Summary
हम पिरामिड न्यूरॉन्स को लेबल और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई में संभावित रूपात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो न्यूरोकेमिकल और व्यवहार असामान्यताओं को आबाद कर सकता है।
Abstract
यह बताया गया है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है। पिरामिड न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक संरचना की पहचान करने के लिए, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, पिरामिड न्यूरॉन्स को दिलसी18 (3) रंग से लेबल किया जाता है और न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। न्यूरोनल संरचना की जांच करने के लिए, डेंड्रिटिक ब्रांचिंग विश्लेषण और Sholl विश्लेषण किया जाता है, जिससे शोधकर्ताओं को क्रमशः डेन्ड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता और न्यूरोनल आर्बर जटिलता के बारे में अनुमान आकर्षित करने की अनुमति मिलती है। डेन्ड्रिटिक कताई का मूल्यांकन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के अभिन्न अंग के स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके किया जाता है, जो चार श्रेणियों (यानी, पतली, मशरूम, ठूंठ, फिलोपोडिया) में कताई को वर्गीकृत करता है। इसके अलावा, एक अतिरिक्त तीन मापदंडों (यानी, लंबाई, सिर व्यास, और मात्रा) भी डेंड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान में परिवर्तन का आकलन करने के लिए चुना जाता है । बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता को मान्य करने के लिए, इन विट्रो सेल संस्कृति से पिरामिड न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक लेबल किए गए थे। कुल मिलाकर, बैलिस्टिक लेबलिंग विधि चूहों में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए अद्वितीय और उपयोगी है, जो परिष्कृत पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के संयोजन में, शोधकर्ताओं को अंतर्निहित संभावित तंत्र को स्पष्ट करने की अनुमति देता है न्यूरोकॉग्निटिव डिसफंक्शन।
Introduction
2000 में, गन एट अल तंत्रिका तंत्र में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और ग्लिया के लिए एक रैपिड लेबलिंग तकनीक का वर्णन किया गया है जो विभिन्न लिपोफिलिक रंगों को संयुक्त करता है, जिससे विभिन्न रंगों के साथ कई मस्तिष्क कोशिकाओं की एक साथ लेबलिंगकीअनुमति1,2। हाल ही में, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक Seabold एट अल3 द्वारा वर्णित किया गया था कि मस्तिष्क स्लाइस के न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट रंगों (दिल) शुरू की । एक बहुमुखी धुंधला तकनीक, बैलिस्टिक लेबलिंग कई पशु प्रजातियों में और उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग करने की क्षमता के लिए सराहना की है । इसके अलावा, इसे मस्तिष्क कोशिकाओंकीउपआबादी 3 की पहचान करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। पारंपरिक तकनीकों (उदाहरण के लिए, गोलगी-कॉक्स सिल्वर इम्प्रोगम, माइक्रोइंजेक्शन)4की तुलना में, बैलिस्टिक लेबलिंग में डेंड्रिटिक कताई सहित रूपात्मक विशेषताओं को अधिक स्पष्ट रूप से अलग करने का अवसर मिलता है, एक विशेषता जो न्यूरोनल जटिलता और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5के बारे में अनुमान लगाने के लिए महत्वपूर्ण है।
एक्सेक्टेरी पिरामिड न्यूरॉन्स एक एकल, बड़े एपिकल डेंडराइट, कई छोटे बेसल डेन्डराइट्स, और हजारों डेन्ड्रिटिक कताई6की विशेषता है। पिरामिड न्यूरॉन्स उच्च क्रम संज्ञानात्मक प्रसंस्करण से संबंधित कई मस्तिष्क क्षेत्रों में पाए जाते हैं, जिसमें प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) और हिप्पोकैम्पस शामिल हैं। पीएफसी में, पिरामिड न्यूरॉन्स परतों द्वितीय/III और परत वी में मनाया जाता है, प्रत्येक अद्वितीय आकृति विज्ञान का प्रदर्शन के साथ । विशेष रूप से, पीएफसी की परत II/III में पिरामिड न्यूरॉन्स परत V6में पिरामिड न्यूरॉन्स की तुलना में एक छोटे एपिकल डेंराइट और कम शाखाओं में बंटी है । हिप्पोकैम्पस के भीतर, पिरामिड न्यूरॉन्स सीए 1 और सीए 3 दोनों क्षेत्रों में स्थित हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग-अलग मॉर्मोलोजी प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, CA1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स एक अधिक विशिष्ट एपिकल डेंडराइट प्रदर्शित करते हैं, जिसमें सीए 3 क्षेत्र6के सापेक्ष सोमा से आगे होने वाली शाखाओं में बंटी होती है।
पीएफसी और हिप्पोकैम्पस दोनों में पिरामिड न्यूरॉन्स पर डेंड्रिटिक कताई एक्साइटरी सिनेप्स7का प्राथमिक स्थल है। डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक विशेषताएं, जिन्हें शास्त्रीय रूप से तीन प्राथमिक श्रेणियों (यानी, पतली, ठूंठ या मशरूम8)में चित्रित किया गया है, एक्सेक्टेटरी सिनेप्स9के आकार से संबंधित हैं। पतली कताई, एक लंबी, पतली गर्दन, छोटे बल्बस सिर, और छोटे पोस्टसिनैप्टिक घनत्व की विशेषता, अधिक अस्थिर हैं और कमजोर कनेक्शन विकसित करते हैं। हालांकि, मशरूम कताई, जिसमें एक बड़ा डेंड्रिटिक रीढ़ सिर होता है, मजबूत सिनैप्टिक कनेक्शन बनाने के लिए पहचाना जाता है, जो उनके बड़े आकार के परिणामस्वरूप प्रभाव होता है। इसके विपरीत, ठूंठ कताई रीढ़ की गर्दन से रहित होती है, जो लगभग समान सिर और गर्दन की मात्रा अनुपात8का प्रदर्शन करती है। हिप्पोकैम्पस के भीतर, शाखाओं में बंटी कताई भी देखी जा सकती है, जिससे रीढ़ की हड्डी में कई सिर होते हैं जो एक ही डेंड्रिटिक रीढ़ की गर्दन10से निकलते हैं। इसलिए, डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक परिवर्तन कार्यक्षमता और संरचनात्मक क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है, जिससे यह विचार होता है कि छोटे कताई सीखने और ध्यान में शामिल हैं, जबकि बड़े, अधिक स्थिर कताई, स्मृति11सहित दीर्घकालिक प्रक्रियाओं में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, डेंड्राइट के साथ डेंड्रिटिक कताई का वितरण सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5,,12से जुड़ा हो सकता है।
इस प्रकार, वर्तमान पद्धतिविज्ञान पत्र के तीन लक्ष्य हैं: 1) बैलिस्टिक लेबलिंग के लिए हमारे प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करें, जिसका उपयोग सफलता दर (यानी, न्यूरॉन्स मीटिंग चयन मानदंड और विश्लेषण के लिए उपयुक्त) के साथ किया गया है) 83.3%5,,12,,13 और कई मस्तिष्क क्षेत्रों (यानी, पीएफसी, नाभिक एक्यूबेन्स, हिप्पोकैम्पस) में); 2) तकनीक की सामान्यता और विट्रो में उगाए गए न्यूरॉन्स के लिए इसके आवेदन को प्रदर्शित करें; 3) न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में उपयोग की गई पद्धति और ऐसे डेटा से तैयार किए जा सकने वाले निष्कर्षों का विस्तार करें।
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Protocol
सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (संघीय आश्वासन संख्या: D16-00028) ।
1. DiI/टंगस्टन बीड ट्यूबिंग की तैयारी
- डीएच 2 ओ भंवर के 10 मिलीग्राम डीडीएच2ओ भंवर के साथ 100 मिलीग्राम पॉलीविनाइलपिरापोलिडोन (पीवीपी) को हल्के से भंग करें।
- पीवीपी समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ट्यूबिंग भरें और इसे 20 सीन के लिए छोड़ दें। फिर, 10 मिलीआर सिरिंज का उपयोग करके ट्यूबिंग के दूसरे छोर के माध्यम से पीवीपी समाधान को निष्कासित करें।
- मिथाइलीन क्लोराइड के 250 माइक्रोनल के साथ 170 मिलीग्राम टंगस्टन माइक्रोकैरियर मोतियों को मिलाएं। भंवर टंगस्टन माड निलंबन अच्छी तरह से।
- मिथिलीन क्लोराइड के 300 माइक्रोन के साथ 6 मिलीग्राम लिपोफिलिक डिलेक्सी18 (3) डाये को मिलाएं। भंवर DilC18 (3) अच्छी तरह से रंगे समाधान ।
नोट: धूम हुड में चरण 1.3-1.4 करें। - एक ग्लास स्लाइड पर टंगस्टन बीड निलंबन के पिपेट 250 माइक्रोन। एयर ड्राई (~ 3 मिन) के लिए निलंबन के लिए प्रतीक्षा करें।
- टंगस्टन माड निलंबन परत के शीर्ष पर DilC18 (3) रंग समाधान के 300 μL जोड़ें। DiIC18 (3) रंग समाधान और टंगस्टन बीन निलंबन अच्छी तरह से एक पिपेट टिप के साथ मिश्रण मिश्रण मिश्रण हवा सूखी (~ 3 मिन) की अनुमति मिलाएं ।
- एक बार सूख जाने के बाद, मिश्रण को दो 1.5 mL अपकेंद्री ट्यूबों में विभाजित करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। नलियों को पानी से भर दें।
- एक पानी स्नान में सोनीकेट (Amp I, 100%) समरूप (~ 5 मिन) तक। सुनिश्चित करें कि सोनिकेटर की नोक सीधे बीड निलंबन के साथ ट्यूबों पर निहित है।
- समरूप मिश्रण के दो 1.5 mL को 15 मीटर शंकुई ट्यूब में मिलाएं। एक और 3 मिन के लिए मिश्रण Sonicate।
- 10 मिलीआर सिरिंज का उपयोग करके टंगस्टन मोतियों-DilC18 (3) रंग मिश्रण को पीवीपी-लेपित ट्यूबिंग में खींचें। तैयारी स्टेशन में ट्यूबिंग फ़ीड (सामग्री की मेजदेखें) ।
- तैयारी स्टेशन पर 1 मिन के लिए घुमाएं। ध्यान से एक 10 मीटर सिरिंज का उपयोग कर टयूबिंग से सभी पानी निकालें।
- नाइट्रोजन गैस चालू करें और नाइट्रोजन प्रवाह को लगभग 0.5 लीटर प्रति मिनट (एलपीएम) में समायोजित करें, तैयारी स्टेशन में ट्यूबिंग घुमाएं, और 30 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ सूखजाएं।
- तैयारी स्टेशन से ट्यूबिंग निकालें और एक ट्यूबिंग कटर का उपयोग कर 13 मिमी लंबाई (कारतूस के लोडिंग आकार मिलान) में कटौती। 13 मिमी लंबाई को अंधेरे में प्रस्फुटन शीशियों में रखें।
2. मस्तिष्क वर्गों की तैयारी
नोट: वयस्क पुरुष F344/N चूहों एक 12/12 प्रकाश के तहत एक नियंत्रित वातावरण में रखे जोड़ी थे: भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ अंधेरे चक्र । प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों का उपयोग करने के लिए सभी जानवरों की देखभाल की गई थी ।
- 5% सेवोफ्लोरीन का उपयोग करके चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज करें।
- निम्नलिखित चरण तक आगे बढ़ें जब चूहे हानिकारक उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी नहीं होते हैं और सजगता अनुपस्थित होती है।
- एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर एक सुपीन स्थिति में चूहे सुरक्षित।
- छाती मिडलाइन के साथ त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाओ। डायाफ्राम को अलग कर कैंची से छाती खोलें। बाईं वेंट्रिकल में 20 ग्राम × 25 मिमी सुई डालें।
- तुरंत कैंची से सही एट्रियम काट लें। 100 एमएम पीबीएस का 50 एमएल प्रवाह दर के 5 एमएल/मिन के साथ परफ्यूज करें। 100 एम पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 100 मिलीआर बफर किया गया।
- परफ्यूजन के ठीक बाद पूरे चूहे के मस्तिष्क को हटा दें।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 10 मिन के लिए पूरे मस्तिष्क को पोस्टकरें।
नोट: 30 से अधिक समय के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पोस्टफिक्स न करें, क्योंकि यह लेबलिंग को प्रभावित करेगा। - चूहे के मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग करके 500 माइक्रोन मोटी कोरोनल अनुभागों को काटें (सामग्री की तालिकादेखें)। पहले कट बनाएं और ब्लेड को जगह में रखें। दूसरे ब्लेड का उपयोग करके दूसरा कट बनाएं और ब्लेड की सतह पर ऊतक रखते हुए पहले ब्लेड को लंबवत हटा दें।
- प्रत्येक कुएं में 100 एमएम पीबीएस के 1 mL के साथ मस्तिष्क स्लाइस एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में रखें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी स्लाइस काटे न जा दें।
3. मस्तिष्क वर्गों की बैलिस्टिक लेबलिंग और दृश्य
- प्रत्येक लक्षित अच्छी तरह से पीबीएस निकालें।
- कारतूस को डीआईआई/टंगस्टन बीड ट्यूबिंग के टुकड़े से लोड कर एप्लीकेटर में रखें।
- दो जाल स्क्रीन के बीच फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखो। एप्लीकेटर को हीलियम नली से कनेक्ट करें। हीलियम के आउटपुट प्रेशर को 90 पाउंड प्रति वर्ग इंच (साई) में एडजस्ट करें।
- नमूना और जाल स्क्रीन के बीच 1.5 सेमी की दूरी पर लक्षित अच्छी तरह से के केंद्र पर हाथ से लागू कर्ता को लंबवत रखें। डीआई/टंगस्टन मोतियों के टबिंग को आग लगा एं।
नोट: शूटिंग से पहले लक्षित कुओं से सभी पीबीएस को हटाना सुनिश्चित करें। - अगले डीआईआई/टंगस्टन बीड ट्यूबिंग के साथ कारतूस लोड करें। शेष स्लाइस पर टयूबिंग से लगातार डीआईआई/टंगस्टन मोतियों को आग लगाते हैं।
- पीबीएस के 100 mM के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट भरें। पीबीएस 3x के ताजा 100 मीटर के 500 माइक्रोन के साथ धोएं। पीबीएस के साथ धोने के दौरान स्लाइस को फ्लिप न करने दें।
- ताजा 100 एमएम पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें और स्लाइस को 3 घंटे के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एक ठीक ब्रश का उपयोग कर ग्लास स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरित करें।
नोट: तीन मस्तिष्क वर्गों प्रत्येक ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित किया जा सकता है । - प्रत्येक अनुभाग पर तुरंत एंटीफीका बढ़ते माध्यम का 1 mL जोड़ें। मस्तिष्क वर्गों के ऊपर 22 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप रखें। 2 दिनों के लिए अंधेरे में कांच स्लाइड सुखाएं।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें और 60 × उद्देश्य पर स्विच करें।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम को 60 × (ए/1.4, तेल) और 0.15 माइक्रोन (पिनहोल आकार 30 माइक्रोन, बैक-अनुमानित पिनहोल त्रिज्या 167 एनएम) का आवर्धन करने के लिए सेट करें। ब्याज के न्यूरॉन्स की छवियों को प्राप्त करने के लिए 543 एनएम तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।
- मस्तिष्क क्षेत्र की सीमाओं और न्यूरॉन्स की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर लक्षित न्यूरॉन प्रकार के लिए जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें।
नोट: प्रत्येक जानवर से कम से कम तीन छवियों का अधिग्रहण करें।
4. सेल संस्कृति के साथ कार्यप्रणाली का उपयोग करें
- पहले रिपोर्ट की गई कार्यप्रणाली14का उपयोग करके एक प्रसवोत्तर दिन में F344/N चूहों से प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को अलग करें ।
- एक सप्ताह के लिए 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश में संस्कृति प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स। अलगाव के बाद तीसरे दिन ताजा न्यूरॉन विकास माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम के आधे बदलें । ग्लास बॉटम डिश 2x को 100 मीटर पीबीएस के 1 एमएल से धोएं।
- कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ फिक्स करें। कोशिकाओं को बैलिस्टिक लेबल करने के लिए चरण 3.2-3.6 दोहराएं।
- 100 mM PBS 3x के 1 mL के साथ धोएं। पीबीएस के ताजा 100 मीटर के 500 माइक्रोन जोड़ें और इसे 3 घंटे के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एंटीफीका बढ़ते माध्यम के 200 μL जोड़ें।
- चरण 3.10 में मापदंडों का उपयोग करके प्रत्येक लक्षित न्यूरॉन के लिए जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें।
5. न्यूरोनल विश्लेषण और डेंड्रिटिक रीढ़ की मात्रा
- प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को रोकने के लिए कोड नंबर का उपयोग कर ब्लाइंड न्यूरॉन्स।
- ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर न्यूरॉन्स के लिए चयन मानदंड स्थापित करें।
नोट: न्यूरॉन्स के लिए चयन मानदंड ों में निरंतर डेंड्रिटिक धुंधला, कम पृष्ठभूमि, कोशिकाओं के अंदर कोई डाइ क्लस्टर, एक्स्सेलुलर स्पेस में डीआई डाइ का न्यूनतम प्रसार, पिरामिड न्यूरॉन्स की सही आकृति विज्ञान(चित्रा 1)शामिल हैं। - ओपन न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर (संलग्न वीडियो 1देखें)।
- ऊपरी बाएं हाथ के कोने में'फाइल फोल्डर'इमेज पर क्लिक करके इमेज फाइल लोड करें।
- क्लिक करें'सोमा'और छवि पर न्यूरॉन्स के सोमा को चिह्नित करें।
- क्लिक करें'ट्री'और चुनें'यूजर गाइडेड'।
- ब्याज की सभी डेंड्रिटिक शाखाओं का पता लगाएं।
नोट: पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए, जो एक एपिकल डेंडराइट और कई बेसिलिर डेंडराइट्स की विशेषता है, केवल एपिकल डेंडराइट का पता लगाया जाता है। सुनिश्चित करें कि सभी कनेक्टिंग शाखाएं एक-दूसरे से जुड़ी हुई हैं। - क्लिक करें'रीढ़"।
- डिटेक्शन पैरामीटर्स को परिभाषित करें और क्लिक करें"सभी का पता लगाएं"।
नोट: मस्तिष्क स्लाइस के लिए, मस्तिष्क क्षेत्रों में उपयोग किए जाने वाले सुसंगत पैरामीटर हैं: 2.0 (बाहरी रेंज), 0.3 (न्यूनतम ऊंचाई), 100% (डिटेक्टर संवेदनशीलता), और 10 (न्यूनतम गिनती)। सेल कल्चर के लिए डिटेक्टर सेंसिटिविटी बढ़ाना और मिनिमम काउंट कम करना जरूरी है। - "सभी वर्गीकृत"का चयन करके कताई को वर्गीकृत करें।
नोट: डेनड्रिटिक कताई को न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर15के अभिन्न एल्गोरिदम का उपयोग करके वर्गीकृत किया जाता है। - ऊपरी बाएं हाथ के कोने में डिस्क छवि का चयन करके ट्रेसिंग सहेजें।
- न्यूरोनल और डेंड्रिटिक रीढ़ की आकृति विश्लेषण करें।
- ओपन न्यूरोनल पुनर्निर्माण मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (संलग्न वीडियो 2देखें)।
- 'फाइल'और'ओपन डाटा फाइल'पर क्लिक करके इमेज लोड करें।
- न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी और डेंड्रिटिक स्पाइन मॉर्फोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए'विश्लेषण'और'ब्रांच्ड स्ट्रक्चर एनालिसिस'पर क्लिक करें।
- न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी के लिए क्लिक करें'ट्री योग'और'डेंडराइट योग'के लिए बॉक्स का चयन करें।
- डेंड्रिटिक स्पाइन मॉर्फोलॉजी के लिए क्लिक करें'स्पाइन्स'और फिर'स्पाइन डिटेल्स'के लिए बॉक्स का चयन करें।
- आउटपुट टेबल पर राइट-क्लिक करके और"सेव टू फाइल"का चयन करके आउटपुट को टेक्स्ट (.txt) फ़ाइल के रूप में सहेजें।
- क्लिक करें'विश्लेषण'और'Sholl विश्लेषण'।
- शुरुआती त्रिज्या को 10 माइक्रोन और त्रिज्या वेतन वृद्धि को 10 माइक्रोन तक सेट करें।
- बॉक्स'डेंडराइट्स'और क्लिक करें'डिस्प्ले'पर क्लिक करें।
- आउटपुट टेबल पर राइट-क्लिक करके और"सेव टू फाइल"का चयन करके आउटपुट को टेक्स्ट (.txt) फ़ाइल के रूप में सहेजें।
6. डेटा विश्लेषण
- न्यूरोनल आकृति विज्ञान (यानी, डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता) डेटा का विश्लेषण करें।
- प्रत्येक शाखा आदेश पर dendrites की संख्या जोड़ें और dendrites की कुल संख्या से विभाजित। प्रत्येक शाखा आदेश पर dendrites की संख्या के लिए सापेक्ष आवृत्तियों की गणना करने के लिए 100 से गुणा करें।
- न्यूरोनल आर्बर जटिलता और डेंड्रिटिक स्पाइन कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए Sholl विश्लेषण डेटा का विश्लेषण करें।
- प्रत्येक त्रिज्या पर चौराहों की संख्या के लिए मतलब और मानक त्रुटि की गणना करें।
- प्रत्येक त्रिज्या पर रीढ़ के प्रकार (यानी, पतले, ठूंठ, मशरूम) पर निर्भर कताई की संख्या का योग करें और उस रीढ़ के प्रकार के लिए कताई की कुल संख्या से विभाजित करें। प्रत्येक त्रिज्या पर कताई की संख्या के लिए सापेक्ष आवृत्तियों की गणना करने के लिए 100 से गुणा करें।
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Representative Results
चित्रा 2Aमें, चूहे के मस्तिष्क वर्गों में हिप्पोकैम्पल क्षेत्र में विशिष्ट पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक द्वारा की गई थी, जिसकी विशेषता एक बड़े एपिकल डेंडराइट और सोमा के चारों ओर कई छोटे बेसल डैंडराइट्स द्वारा की जाती थी। चित्रा 2B को एनानल पुनर्निर्माण मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में न्यूरॉन दिखाता है सोमा का पता चलने के बाद, डेंड्रिटिक शाखाओं का पता लगाया गया, और कताई का पता लगाया गया। इसके बाद, डेटा का विश्लेषण न्यूरोनल पुनर्निर्माण मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया, जिसने डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता(चित्रा 2 सी)और न्यूरोनल आर्बर जटिलता(चित्रा 2डी)का आकलन करने का अवसर प्रदान किया।
चित्रा 2 सीमें, हमने प्रत्येक डेंराइट और सौंपे गए शाखा आदेश के साथ तय खंडों की संख्या गिनने के लिए "ट्री योग" आउटपुट से एकत्र की गई अपकेंद्रित्र शाखा ऑर्डरिंग विधि का उपयोग किया। शाखा आदेश 1-15 के लिए प्रत्येक शाखा आदेश पर खंडों की सापेक्ष आवृत्ति की जांच की गई। जब समूहों के बीच डेंड्रिटिक शाखाओं के वितरण में बदलाव देखा गया, तो डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता में परिवर्तन अनुमानित किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूरोनल आर्बर जटिलता के पूरक उपाय के रूप में एक शोल विश्लेषण किया गया था, जिससे सोमा से हर 10 माइक्रोन होने वाले डेंड्रिटिक चौराहों की संख्या प्रत्येक नमूना अनुभाग(चित्रा 2डी)में निर्धारित की गई थी। जब समूहों के बीच डेंड्रिटिक चौराहों की संख्या में बदलाव देखा गया, तो न्यूरोनल आर्बर जटिलता में परिवर्तन अनुमानित किया जा सकता है।
डेंड्रिटिक कताई में रूपात्मक परिवर्तन लंबाई (μm), सिर व्यास (μm), और मात्रा (μm3),के रूप में चित्रा 3A-Bमें देखा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।B इसके अलावा, कताई को न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण प्रणाली का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था। प्रत्येक त्रिज्या के बीच कताई की संख्या की सापेक्ष आवृत्ति पतली, मशरूम, और ठूंठ कताई के लिए जांच की गई थी। हमारी समझ को देखते हुए कि रीढ़ के प्रकार मजबूत सिनैप्टिक कनेक्शन (यानी, स्टूबल के सापेक्ष मशरूम) और न्यूरोट्रांसमीटर एफ़ेरेंट बनाते हैं, न्यूरॉन के साथ कताई के वितरण में बदलाव सिनैप्टिक कनेक्टिविटी का संकेत दे सकता है।
इसके अलावा, हम सेल संस्कृति में एक प्राथमिक पिरामिड न्यूरॉन पर बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक की उपयोगिता मांय । सबसे पहले, हमने 2 सप्ताह के लिए पाली-एल-लिसिन के साथ लेपित सेल कल्चर प्लेट पर पोस्टनेटल डी 1 (दिन 1) में प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को सुसंस्कृत किया या लगभग 70% संप्रवाह तक। फिर नमूनों को 15 मिन के लिए 4% पीएफए के साथ तय किया गया और पीबीएस के साथ 2x धोया गया । वर्तमान प्रोटोकॉल के चरण 3.1 से शुरुआत करते हुए, हमने हिप्पोकैम्पस से प्राथमिक पिरामिड न्यूरॉन्स को बैलिस्टिक रूप से लेबल और इमेज किया। डेटा ने सोमा और बड़े एपिकल डेंडराइट(चित्रा 4A)के त्रिकोण आकार के आधार पर स्थिर लेबलिंग और पहचान पिरामिड न्यूरॉन्स को दिखाया। कोशिका संस्कृति में उगाए जाने वाले प्राथमिक पिरामिड न्यूरॉन्स के डेंड्रिटिक कताई की जांच करने के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग चूहे के मस्तिष्क में उन लोगों के समान अवसर प्रदान करता है। उदाहरण परिणाम पतले डेंड्रिटिक कताई(चित्र4B)और डेंड्रिटिक रीढ़ की लंबाई μm(चित्रा 4C)में मापा के वितरण के लिए सचित्र हैं । हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि सेल संस्कृति में उगाए गए प्राथमिक पिरामिड न्यूरॉन्स में कम डेंड्रिटिक ब्रांचिंग थी, कम से कम इस उदाहरण में, डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता और न्यूरोनल आर्बर जटिलता का मूल्यांकन किया गया था।
चित्रा 1: बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक का उपयोग करके लेबल किए गए मीडिएटल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए उपयोग किए गए चयन मानदंड। (A)मध्यकालीन प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से एक अच्छी तरह से लेबल वाले पिरामिड न्यूरॉन की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि (60x) । एक स्पष्ट सोमा और एपिकल डेंडराइट के साथ एक पिरामिड न्यूरॉन में कम पृष्ठभूमि के साथ निरंतर, उज्ज्वल डेंड्रिटिक धुंधला शामिल था। (B-C) अधिक डिस्टल शाखाओं(बी)और उच्च पृष्ठभूमि(सी)पर हल्के धुंधला के साथ मीडियाके प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स से एक पिरामिड न्यूरॉन की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि (60x) । (D)एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि (60x) एक लेबल वाले न्यूरॉन की एक मध्यस्थता कॉन्फोकल छवि (60x) से मीडियाके प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (ब्रेग्मा निर्देशांक के आधार पर) जिसमें त्रुटिपूर्ण रूपात्मक विशेषताएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: बैलिस्टिक लेबलिंग प्रौद्योगिकी और न्यूरोनाटॉमिक आकलन का उपयोग करहिपकैंपस (हिप) में पिरामिड न्यूरॉन्स की लेबलिंग। (A)बैलिस्टिक टंगस्टन मोतियों द्वारा लेबल किए गए पिरामिड न्यूरॉन्स की तीन प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां (60x) । (ख)न्यूरोनल आकृति विज्ञान का आकलन: डेंड्रिटिक ब्रांच ऑर्डर एनालिसिस और स्हॉल एनालिसिस । डेंड्रिटिक रीढ़ की खोज की गई छवि जिसमें स्पाइन मॉर्फोलॉजी को भी डेंड्रिटिक स्पाइन एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पहचाना गया था। (ग)शाखा आदेश विभिन्न शाखा आदेशों पर डेंड्रिटिक शाखाओं की सापेक्ष आवृत्ति की जांच करने के लिए उपयोग किए गए विश्लेषण करता है। (D)सोमा से हर 10 माइक्रोन डेंड्रिटिक चौराहों की संख्या का आकलन न्यूरोनल आर्बर जटिलता के उपाय के रूप में Sholl विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था । डेटा को पूरे डेटासेट(सी)की सापेक्ष आवृत्तियों के रूप में वर्णित किया गया है या 95% कॉन्फिडेंस अंतराल(डी)के साथ फिट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3. डेंड्रिटिक स्पाइन मॉर्फोलॉजी का आकलन। (ए-बी)डेंड्रिटिक कताई का वितरण रीढ़ के प्रकार (यानी, पतले, ठूंठ, मशरूम) के एक समारोह के रूप में सचित्र है। डेन्ड्रिटिक रीढ़ की आकृति विज्ञान के आकलन के रूप में अतिरिक्त डेंड्रिटिक रीढ़ के मापदंडों (यानी लंबाई, मात्रा, सिर व्यास) का भी विश्लेषण किया गया। डेटा को पूरे डेटासेट की सापेक्ष आवृत्तियों के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4. बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक का उपयोग करके प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन इन विट्रो की लेबलिंग। (क)विट्रो में बैलिस्टिक टंगस्टन मोतियों द्वारा लेबल किए गए प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां (60x) । मस्तिष्क स्लाइस में बैलिस्टिक लेबलिंग से प्राप्त लोगों के समान उदाहरण परिणाम पतले डेंड्रिटिक कताई(बी)और लंबाई(सी)के वितरण के लिए दिखाए जाते हैं। डेटा को पूरे डेटासेट की सापेक्ष आवृत्तियों के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 1: न्यूरोनल ट्रेसिंग और डेंड्रिटिक स्पाइन डिटेक्शन की प्रक्रियाएं। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)
वीडियो 2: मात्रात्मक विश्लेषण के लिए डेटा संग्रह और आउटपुट की प्रक्रियाएं। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे के मस्तिष्क और विट्रो में उगाए गए दोनों न्यूरॉन्स के लिए एक बहुमुखी लेबलिंग तकनीक का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम न्यूरोनल आकृति विज्ञान और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर और न्यूरोनल पुनर्निर्माण मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कार्यप्रणाली की रिपोर्ट करते हैं। न्यूरोनल मॉर्थोलॉजी और डेंड्रिटिक कताई का आकलन डेंड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता, न्यूरोनल आर्बर जटिलता, डेंड्रिटिक रीढ़ की आकृति विज्ञान और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी में परिवर्तन निर्धारित करने का अवसर प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल का आयोजन करते समय शोधकर्ताओं को कुछ कदमों पर विशेष ध्यान देना चाहिए । सबसे पहले, बहुत लंबे समय के लिए 4% पीएफए में फिक्सिंग के बाद लिपोफिलिक झिल्ली की अखंडता को नुकसान पहुंचाएगा और कोशिकाओं के बाहर रिसाव करने के लिए रंगे हुए कारण होगा। दूसरा, मस्तिष्क स्लाइस में बैलिस्टिक लेबलिंग की विशिष्टता की तुलना में, जो केवल न्यूरॉन्स को लक्षित करता है, विट्रो में प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की लेबलिंग ग्लिया की गैरविशिष्ट लेबलिंग का परिचय देता है क्योंकि मस्तिष्क स्लाइस में बैलिस्टिक लेबलिंग एक प्रकार के न्यूरॉन (यानी पिरामिड न्यूरॉन, मध्यम कांटेदार न्यूरॉन, कणिका कोशिका) के लिए विशिष्ट नहीं है। इस प्रकार, ब्रेग्मा निर्देशांक, रूपात्मक आकलन, या विशिष्ट सेल मार्कर को बैलिस्टिक लेबलिंग विधि के साथ जोड़ा जाना चाहिए। तीसरा, मस्तिष्क स्लाइस की मोटाई 200-500 माइक्रोन के बीच हो सकती है; सर्वोत्तम परिणामों के लिए इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए। चौथा, लेबलिंग और डाइ पेंयूप की दक्षता कई कारकों से संबंधित है, जैसे हीलियम दबाव, बैलिस्टिक आवेदन के बाद समय को इनक्यूबेटिंग, डीआई/टंगस्टन मोतियों, जाल स्क्रीन और मस्तिष्क स्लाइस की सतह के बीच की दूरी आदि। प्रोटोकॉल प्रत्येक अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। पांचवां, बड़े झुरमुट या तैयारी के दौरान बैलिस्टिक रंग लेपित टंगस्टन मोतियों के समूहों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि झुरमुट व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को प्रतिष्ठित नहीं होने देंगे। हमने यह भी निर्धारित किया है कि DiI इस बैलिस्टिक पद्धति में DiO की तुलना में अधिक पूरी तरह से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स भर में फैलाना ।
फिर भी, पारंपरिक लेबलिंग विधियों के साथ तुलना में4,बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक उच्च संकल्प confocal इमेजिंग संभव बनाता है, न्यूरोनल और डेंड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान के आकलन के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर डेंड्रिटिक कताई (यानी, पतली, मशरूम, ठूंठ), शाखा आदेश माप, शास्त्रीय Sholl विश्लेषण, और डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक विशेषताओं की माप, जैसे लंबाई (μm), सिर व्यास (μm), और मात्रा (μm3)के स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण के लिए एक एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है । कई न्यूरोनल मापदंडों का परिमाणीकरण न्यूरोकॉग्निटिव रोग अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने का अवसर प्रदान करता है।
कुल मिलाकर, बैलिस्टिक लेबलिंग विधि चूहे के विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में और सेल संस्कृति में न्यूरोनल संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देती है, जो न्यूरोकॉग्निटिव रोग अंतर्निहित संभावित तंत्रों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन में, हम एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक द्वारा पिरामिड न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए एक विधि पेश करते हैं। इसके अलावा, न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त, हमने हिप्पोकैम्पस पिरामिड न्यूरॉन्स में न्यूरोनल और डेंड्रिटिक स्पाइन आकृति विज्ञान की जांच करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। न्यूरोनल और/या डेंड्रिटिक स्पाइन आकृति विज्ञान में समूह मतभेद न्यूरोकॉग्निटिव रोग अंतर्निहित तंत्र को समझने का अवसर प्रदान करते हैं ।
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Disclosures
किसी भी लेखक के पास घोषणा करने के लिए हितों के टकराव नहीं हैं ।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच ग्रांट एचडी043680, MH106392, DA013137 और NS100624 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
