مرة واحدة كل 3 دقائق، للسماح لإعادة تحميل المركبات22. - بعد تحقيق خط أساس مستقر (<20٪ تباين على مدى خمسة تحفيزات)، خفض بلطف القنية الداخلية باليد في قنية الدليل الذي هو مسبقا في المحفز ثنائي القطب.
- خذ تسجيلات خط الأساس الإضافية 2-3 لضمان أن إدخال القنية نفسه لم يسبب تغييرا في الإشارة المثارة. في بعض الحالات، يمكن أن يؤدي إدخال وإزالة القنية الداخلية إلى تلف VTA. إذا كانت الإشارة تتغير بشكل كبير خلال فترة خط الأساس هذه (>20٪)، ثم تأخذ إضافية 3-4 التسجيلات حتى إعادة استقرار خط الأساس.
- باستخدام مضخة حقنة وmicrosyringe، غرس 0.5 ميكرولتر من الحل (على سبيل المثال، 0.9٪ ملحية، N-ميثيل-D-الأسبارتات [NMDA]، (2R) -أمينية-5-فوسفونوفاليك حمض [AP5]) في VTA على مدى فترة 2 دقيقة.
- بعد التخدير، اترك القنية الداخلية لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الإزالة.
ملاحظة: قد تتطلب بعض الأدوية ترك القنية الداخلية لفترة أطول استنادا إلى حركية الدواء ، وقد تتسبب إزالة القنية الداخلية في انتقال الدواء مرة أخرى عبر القنية الداخلية. إذا كان هناك قلق، يمكن للمرء أن يترك القنية الداخلية في قنية دليل خلال كامل التسجيل. وإلا، يمكن أن يبدأ التسجيل بعد هذه الفترة 1 دقيقة. - استمر في التسجيل كل 3 دقائق لقياس تأثيرات ما بعد التلقيح.
ملاحظة: إذا غرس حل عنصر تحكم، ولم يتم ملاحظة أي تأثير، فمن الممكن لبث مرة ثانية10. إذا كان هناك تغيير الافراج عن DA الناجمة عن إدراج قنية داخلية أو ضخ المالحة، إشارة يتعافى عادة إلى خط الأساس في غضون 30 دقيقة.
5. التحقق النسيجي من وضع القطب
- في نهاية التجربة ، قم بإنشاء آفة صغيرة في موقع التسجيل باستخدام ميكروليكترودي ألياف الكربون.
- إذا كان يجب الحفاظ على القطب لمعايرة ما بعد الاختبار، ثم استخدام سلك التنغستن وضعت في الشعيرات الدموية الزجاجية جاحظ ~ 100 ميكرومتر وراء طرف الشعرية. في هذه الحالة، رفع القطب من الدماغ، واستبدال القطب تسجيل مع القطب التنغستن، وخفضه إلى نفس تنسيق الظهر.
ملاحظة: يمكن استخدام ألياف الكربون لتقرح الدماغ أيضا، وسوف توفر تمثيلا أكثر دقة لموقع موقع التسجيل. ومع ذلك، فإن المجرب يفقد القدرة على معايرة هذه الأقطاب الكهربائية.
- إذا كان يجب الحفاظ على القطب لمعايرة ما بعد الاختبار، ثم استخدام سلك التنغستن وضعت في الشعيرات الدموية الزجاجية جاحظ ~ 100 ميكرومتر وراء طرف الشعرية. في هذه الحالة، رفع القطب من الدماغ، واستبدال القطب تسجيل مع القطب التنغستن، وخفضه إلى نفس تنسيق الظهر.
- لتقرح موقع التسجيل، وتطبيق الجهد باستخدام إمدادات الطاقة. تبدأ من 1 V وزيادة 1 V كل 10 ق حتى يتم التوصل إلى 10 V.
- قتل الحيوان باستخدام حقنة قاتلة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (150 ملغم/كغ).
- Perfuse الفئران باستخدام حل 4 ٪ الفورماليين.
- إزالة الرأس من الفئران باستخدام المقصلة شحذ.
- باستخدام rongeurs، وإزالة النسيج الضام والجمجمة المحيطة الدماغ، وطرد بلطف الدماغ من أي الأنسجة المتبقية.
- تخزين الدماغ في 4٪ الفورمالاتين لمدة يوم واحد ومن ثم نقله إلى السكروز 30٪.
ملاحظة: Perfusion مع 4٪ الفورماتين ليس من الضروري أن نرى موقع الآفة، على الرغم من أن كأفضل ممارسة من شأنها تحسين إعادة بناء موقع الآفة. - إنشاء شرائح 30 ميكرومتر من الدماغ باستخدام cryostat.
- قم بتركيب الشرائح على الشرائح وغطيها بقسيمة غطاء.
- تدل على موقع آفة الألياف الكربونية microelectrode وحافز ثنائي القطب / ضخ موقع cannula باستخدام المجهر الخفيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام CIS-FSCV لدراسة وظيفة مستقبلات الأسبارتات N-methyl-D-D VTA (NMDAR) ومستقبلات أستيل النيكوتينيك (nAChRs) ومستقبلات أستيل الموسكارينية (mAChRs) في قيادة إطلاق DA التدريجي في نواة NAc. ويبين الشكل 2 البيانات التمثيلية للتحكم السلبي، ضخ 0.9٪ المالحة، قبل (خط الأساس) و 9 دقائق بعد التلقيح (المالحة). يظهر الشكل 2 رسم لون مع المحتملة على المحور ص، والوقت على المحور س، والتيارات (ممثلة كما لون زائف) على المحور ض، الحالية مقابل آثار الوقت (IvT)، فضلا عن فولتامموجرام دوري التي اتخذت في ذروة أثار استجابة لإثبات أن التحليل قياس يتوافق مع DA. كما هو متوقع، لم يغير التسريب المالح إطلاق DA التدريجي المحفز.
لإثبات أن CIS-FSCV يمكن أن تنتج تأثيرات ثنائية الاتجاه عند استخدام ناهضات وخصوم, قارنا آثار ضخ ناهض NMDAR, NMDA (500 نانوغرام; الشكل 3ألف)إلى خصم NMDAR، AP5 (1 ميكروغرام؛ الشكل 3باء). ضخ NMDA أنتجت زيادة قوية في حفز الافراج عن DA phasic (الشكل 3A، 9 دقيقة بعد التسريب) في حين أن الخصم التنافسي NMDAR ، AP5 (1 ميكروغرام) ، أنتجت انخفاضا قويا(الشكل 3باء، 9 دقائق بعد التسريب). لإثبات فائدة CIS-FSCV باستخدام الخصوم التي تستهدف فئات مختلفة من مستقبلات أستيل, قارنا آثار ضخ غير انتقائي, غير تنافسية nAChR خصم mecamylamine (3 ميكروغرام; الشكل 4ألف)وغير انتقائية، وتنافسية mAChR خصم سكوبولامين (67 ميكروغرام؛ الشكل 4باء). أنتجت كل من الأدوية انخفاضات قوية في حفز الافراج عن DA phasic (الشكل 4، 9 دقيقة بعد الزرع). ملخص لنتائج الشكل 2والشكل 3والشكل 4 يتم إعادة صياغتها في الشكل 5، حيث يتم متوسط فترة خط الأساس على مدى خمسة تحفيزات ويتم عرض فترة الدواء كنسبة مئوية من متوسط خط الأساس.
الشكل 1: الجدول الزمني للتسجيل قبل وبعد الميكروية VTA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اللون التمثيلي ومؤامرات IvT لخط الأساس (يسار) وضخ المالحة (السيارة) (يمين) على إطلاق DA التدريجي المحفز في نواة NAc في فأر سبراغ دولي ذكر واحد. الشريط الأزرق يمثل التحفيز. تسجيل خط الأساس يحدث في ر = 0، قبل أن يتم وضع القنية الداخلية في قنية دليل في محفز ثنائي القطب. تم أخذ التسجيل المالح 9 دقائق (ر = 9) بعد التلقيح. تتوافق مجموعة الفولتاموغرام الدورية مع ذروة قطع الأرض IvT ، مما يدل على ذروة الأكسدة عند 0.6 V والحد من الذروة عند -0.2 V ، مما يدل على DA. لا ينبغي ملاحظة أي تغيير في إطلاق سراح أثار حفز بعد ضخ VTA المالحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آثار ضخ ناهض NMDAR (NMDA) وخصم (AP5). (أ) لون تمثيلي ومؤامرات IvT من خط الأساس (يسار) و 500 نانوغرام من التسريب ناهض NMDAR (يمين) على حفز الافراج عن DA phasic في نواة NAc في الفئران داولي سبراغ ذكر واحد. NMDA ضخ زيادة حفز الافراج عن DA phasic (تسجيل اتخذت 9 دقائق بعد التسريب). (ب) اللون التمثيلي ومؤامرات IvT من خط الأساس (يسار) و 1 ميكروغرام من خصم NMDAR (2R) - أمينية - 5 - phosphonovaleric حمض (AP5) ضخ (يمين) على حفز الافراج عن DA phasic في نواة NAc في فأر واحد من الذكور سبراغ داولي. خفض ضخ AP5 حفز الافراج عن DA phasic (تسجيل اتخذت 9 دقائق بعد التسريب). وقعت التسجيلات الأساسية في t = 0 ، قبل وضع القنية الداخلية في قنية الدليل في المحفز ثنائي القطب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار ضخ الميكاميلامين والسكوبولامين. (أ) اللون التمثيلي ومؤامرات IvT من خط الأساس (يسار) و 3 ميكروغرام من مستقبلات أستيل النيكوتينية غير الانتقائية خصم mecamylamine (MEC) التسريب (يمين) على حفز الافراج عن DA phasic في نواة NAc في الفئران داولي سبراغ ذكر واحد. (ب) اللون التمثيلي ومؤامرات IvT لخط الأساس (يسار) و 67 ميكروغرام من مستقبلات أستيل غير انتقائية الموسكارينية خصم سكوبولامين (SCOP) ضخ (يمين) على حفز الافراج عن DA phasic في نواة NAc في الفئران واحد ذكر سبراغ دولي. حدث تسجيل خط الأساس عند t = 0 ، قبل وضع القنية الداخلية في قنية الدليل في المحفز ثنائي القطب. تم أخذ تسجيلات MEC و SCOP بعد 9 دقائق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: موجز البيانات التي تبين آثار المخدرات مع مرور الوقت. وبلغ متوسط فترة ما قبل التسريب (خط الأساس) أكثر من خمسة محفزات، وتقدم فترة ما بعد التلقيح (ابتداء من t = 3) كنسبة مئوية من خط الأساس. في 9 دقيقة بعد التسريب، لاحظنا أن إشارة DA التي تم استحضارها كانت 103٪ من خط الأساس بعد التسريب المالح، و 196٪ بعد ضخ NMDA، و 18٪ بعد ضخ AP5، و 49٪ بعد ضخ MEC، و 43٪ بعد ضخ SCOP. n = 1 لكل شرط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV يوفر فرصة فريدة للتحقيق في آليات مستقبلات VTA الكامنة وراء الافراج عن DA phasic. هناك خطوتان حاسمتان من أجل ضمان التسجيل الصحيح. أولا، يجب تحقيق تسجيل خط أساس مستقر، مع القليل من الانجراف في إشارة DA المثارة. ومن الطرق الهامة لزيادة احتمال إنشاء تسجيل مستقر هو التأكد من أن القطب كان لديه متسع من الوقت للدورة في كل من 60 هرتز و 10 هرتز (عادة 15 دقيقة في 60 هرتز، و 10 دقائق في 10 هرتز). كما يجري تدوير ألياف الكربون, ألياف الكربون نفسها تتأكسد, ويصبح محفورا, خفض مساحة السطح ولكن إنتاج سطح جديد لامتزاز الدوبامين23. وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة في الحساسية لDA. وهكذا, قد يرى المرء زيادة طفيفة في حفز إطلاق الدوبامين مع مرور الوقت في التجربة بسبب هذا النقش المتزايد, بدلا من أي تلاعب الدوائية. بالإضافة إلى ذلك، فإن بدء التسجيل في غضون 90 إلى 120 دقيقة من التخدير الأولي سيزيد من احتمال تسجيل مستقر على مدى فترات طويلة من الزمن. على هذا النحو ، مع اقتراب الجرذ من الموت من التخدير ، فمن المعتاد أن ينخفض إطلاق DA المثار ببطء.
الخطوة الحاسمة الثانية في هذا الإجراء هي التأكد من أن يتم إدخال قنية التسريب بلطف في القطب القطب تحفيز ثنائي القطب. يمكن أن تتحرك أشرطة الذراع المجسمة إذا تم وضع الكثير من الضغط أثناء إدخال القنية الداخلية ، ونتيجة لذلك ، قد تزيد إشارة الدوبامين أو تنخفض بشكل مصطنع ، حيث قد يكون موقع التحفيز مختلفا. إذا كان هناك تغيير كبير في إشارة أثار بعد إدراج القنية، ينبغي أن تنشأ فترة خط الأساس الجديد. وعلاوة على ذلك، إذا كان هناك تغيير الافراج عن DA الناجمة عن إدراج قنية داخلية أو ضخ السيارة، وإشارة يتعافى عادة إلى خط الأساس في غضون 30 دقيقة. إذا كان هناك تعديلات واسعة النطاق في إطلاق DA على ضخ السيارة ، يمكن تقليل معدل التسريب أو الحجم. قد يقوم المحققون أيضا بإجراء تسجيل إضافي بعد إدخال القنية الداخلية قبل التسريب لتقييم ما إذا كان إدخال القنية نفسها يمكن أن يغير الإطلاق. ومن المهم التحقق من حدوث التسريب، وأنه لا يوجد حصار على القنية الداخلية. طريقة واحدة للقيام بذلك هو جعل فقاعة صغيرة في أنابيب التسريب، ووضع علامة على هذا مع قلم أو علامة. يجب أن تكون الفقاعة أبعد من العلامة بعد التسريب. طريقة أخرى لضمان حدوث التسريب بشكل صحيح هي تشغيل مضخة التسريب بعد إزالة القنية الداخلية من الدماغ ، وإذا كان لا يزال هناك حل يتشكل عند الطرف ، فمن المرجح حدوث ضخ ناجح.
يمكن تكييف CIS-FSCV لدراسة مستقبلات VTA في كل من الحيوانات الساذجة سلوكيا والمدربة لدراسة التغيرات في وظيفة المستقبلات بمرور الوقت11. ويمكن أيضا أن يكون CIS-FSCV تعديل لقياس 5-HT والنورادرينالين (NE)24,25. CIS-FSCV هو أيضا مناسبة للغاية لتجارب مستيقظا والسلوك ويمكن دمجها مع النهج optogenetic26،27. من المهم ملاحظة أن أحداث الإطلاق التي يتم استحضارها كهربائيا تختلف عن أحداث الإطلاق العابرة التي غالبا ما لوحظت في دراسات الحركة الحرة ، وأقل في كثير من الأحيان في التحضير المخدر. أحداث الإفراج عابرة, على سبيل المثال, قد لا يكون بالضرورة مدفوعا إزالة الاستقطاب المباشر للخلايا العصبية الدوبامين على عكس الأحداث الافراج عن أثار كهربائيا28. على هذا النحو, النشاط العصبي التدريجي قد تكون بعيدة عن أحداث إطلاق الدوبامين الكشف عن طريق FSCV. وعلاوة على ذلك ، أثار بصريا الافراج عن DA وقد تبين أن تختلف عن أحداث الافراج عن DA أثار كهربائيا. وقد كشفت مقارنة أجريت مؤخرا بين التحفيز بصريا وكهربائيا أثار أن التحفيز أثار كهربائيا تنتج تنظيم متعدد متشابك من الافراج عن DA phasic، في حين أن التحفيز أثار بصريا يمكن أن تحد من التحفيز إلى دوائر أكثر تحديدا29.
وقد استخدمت بعض النهج الحديثة optogenetic والفلورسنت أساليب للتحقيق في الدوائر الكامنة وراء ديناميات الدوبامين السريع في الجسم الحي30. على سبيل المثال، أظهرت الأعمال الأخيرة التي أجراها صن وزملاؤه أن التحفيز البصري الجيني للخلايا العصبية الدوبامين في نيغرا substantia تنتج ارتفاعات سريعة من DA في المخطط، كما تقاس عن طريق التعبير عن G-البروتين مقرها مستقبلات التنشيط القائم على DA (GRABDA)أجهزة الاستشعار30. ويمكن استخدام النهج البصرية والفلورية المشتركة لتحفيز أو تثبيط مدخلات محددة من المركبات المفرزة إلى VTA أثناء قياس إطلاق DA في NAc. CIS-FSCV لا يمكن أن تحفز afferents على وجه التحديد كما التحفيز optogenetic، ولكن لديها ميزة في أنه يمكن معالجة الأسئلة حول مستقبلات presynaptic وما بعد متشابك داخل VTA. في حين أن كلا من نهج الفلورسنت وFSCV لديها ما يكفي من الدقة الزمنية (subsecond) والحساسية لDA (1-10 nM) لقياس التغيرات بالمقارنة في الافراج عن DA phasic30،31، ميزة واحدة FSCV قد يكون أكثر من رصد الفلورسنت من DA phasic في الجسم الحي هو أنه لا توجد حاجة إلى التلاعب الجيني للتسجيل. والواقع أن تجربة CIS-FSCV يمكن أن تكتمل في غضون ساعات، في حين أن النهج البصرية الفلورية والنهج المشتركة تتطلب وقتا كافيا (أسابيع) للتعبير الكافي باستخدام البنى الفيروسية.
فائدة رئيسية من CIS-FSCV هو أن تنظيم مستقبلات VTA محددة من الافراج عن DA phasic يمكن دراستها في الدماغ سليمة, بناء على غيرها في الدراسات الحية التي تقيس إما الخصائص الكهربية للخلايا العصبية VTA أو في الدراسات المختبرية التي تقيم تنظيم presynaptic من الافراج عن DA phasic3,12. أحد المحاذير من CIS-FSCV هو أن هذه التسجيلات يجب أن تتم في منطقة غنية نسبيا DA. هذا لسببين: أولا، هناك بعض الحدود لحساسية FSCV، والتي يمكن أن تكشف فقط تركيزات DA في نطاق نانومولار وفوق6،19. ثانيا، FSCV لديه مشكلة في فصل النورادرينالين من DA، لأن فولتامموجرامات دورية متطابقة تقريبا. وهكذا، قد تقتصر هذه الدراسات على تقييم المناطق ذات DA عالية، مثل بعض أجزاء من قشرة الجبهي الوسطي، NAc، المخطط، ودرنة الشم32. قد تكون الدراسات المستقبلية قادرة على توظيف بعض التطورات FSCV النهج التي تسمح للتمييز أفضل بين DA و NE, فضلا عن الناقلات العصبية الكهربائية الأخرى مثل أدينوسين33 والسيروتونين12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم العمل من قبل كلية إليزابيث تاون (R.J.W. و M.L.و L.M) ، من قبل زمالة الدراسات العليا NSF (R.J.W.) وكلية ييل للطب (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M.
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
