Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In Situ Påvisning af Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline ved hjælp af Nærhed Ligation Assay

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

Denne protokol viser brugen af nærhedligation assay at sonde for protein-protein interaktioner in situ i C. elegans germline.

Abstract

Forståelse af, hvornår og hvor protein-protein interaktioner (PPI) opstår, er afgørende for at forstå protein funktion i cellen, og hvordan bredere processer såsom udvikling påvirkes. Den Caenorhabditis elegans germline er en stor model system til undersøgelse af PPI, der er relateret til regulering af stamceller, meiose, og udvikling. Der er en række veludviklede teknikker, der gør det muligt proteiner af interesse at blive mærket for anerkendelse af standard antistoffer, hvilket gør dette system fordelagtigt for nærhed ligation assay (PLA) reaktioner. Som følge heraf er PLA i stand til at vise, hvor PPI forekommer på en rumlig og tidsmæssig måde i germlines mere effektivt end alternative tilgange. Beskrevet her er en protokol for anvendelse og kvantificering af denne teknologi til sonde PPI i C. elegans germline.

Introduction

Over 80 % af proteinerne skønnes at have interaktioner med andre molekyler1, hvilket understreger , hvor vigtige PPI er for udførelsen af specifikke biologiske funktioner i cellen2. Nogle proteiner fungerer som hubs, der letter samling af større komplekser, der er nødvendige for celleoverlevelse1. Disse hubs formidler flere PPI'er og hjælper med at organisere proteiner i et netværk, der letter bestemte funktioner i en celle3. Dannelse af proteinkomplekser påvirkes også af biologisk kontekst, såsom tilstedeværelse eller fravær af specifikke interagerende partnere4,cellesignaleringshændelser og udviklingsstadiet af en celle.

C. elegans er almindeligt anvendt som en model organisme for en række undersøgelser, herunder udvikling. Den enkle anatomi af dette dyr består af flere organer, herunder gonade, tarm, og gennemsigtig neglebånd, som letter analysen af orm udvikling. Den germline bosat i gonade er et fantastisk værktøj til at studere, hvordan germline stamceller modnes i gameter5, der udvikler sig til embryoner og i sidste ende den næste generation af afkom. Kimlinens distale spidsregion indeholder en pulje af selvfornyende stamceller (figur 1). Som stamceller forlade niche, de fremskridt i meiotic pachytene og i sidste ende udvikle sig til oocytter i den unge voksne fase (Figur 1). Dette udviklingsprogram i germline er stramt reguleret gennem forskellige mekanismer, herunder en post-transskriptionel regulerende netværk faciliteret af RNA-bindende proteiner (RFP' er)6. PPI er vigtige for denne regulerende aktivitet, da ropp'er forbinder med andre cofaktorer for at udøve deres funktioner.

Der er flere tilgange, der kan bruges til at sonde for PPI i ormen, men hver har unikke begrænsninger. In vivo immunnedbør (IP) kan bruges til at isolere protein-protein komplekser fra hele ormen ekstrakter; Denne fremgangsmåde angiver dog ikke, hvor PPI forekommer i ormen. Desuden kan proteinkomplekser, der er forbigående og kun dannes i et bestemt udviklingstrin eller i et begrænset antal celler, være vanskelige at genvinde ved co-immunudfældning. Endelig skal IP-eksperimenter tage fat på problemerne ved proteinkompleks resortiment efter lysis og ikke-specifik retention af proteiner på affinitetsmatrixen.

Alternative tilgange til in situ-påvisning af PPI er co-immunfarvning, Förster resonans energioverførsel (FRET) og bimolekylær fluorescens komplementation (BiFC). Co-immunfarvning er afhængig af samtidig påvisning af to proteiner af interesse i fast ormvæv og måling af omfanget af signalkolokalisering. Brug af mikroskopi med superopløsning, som giver flere detaljer end standardmikroskopi7, bidrager til strengere test af proteinkolokalisering ud over den diffraktionsbegrænsede barriere på 200-300 nm8. Co-immunfarvning ved hjælp af både konventionel og superopløsningsmikroskopi fungerer dog bedst for proteiner med veldefinerede lokaliseringsmønstre. Derimod bliver det langt mindre informativt for diffust distribuerede interagerende partnere. Måling med henblik på samlokalisering af signaler baseret på overlapning giver ikke nøjagtige oplysninger om , hvorvidt proteinerne er komplekse med hinanden9,10.

Desuden er co-immunudfældning og co-immunfarvning af protein-protein komplekser ikke kvantitative, hvilket gør det udfordrende at afgøre, om sådanne interaktioner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er afhængig af mærkning af proteiner af interesse med fluorescerende proteiner (FPs), der har spektral overlapning, hvor energi fra en FP (donor) overføres til et andet FP (acceptor)11. Denne ikke-radiative overførsel af energi resulterer i fluorescens af acceptorFP, som kan detekteres ved dens respektive emissionsbølgelængde. BiFC er baseret på rekonstitution af et fluorescerende protein in vivo. Det indebærer opdeling GFP i to komplementære fragmenter, såsom helices 1-10 og helix 1112, som derefter smeltes til to proteiner af interesse. Hvis disse to proteiner interagerer, bliver de komplementære fragmenter af GFP tæt nok i nærheden til at folde og samle, hvilket genudgør GFP fluorophore. Rekonstitueret gfp observeres derefter direkte som fluorescens og angiver, hvor der er forekommet en PPI.

Som sådan er både FRET og BiFC afhængige af store fluorescerende tags, der kan forstyrre funktionen af det mærkede protein. Desuden kræver FRET og BiFC rigelige og sammenlignelige udtryk for de mærkede proteiner for at opnå nøjagtige data. FRET er muligvis ikke egnet til forsøg, hvor den ene partner overstiger den anden, hvilket kan føre til høj baggrund13. Overekspression i BiFC-forsøg bør også undgås, da dette kan fremkalde uspecifik samling14, der resulterer i øget baggrund. Begge teknikker kræver optimering af de mærkede proteiners ekspressions- og billeddannelsesforhold, hvilket kan forlænge den tid, det tager at fuldføre eksperimenter.

Nærhedligation assay (PLA) er en alternativ tilgang, der kan løse begrænsningerne af de teknikker, der er nævnt ovenfor. PLA udnytter primære antistoffer, der genkender de proteiner af interesse (eller deres tags). Disse primære antistoffer bindes derefter af sekundære antistoffer, der indeholder oligonukleotidsonder, der kan hybridisere med hinanden, når der inden for en afstand på 40 nm (eller kortere)15. Den resulterende hybridiserede DNA forstærkes gennem en PCR-reaktion, som detekteres af sonder, der supplerer DNA'et. Dette resulterer i foci, der visualiseres af et mikroskop. Denne teknologi kan detektere PPI in situ i komplekse væv (dvs. ormen gonade), som er organiseret som en samlebånd, der indeholder celler på forskellige stadier af udvikling og differentiering. Med PLA kan PPI visualiseres direkte i en fast ormgode, hvilket er fordelagtigt for at undersøge, om PPI forekommer i en bestemt udviklingsfase. PLA tilbyder større opløsning af PPI i modsætning til co-lokaliseringsbaserede analyser, som er ideel til at foretage præcise målinger. Hvis det bruges, super-opløsning mikroskopi har potentiale til at give finere detaljer om placeringen af PLA foci i en celle. En anden fordel er, at foci som følge af PLA reaktioner kan tælles af en ImageJ-baseret analyse workflow, hvilket gør denne teknik kvantitativ.

LC8-familien af dynein-lyskæder blev først beskrevet som en underenhed af dynein motorkomplekset16 og en hypotese til at fungere som en lastadapter. Siden sin første opdagelse, LC8 er blevet fundet i flere proteinkomplekser ud over dynein motor kompleks17,18,19,20. Scanning efter proteinsekvenser , der indeholder LC8 interaktionsmotivet19 , tyder på , at LC8 kan have mange interaktioner med en bred vifte af forskellige proteiner17,18,19,20,21,22. Som et resultat, LC8 familie proteiner er nu betragtes som knudepunkter, der bidrager til at fremme samling af større protein komplekser19,22, såsom samlinger af iboende uordnede proteiner21.

En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskæde-1 (DLC-1), er bredt udtrykt på tværs af mange væv og ikke beriget i specifikke subcellulære strukturer23,24. Derfor er identifikation af biologisk relevante in vivo-partnere for DLC-1 i C. elegans udfordrende af en række årsager: 1) co-immunudfældning angiver ikke den vævskilde, hvor interaktionen finder sted. 2) begrænset ekspression af bestemte partnere eller forbigående interaktioner kan hindre evnen til at påvise en interaktion ved co-immunoudfældning; og 3) diffus distribution af DLC-1 fører til ikke-specifik overlapning med potentielle partnerproteiner ved co-immunfarvning. Baseret på disse udfordringer er PLA en ideel tilgang til test af in vivo interaktioner med DLC-1.

Det er tidligere blevet rapporteret, at DLC-1 interagerer direkte med og fungerer som en cofaktor for RNA-bindende proteiner (RBC' er) FBF-223 og GLD-125. Vores arbejde understøtter modellen af DLC-1, der fungerer som et hubprotein, og foreslår, at DLC-1 letter et interaktionsnetværk, der strækker sig ud over dynein19,,22. Ved hjælp af en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-interagerende RBP opkaldt OMA-1 er blevet identificeret26. OMA-1 er vigtig for oocytvækst og meiotisk modning27 og fungerer sammen med en række translationelle repressorer og aktivatorer28. Mens FBF-2 og GLD-1 udtrykkes i henholdsvis stamceller og meiotiske pachytenregioner, udtrykkes OMA-1 diffust udtrykt i kimen fra meiotisk pachyten gennem oocytterne27 (Figur 1). Dette tyder på, at DLC-1 former komplekser med RAS i forskellige regioner af gonade. Det er også blevet konstateret, at den direkte interaktion mellem DLC-1 og OMA-1 observeret in vitro ikke er inddrevet af en in vivo IP. PLA er med succes blevet brugt som en alternativ tilgang til yderligere undersøgelse af denne interaktion i C. elegans germline, og resultaterne tyder på, at PLA kan bruges til at sonde mange andre PPI i ormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol bruger C. elegans stammer, hvor potentielle interagerende partnere er begge mærket. Det anbefales på det kraftigste, at der anvendes en negativ kontrolstamme, hvor et mærket protein ikke forventes at interagere med en anden kodet kandidatinteraktionspartner. Her blev GFP alene brugt som en negativ kontrol til at vurdere baggrunden, da DLC-1 ikke forventes at interagere med GFP i ormen. GFP-mærket OMA-1 blev brugt som den eksperimentelle stamme, da foreløbige data tyder på en interaktion med DLC-1. Nematode stammer co-ekspres kontrol og test proteiner med 3xFLAG-tagged DLC-1 er nævnt i denne tekst som 3xFLAG: :DLC-1; GFP og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (stammer til rådighed efter anmodning; flere oplysninger i Materialetabel) henholdsvis. Her bruges 3xFLAG- og GFP-tags. andre mærker kan dog erstattes, så længe deres antistoffer er kompatible med PLA-kitreagenserne.

1. Pasning af dyr

  1. Hold orme på nematode vækstmedium (NGM) plader, der er seedet med OP50 stamme af E. coli og vedligeholde ved 24 °C for optimal tekspression af GFP.
  2. Passage voksne orme hver 2-3 dage til at udbrede orme og holde dem godt fodret.

2. Forberedelse af synkron kultur

  1. Synkroniser orme ved at blege en plade af velnærede, gravide hermafroditter. En blegning protokol er beskrevet i Porta-de-la-Riva et al.29. Embryonerne skal udklækkes natten over i et centrifugerør ved 24 °C, mens de roterer enden over enden i 10 ml M9 minimal media (M9) buffer. Dette vil producere en kultur af arresterede L1 larver.
  2. Inkuber røret af anholdte L1 scene larver på is i 10 min, så top off røret med iskold 1x M9.
  3. Der anvendes en centrifuge til pelletering af larverne ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Omhyggeligt aspirere supernatanten, så der kun er 1-2 ml supernatant tilbage.
  4. Re-suspendere pellet af larver og bruge en mikropipette til at overføre 2 μL af suspenderet larver kultur til et glas dias. Tæl, hvor mange larver der er til stede for at bestemme tætheden af larvernes kultur, som vil hjælpe med at guide såning af ormene i trin 2.5.
    BEMÆRK: En massefylde på 10-15 L1 larver/1 μL fungerer godt til såning.
  5. Brug en mikropipettertil at overføre mængden af larver kultur er nødvendig for at frø ca 100-120 L1 etape larver på en 60 mm OP50 plade. F.eks. frø 10 μL af en larverkultur, der har en massefylde på 10 L1 larver/1 μL kultur.
    BEMÆRK: Må ikke overstige et volumen på 40 μL for at så larverne, eller overskydende væske vil forstyrre OP50-plænen. Hvis dyrkningsvolumenet overstiger 40 μL, gentages trin 2.3-2.4 for yderligere at reducere volumenet og øge tætheden af larvernes kultur.
  6. Avl orme ved 24 °C. Registrer det tidspunkt, hvor L1s er seedet på pladen og regelmæssigt kontrollere udviklingstrinet for at identificere det ideelle tidspunkt for dissektion.
    BEMÆRK: Ved 52 timer efter såning af L1s, orme dyrket ved 24 °C er typisk i den unge voksne fase, som er den ideelle fase for dissektion for gonade-målrettet PLA. Det faktiske tidspunkt, hvor de synkroniserede orme når unge voksne fase kan variere mellem stammer og inkubationstemperatur.

3. Dissektion/gonadeekstrudering

BEMÆRK: Dissektion at ekstrudere gonade er nødvendig for gonade-målrettet PLA til at arbejde med succes. Denne fremgangsmåde kan også frigive embryoner, som også arbejder ved hjælp af denne protokol for PLA (se Diskussion for mere information). Efter dissektion fastgøres og behandles både de negative kontrolprøver og forsøgsprøverne parallelt for PLA. Det foreslås også, at der udarbejdes et yderligere sæt prøver med henblik på fluorescerende co-immunstaining23 for at påvise proteinpartnernes udtryksmønstre af interessepartnere.

  1. Der vælges 30-40 unge voksne orme i en urglasskål indeholdende 500 μL på 1x M9 + levamisole (2,5 mM endelig koncentration). Efter indsamling af orme, omhyggeligt fjerne og kassere de fleste af medierne for at fjerne bakterier, der overføres sammen med orme.
  2. Der tilsættes friske 500 μL på 1x M9 + levamisole, og pipetten anvendes til forsigtigt at udarbejde og dispensere mediet for at skylle ormene. Forsigtigt fjerne og kassere de fleste af medierne for at rydde bakterier, der overføres sammen med orme.
    1. Gentag dette trin 2x-3x, indtil alle bakterier er fjernet. Efter vask er afsluttet, lad orme i omkring 100 μL medier til at holde hydreret.
      BEMÆRK: Lad ikke ormene sidde i medier i mere end 7 minutter, da dette vil forringe ekstruderingen af gonader under dissektion. Udfør vasker under støtte af dissekere mikroskop til at overvåge fjernelse af medier, så orme ikke går tabt.
  3. Ved hjælp af et glas eller polyethylen pipette, overføre orme til en 25 mm x 75 mm mikroskop dias belagt med 0,001% poly-L-lysin (dias, der anvendes i denne procedure har en epoxy belagt omkreds, forlader tre arbejdsområder, 14 mm x 14 mm hver). Fjern overskydende medier, så der stadig er ca. 10-15 μL medietilbage.
  4. Ved hjælp af et dissekeret mikroskop og ved hjælp af to 261/2 gauge nåle, placere den ene nål over den anden, således at enderne danner en saks. Brug nåle orienteret på denne måde, skære orme bag svælget til at frigive kønsceller. Dissekere alle orme inden for 5 minutter.
    BEMÆRK: Flere detaljer om, hvordan man udfører dissektioner kan findes i en tidligere publikation af Gervaise og Arur30.
  5. Når alle orme er dissekeret, skal du forsigtigt placere en 22 mm x 40 mm dæksel over slæden, så den er vinkelret på slæden. Enderne af dækstrækket skal hænge ud af sliden.
  6. Fastfrys objektglassene på en forkølet aluminiumsblok, der holdes på tøris i mindst 20 min. Placer forsigtigt en kold blyant oven på dækslen for at forhindre, at dækslen løsner sig på grund af isudvidelse.

4. Fiksering/blokering

  1. Når du er klar til fiksering, skal du svirpe dækslips af med en blyant eller et andet stumpt kantværktøj og straks dyppe slæden i en krukke med frisk, iskold methanol (kølet til -20 °C) i 1 min.
  2. Tør forsigtigt kanterne på det objektglas, der omgiver prøven, så det næste reagens holdes af overfladespænding omkring prøven. Påfør 150 μL fiksativ (2% formaldehyd i 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) i 5 min ved RT.
    BEMÆRK: Vi har også testet en methanol/acetone fikseringsprocedure31,32 og fundet ud af, at den er kompatibel med PLA-reaktionen.
  3. Rør ved slæden til en køkkenrulle i en vinkelret 90° vinkel for at lade fiksativløbelsen løbe af slæden og absorbere ind i køkkenrulle. Bloker dias 2x i 15 min på RT i en Coplin krukke med 50 ml 1x PBS/1% Triton X-100/1% kvæg serum albumin (PBT/BSA).
    BEMÆRK: Coplin krukker eller andre typer af farvning krukker anbefales til denne blokering trin og vask trin nedenfor i afsnit 6-9. Disse giver tilstrækkelige mængder til effektiv udveksling af blokerings- eller vaskebuffer med prøven.
  4. Bloker objektglas med en PBT/BSA-opløsning, der indeholder 10 % normalt gedeserum. Tør forsigtigt kanter, der omgiver slæden, og påfør 100 μL af opløsningen på slæden. Inkuber i 1 time på RT i et fugtigt kammer.
    BEMÆRK: Dette trin anbefales stærkt til farvning med det primære αFLAG-antistof. Det fugtige kammer er konstrueret ved at sikre glaspipetter med tape i bakken, så objektglassene kan lægge på, når de inkuberer. Dæmpede opgaveklude ( Materialebord )placeresi bakken for at øge bakkens indvendige fugtighed for at forhindre fordampning. Låget og bakken er dækket af folie for at beskytte prøverne mod lys under de lysfølsomme trin.
  5. Placer glide på et køkkenrulle for at lade PBT/ BSA/10%NGS løsning løbe ud af diaset og forsigtigt tørre kanterne af diaset. Brug det blokerende reagens (Materialetabel) til at blokere slides. Påfør en dråbe på 14 mm x 14 mm plads. Inkuber i 1 time ved 37 °C i et fugtigt kammer.

5. Primær antistofinkubation

BEMÆRK: For at opnå de bedste PLA-resultater og minimal baggrund kan fortyndingsfaktoren for de primære antistoffer kræve optimering (se Diskussion for flere detaljer). Derudover bør de primære antistoffer hæves i forskellige værter, der matcher specificiteten af de sekundære antistoffer, der anvendes til PLA.

  1. Placer glider på en køkkenrulle for at lade blokere reagens løbe ud af diaset og forsigtigt tørre kanterne. Brug antistoffortyndingsmiddel (Materialetabel) til at fortynde de primære antistoffer. Der påføres 40 μL primær antistofopløsning pr. 14 mm x 14 mm plads.
  2. Inkuber glider i et fugtigt kammer natten over ved 4 °C.

6. PLA sonde (sekundært antistof) inkubation

BEMÆRK: Ved trin 6-9 skal der anvendes vaskebuffere A og B på RT. Hvis bufferne opbevares ved 4 °C, skal de varmes til RT, før de skal.

  1. Vask objektglas 2x i 5 min med 50 ml 1x vaskebuffer A(Materialebord)på RT i en Coplin-krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm.
  2. Placer slide på en køkkenrulle til at lade vaske buffer løbe ud af dias og forsigtigt tørre kanterne. Der fremstilles en opløsning på 40 μL indeholdende PLUS- og MINUS-sonder (fortyndet 1:5 med antistoffortyndingsmiddel). Påfør opløsningen på hver 14 mm x 14 mm plads.
  3. Inkuber i et fugtigt kammer i 1 time ved 37 °C.

7. Ligation

  1. Vask objektglas 2x i 5 minutter med 50 ml 1x vaskebuffer A på RT i en Coplin krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm.
  2. Ligationsbufferen(Materialetabel)1:5 fortyndes med ultrarent vand. Brug denne buffer til at fortynde ligase (Tabel af materialer) 1:40 til at forberede et arbejdslager af ligation løsning.
    1. Placer slæden på en køkkenrulle for at lade vaskebufferen løbe af slæden og forsigtigt tørre kanterne af. 40 μL af ligationsopløsningen påføres hver 14 mm x 14 mm plads.
  3. Inkuber i et fugtigt kammer i 30 min ved 37 °C.

8. Forstærkning

BEMÆRK: Brug af detektionsreagenser med røde fluorophorer ( Materialetabel )resultereri den mindste mængde baggrundsmængde i C. elegansvæv.

  1. Vask objektglas 2x i 5 minutter med 50 ml 1x vaskebuffer A på RT i en Coplin krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm.
  2. Fortynd forstærkningen rød buffer (Tabel af materialer) 1:5 med ultrarent vand. Brug denne buffer til at fortynde polymerasen (Materialetabel) 1:80 til at forberede et arbejdslager af forstærkningsopløsning og beskytte mod lys.
    1. Placer slæden på en køkkenrulle for at lade vaskebufferen løbe af slæden og forsigtigt tørre kanterne af. Der påføres 40 μL forstærkningsopløsning på hver 14 mm x 14 mm plads.
  3. Inkuber i et fugtigt kammer i 1 time og 40 min ved 37 °C. Sørg for, at det fugtige kammer er dækket med folie for at beskytte prøverne mod lys.

9. Afsluttende vasker

  1. Vask objektglas 2x i 10 min med 50 ml 1x vaskebuffer B (Materialebord) på RT i en Coplin-krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm.
  2. Skylninger 1x i 1 min med 50 ml 0,01 x vaskebuffer B på RT i en Coplin krukke. Indstil Coplin krukken på en orbital shaker sat til 60 rpm. Denne buffer fremstilles ved fortynding af vaskebuffer B med ultrarent vand.

10. Coverslip montering

  1. Lad den overskydende vaskebuffer løbe af slæden på en køkkenrulle og tør eventuelle resterende buffer tilbage på epoxy-belagt omkredsen af diaset.
  2. Der tilsættes 10 μLmonteringsmedium( Materialebord ) for at udtage prøver og lægge forsigtigt en dæksel ovenpå, så monteringsmediet kan sprede sig.
  3. Mal rundt om kanten af coverslip med neglelak for at forsegle dækstrækket og glide. Vær forsigtig med påføring af neglelak for at undgå at flytte dæksedlen, hvilket vil beskadige kimlinjerne. Lad neglelakken hærde i mindst 20 min på RT, mens lysbilleder er beskyttet mod lys, før du ser det under et mikroskop.
  4. Opbevar objektglas i en mørk beholder eller objektglasholder, da PLA-mærkede prøver er lysfølsomme. Producenten foreslår, at lysbilleder kan opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring eller ved 4 °C til kortvarig opbevaring. Objektglas, der tilberedes ved hjælp af denne protokol, varer mindst to måneder, når de opbevares ved 20 °C.

11. Erhvervelse af billeder

  1. Med henblik på kvantificering skal der anvendes et konfokalmikroskop til at tage billeder af ekstruderede kimlinjer, der er i frit udsyn, ubeskadiget og uhindret. Fange en z-stack af kønskiminen, der spænder over hele germline i z-plan og generere en maksimal projektion billede til brug for kvantificering.
    BEMÆRK: Konfokal mikroskopi er ideel til at opnå og kvantificere PLA-billeder med mindre baggrund sammenlignet med dem, der opnås ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop.
    1. Hvis germlinen ikke passer ind i ét synsfelt, skal du registrere de overlappende synsfelter efter behov for at afbilde hele kønskimen. Maksimale projektioner af disse billeder kan syes sammen i FIJI.
  2. Sørg for at holde billeddannelsesforholdene ens mellem kontrolprøver og forsøgsprøver for at fastsætte en rimelig og korrekt tærskel for identifikation af foci under billedanalyse.
    BEMÆRK: Der registreres mindst 8-10 kimlinjer fra hver prøve pr. replikat for at lette den statistiske analyse af PLA-kvantificering. Mindst tre biologiske replikater anbefales til PLA for at opnå pålidelige og konsekvente kvantitative resultater.

12. Billedanalyse og kvantificering ved hjælp af FIJI/ImageJ

BEMÆRK: Følgende arbejdsproces er baseret på billeder, der er anskaffet ved hjælp af 40x-målsætningen på et konfokalt mikroskop, hvor billeder gemmes i .czi-formatet. Disse .czi billeder og deres ledsagende metadata, herunder dimensioner, kan tilgås og åbnes i FIJI / ImageJ til yderligere analyse. Det bør kontrolleres, om FIJI accepterer formatet af konfokale filer fra den konfokale, der er til rådighed for den specifikke bruger. Hvis ikke, kan billeder i .tiff-formatet alternativt bruges til analyse, men brugeren skal indstille billedets skala manuelt i FIJI/ImageJ (Analysér | Angiv skala). Det anbefales, at alle negative kontrolbilleder analyseres sammen først for at fastslå baggrundsniveauet.

  1. Start analysearbejdsgangen ved først at analysere alle negative kontrolbilleder, og gå derefter videre til forsøgsprøverne. Åbn et maksimalt projektionsbillede i FIJI/ImageJ for at analysere (Figur 2A). Hvis du bruger en .czi-fil, bliver der bedt om at åbne feltet Importindstillinger for bioformater.
    1. Medtag følgende indstillinger for at åbne billedet: vis stak med databrowser; farvetilstand = Farvelagt. Et vindue med billedet skal nu åbnes med en slidelinje for at skifte mellem forskellige kanaler, der er taget af konfokale kanaler (f.eks.
    2. Hvis billeder skal sys, skal du oprette dubletter af hver kanal fra hvert billede ved at højrevælge billedet med musen og vælge Dubler for at åbne vinduet Dublerede. Angiv kun det kanalnummer (c), der svarer til PLA- eller DAPI-kanalen (f.eks. 2), og fjern markeringen i afkrydsningsfeltet for Dublethyperstack.
    3. Med begge billeder, der skal syes åbne, skal du vælge Plugins | Syning | Frarådes | 2D syninger. Vinduet Syning af 2D-billeder åbnes. Vælg, hvilke billeder der skal bruges til syning, og brug de standardparametre, der er forudindstillet i vinduet, og vælg derefter Ok. Det resulterende billede vil være et samlet gråtonebillede.
      BEMÆRK: Hvis underbillederne ikke flugter perfekt, justeres parametre (dvs. forøgelse af antallet af toppe, der skal kontrolleres fra 5 til 500, eller ændring af fusionsmetoden fra Lineær blanding til Maks. Intensitet)kan hjælpe med at opnå det ønskede billede. Mens andre syningværktøjer er tilgængelige, bevarer denne tilgang billedets dimensionalitet, hvilket er vigtigt for kvantificering.
  2. Åbn roi-styringen (Interesseområde) ved at trykke på T på tastaturet. Der åbnes et nyt vindue med navnet ROI Manager.
  3. Vælg polygonværktøjet i FIJI-værktøjssættet. Drop punkter omkring germline at skitsere det og generere en ROI (Figur 2B). Tilslut den sidste prik til den første for at generere et komplet investeringsafkast.
    BEMÆRK: For mørkere billeder er det nyttigt at justere kontrasten for at forbedre synligheden af kønskiminen (som er reversibel), så den kan skitseres mere præcist.
    1. Umiddelbart efter fuldførelsen af investeringsafkastet skal du gå til roilederen og vælge Tilføj [t] for at gemme investeringsafkastet. Det er bydende nødvendigt, at eventuelle ændringer i investeringsafkastet, herunder tilføjelse/fjernelse af punkter eller flytning af investeringsafkastet og punkter, opdateres (vælg Opdater fra ROI-chef), før du fortsætter til næste trin, ellers går de tabt. Yderligere detaljer om manipulation af investeringsafkast og deres punkter kan findes i FIJI / ImageJ brugervejledning.
  4. Når roi-retningen er indstillet, kan den gemmes til senere brug ved at vælge roi-navnet i ROI-lederen efterfulgt af Mere | Gem | (navn fil og angive destination for hvor der skal gemmes). Gemte investeringsafkast kan åbnes i ROI-lederen ved at vælge Mere | Åben | (vælg filen).
  5. Mål området inde i investeringsafkastet ved at vælge roi-navnet fra ROI-lederen og derefter vælge knappen Mål på roilederen. Vinduet Resultater åbnes med oplysninger om investeringsafkastet, herunder det område, det dækker på billedet (μM2) (indsat i figur 2B). Registrer disse oplysninger i et regneark til efterfølgende beregninger.
    BEMÆRK: Sørg for, at billedets skala er indstillet korrekt, så roi'ens korrekte dimensioner indsamles. De typer målinger, der rapporteres i feltet Resultater, kan ændres ved at gå til Analysér | Sæt målinger....
  6. Åbn kun et dubletbillede af PLA-kanalen ved at højrevælge PLA-billedet og vælge Dublet (Figur 2C). Der åbnes et dubletvindue. Angiv kun det kanalnummer (c), der svarer til PLA-kanalen (f.eks. 2), og fjern markeringen i afkrydsningsfeltet for Dublethyperstack. Kopiering af dette billede anbefales, så det oprindelige billede ikke ændres.
    BEMÆRK: Disse indstillinger vises kun, når du ser billederne, der indeholder flere kanaler på FIJI/ImageJ. En alternativ tilgang er at opdele kanalerne Billede | Farve | Opdel kanaler, men det vil ændre din oprindelige billedfil.
  7. Når kun billedet af PLA-kanal er markeret, skal du gå til Billede | Juster | Tærskel. Der åbnes et tærskelvindue for billedet. Vælg Standard som tærskelmetode, Rød som farve, og markér feltet Mørk baggrund. Brug det øverste spor på vinduet, skub stangen mod højre, indtil alle PLA foci er tydeligt fremhævet i billedet.
    1. Registrer værdien i boksen til højre for det øverste spor, og noter dig, hvilken værdi der blev brugt til at angive tærsklen. Vælg Anvend i vinduet Tærskel for at færdiggøre tærsklen, og billedet konverteres til en hvid baggrund med kun tærskelværdien, der er synlig som sorte prikker (Figur 2D). Test tærsklen på flere negative kontrolbilleder for at sikre, at det er hensigtsmæssigt at tage alle PLA foci fra billede til billede før kvantificering.
      BEMÆRK: Hvis du vil have vist tærskelværdien foci som sorte prikker på hvid baggrund, skal du gå til Proces | Binær | Indstillinger... og fjern markeringen i feltet Sort baggrund. En tærskelværdi mellem 30-40 er et godt udgangspunkt for at identificere PLA i kønskimen. Den ideelle værdi kan dog variere afhængigt af baggrunden.
  8. For at kvantificere PLA foci skal du anvende det investeringsafkast, der genereres fra trin 12.3-12.3.1, på tærskelbilledet ved at vælge roi-navnet i vinduet ROI-leder. Omridset af investeringsafkastet skal vises på billedet på samme sted som fra kildebilledet (Figur 2E).
    1. Gå til Analysér | Analysér partikler. Vinduet Analysér partikler åbnes, og du vælger følgende parametre: størrelse (micron^2) = 0-Infinity, cirkularitet = 0,00-1,00, show = Intet. Markér afkrydsningsfeltet Opsummer.
    2. Vælg Ok, og der vises en oversigtstabel med oplysninger om investeringsafkastet (dvs. det samlede antal PLA foci, det samlede areal, der er besat af PLA foci inde i investeringsafkastet, PLA foci'ens gennemsnitlige størrelse og procentdelen af pla foci-areal i forhold til roiens størrelse) (indsat i figur 2E). Registrer disse målinger i et regneark.
  9. Gentag trin 12.1-12.8 for flere negative kontrolbilleder med samme tærskel.
    1. Når alle negative kontrolbilleder er blevet analyseret, gentages trin 12.1-12.8 for alle forsøgsprøver, der anvender den samme tærskel, som blev bestemt af den negative kontrol for at identificere og kvantificere PLA foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Co-immunfarvning af både 3xFLAG::DLC-1; GFP og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines med FLAG- og GFP-antistoffer afslørede deres udtryksmønstre i kimen (figur 3Aii-iii,3Bii-iii). Mens GFP blev udtrykt i hele germline (Figur 3Aiii), OMA-1::GFP udtryk var begrænset til den sene pachyten og oocytter (Figur 3Biii)27. FLAG immunfarvning viser, at 3xFLAG::DLC-1 blev udtrykt i hele kønskiminen i begge stammer (Figur 3Aii,3Bii). Ved co-immunfarvning kan overlapningen mellem 3xFLAG::DLC-1 og OMA-1::GFP ikke skelnes fra overlapningen mellem 3xFLAG::DLC-1 og GFP (negativ kontrol).

Da disse forsøg testet for interaktioner mellem DLC-1 og OMA-1, regionen interesse for PLA kvantificering i germline omfattede den sene pachyten gennem oocytter i alle kendte germlines (Figur 2B), da dette er regionen OMA-1 udtryk (Figur 1, Figur 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines syntes at have en større mængde PLA foci i denne region sammenlignet med 3xFLAG::DLC-1; GFP-kimlinjer (Figur 3Ciii-iv,3Diii-iv). Kvantificering af PLA afslørede, at antallet af PLA foci til stede i 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines var signifikant større end 3xFLAG::DLC-1; GFP (Figur 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tabel 1). Selv med 10 gange højere fortynding af Antistoffer ne med gfe og flag var forskellen mellem kontrol- og forsøgsplaserne stadig signifikant forskellig. Den samlede massefylde og den gennemsnitlige størrelse af foci blev imidlertid reduceret (tabel 1).

Figure 1
Figur 1: Skemaaf C. elegans germline. Den distale tip region indeholder stamcellepuljen, som efterfølges af meiotisk pachyten, hvor cellerne har skiftet fra mitose til meiose. Celler, der forlader den meiotiske pachyten udvikle sig til oocytter, med den mest modne oocyt i den proksimale ende. Regionen skygget i grøn, som spænder fra den sene meiotiske pachyten e gennem alle oocytter, repræsenterer OMA-1 mønster af udtryk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af arbejdsgangen for kimlinje PLA-kvantificering. Den germline, der anvendes i dette tal er en repræsentativ 3xFLAG::DLC-1; GFP-kimlinje fra figur 3C. (A) Billede af fusionerede PLA- og DAPI-kanaler, der er åbnet i FIJI/ImageJ. (B) Polygonen i FIJI bruges til at skitsere og definere interesseregionen (ROI) i den germline (gul linje med hvide kasser), der kvantificeres, og arealet af investeringsafkastet (μM2) måles (indtræden af B). (C) Et enkelt billede af PLA-kanalen opnås ved at duplikere eller opdele det oprindelige billede i (A,B). (D) Tærsklen er omhyggeligt indstillet til tydeligt at fremhæve alle PLA foci i PLA-billedet. Den samme tærskel skal anvendes på alle eksperimentelle og kontrolbilleder, der vil blive analyseret sammen. (E) Med investeringsafkastet valgt i tærskelbilledet returnerer funktionen Analysér partikler en tabel over resultater, der omfatter det samlede antal foci, der er inkluderet i investeringsafkastet (indtræden af E). Billeder er snapshots fra FIJI/Image J: Plugins | Forsyningsselskaber | Hent billede. Skalastænger = 10 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af kimliner efter co-immunfarvning eller PLA. (A,B) Udtrykket mønstre af mærkede proteiner i 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) blev evalueret i dissekeret, fast, og immunplettet gonader. Anti-FLAG antistof blev anvendt ved en 1:1000 fortynding, mens anti-GFP antistof blev anvendt ved en 1:200 fortynding, hvilket er optimalt for immunofluorescens billeder. DNA blev plettet af DAPI, og den enkelte kanal er vist i gråtoner for bedre kontrast (Aiv, Biv). I hvert billede er stamcellerog meiotiske pachytener skitseret med stiplede linjer, mens oocytterne er skitseret med stiplede linjer. Billeder blev erhvervet med et epifluorescerende mikroskop. Skalastænger = 10 μM. (C,D) PLA i ekstruderet 3xFLAG::DLC-1; GFP (C) og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) gonader. Anti-FLAG antistof blev anvendt ved en 1:1000 fortynding, mens anti-GFP antistof blev anvendt ved en 1:4000 fortynding. DNA blev plettet af DAPI, og både de enkelte DAPI (Cii, Dii) og PLA kanaler (Ciii,iv, Diii,iv) er vist i gråtoner for bedre kontrast. Den grønne, stiplede boks (Ciii, Diii) angiver placeringen af de zoomede PLA-billeder (Civ, Div). I hvert billede er stamcellerog meiotiske pachytener skitseret med stiplede linjer, mens oocytterne er skitseret med stiplede linjer. Billeder blev erhvervet med et konfokalmikroskop. Skalastænger = 10 μM. (A,B,C,D) blev alle samlet med billedbehandlingssoftware (se Materialetabel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Antistoffortynding Strain Testet Gennemsnitlig PLA-tæthed (foci/μM2)X 10-2 T-test Pla Foci's gennemsnitlige størrelse (μM2) T-test
αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3,9 ± 1,4 P = 1,917E-05 0,52 ± 0,127 P = 0,057
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 9,1 ± 2,7 1,8 ± 2,08
αFLAG (1:10.000), αGFP (1:40.000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3,2 ± 2,4 P = 3,395E-04 0,51 ± 0,1 P = 0,019
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 7,7 ± 3 0,7 ± 0,24

Tabel 1: Oversigt over PLA-resultater. Tabel, der viser en sammenfatning af PLA-kvantificering ved to fortyndinger af det primære antistof. Forskellene i den gennemsnitlige PLA-tæthed eller gennemsnitlige størrelse af PLA foci for OMA-1::GFP mellem de to antistoftitreder var ikke signifikante (p-værdi blev ikke vist). Den samme sammenligning blev også anvendt på gfp, hvilket heller ikke resulterede i nogen signifikant forskel (p-værdi ikke vist). P-værdierne blev bestemt ved hjælp af en tosidet/lige varians t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når man studerer PPI i C. elegans germline, den højere opløsning, der tilbydes af PLA i forhold til co-immunfarvning tillader visualisering og kvantificering af steder, hvor interaktioner forekommer i kønsceller. Det blev tidligere rapporteret, at DLC-1 direkte interagerer med OMA-1 ved hjælp af en in vitro GST pulldown assay26; Denne interaktion blev dog ikke genoprettet ved en in vivo-pulldown. Den fluorescerende co-immunfarvning af 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines viser en overlapning i udtryksmønstrene for DLC-1 og OMA-1. der er dog ingen indikation af, hvor deres interaktioner forekommer i germlinen, og overlapningen i sig selv er ikke større end mellem 3xFLAG::DLC-1 og GFP, der ikke er smeltet til noget protein (negativ kontrol). Ved hjælp af in situ PLA blev det konstateret, at DLC-1 interagerer med OMA-1 i germline, hvilket tyder på, at PLA kan være mere følsomme for påvisning af PPI i forhold til andre tilgange. Gennem denne tilgang fortsætter vi med at udvide dlc-1's nye rolle som RBP-cofaktor. Dette arbejde viser PLA's evne til at opdage PPI i germlinen og fastlægger en reference for fremtidige brugere, der undersøger samspillet mellem proteiner af deres egen interesse.

PLA giver brugerne mulighed for at teste for PPI med sammenlignelig følsomhed uden ulemper forbundet med andre teknikker såsom FRET og BiFC. Biologisk relevante proteinekspressionsniveauer er muligvis ikke optimale for FRET og BiFC. Funktionen af potentielle interaktionspartnere kan også blive påvirket af de store tags, der anvendes i begge tilgange. Desuden kræver FRET-analyser en specialiseret mikroskopiopsætning, som muligvis ikke er umiddelbart tilgængelig. PLA kan også være en omkostningseffektiv metode til at studere PPI sammenlignet med andre teknikker. Brugerne behøver kun at få PLA-reagenser og adgang til et konfokalmikroskop til billeddannelse ud over de reagenser, der er nødvendige for immunfarvning. Billedanalyse udføres ved hjælp af open source-programmet FIJI/ImageJ, som er tilgængeligt for alle brugere uden omkostninger. Brugere, der ikke har erfaring med FRET eller BiFC, kan finde PLA som et passende alternativ. Protokollen præsenteres her indeholder kun flere yderligere trin ud over en typisk immunfarvning procedure, hvilket gør denne teknik næsten tilgængelig for enhver bruger med immunfarvning erfaring.

Ekstrudering af gonaden ved dissektion er vigtigt for PLA at arbejde med succes. Væv, der opbevares inde i ormen neglebånd er ikke mærket af PLA ved hjælp af denne protokol. Det er endvidere blevet konstateret, at ekstruderede embryoner er effektivt mærket af denne PLA-protokol. Dette tyder på, at andre væv, der frigives under dissektion, såsom tarmen, er også tilbøjelige til at være forenelige med PLA. Det er blevet konstateret, at PLA producerer robuste signaler på gonade samt embryoprøver tilberedt med to fikseringsprotokoller, der ofte anvendes til immunfarvning. Dette tyder på, at yderligere fikseringsprocedurer, der anvendes i marken, kan være forenelige med PLA, men skal evalueres individuelt af brugeren.

Bestemmelse af den optimale fortynding af primære antistoffer er afgørende for en vellykket PLA. Det er bedst at starte med fortyndingen, der er optimeret til immunfluorescens. Dette opnås typisk ved at titrere det primære antistof i et immunfluorescensforsøg for at finde den optimale fortynding, hvor der er lav baggrund og et højt, specifikt signal. Når de optimale fortyndinger til immunfluorescens er fastlagt, kan de samme fortyndinger testes i en PLA-analyse, der sammenligner signalet fra et par potentielle interactors med signalet fra et kontrolpar af ikke-interagerende proteiner.

I tilfælde, hvor der observeres rigeligt signal i kontrolprøven, er yderligere fortynding af primære antistoffer påkrævet. Det er blevet konstateret, at de optimale primære antistoffortyndinger for PLA er mindst de samme eller endnu mere fortyndede end det, der anvendes til immunfluorescens. F.eks. er immunofluorescensbilleder i figur 3A,B repræsentative for en 1:1000 fortynding af anti-FLAG og en 1:200 fortynding af anti-GFP. Men antistoffortyndinger i PLA-billeder i figur 3C,D var 1:1000 anti-FLAG og 1:4000 anti-GFP. Fortyndingen af anti-GFP antistof, der anvendes i PLA, er større end det, der blev brugt til immunfluorescens, hvilket tyder på, at PLA er meget mere følsom. Det blev konstateret, at fortyndingsantistoffer 10 gange yderligere resulterede i en reduktion af PLA-tætheden samt størrelsen af DLC-1/OMA-1 foci (tabel 1). På trods af denne reduktion var forskellen i PLA-tæthed en mellem negativ kontrol og DLC-1/OMA-1 stadig væsentligt anderledes. Dette tyder på, at PLA stadig er meget følsom med højere fortyndinger af det primære antistof; Forekomsten af påviselige interaktioner vil dog blive undervurderet.

Derimod kan for lav antistoffortynding have to slags skadelige konsekvenser. For det første kan det give et betydeligt baggrundssignal i den negative kontrol. For det andet kan PLA foci produceret af de interagerende partnerproteiner fusionere og overlappe hinanden, hvilket gør dem vanskelige at løse i et maksimalt projektionsbillede. Dette fører til en undervurdering af PLA foci-nummer og tæthed under billedanalyse. PLA-signal er en balance mellem at opdage falsk nærhed mellem ikke-interagerende partnere og detektere alle tilfælde af reelle PPI, der forekommer i stikprøven. Som følge heraf er inkorporering af en negativ kontrol, hvor to proteiner ikke interagerer, afgørende for at bestemme baggrundsniveauet i PLA-forsøg. Udeladelse af et primært antistof i et PLA-forsøg er blevet anvendt som negativ kontrol i andreindberetninger9,10. Denne fremgangsmåde kan dog ikke tage højde for uspecifikke interaktioner eller ikke-specifik antistofbinding, der kan påvirke resultatet i det eksperimentelle PLA. GFP blev brugt her som en negativ kontrol, da der ikke forventedes nogen direkte interaktion mellem DLC-1 og GFP. Det blev konstateret, at den negative kontrol havde nogle baggrundssignal. Dette underbygger yderligere betydningen af en negativ kontrol for en PLA-analyse ved vurderingen af forsøgsdataene.

Når PLA-optimerede fortyndinger er etableret, kan disse fortyndinger bruges til at teste på tværs af en række forskellige ormestammer, der indeholder forskellige par interaktionspartnere, der er mærket med de samme affinitetstags. Det er vigtigt at bruge det samme par primære antistoffer for at sikre en rimelig sammenligning af de resulterende PLA-signaler, da variation i antistofaffinitet kan påvirke resultatet af et PLA-eksperiment. En anden rapport om PLA foreslår optimering fortynding af PLA sekundære antistoffer10; Dette anbefales dog ikke. Højere fortyndinger af sekundære antistoffer kan reducere effekten af de andre downstream PLA trin, der afhænger af anerkendelse af PLUS og MINUS sonder, der er konjugeret til de sekundære antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Nogle nematode stammer, der anvendes i denne undersøgelse blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center finansieret af NIH (P40OD010440). Konfokal mikroskopi blev udført på University of Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory drives med støtte fra NIH Awards P20GM103546 og S10OD021806. Dette arbejde blev delvist støttet af NIH tilskud GM109053 til E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 til X.W., og Montana Academy of Sciences pris til X.W. Finansieringsgiverne var ikke involveret i studiedesign eller udarbejdelse af rapporten. Vi takker M. Ellenbecker for diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Tags

Udviklingsbiologi germline RNA-bindende protein LC8 PLA C. elegans nærhed ligation assay
In Situ Påvisning af Ribonucleoprotein Complex Assembly i <em>C. elegans</em> Germline ved hjælp af Nærhed Ligation Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter