Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In Situ Detektion av Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline med hjälp av Proximity Ligation Assay

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

Detta protokoll visar användning av närhet ligering analys att sond för protein-protein interaktioner på plats i C. elegans sett.

Abstract

Att förstå när och var protein-proteininteraktioner (PROT) uppstår är avgörande för att förstå proteinfunktion i cellen och hur bredare processer såsom utveckling påverkas. Caenorhabditis elegans germline är ett bra modellsystem för att studera protonger som är relaterade till reglering av stamceller, meios och utveckling. Det finns en mängd väl utvecklade tekniker som gör att proteiner av intresse kan märkas för erkännande av standardantikroppar, vilket gör detta system fördelaktigt för närhet ligering analys (PLA) reaktioner. Som ett resultat kan PLA visa var prothämmare förekommer på ett rumsligt och tidsmässigt sätt i settrar mer effektivt än alternativa metoder. Beskrivs här är ett protokoll för tillämpning och kvantifiering av denna teknik för att undersöka probetalare i C. elegans sett.

Introduction

Över 80% av proteiner beräknas ha interaktioner med andramolekyler 1, vilket betonar hur viktigt protontonitet är för utförandet av specifika biologiska funktioner i cellen2. Vissa proteiner fungerar som nav som underlättar montering av större komplex som är nödvändiga för cellöverlevnad1. Dessa nav förmedlar flera probehörningar och hjälper till att organisera proteiner i ett nätverk som underlättar specifika funktioner i en cell3. Bildandet av proteinkomplex påverkas också av biologiskt sammanhang, såsom närvaron eller frånvaron av specifika samverkande partners4,cellsignalering händelser, och utvecklingsstadiet av en cell.

C. elegans används ofta som modellorganism för en mängd olika studier, inklusive utveckling. Den enkla anatomin hos detta djur består av flera organ, inklusive gonad, tarm, och transparent nagelband, vilket underlättar analysen av maskutveckling. Den sett som bor i gonaden är ett bra verktyg för att studera hur sett stamceller mogna till könsceller5 som utvecklas till embryon och så småningom nästa generation av avkomma. Den distala spetsregionen i könscellerna innehåller en pool av självförnyande stamceller (figur 1). När stamceller lämnar nischen går de vidare till den meiotiska pachytenen och utvecklas så småningom till äggceller i det unga vuxna stadiet (figur 1). Detta utvecklingsprogram i setten är hårt reglerat genom olika mekanismer, inklusive ett regleringsnätverk efter transkription som underlättas av RNA-bindande proteiner (RBPs)6. Prothämmare är viktiga för denna regleringsverksamhet, eftersom ringpärmsmekanismer associerar med andra kofaktorer för att utöva sina uppgifter.

Det finns flera metoder som kan användas för att söka efter protoniteter i masken, men var och en har unika begränsningar. In vivo immunoprecipitation (IP) kan användas för att isolera protein-proteinkomplex från hela maskextrakt; Den här metoden anger dock inte var PPI förekommer i masken. Dessutom kan proteinkomplex som är övergående och endast bildas under ett visst utvecklingsstadium eller i ett begränsat antal celler vara svåra att återhämta sig genom samimmunprecipitation. Slutligen måste IP-experiment ta itu med problemen med proteinkomplex reassortment efter lys och icke-specifik retention av proteiner på affinitetsmatrisen.

Alternativa metoder för in situ detektion av prokrommor är co-immunostaining, Förster resonans energiöverföring (FRET), och bimolekylära fluorescenskomplementation (BiFC). Co-immunostaining bygger på samtidig detektion av två proteiner av intresse för fast mask vävnad och mätning av omfattningen av signal colocalization. Användning av super-upplösning mikroskopi, som erbjuder större detaljrikare än standardmikroskopi7, hjälper till att strängare testa protein kolacalisering utöver diffraktion-begränsad barriär på 200-300 nm8. Men co-immunostaining med både konventionella och super-upplösning mikroskopi fungerar bäst för proteiner med väldefinierade lokalisering mönster. Däremot blir det mycket mindre informativt för diffust distribuerade interagerande partners. Mätning för samlokalisering av signaler baserade på överlappning ger inte korrekt information om huruvida proteinerna är i komplex med varandra9,10.

Dessutom är samimmunitet och co-immunostaining av protein-proteinkomplex inte kvantitativa, vilket gör det svårt att avgöra om sådana interaktioner är betydande. FRET och BiFC är båda fluorescerande-baserade tekniker. FRET bygger på märkning av proteiner av intresse med fluorescerande proteiner (FPs) som har spektral överlappning vid vilken energi från en FP (givare) överförs till en annan FP (acceptor)11. Denna icke-strålningsöverföring av energi resulterar i fluorescens hos acceptor FP som kan detekteras vid dess respektive våglängd av utsläpp. BiFC är baserad på rekonstituering av ett fluorescerande protein in vivo. Det innebär att dela GFP i två kompletterande fragment, såsom helices 1-10 och helix 1112, som sedan smälts till två proteiner av intresse. Om dessa två proteiner samverkar, blir de kompletterande fragmenten av GFP tillräckligt nära i närheten av att vika och montera, rekonstruera GFP-fluorofore. Rekonstituerat genetiskt nytt liv observeras sedan direkt som fluorescens och anger var ett PPI har inträffat.

Som sådan, både FRET och BiFC beror på stora fluorescerande taggar som kan störa funktionen av taggade proteinet. Dessutom kräver FRET och BiFC rikligt och jämförbart uttryck för de taggade proteinerna för att få korrekta data. FRET kanske inte är lämpligt för experiment där en partner är över den andra, vilket kan leda till hög bakgrund13. Överuttryck i BiFC-experiment bör också undvikas, eftersom detta kan framkalla ospecifik montering14 som resulterar i ökad bakgrund. Båda teknikerna kräver optimering av uttryck och bildframställning villkor för taggade proteiner, vilket kan förlänga den tid som krävs för att slutföra experiment.

Den närhet ligering analys (PLA) är ett alternativt tillvägagångssätt som kan ta itu med begränsningarna i de tekniker som nämns ovan. PLA drar nytta av primära antikroppar som känner igen proteiner av intresse (eller deras taggar). Dessa primära antikroppar binds sedan av sekundära antikroppar som innehåller oligonukleotidsonder som kan hybridiseras med varandra när de ligger inom ett avstånd på 40 nm (eller kortare)15. Den resulterande hybridiserade DNA förstärks genom en PCR-reaktion, som detekteras av sonder som kompletterar DNA. Detta resulterar i högborgar som visualiseras av ett mikroskop. Denna teknik kan upptäcka protontontonala institut på plats i komplexa vävnader (dvs. masken gonad), som är organiserad som en löpande band som innehåller celler i olika stadier av utveckling och differentiering. Med PLA kan protonger visualiseras direkt i en fast mask gonad, vilket är fördelaktigt för att undersöka om protonger uppstår under ett visst utvecklingsstadium. PLA erbjuder större upplösning av probetalare i motsats till samlokaliseringsbaserade analyser, som är idealiska för att göra exakta mätningar. Om den används, super-upplösning mikroskopi har potential att ge finare detaljer om placeringen av PLA foci i en cell. En annan fördel är att foci till följd av PLA-reaktioner kan räknas av ett ImageJ-baserat analysarbetsflöde, vilket gör denna teknik kvantitativ.

LC8-familjen av dynein ljuskedjor beskrevs först som en underavdelning av dynein motorkomplex16 och hypotesen att fungera som en last adapter. Sedan den första upptäckten, LC8 har hittats i flera proteinkomplex utöver dynein motorkomplex17,18,19,20. Scanning för proteinsekvenser som innehåller LC8 interaktion motiv19 tyder på att LC8 kan ha många interaktioner med ett brett utbud av olika proteiner17,18,19,20,21,22. Som ett resultat, LC8 familj proteiner anses nu nav som bidrar till att främja montering av större proteinkomplex19,22, såsom församlingar av inneboende oordnade proteiner21.

Ett C. elegans LC8-familjens protein, dynein ljuskedja-1 (DLC-1), uttrycks brett över många vävnader och inte berikas i specifika subcellulära strukturer23,,24. Följaktligen är identifiering av biologiskt relevanta in vivo-partners för DLC-1 i C. elegans utmanande av flera skäl: 1) samimmunitetsförfällning anger inte vävnadskällan där interaktionen sker. 2) begränsat uttryck för vissa partners eller övergående interaktioner kan hindra förmågan att upptäcka en interaktion genom samimmunprecipitation; och 3) diffus fördelning av DLC-1 leder till icke-specifik överlappning med potentiella partnerproteiner genom co-immunostaining. Baserat på dessa utmaningar är PLA en idealisk metod för att testa in vivo-interaktioner med DLC-1.

Det har tidigare rapporterats att DLC-1 direkt interagerar med och fungerar som en kofaktor för RNA-bindande proteiner (RBPs) FBF-223 och GLD-125. Vårt arbete stöder modellen av DLC-1 fungerar som ett nav protein och föreslår att DLC-1 underlättar ett interaktionsnätverk som sträcker sig bortom dynein19,22. Med hjälp av en GST pulldown-analys har en ny DLC-1-interacting RBP med namnet OMA-1 identifierats26. OMA-1 är viktigt för äggcellstillväxt och meiotisk mognad27 och fungerar tillsammans med ett antal translationella förtryckare och aktivatorer28. Medan FBF-2 och GLD-1 uttrycks i stamceller och meiotiska pachytene regioner, respektive, OMA-1 är diffust uttryckt i könsceller från den meiotiska pachyten genom äggceller27 (figur 1). Detta tyder på att DLC-1 bildar komplex med ringpärmsmekanismer i olika regioner i gonaden. Det har också visat sig att den direkta interaktionen mellan DLC-1 och OMA-1 observerade in vitro inte återvinns genom en in vivo IP. PLA har framgångsrikt använts som en alternativ metod för att ytterligare studera denna interaktion i C. elegans sett, och resultaten tyder på att PLA kan användas för att söka många andra protonger i masken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Detta protokoll använder C. elegans stammar där potentiella interagerande partner är båda taggade. Det rekommenderas starkt att en negativ kontrollstam används, där ett taggat protein inte förväntas interagera med en annan taggad kandidatinteraktionspartner. Här användes GFP ensam som en negativ kontroll för att bedöma bakgrunden, eftersom DLC-1 inte förväntas interagera med GFP i masken. GFP-märkta OMA-1 användes som experimentell stam, som preliminära data tyder på en interaktion med DLC-1. Nematodstammar som uttrycker kontroll- och testproteiner med 3xFLAG-märktA DLC-1 kallas i denna text 3xFLAG::DLC-1; GFP och 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (stammar finns tillgängliga på begäran, mer information i register över material), respektive. Här används 3xFLAG- och GFP-taggarna; Andra taggar kan dock ersättas så länge deras antikroppar är kompatibla med PLA-kitreagenserna.

1. Djurvård

  1. Förvara maskar på ngm-plattor (nematod growth medium) som sås med OP50-stammen av E. coli och underhålls vid 24 °C för optimalt uttryck för GFP.
  2. Passage vuxna maskar var 2-3 dagar för att sprida maskar och hålla dem välnärda.

2. Beredning av synkron kultur

  1. Synkronisera maskar genom att bleka en tallrik med välnärda, gravid hermafroditer. Ett blekningsprotokoll beskrivs i Porta-de-la-Riva et al.29. Låt embryona kläckas över natten i ett centrifugrör vid 24 °C medan den roterande änden över ände i 10 ml M9 minimal media (M9) buffert. Detta kommer att producera en kultur av arresterade L1 larver.
  2. Inkubera röret av arresterade L1-steglarver på is i 10 min, toppa sedan röret med iskall 1x M9.
  3. Använd en centrifug för att pelleten larverna vid 600 x g i 5 min vid 4 °C. Sug försiktigt supernatanten så att endast 1-2 ml supernatant kvarstår.
  4. Åter avbryta pellets larverna och använd en mikropipette för att överföra 2 μL suspenderad larverkultur till en glasrutschbana. Räkna hur många larver som finns för att bestämma larvkulturens densitet, vilket hjälper till att styra sådd av maskarna i steg 2.5.
    OBS: En densitet på 10-15 L1 larver/1 μL fungerar bra för sådd.
  5. Använd en mikropipette för att överföra den volym larverkultur som behövs för att så cirka 100-120 L1-steglarver på en 60 mm OP50-platta. Till exempel utsäde 10 μL av en larverkultur som har en densitet på 10 L1 larver/1 μL kultur.
    OBS: Överskrid inte en volym på 40 μL för att så larverna, annars stör överflödig vätska OP50-gräsmattan. Om odlingsvolymen överstiger 40 μL, upprepa steg 2.3-2.4 för att ytterligare minska volymen och öka tätheten av larverkultur.
  6. Odla maskar vid 24 °C. Registrera den tid då L1s såds på tallrik och kontrollera regelbundet utvecklingsstadiet för att identifiera den idealiska tiden för dissekering.
    OBS: Vid 52 h efter sådd av L1s, maskar odlade vid 24 °C är vanligtvis i den unga vuxna scenen, vilket är det perfekta steget för dissekering för gonad-riktade PLA. Den faktiska tiden då de synkroniserade maskarna når unga vuxna stadium kan dock variera mellan stammar och inkubationstemperatur.

3. Dissekering / gonad extrudering

OBS: Dissekering för att pressa gonad är nödvändigt för gonad-riktade PLA att fungera framgångsrikt. Detta tillvägagångssätt kan också frigöra embryon, som fungerar också genom att använda detta protokoll för PLA (se Diskussion för mer information). Efter dissekering fixeras och behandlas både de negativa kontroll- och experimentproverna för PLA parallellt. Det föreslås också att ytterligare en uppsättning prover bereds för fluorescerande co-immunostaining23 för att visa uttryck mönster av protein partner av intresse.

  1. Plocka 30-40 unga vuxna maskar i en klocka glasskål som innehåller 500 μL 1x M9 + levamisole (2,5 mM slutlig koncentration). Efter att ha samlat maskarna, försiktigt ta bort och kasta de flesta av medierna för att ta bort bakterier som överförs tillsammans med maskar.
  2. Tillsätt i färsk 500 μL av 1x M9 + levamisole och använd pipetten för att försiktigt dra upp och fördela media för att skölja maskarna. Ta försiktigt bort och kasta de flesta av medierna för att rensa bakterier som överförs tillsammans med maskar.
    1. Upprepa detta steg 2x-3x tills alla bakterier tas bort. När tvättarna är klara, lämna maskar i ca 100 μL media för att hålla hydratiserade.
      OBS: Låt inte maskarna sitta i media längre än 7 minuter, eftersom detta försämrar extruderingen av gonader under dissekering. Utför tvättar under stöd av dissekera mikroskop för att övervaka borttagning av media så att maskar inte går förlorade.
  3. Med hjälp av en glas- eller polyetenpipett överför du maskar till en 25 mm x 75 mm mikroskoprutin belagd med 0,001 % poly-L-lysin (diabilder som används i detta förfarande har en epoxibelagd omkrets, vilket ger tre arbetsytor, 14 mm x 14 mm vardera). Ta bort överflödigt medium så att cirka 10-15 μL media finns kvar.
  4. Under hjälp av ett dissekering mikroskop och med hjälp av två 261/2 gauge nålar, placera en nål över den andra så att ändarna bildar en sax. Använda nålar orienterade på detta sätt, skär maskar bakom svalget för att frigöra sett. Dissekera alla maskar inom 5 minuter.
    OBS: Mer information om hur man utför dissektioner finns i en tidigare publikation av Gervaise och Arur30.
  5. När alla maskar har dissekerats, placera försiktigt ett 22 mm x 40 mm täckglas över bilden så att det är vinkelrätt mot bilden. Ändarna på täcket ska hänga av bilden.
  6. Frys rutschbanorna på ett förkylt aluminiumblock som hålls på torris i minst 20 min. Placera försiktigt en kyld penna ovanpå täcket för att förhindra att täcket lossnar på grund av isutbyggnad.

4. Fixering/blockering

  1. När du är klar för fixering, snärta av täcken med en penna eller annat trubbigt verktyg och doppa omedelbart rutschkanan i en burk som innehåller färsk, iskall metanol (kyld till -20 °C) i 1 min.
  2. Torka försiktigt av kanterna på bilden som omger provet så att nästa reagens hålls av ytspänning runt provet. Applicera 150 μl fixativ (2% formaldehyd i 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) i 5 min vid RT.
    OBS: Vi har också testat en metanol / aceton fixeringsprocedur31,32 och fann att den är kompatibel med PLA-reaktionen.
  3. Tryck på bilden till en pappershandduk i vinkelrät 90° vinkel för att låta fixativet rinna av bilden och absorbera in i pappershandduken. Block diabilder 2x för 15 min på RT i en Coplin burk med 50 ml 1x PBS/1% Triton X-100/1% nötkreatur serum albumin (PBT / BSA).
    OBS: Coplin burkar eller andra typer av färgning burkar rekommenderas för detta blockeringssteg och tvättsteg nedan i avsnitt 6-9. Dessa ger tillräckliga volymer för ett effektivt utbyte av blockerings- eller tvättbuffert med provet.
  4. Block diabilder med en PBT/BSA-lösning som innehåller 10% normalt getserum. Torka försiktigt av kanter som omger bilden och applicera 100 μL av lösningen på bilden. Inkubera i 1 h vid RT i en fuktig kammare.
    OBS: Detta steg rekommenderas starkt för färgning med αFLAG primära antikroppar. Den fuktiga kammaren är konstruerad genom att säkra glaspipetter med tejp i facket för att rutschbanorna ska ligga på när de ruvar. Dämpade arbetsservetter (Tabell över material) placeras i facket för att höja den inre luftfuktigheten i facket för att förhindra avdunstning. Locket och brickan är täckta i folie för att skydda proverna från ljus under de ljuskänsliga stegen.
  5. Placera bilden på en pappershandduk så att PBT/BSA/10%NGS-lösningen ska rinna av bilden och försiktigt torka av bildens kanter. Använd blockeringsreagensen (Tabell över material) för att blockera bilder. Applicera en droppe på utrymmet på 14 mm x 14 mm. Inkubera diabilder i 1 h vid 37 °C i fuktig kammare.

5. Primär inkubation av antikroppar

OBS: För att få bästa PLA-resultat och minimal bakgrund kan utspädningsfaktorn för de primära antikropparna kräva optimering (se Diskussion för mer information). Dessutom bör de primära antikropparna höjas i olika värdar som matchar specificiteten hos de sekundära antikroppar som används för PLA.

  1. Placera bilden på en pappershandduk så att blockerande reagens kantar av bilden och torka försiktigt kanterna. Använd antikroppsspädningsvattnet (Tabell över material) för att späda ut de primära antikropparna. Applicera 40 μl primär antikroppslösning per 14 mm x 14 mm utrymme.
  2. Inkubera glider i en fuktig kammare över natten vid 4 °C.

6. PLA-sond (sekundär antikropp) inkubation

OBS: För steg 6-9, använd tvättbuffertar A och B på RT. Om buffertarna förvaras vid 4 °C, låt dem värmas upp till RT före användning.

  1. Tvätta diabilder 2x i 5 min med 50 ml 1x tvättbuffert A (Tabell över material) på RT i en Coplin burk. Ställ in Coplin-burken på en orbital shaker inställd på 60 rpm.
  2. Placera bilden på en pappershandduk så att tvättbufferten kantar från bilden och torka försiktigt kanterna. Förbered en 40 μL-lösning som innehåller PLUS- och MINUS-sonder (utspädd 1:5 med antikroppsspädning). Applicera lösningen på varje 14 mm x 14 mm utrymme.
  3. Inkubera diabilder i en fuktig kammare i 1 h vid 37 °C.

7. Ligering

  1. Tvätta diabilder 2x i 5 min med 50 ml 1x tvättbuffert A vid RT i en Coplin burk. Ställ in Coplin-burken på en orbital shaker inställd på 60 rpm.
  2. Späd ligeringbufferten (Tabell över material) 1:5 med ultravatten. Använd den här bufferten för att späda ut lige(Tabell över material)1:40 för att förbereda ett fungerande lager av ligeringlösning.
    1. Placera bilden på en pappershandduk så att tvättbufferten kantar från bilden och torka försiktigt kanterna. Applicera 40 μL av ligeringslösningen på varje 14 mm x 14 mm utrymme.
  3. Inkubera diabilder i en fuktig kammare i 30 min vid 37 °C.

8. Förstärkning

OBS: Användning av detektionsreagenser med röda fluorofores (Tabell över material) resulterar i minst mängd bakgrund i C. elegans vävnad.

  1. Tvätta diabilder 2x i 5 min med 50 ml 1x tvättbuffert A vid RT i en Coplin burk. Ställ in Coplin-burken på en orbital shaker inställd på 60 rpm.
  2. Späd den förstärkande röda bufferten (Tabell över material) 1:5 med ultrarent vatten. Använd denna buffert för att späda ut polymeras (Tabell över material) 1:80 för att förbereda ett arbetslager av förstärkningslösning och skydda mot ljus.
    1. Placera bilden på en pappershandduk så att tvättbufferten kantar från bilden och torka försiktigt kanterna. Applicera 40 μl av förstärkningslösningen på varje 14 mm x 14 mm utrymme.
  3. Inkubera diabilder i en fuktig kammare i 1 h och 40 min vid 37 °C. Se till att den fuktiga kammaren är täckt med folie för att skydda proverna från ljus.

9. Slutliga tvättar

  1. Tvätta diabilder 2x i 10 min med 50 ml 1x tvättbuffert B (Tabell över material) på RT i en Coplin burk. Ställ in Coplin-burken på en orbital shaker inställd på 60 rpm.
  2. Tvätta diabilder 1x i 1 min med 50 ml 0,01x tvättbuffert B vid RT i en Coplin burk. Ställ in Coplin-burken på en orbital shaker inställd på 60 rpm. Denna buffert bereds genom spädning tvättbuffert B med ultrarent vatten.

10. Täcklipmontering

  1. Låt den överflödiga tvättbufferten rinna av bilden på en pappershandduk och torka bort eventuella kvarvarande bufferter kvar på den epoxibelagda omkretsen av bilden.
  2. Tillsätt 10 μl monteringsmedium (Tabell över material) för att prova och lägg försiktigt ett täckslip ovanpå, så att monteringsmediet kan spridas ut.
  3. Måla runt kanten av täckslip med nagellack för att täta täcken och glida. Var försiktig med applicering av nagellack för att undvika att flytta täcket, vilket kommer att skada settarna. Låt nagellacket härda i minst 20 minuter vid RT, medan bilderna är skyddade från ljus, innan du tittar på det under ett mikroskop.
  4. Förvara diabilder i en mörk behållare eller glidhållare, eftersom PLA-märkta prover är ljuskänsliga. Tillverkaren föreslår att diabilder kan förvaras vid -20 °C för långtidsförvaring eller vid 4 °C för kortvarig förvaring. Diabilder som bereds med detta protokoll kommer att pågå i minst 2 månader när de förvaras vid 20 °C.

11. Bild förvärv

  1. För kvantifiering, använd ett konfokalt mikroskop för att ta bilder av extruderade sett som är i klar syn, oskadad och fri. Fånga en z-stack av sett som spänner över hela sett i z-planet och generera en maximal projektionsbild att använda för kvantifiering.
    Obs: Konfokalmikroskopi är idealisk för att erhålla och kvantifiera PLA-bilder med mindre bakgrund jämfört med dem som erhållits med hjälp av ett epifluorescent mikroskop.
    1. Om germlin inte får plats i ett synfält tar du de överlappande bildfälten efter behov för att avbilda hela könsrutten. Maximala projektioner av dessa bilder kan sys ihop i FIJI.
  2. Var noga med att hålla bildförhållanden på samma sätt mellan kontroll- och experimentprover för att fastställa en rättvis och korrekt tröskel för identifiering av högborgar under bildanalys.
    OBS: Registrera minst 8-10 sett från varje prov per replikat för att underlätta statistisk analys av PLA kvantifiering. Minst tre biologiska replikat rekommenderas för PLA för att uppnå tillförlitliga och konsekventa kvantitativa resultat.

12. Bildanalys och kvantifiering med FIJI/ImageJ

Följande arbetsflöde baseras på bilder som hämtats med 40x-målet på ett konfokalmikroskop, där bilder sparas i .czi-format. Dessa .czi-bilder och tillhörande metadata, inklusive dimensioner, kan nås och öppnas i FIJI/ImageJ för vidare analys. Det bör kontrolleras om FIJI accepterar formatet för konfiktfiler från den konfiktal som är tillgänglig för den specifika användaren. Om inte, kan bilder i .tiff-format användas alternativt för analys, men användaren måste ställa in bildens skala manuellt i FIJI/ImageJ (Analyze | Ange skala). Det rekommenderas att alla negativa kontrollbilder analyseras tillsammans först för att fastställa nivån på bakgrunden.

  1. Starta analysarbetsflödet genom att analysera alla negativa kontrollbilder först och gå sedan vidare till experimentexemplen. Öppna en maximal projektionsbild i FIJI/ImageJ för att analysera (figur 2A). Om du använder en Czi-fil kommer en importalternativ för bioformat att uppmanas att göra det.
    1. Inkludera följande alternativ för att öppna bilden: visa stack med databläddrare; färgläge = Färgat. Ett fönster med bilden ska nu öppnas med ett bildfält för att växla mellan olika kanaler som fångas av confocal (t.ex.
    2. Om bilder behöver sys skapar du dubbletter av varje kanal från varje bild genom att välja bilden med musen och välja Duplicera för att öppna fönstret Duplicera. Ange endast kanalnumret (c) som motsvarar PLA- eller DAPI-kanalen (t.ex. 2) och avmarkera rutan för Duplicera Hyperstack.
    3. Med båda bilderna som ska sys öppna, välj Plugins | Sömnad | Inaktuell | 2D-sömmar. Ett fönstret Sömmar av 2D-bilder öppnas. Välj vilka bilder som ska användas för att sy och använd standardparametrarna som är förinställda i fönstret och välj sedan Ok. Den resulterande bilden blir en sammansatt gråskalebild.
      OBS: Om underbilderna inte justeras perfekt, justera parametrar (dvs. öka antalet toppar som ska kontrolleras från 5 till 500 eller ändra fusionsmetoden från linjär blandning till max. Intensitet) kan bidra till att få önskad bild. Medan andra sömnad verktyg finns tillgängliga, behåller detta tillvägagångssätt dimensionalitet av bilden, vilket är viktigt för kvantifiering.
  2. Öppna ROI-chefen (Region of Interest) genom att trycka på T på tangentbordet. Ett nytt fönster med namnet ROI Manager öppnas.
  3. Välj polygonverktyget i verktygslådan FIJI. Släpp punkter runt germline för att beskriva den och generera en ROI(figur 2B). Anslut den sista punkten till den första för att generera en komplett avkastning.
    För mörkare bilder är det bra att justera kontrasten för att förbättra sikten på germline (som är reversibel) så att den kan beskrivas mer exakt.
    1. Omedelbart efter att du har slutfört avkastningen går du till ROI-chefen och väljer Lägg till [t] för att lagra avkastningen. Det är absolut nödvändigt att alla ändringar av avkastningen inklusive att lägga till /ta bort punkter eller förflyttning av avkastningen och punkter uppdateras (välj Uppdatera från ROI manager) innan du fortsätter till nästa steg, eller de kommer att gå förlorade. Ytterligare detaljer om manipulering av rois och deras poäng finns i FIJI / ImageJ Användarhandbok.
  4. När ROI-orienteringen har ställts in kan den sparas för senare referens genom att välja ROI-namnet i ROI-chefen följt av Mer | Spara | (namnfil och ange mål för var du vill spara). Sparade ROIs kan öppnas i ROI-chefen genom att välja Mer | Öppna | (välj filen).
  5. Mät området inuti AVKASTNINGEN genom att välja ROI-namnet från ROI-chefen och välj sedan knappen Mät på ROI-chefen. Ett resultatfönster öppnas med information om avkastningen på sysselsatt kapital, inklusive det område som den täcker i bilden (μM2) (infälld bild 2B). Registrera den här informationen i ett kalkylblad för efterföljande beräkningar.
    Se till att bildens skala har ställts in korrekt så att de korrekta dimensionerna på avkastningen samlas in. De typer av mätningar som rapporteras i rutan Resultat kan ändras genom att gå till Analys | Ställ in mått....
  6. Öppna en dubblettbild av endast PLA-kanalen genom att välja PLA-bilden och välja Duplicera (Bild 2C). Ett duplicerat fönster öppnas. Ange endast kanalnumret (c) som motsvarar PLA-kanalen (t.ex. 2) och avmarkera kryssrutan för Duplicera Hyperstack. Duplicering av den här bilden rekommenderas så att den ursprungliga bilden inte ändras.
    Dessa alternativ visas bara när du visar bilderna som innehåller flera kanaler på FIJI/ImageJ. En alternativ metod är att dela kanalerna Bild | Färg | Dela kanaler, men detta kommer att ändra din ursprungliga bildfil.
  7. Med bara bilden av PLA-kanal markerad går du till Bild | Justera | Tröskelvärdet. Ett tröskelfönster för bilden öppnas. Välj Standard som tröskelmetod, Röd som färg och markera rutan Mörk bakgrund. Använd det övre spåret i fönstret och skjut fältet till höger tills alla PLA-högborgar är tydligt markerade i bilden.
    1. Registrera värdet i rutan till höger om det övre spåret och notera vilket värde som användes för att ange tröskelvärdet. Välj Använd i fönstret Tröskelvärde för att slutföra tröskelvärdet, så konverteras bilden till en vit bakgrund med endast tröskelspärren synlig som svarta punkter (bild 2D). Testa tröskelvärdet på flera negativa kontrollbilder för att säkerställa att det är lämpligt att fånga alla PLA-foci från bild till bild före kvantation.
      OBS: Om du vill visa tröskelspärrar som svarta punkter på vit bakgrund går du till Process | Binär | Alternativ... och avmarkera rutan Svart bakgrund. Ett tröskelvärde mellan 30-40 är en bra utgångspunkt för att identifiera PLA i könscellerna. Det ideala värdet kan dock variera beroende på bakgrund.
  8. Om du vill kvantifiera PLA-foci:en använder du avkastningen på avkastningen som genereras från steg 12.3-12.3.1 på tröskelbilden genom att välja ROI-namnet från ROI-hanteringsfönstret. Roi-konturen ska visas på bilden på samma plats som från källbilden (bild 2E).
    1. Gå till Analysera | Analysera partiklar. Fönstret Analysera partiklar öppnas och väljer följande parametrar: storlek (micron^2) = 0-Infinity, cirkuläritet = 0,00-1,00, visa = Ingenting. Markera rutan Summera.
    2. Välj Ok, och en sammanfattningstabell visas med information om avkastningen (dvs. det totala antalet PLA-foci, den totala yta som upptas av PLA-foci inuti i ROI, genomsnittlig storlek på PLA-foci och procentandelen av den yta som pla-högborgar har upptaget i förhållande till roi:s storlek) (infälld figur 2E). Registrera dessa mått i ett kalkylblad.
  9. Upprepa steg 12.1-12.8 för flera negativa kontrollbilder med samma tröskel.
    1. När alla negativa kontrollbilder har analyserats, upprepa steg 12.1-12.8 för alla experimentella prover med samma tröskel som bestämdes av den negativa kontrollen för att identifiera och kvantifiera PLA foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Co-immunostaining av både 3xFLAG::DLC-1; GFP och 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-sett med flagg- och GFP-antikroppar avslöjade deras uttrycksmönster i könscellerna (figur 3Aii-iii,3Bii-iii). Medan GFP uttrycktes i hela könsceller (Figur 3Aiii), OMA-1::GFP uttryck var begränsad till den sena pachyten och äggceller (figur 3Biii)27. FLAG immunfärgning visar att 3xFLAG::DLC-1 uttrycktes i hela sett i båda stammarna (Figur 3Aii,3Bii). Genom co-immunostaining är överlappningen mellan 3xFLAG::DLC-1 och OMA-1::GFP omöjlig att skilja från den mellan 3xFLAG::DLC-1 och GFP (negativ kontroll).

Eftersom dessa experiment testades för interaktioner mellan DLC-1 och OMA-1 omfattade den region av intresse för PLA-kvantifiering i könscellerna den sena pachytenenen genom äggcellerna i alla undersökta settor (figur 2B), eftersom detta är regionen OMA-1 uttryck ( figur1, figur 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-setts verkade ha en större mängd PLA-foci inom denna region jämfört med 3xFLAG::DLC-1; GFP-sett (figur 3Ciii-iv,3Diii-iv). Kvantifiering av PLA visade att antalet PLA foci närvarande i 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP-settraderna var betydligt större än 3xFLAG::DLC-1; GFP (figur 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tabell 1). Vidare, även med 10x högre utspädning av GFP och FLAG antikroppar, skillnaden mellan kontroll och experimentella PLA var fortfarande betydligt annorlunda; Focis totala densitet och genomsnittliga storlek minskade dock(tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Schematisk av C. elegans sett. Den distala spets regionen innehåller stamceller poolen, som följs av meiotic pachytene, där celler har bytt från mitos till meios. Celler som lämnar den meiotiska pachyten utvecklas till äggceller, med den mest mogna äggcellen i den proximala änden. Regionen skuggas i grönt, som sträcker sig från den sena meiotiska pachyten genom alla äggceller, representerar OMA-1 mönster av uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av arbetsflödet för kvantifiering av könsceller. Den sett som används i denna siffra är en representativ 3xFLAG::DLC-1; GFP-sett från figur 3C. (A)Bild av sammanslagna PLA- och DAPI-kanaler som öppnats i FIJI/ImageJ. B)Polygonverktyget i FIJI används för att beskriva och definiera det område av intresse (ROI) i den sett (gul linje med vita rutor) som kvantifieras, och roi-området (μM2)mäts (infälld B). (C)En enda bild av PLA-kanalen erhålls genom att duplicera eller dela upp den ursprungliga bilden i (A,B). (D)Tröskeln är noggrant inställd på att tydligt markera alla PLA foci i PLA bilden. Samma tröskel måste tillämpas på alla experimentella och kontrollbilder som ska analyseras tillsammans. (E)Med roi valt i tröskelbilden returnerar funktionen Analysera partiklar en resultattabell som inkluderar det totala antalet foci som ingår i ROI (infälld av E). Bilder är ögonblicksbilder från FIJI / Bild J: Plugins | Allmännyttiga företag | Arkivbild. Skalstaplar = 10 μM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av settar efter co-immunostaining eller PLA. (A,B) Uttrycksmönstren för taggade proteiner i 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) och 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) utvärderades i dissekeras, fasta och immunostained gonads. Anti-FLAG antikroppar användes vid en 1:1000 utspädning, medan anti-GFP antikroppar användes vid en 1:200 utspädning, vilket är optimalt för immunofluorescens bilder. DNA färgades av DAPI, och den enskilda kanalen visas i gråskala för bättre kontrast (Aiv, Biv). I varje bild, stamceller och meiotiska pachytene beskrivs med streckade linjer, medan äggcellerna beskrivs med streckade linjer. Bilder förvärvades med ett epifluorescent mikroskop. Skalstänger = 10 μM.(C,D)PLA i strängpressad 3xFLAG::DLC-1; GFP (C) och 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) gonads. Anti-FLAG antikroppar användes vid en 1:1000 utspädning, medan anti-GFP antikroppar användes vid en 1:4000 utspädning. DNA färgades av DAPI, och både de enskilda DAPI(Cii, Dii)och PLA kanaler (Ciii, iv, Diii, iv) visas i gråskala för bättre kontrast. Den gröna, streckade rutan(Ciii,Diii) betecknar platsen för de inzoomade PLA-bilderna (Civ,Div). I varje bild, stamceller och meiotiska pachytene beskrivs med streckade linjer, medan äggcellerna beskrivs med streckade linjer. Bilder förvärvades med ett konfokalt mikroskop. Skalstaplar = 10 μM. (A,B,C,D) monterades alla med bildbehandlingsprogram (se Tabell över material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Antikroppsutspädning Ansträngda Genomsnittlig PLA-densitet (foci/μM2) X 10-2 T-test Genomsnittlig storlek på PLA Foci (μM2) T-test
αFLAG (1:1000), αGFP (01:4000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3,9 ± 1,4 P = 1.917E-05 0,52 ± 0,127 P = 0,057
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 9,1 ± 2,7 1,8 ± 2,08
αFLAG (1:10 000), αGFP (1:40 000) 3xFLAG::DLC-1; GFP 3,2 ± 2,4 P = 3.395E-04 0,51 ± 0,1 P = 0,019
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 7,7 ± 3 0,7 ± 0,24

Tabell 1: Sammanfattning av PLA-resultaten. Tabell som rapporterar en sammanfattning av PLA-kvantifiering vid två utspädningar av primärantikropp. Skillnaderna i genomsnittlig PLA-densitet eller genomsnittlig storlek på PLA-högborgar för OMA-1::GFP mellan båda antikroppstitreringarna var inte signifikanta (p-värdet visades inte). Samma jämförelse tillämpades också på GFP, vilket inte heller resulterade i någon signifikant skillnad (p-värde som inte visas). P-värdena fastställdes med hjälp av ett tvåstjärtat/lika varians t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När man studerar prober i C. elegans sett, den högre upplösning som erbjuds av PLA jämfört med co-immunostaining tillåter visualisering och kvantifiering av platser där interaktioner förekommer i sett. Det har tidigare rapporterats att DLC-1 direkt interagerar med OMA-1 med hjälp av en in vitro GST pulldown analys26; Denna interaktion återställdes dock inte av en in vivo-pulldown. Fluorescerande co-immunostaining av 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-sett visar en överlappning i uttrycksmönstren för DLC-1 och OMA-1. Det finns dock ingen indikation på var deras interaktioner förekommer i sett, och överlappningen i sig är inte större än mellan 3xFLAG::DLC-1 och GFP som inte är smält till något protein (negativ kontroll). Med hjälp av in situ PLA, konstaterades det att DLC-1 interagerar med OMA-1 i sett, vilket tyder på att PLA kan vara mer känsliga för detektion av prothämmare jämfört med andra metoder. Genom detta tillvägagångssätt fortsätter vi att utveckla den framväxande rollen som DLC-1 som RBP-kofaktor. Detta arbete visar pla:s förmåga att upptäcka prottrogen i sett och upprättar en referens för framtida användare som undersöker samspelet mellan proteiner av eget intresse.

PLA erbjuder användarna möjligheten att testa för probetalare med jämförbar känslighet utan nackdelar i samband med andra tekniker som FRET och BiFC. Biologiskt relevanta nivåer av proteinuttryck kanske inte är optimala för FRET och BiFC. Dessutom kan funktionen hos potentiella interaktionspartner påverkas av de stora taggar som används i båda metoderna. Dessutom kräver FRET-analyser en specialiserad mikroskopiupplägg som kanske inte är lätt tillgänglig. PLA kan också vara ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att studera prothämmare jämfört med andra tekniker. Användare behöver bara få PLA reagenser och tillgång till ett konfokalmikroskop för bildbehandling utöver de reagenser som behövs för immunstainning. Bildanalys utförs med hjälp av open-source-programmet FIJI/ImageJ, som är tillgängligt för alla användare utan kostnad. Användare som inte har någon erfarenhet av FRET eller BiFC kan finna PLA vara ett lämpligt alternativ. Protokollet presenteras här innehåller bara flera ytterligare steg utöver en typisk immunstaining förfarande, vilket gör denna teknik praktiskt taget tillgänglig för alla användare med immunstaining erfarenhet.

Extrudering av gonad av dissekering är viktigt för PLA att fungera framgångsrikt. Vävnader som behålls inuti masken nagelband är inte märkta med PLA med hjälp av detta protokoll. Det har vidare konstaterats att extruderade embryon är effektivt märkta med detta PLA-protokoll. Detta tyder på att andra vävnader som frigörs under dissekering, såsom tarmen, är också sannolikt att vara kompatibla med PLA. Det har visat sig att PLA producerar robusta signaler på gonad samt embryoprover beredda med två fixeringsprotokoll som ofta används för immunfärgning. Detta tyder på att ytterligare fixeringsprocedurer som används i fältet kan vara kompatibla med PLA, men måste utvärderas individuellt av användaren.

Bestämning av optimal utspädning av primära antikroppar är avgörande för framgångsrik PLA. Det är bäst att börja med utspädning som har optimerats för immunfluorescens. Detta uppnås vanligtvis genom att titrera den primära antikroppen i ett immunofluorescensexperiment för att hitta den optimala utspädningen där det finns låg bakgrund och en hög, specifik signal. När de optimala utspädningarna för immunofluorescens har fastställts kan samma utspädningar testas i en PLA-analys som jämför signalen från ett par potentiella interactorer med signalen som produceras av ett kontrollpar av icke-interagerande proteiner.

I de fall då riklig signal observeras i kontrollprovet krävs ytterligare utspädning av primära antikroppar. Det har visat sig att de optimala primära antikroppsutspädningar för PLA är minst samma eller ännu mer späda än vad som används för immunofluorescens. Immunofluorescensbilder i figur 3A,B är till exempel representativa för en 1:1000-utspädning av anti-FLAG och en 1:200-utspädning av anti-GFP. Antikropparnas utspädningar i PLA-bilder i figur 3C,D var dock 1:1000 av anti-FLAG och 1:4000 av anti-GFP. Utspädningen av anti-GFP-antikroppar som används i PLA är större än vad som användes för immunofluorescens, vilket tyder på att PLA är mycket känsligare. Det konstaterades att spädning av antikroppar 10 gånger ytterligare resulterade i en minskning av PLA-densitet samt storleken på DLC-1/OMA-1 foci (tabell 1). Trots denna minskning var skillnaden i PLA-densitet mellan den negativa kontrollen och DLC-1/OMA-1 fortfarande signifikant annorlunda. Detta tyder på att PLA fortfarande är mycket känslig med högre utspädningar av primär antikropp; Förekomsten av påvisbara interaktioner kommer dock att underskattas.

Däremot kan för låg antikroppsutspädning få två typer av skadliga konsekvenser. För det första kan det ge betydande bakgrundssignal i den negativa kontrollen. För det andra kan PLA foci som produceras av de interagerande partnerproteinerna slås samman och överlappar varandra, vilket gör dem svåra att lösa i en maxprojektionsbild. Detta leder till en underskattning av PLA foci antal och densitet under bildanalys. PLA signal är en balans mellan att upptäcka falsk närhet mellan icke-interagerande partner och upptäcka varje instans av verkliga protontontonala som förekommer i provet. Som ett resultat är införlivandet av en negativ kontroll där två proteiner inte interagerar avgörande för att bestämma nivån på bakgrunden i PLA-experiment. Utelämnandet av en primär antikropp i ett PLA-experiment har använts som en negativ kontroll i andra rapporter9,10; Detta tillvägagångssätt kan dock inte ta hänsyn till ospecifika interaktioner eller ospecifik antikroppsbindning som kan påverka resultatet i den experimentella PLA. GFP användes här som en negativ kontroll, eftersom ingen direkt interaktion mellan DLC-1 och GFP förväntades. Det konstaterades att den negativa kontrollen hade någon bakgrundssignal. Detta stöder ytterligare vikten av en negativ kontroll för en PLA-analys vid utvärdering av experimentella data.

När PLA-optimerade utspädningar har fastställts kan dessa utspädningar användas för att testa över en rad olika maskstammar som innehåller olika par interaktionspartner som är taggade med samma affinitetstaggar. Det är viktigt att använda samma par primära antikroppar för att säkerställa en rättvis jämförelse av resulterande PLA-signaler, eftersom variation i antikroppsaffinitet kan påverka resultatet av ett PLA-experiment. En annan rapport om PLA föreslår att optimera utspädning av PLA sekundära antikroppar10; Detta rekommenderas dock inte. Högre utspädningar av sekundära antikroppar kan minska effekten av andra PLA-steg nedströms som är beroende av erkännande av PLUS- och MINUS-sonder som är konjugerade till de sekundära antikropparna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vissa nematod stammar som används i denna studie tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center finansieras av NIH (P40OD010440). Konfokalmikroskopi utfördes vid University of Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory drivs med stöd från NIH Awards P20GM103546 och S10OD021806. Detta arbete stöddes delvis av NIH-bidraget GM109053 till E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 till X.W., och Montana Academy of Sciences award till X.W. Finansiärerna var inte involverade i studiens utformning eller skriva rapporten. Vi tackar M. Ellenbecker för diskussion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 159 sett RNA-bindande protein LC8 PLA C. elegans närhetsligeringsanalys
In Situ Detektion av Ribonucleoprotein Complex Assembly i <em>C. elegans</em> Germline med hjälp av Proximity Ligation Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter