Summary
Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.
Abstract
Se ha informado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas está relacionada con su plasticidad estructural. Para identificar la estructura morfológica de las neuronas piramidales y las espinas dendríticas, se puede utilizar una técnica de etiquetado balístico. En el protocolo actual, las neuronas piramidales se etiquetan con tinte DilC18(3) y se analizan utilizando un software de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. Para investigar la estructura neuronal, se realizan análisis de ramificación dendrítica y análisis de Sholl, lo que permite a los investigadores extraer inferencias sobre la complejidad de las ramificaciones dendríticas y la complejidad del árbol neuronal, respectivamente. La evaluación de las espinas dendríticas se lleva a cabo utilizando un algoritmo de clasificación asistida automática integral para el software de reconstrucción, que clasifica las espinas en cuatro categorías (es decir, delgada, hongo, rechoncho, filopodia). Además, también se eligen otros tres parámetros (es decir, longitud, diámetro de la cabeza y volumen) para evaluar alteraciones en la morfología dendrítica de la columna vertebral. Para validar el potencial de la amplia aplicación de la técnica de etiquetado balístico, las neuronas piramidales del cultivo celular in vitro fueron etiquetadas con éxito. En general, el método de etiquetado balístico es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, lo que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción, permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes disfunción neurocognitiva.
Introduction
En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.3 que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de una amplia gama de edades. Además, se puede combinar con inmunostaining para identificar subpoblaciones de células cerebrales3. En comparación con las técnicas tradicionales (por ejemplo, imperraje de plata Golgi-Cox, microinyección)4, el etiquetado balístico ofrece la oportunidad de distinguir más claramente las características morfológicas, incluidas las espinas dendríticas, una característica que es fundamental para extraer inferencias sobre la complejidad neuronal y la conectividad sináptica5.
Las neuronas piramidales excitatorias se caracterizan por una sola dendrita apical grande, múltiples dendritas basales más cortas y miles de espinas dendríticas6. Las neuronas piramidales se encuentran en múltiples regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento cognitivo de orden superior, incluyendo la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo. En el PFC, las neuronas piramidales se observan en las capas II/III y V, con cada una de ellas una morfología única. Específicamente, las neuronas piramidales en la capa II/III de la PFC tienen una dendrita apical más corta y menos ramificación que las neuronas piramidales en la capa V6. Dentro del hipocampo, las neuronas piramidales se encuentran en las regiones CA1 y CA3, con cada una mostrando morfologías distintas. Específicamente, las neuronas piramidales en la región CA1 exhiben una dendrita apical más distintiva, con ramificaciones que ocurren más lejos del soma, en relación con la regiónCA3 6.
Las espinas dendríticas en las neuronas piramidales tanto en el PFC como en el hipocampo son el sitio principal de las sinapsis excitatorias7. Las características morfológicas de las espinas dendríticas, que se caracterizan clásicamente en tres categorías primarias (es decir, delgadas, rechonchas o setas8),se han relacionado con el tamaño de la sinapsis excitatoria9. Las espinas delgadas, caracterizadas por un cuello largo y delgado, una cabeza bulbosa pequeña y densidades postsinápticas más pequeñas, son más inestables y desarrollan conexiones más débiles. Sin embargo, las espinas de setas, que tienen una cabeza de la columna vertebral dendrítica más grande, son reconocidas por formar conexiones sinápticas más fuertes, un efecto resultante de su mayor tamaño. En contraste agudo, las espinas rechonchas están desprovistas de un cuello de columna vertebral, exhibiendo una relación de volumen de cabeza y cuello aproximadamente igual8. Dentro del hipocampo, también se pueden observar espinas ramificadas, por lo que la columna vertebral tiene múltiples cabezas que emergen del mismo cuello dela dorsal dendrítico10. Por lo tanto, los cambios morfológicos de las espinas dendríticas podrían reflejar la funcionalidad y la capacidad estructural. Además, los estudios han demostrado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas se relaciona con su plasticidad estructural, lo que lleva a la idea de que las espinas pequeñas están involucradas en el aprendizaje y la atención, mientras que las espinas más grandes y estables, están involucradas en procesos a largo plazo, incluida la memoria11. Además, la distribución de espinas dendríticas a lo largo de la dendrita puede estar asociada con la conectividad sináptica5,12.
Por lo tanto, el presente documento metodológico tiene tres objetivos: 1) Presentar nuestro protocolo de etiquetado balístico, que ha sido utilizado con una tasa de éxito (es decir, neuronas que cumplen con los criterios de selección y apropiado para el análisis) de 83,3%5,12,13 y en múltiples regiones cerebrales (es decir, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demostrar la generalización de la técnica y su aplicación a las neuronas cultivadas in vitro; 3) Detallar la metodología utilizada en el software de reconstrucción neuronal y las inferencias que se pueden extraer de dichos datos.
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Protocol
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028).
1. Preparación de tubos de cuentas DiI/Tungsteno
- Disolver 100 mg de polivinilpirrolidona (PVP) con 10 ml de ddH2O. Vortex la solución de PVP ligeramente.
- Llene el tubo con la solución PVP (ver Tabla de Materiales)y déjelo durante 20 minutos. A continuación, expulse la solución de PVP a través del otro extremo del tubo utilizando una jeringa de 10 ml.
- Combinar 170 mg de perlas de microportadora de tungsteno con 250 ml de cloruro de metileno. Vortex la suspensión de cuentas de tungsteno a fondo.
- Combinar 6 mg de tinte lipofílico DilC18(3) con 300 ml de cloruro de metileno. Vortex la solución de tinte DilC18(3) a fondo.
NOTA: Realice los pasos 1.3–1.4 en una campana de humo. - Pipetear 250 l de la suspensión de cuentas de tungsteno sobre un portaobjetos de vidrio. Espere a que la suspensión se seque al aire (3 min).
- Añadir 300 l de solución de tinte DilC18(3) en la parte superior de la capa de suspensión de cuentas de tungsteno. Mezcle bien la solución de tinte DiIC18(3) y la suspensión de cuentas de tungsteno con una punta de pipeta y deje que la mezcla se seque al aire (3 min).
- Una vez seca, usa una cuchilla de afeitar para dividir la mezcla en dos tubos centrífugos de 1,5 ml. Llene los tubos con agua.
- Sonicado en un baño de agua (Amp I, 100%) hasta que sea homogéneo (5 min). Asegúrese de que la punta del sonicador se encuentra directamente en los tubos con la suspensión del cordón.
- Combine los dos 1,5 ml de mezcla homogeneizada en un tubo cónico de 15 ml. Sonicar la mezcla durante otros 3 min.
- Dibuje la mezcla de colorante de cuentas de tungsteno-DilC18(3) en el tubo recubierto de PVP con una jeringa de 10 ml. Alimentar el tubo en la estación de preparación (ver Tabla de Materiales).
- Gire durante 1 min en la estación de preparación. Retire con cuidado toda el agua del tubo con una jeringa de 10 ml.
- Encienda el gas nitrógeno y ajuste el flujo de nitrógeno a aproximadamente 0,5 litros por minuto (LPM), gire el tubo en la estación de preparación y seque con nitrógeno durante 30 minutos.
- Retire el tubo de la estación de preparación y corte en longitudes de 13 mm (coincidiendo con el tamaño de carga del cartucho) utilizando una cortadora de tubos. Mantenga las longitudes de 13 mm en viales de centelleo en la oscuridad.
2. Preparación de secciones cerebrales
NOTA: Las ratas macho adultas F344/N fueron emparejadas alojados en un ambiente controlado bajo una luz 12/12: ciclo oscuro con acceso ad libitum a alimentos y agua. Todos los animales fueron atendidos utilizando las pautas establecidas por los Institutos Nacionales de Salud en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
- Anestetiza profundamente a las ratas usando 5% de sevoflurano.
- Proceda al siguiente paso cuando las ratas no respondan a estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
- Asegure la rata en una posición supina dentro de una campana de humo químico.
- Haga una incisión a través de la piel a lo largo de la línea media torácica. Separe el diafragma y abra el pecho con tijeras. Inserte una aguja de 20 G a 25 mm en el ventrículo izquierdo.
- Corte inmediatamente la aurícula derecha con tijeras. Perpeto 50 mL de 100 mM PBS con 5 mL/min de caudal. Perpeto 100 mL de 4% paraformaldehyde tamponado en 100 mM PBS.
- Retire todo el cerebro de la rata inmediatamente después de la perfusión.
- Postfijar todo el cerebro durante 10 min con 4% de paraformaldehído.
NOTA: No postfixen en 4% paraformaldehído durante más de 30 min, ya que afectará al etiquetado. - Cortar secciones coronales de 500 m de espesor utilizando una matriz cerebral de rata (ver Tabla de Materiales). Haga el primer corte y mantenga la hoja en su lugar. Haga un segundo corte usando una segunda cuchilla y retire verticalmente la primera cuchilla, manteniendo el tejido en la superficie de la hoja.
- Coloque las rodajas cerebrales en una placa de 24 pocillos con 1 ml de PBS de 100 mM en cada poca. Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las rebanadas.
3. Etiquetado balístico y visualización de secciones cerebrales
- Quite el PBS de cada pozo de destino.
- Cargue el cartucho con un trozo de tubo de cuentas DiI/Tungsteno y colóquelo en el aplicador.
- Coloque un trozo de papel de filtro entre dos pantallas de malla. Conecte el aplicador a la manguera de helio. Ajuste la presión de salida del helio a 90 libras por pulgada cuadrada (psi).
- Coloque el aplicador verticalmente a mano en el centro del pozo objetivo a una distancia de 1,5 cm entre la muestra y la pantalla de malla. Dispare el tubo de cuentas DiI/Tungsten.
NOTA: Asegúrese de eliminar todo el PBS de los pozos objetivo antes de disparar. - Cargue el cartucho con el siguiente tubo de cuentas DiI/Tungsten. Dispara continuamente las cuentas DiI/Tungsteno desde el tubo en las rodajas restantes.
- Llene la placa de 24 pocillos con 100 mM de PBS. Lavar con 500 ml de 100 mM frescos de PBS 3x. No deje que las rebanadas se volteen mientras se lava con PBS.
- Añadir 500 ml de PBS fresco de 100 mM y mantener las rodajas a 4 oC en la oscuridad durante 3 h.
- Transfiera las rebanadas cerebrales a diapositivas de vidrio usando un cepillo fino.
NOTA: Se pueden transferir tres secciones cerebrales a cada diapositiva de vidrio. - Añadir inmediatamente 1 ml de medio de montaje antidescolora en cada sección. Coloque un cubreobjetos de 22 mm x 50 mm sobre las secciones del cerebro. Seque los portaobjetos de vidrio en la oscuridad durante 2 días.
- Encienda el sistema de microscopio confocal y cambie a un objetivo de 60o.
- Ajuste el sistema de microscopio confocal para que tenga un aumento de 60o (A/1.4, aceite) y un intervalo de plano Z de 0,15 m (tamaño de agujero de 30 m, radio de agujero proyectado hacia atrás 167 nm). Utilice una longitud de onda de 543 nm para adquirir imágenes de las neuronas de interés.
- Obtener imágenes de la pila Z para el tipo de neurona objetivo basado en los límites de la región del cerebro y características morfológicas de las neuronas.
NOTA: Adquiera al menos tres imágenes de cada animal.
4. Uso de la metodología con cultivo celular
- Aislar las neuronas corticales primarias de ratas F344/N en el primer día postnatal utilizando la metodología14previamente reportada.
- Cultivo de neuronas corticales primarias en un plato inferior de vidrio de 35 mm durante una semana. Cambiar la mitad del medio de cultivo con medio de crecimiento de neurona fresca al tercer día después del aislamiento. Lave el plato inferior de vidrio 2x con 1 mL de 100 mM PBS.
- Fijar con 4% paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Repita los pasos 3.2–3.6 para etiquetar las células de forma balística.
- Lavar con 1 mL de 100 mM PBS 3x. Añadir 500 ml de 100 mM frescos de PBS y mantenerlo a 4 oC en la oscuridad durante 3 h.
- Añadir 200 s de medio de montaje antidescolor.
- Obtener imágenes de pila Z para cada neurona objetivo utilizando los parámetros en el paso 3.10.
5. Análisis neuronal y cuantificación dendrítica de la columna vertebral
- Neuronas ciegas usando números de código para prevenir el sesgo del experimentador.
- Establecer criterios de selección para las neuronas en función de la región cerebral de interés.
NOTA: Los criterios de selección para las neuronas incluyen tinción dendrítica continua, fondo bajo, sin grupos de tinte dentro de las células, difusión mínima del tinte DiI en el espacio extracelular, morfología correcta de las neuronas piramidales(Figura 1). - Abra el software de reconstrucción neuronal (Consulte el vídeo adjunto 1).
- Cargue un archivo de imagen haciendo clic en la imagen"Carpetade archivos" en la esquina superior izquierda.
- Haga clic en "Soma" y marque el soma de las neuronas en la imagen.
- Haga clic en "Tree" y seleccione "User-Guided".
- Traza todas las ramas dendríticas de interés.
NOTA: Para las neuronas piramidales, que se caracterizan por una dendrita apical y múltiples dendritas basilares, sólo se traza la dendrita apical. Asegúrese de que todas las ramas de conexión estén unidas entre sí. - Haga clic en"Espina".
- Defina los parámetros de detección y haga clic en"Detectar todo".
NOTA: Para las rebanadas cerebrales, los parámetros consistentes utilizados en todas las regiones cerebrales son: 2.0 (Rango exterior), 0.3 (Altura mínima), 100% (Sensibilidad del detector) y 10 (Recuento mínimo). Para el cultivo celular, es necesario aumentar la sensibilidad del detector y disminuir el recuento mínimo. - Clasificar espinas seleccionando"Clasificar todo".
NOTA: Las espinas dendríticas se clasifican utilizando un algoritmo integral del software de reconstrucción neuronal15. - Guarde el seguimiento seleccionando la Imagen de disco en la esquina superior izquierda.
- Realizar análisis morfológicos neuronales y dendríticos de la columna vertebral.
- Software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal abierta (Ver vídeo adjunto 2).
- Cargue la imagen haciendo clic en"Archivo"y "Abrir archivode datos ".
- Haga clic en "Análisis" y"Análisis de estructura ramificada"para analizar la morfología neuronal y la morfología dendrítica de la columna vertebral.
- Para la morfología neuronal, haga clic en"Totalesde árbol" y seleccione la casilla para"Totales de dendrita".
- Para la morfología dendrítica de la columna vertebral, haga clic en"Espinas"y luego seleccione la casilla para"Detalles de la columna vertebral".
- Guarde la salida como un archivo de texto (.txt) haciendo clic con el botón derecho en la tabla de salida y seleccionando"Guardaren archivo".
- Haga clic en"Analizar"y "Análisis de gritos".
- Fije el Radio inicial a 10 m y el Incremento del radio a 10 m.
- Haga clic en el cuadro "Dendrites" y haga clic en "Mostrar".
- Guarde la salida como un archivo de texto (.txt) haciendo clic con el botón derecho en la tabla de salida y seleccionando"Guardaren archivo".
6. Análisis de datos
- Analizar los datos de morfología neuronal (es decir, complejidad de ramificación dendrítica).
- Agregue el número de dendritas en cada orden de bifurcación y divida por el número total de dendritas. Multiplique por 100 para calcular las frecuencias relativas para el número de dendritas en cada orden de bifurcación.
- Analice los datos del análisis de Sholl para examinar la complejidad del árbol neuronal y la conectividad dela dorsal dendrítica.
- Calcule la media y el error estándar de la media para el número de intersecciones en cada radio.
- Sume el número de espinas que dependen del tipo de columna vertebral (es decir, delgada, rechonchas, setas) en cada radio y divídalas por el número total de espinas para ese tipo de columna vertebral. Multiplique por 100 para calcular las frecuencias relativas para el número de espinas en cada radio.
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Representative Results
En la Figura 2A,las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones del cerebro de la rata fueron identificadas por la tecnología de etiquetado balístico, caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. La Figura 2B muestra la neurona en el software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal después de que se detectó el soma, se trazaron ramas dendríticas y se detectaron espinas. Posteriormente, los datos se analizaron utilizando un software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal, que brindó la oportunidad de evaluar la complejidad de la ramificación dendrítica(Figura 2C)y la complejidad del árbol neuronal(Figura 2D).
En la Figura 2C,utilizamos el método de ordenación de ramas centrífugas, recopilado de la salida "Totales de árbol", para contar el número de segmentos atravesados a lo largo de cada dendrita y el orden de rama asignado. La frecuencia relativa de los segmentos en cada orden de sucursal se examinó para las órdenes de rama 1–15. Cuando se observaron cambios en la distribución de las ramas dendríticas entre grupos, se podían inferir alteraciones en la complejidad de las ramificaciones dendríticas. Además, se realizó un análisis de Sholl como una medida complementaria de la complejidad del árbol neuronal, mediante el que se cuantificaba el número de intersecciones dendríticas que se producía cada 10 m del soma en cada sección de muestra(Figura 2D). Cuando se observaron cambios en el número de intersecciones dendríticas entre grupos, se podrían inferir alteraciones en la complejidad del árbol neuronal.
Los cambios morfológicos en las espinas dendríticas podrían evaluarse utilizando la longitud (m), el diámetro de la cabeza (m) y el volumen (m3), como se ve en la Figura 3A–B. Además, las espinas se clasificaron utilizando el sistema de clasificación asistida automática en el software de reconstrucción neuronal. La frecuencia relativa del número de espinas entre cada radio se examinó en busca de espinas delgadas, de setas y rechonchas. Dada nuestra comprensión de qué tipos de columna vertebral forman conexiones sinápticas más fuertes (es decir, seta en relación con la rechonchas) y neurotransmisores aferents, los cambios en la distribución de las espinas a lo largo de la neurona pueden indicar conectividad sináptica.
Además, validamos la utilidad de la técnica de etiquetado balístico en una neurona piramidal primaria en el cultivo celular. En primer lugar, cultivamos neuronas primarias del hipocampo en D1 postnatal (día 1) en una placa de cultivo celular recubierta con poli-L-lisina durante 2 semanas o hasta aproximadamente 70% de confluencia. Luego las muestras se fijaron con 4% PFA durante 15 min y se lavaron 2veces con PBS. Comenzando en el paso 3.1 del protocolo actual, etiquetamos e imagendeamos balísticamente las neuronas piramidales primarias del hipocampo. Los datos mostraron etiquetado estabilizado e identificaron neuronas piramidales basadas en la forma triangular del soma y la gran dendrita apical(Figura 4A). La utilización del software de reconstrucción neuronal para investigar las espinas dendríticas de las neuronas piramidales primarias cultivadas en el cultivo celular ofrece oportunidades similares a las del cerebro de rata. Se ilustran ejemplos de resultados para la distribución de espinas dendríticas delgadas(Figura 4B)y la longitud de la columna vertebral dendrítica medida en ám(Figura 4C). Sin embargo, es digno de mención que las neuronas piramidales primarias cultivadas en el cultivo celular tenían menos ramificación dendrítica, excluyendo la evaluación, al menos en este ejemplo, de la complejidad de ramificación dendrítica y la complejidad del árbol neuronal.
Figura 1: Criterios de selección utilizados para las neuronas piramidales en la corteza prefrontal medial etiquetada mediante tecnología de etiquetado balístico. (A) Una imagen confocal representativa (60x) de una neurona piramidal bien etiquetada de la corteza prefrontal medial. Una sola neurona piramidal con un soma claro y dendrita apical incluía tinción dendrítica continua y brillante con fondo bajo. (B–C) Una imagen confocal representativa (60x) de una neurona piramidal de la corteza prefrontal medial con manchas de luz en las ramas más distales(B)y fondo alto (C). (D) Una imagen confocal representativa (60x) de una neurona etiquetada de la corteza prefrontal medial (basada en coordenadas Bregma) que tiene características morfológicas defectuosas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El etiquetado de las neuronas piramidales en el hipocampo (HIP) utilizando tecnología de etiquetado balístico y evaluaciones neuroanatómicas. (A) Tres imágenes confocales representativas (60x) de neuronas piramidales etiquetadas por cuentas de tungsteno balístico. (B) La evaluación de la morfología neuronal: análisis de orden de rama dendrítica y análisis Sholl. La imagen trazada de la columna dendrítica en la que la morfología de la columna vertebral también se identificó utilizando un software de análisis de columna dendrítica. (C) Análisis de órdenes de sucursal utilizados para examinar la frecuencia relativa de las ramas dendríticas en diferentes órdenes de bifurcación. (D) El número de intersecciones dendríticas cada 10 m del soma se evaluó utilizando el análisis Sholl como medida de la complejidad del árbol neuronal. Los datos se describen como frecuencias relativas de todo el conjunto de datos (C) o se ajustan con intervalos de confianza del 95% (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La evaluación de la morfología dendrítica de la columna vertebral. (A–B) La distribución de espinas dendríticas ilustradas en función del tipo de columna vertebral (es decir, delgada, rechonchas, setas). También se analizaron parámetros adicionales dendríticos de la columna vertebral (es decir, longitud, volumen, diámetro de la cabeza) como una evaluación de la morfología dendrítica de la columna vertebral. Los datos se ilustran como frecuencias relativas de todo el conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El etiquetado de la neurona cortical primaria in vitro utilizando la tecnología de etiquetado balístico. (A) Imágenes confocales representativas (60x) de neuronas corticales primarias etiquetadas por cuentas de tungsteno balístico in vitro. Ejemplos de resultados similares a los adquiridos a partir del etiquetado balístico en rodajas cerebrales se muestran para la distribución de espinas dendríticas delgadas (B) y longitud (C). Los datos se ilustran como frecuencias relativas de todo el conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Procedimientos de rastreo neuronal y detección de columna dorsal dendrítica. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Vídeo 2: Procedimientos de recopilación y salida de datos para análisis cuantitativo. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
En este protocolo, describimos una técnica de etiquetado versátil para las neuronas tanto del cerebro de rata como de las cultivadas in vitro. Además, informamos de la metodología para la utilización de software de reconstrucción neuronal y software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. La evaluación de la morfología neuronal y las espinas dendríticas ofrece una oportunidad para determinar alteraciones en la complejidad de las ramificaciones dendríticas, la complejidad del árbol neuronal, la morfología dendrítica de la columna vertebral y la conectividad sináptica.
Al llevar a cabo el protocolo, los investigadores deben prestar especial atención a unos pocos pasos. En primer lugar, la fijación posterior en 4% PFA durante demasiado tiempo dañará la integridad de la membrana lipofílica y hará que el tinte se filtre fuera de las células. En segundo lugar, en comparación con la especificidad del etiquetado balístico en las rebanadas cerebrales, que se dirige sólo a las neuronas, el etiquetado de las neuronas corticales primarias in vitro introduce el etiquetado inespecífico de la glia porque el etiquetado balístico en las rebanadas cerebrales no es específico para un tipo de neurona (es decir, neurona piramidal, neurona espinosa media, célula de gránulo). Por lo tanto, las coordenadas de Bregma, las evaluaciones morfológicas o los marcadores celulares específicos deben combinarse con el método de etiquetado balístico. En tercer lugar, el grosor de las rodajas cerebrales puede estar entre 200-500 m; para obtener mejores resultados, debe optimizarse. En cuarto lugar, la eficiencia del etiquetado y la penetración del tinte está relacionada con muchos factores, como la presión de helio, los tiempos de incubación después de la aplicación balística, las cuentas DiI/Tungsteno, la distancia entre la pantalla de malla y la superficie de las rebanadas cerebrales, etc. El protocolo debe optimizarse para cada estudio. Quinto, grandes grumos o racimos de cuentas de tungsteno recubiertas de tinte balístico durante la preparación deben evitarse, porque los grumos no permitirían distinguir las neuronas individuales. También determinamos que DiI se difunde a través de las neuronas individuales más completamente que DiO en esta metodología balística.
Sin embargo, en comparación con los métodos de etiquetado tradicionales4, la técnica de etiquetado balístico hace posible la imagen confocal de alta resolución, lo que permite la evaluación de la morfología neuronal y dendrítica de la columna vertebral. Además, el software de reconstrucción neuronal utiliza un algoritmo para la clasificación asistida automática de espinas dendríticas (es decir, delgadas, setas, rechonchas), mediciones de orden de ramas, análisis clásico de Sholl y medición de características morfológicas de espinas dendríticas, tales como longitud (m), diámetro de la cabeza (m) y volumen (m3). La cuantificación de múltiples parámetros neuronales ofrece la oportunidad de comprender mejor los mecanismos subyacentes a la disfunción neurocognitiva.
En general, el método de etiquetado balístico permite la visualización de estructuras neuronales en diferentes regiones cerebrales de la rata y en el cultivo celular, lo que es importante para dilucidar los posibles mecanismos subyacentes a la disfunción neurocognitiva. En el presente estudio, presentamos un método para etiquetar las neuronas piramidales mediante una técnica de etiquetado balístico. Además, combinado con el software de reconstrucción neuronal, demostramos la capacidad de examinar la morfología neuronal y dendrítica de la columna vertebral en las neuronas piramidales hipocampales. Las diferencias de grupo en la morfología neuronal y/o dendrítica de la columna vertebral proporcionan una oportunidad para entender los mecanismos subyacentes a la disfunción neurocognitiva.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por las subvenciones DE NIH HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
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