Summary
El protocolo actual establece un método riguroso y reproducible para la cuantificación de los cambios morfológicos articulares que acompañan a la osteoartritis. La aplicación de este protocolo puede ser valiosa para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas en la osteoartritis.
Abstract
Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, la osteoartritis (OA) se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de la cadera y la rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida. Hasta la fecha, no existen terapias curativas para OA capaz de ralentizar o inhibir la degeneración del cartílago. En la actualidad, hay un extenso cuerpo de investigación en curso para entender la patología de OA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos o agentes que pueden ralentizar, detener o incluso revertir OA de manera eficiente. Por lo tanto, es crucial tener un enfoque cuantitativo y reproducible para evaluar con precisión los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago articular, el sinovium y el hueso subcondral. Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación de Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o Mankin. A pesar de la importancia de estos sistemas de puntuación, son semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles, pero importantes, en el cartílago durante los estados tempranos de la enfermedad o las fases de tratamiento temprano. El protocolo que describimos aquí utiliza un sistema de software histomorfométrico computarizado y semiautomatizado para establecer una metodología cuantitativa estandarizada, rigurosa y reproducible para la evaluación de cambios conjuntos en OA. Este protocolo presenta una poderosa adición a los sistemas existentes y permite una detección más eficiente de los cambios patológicos en la articulación.
Introduction
Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, OA se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de cadera y rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida1,,2,3. El cartílago articular es el tejido conectivo especializado de las articulaciones diarthrodiales diseñadas para minimizar la fricción, facilitar el movimiento y soportar la compresión articular4. El cartílago articular se compone de dos componentes principales: condrocitos y matriz extracelular. Los condrocitos son células especializadas, metabólicamente activas que desempeñan un papel principal en el desarrollo, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular4. La hipertrofia condrocitos (CH) es uno de los principales signos patológicos del desarrollo de la OA. Se caracteriza por un aumento del tamaño celular, disminución de la producción de proteoglicano, y aumento de la producción de enzimas degradantes de la matriz de cartílago que eventualmente conducen a la degeneración del cartílago5,6,7. Además, los cambios patológicos en el hueso subcondral y el sinovium de la articulación juegan un papel importante en el desarrollo y progresión de la OA8,9,10,11,12. Hasta la fecha, no existen terapias curativas que inhiban la degeneración del cartílago1,2,3,13,14. Por lo tanto, hay una amplia investigación en curso que tiene como objetivo entender la patología oA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos que son capaces de ralentizar o incluso detener OA. En consecuencia, existe una creciente necesidad de un enfoque cuantitativo y reproducible que permita una evaluación precisa de los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago, el sinovium y el hueso subcondral de la articulación.
Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación OARSI o Mankin15. Sin embargo, estos sistemas de puntuación son sólo semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles que ocurren en la articulación durante la enfermedad o en respuesta a la manipulación genética o una intervención terapéutica. Hay informes esporádicos en la literatura que describen análisis histomorfométricos del cartílago, sinovium, o hueso subcondral16,17,18,19,20,21. Sin embargo, todavía falta un protocolo detallado para un análisis histomorfométrico riguroso y reproducible de todos estos componentes conjuntos, creando una necesidad insatisfecha en el campo.
Para estudiar los cambios patológicos en OA utilizando análisis histomorfométricos, utilizamos un modelo de ratón OA quirúrgico para inducir OA a través de la desestabilización del menisco medial (DMM). Entre los modelos establecidos de OA murina, DMM fue seleccionada para nuestro estudio porque implica un mecanismo menos traumático de lesión22,,23,,24,,25,26. En comparación con las cirugías de lesión menisca-ligamentoligamenta (MLI) o lesión del ligamento cruzado anterior (ACLI), DMM promueve una progresión más gradual de la OA, similar al desarrollo de OA en humanos22,,24,,25,,26. Los ratones fueron eutanasiados doce semanas después de la cirugía de MMC para evaluar los cambios en el cartílago articular, el hueso subcondral y el sinovium.
El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado, riguroso y cuantitativo para evaluar los cambios conjuntos que acompañan a OA.
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Protocol
Los ratones C57BL/6 de edad de doce semanas fueron comprados en Jax Labs. Todos los ratones fueron alojados en grupos de 3-5 ratones por jaula de micro-isolator en una habitación con un horario de 12 h de luz/oscuridad. Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.
1. Modelo quirúrgico de osteoartritis postraumático (PTOA)
- Anestetizar ratones usando una combinación de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal, administrar buprenorfina (1 mg/kg) a través de inyección intraperitoneal para aliviar el dolor, y afeitar el cabello sobre la rodilla. Compruebe la falta de un reflejo del pedal antes de comenzar la cirugía.
- Realizar la desestabilización de la cirugía de menisco medial (DMM) como se describió anteriormente22,23.
NOTA: Consulte las referencias de Glasson et al. y Singh et al. para obtener información más detallada sobre el protocolo quirúrgico22,23.- Hacer una incisión longitudinal de 3 mm desde la rótula distal hasta la meseta tibial proximal de la articulación derecha de la rodilla. Use una sutura para desplazar el tendón rotuliano.
- Abra la cápsula articular medial al tendón y mueva la almohadilla de grasa infrapatellar para visualizar la región intercondylar, el menisco medial y el ligamento meniscotibial23.
- Transecte el ligamento meniscotibial medial para completar dMM y desestabilizar la articulación22,,23. Cierre el lugar de la incisión con grapas o suturas.
- Realizar cirugías falsas siguiendo un procedimiento similar, pero sin transsección del ligamento meniscotibial medial.
NOTA: Los ratones fueron aleatorizados para recibir dMM o cirugía falsa. Según la literatura publicada anteriormente, los ratones desarrollan PTOA significativa 12 semanas después de la cirugía DMM22,23,24.
2. Eutanasia de ratones y recolección de muestras
- Eutanasia de ratón
- Doce semanas después de la DMM, los ratones anestesian utilizando una combinación de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
- Haga una incisión de línea media a través de la piel a lo largo del tórax y retraiga la caja torácica para exponer el corazón para la fijación de perfusión27.
NOTA: Consulte la referencia de Gage et al. para obtener información adicional sobre el protocolo para la fijación adecuada de roedores, así como la representación en vídeo del montaje y los procedimientos adecuados del equipo27. - Configure el aparato de perfusión de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Eutanasia el ratón mediante la perfumar salina heparinizada a través del ventrículo izquierdo hasta que la sangre se despeje y el hígado se palidezca. Perfundie el ratón con una formalina tamponada 10% neutra hasta que se logre una fijación completa del ratón.
NOTA: Un ratón perfundido con éxito se volverá rígido. El tiempo medio de perfusión utilizando el sistema de bomba automatizado es de 5-7 min.
- Recogida y preparación de muestras
- Aísle las rodillas cortando el hueso a media fémur y media de la tibia y diseccione el tejido muscular circundante.
- Continúe la fijación almacenando las articulaciones de la rodilla en un 10% de formalina tamponada neutra a temperatura ambiente durante 24 h, luego a 4oC durante 6 días.
- Descalcificar el hueso almacenando la muestra en tampón de descalcificación EDTA durante 1 semana a temperatura ambiente con agitación leve28. Cambie la solución de búfer de descalcificación cada 3 días.
NOTA: El tampón de descalcificación se preparó mediante la disolución de 140 g de tetrasódico EDTA ultrapuro en una solución de 850 ml de agua destilada más 15 ml de ácido acético glacial. El tampón se equilibra a 7,6 por adición por gotas de ácido acético glacial a la solución. Al alcanzar el pH de 7,6, el tampón se llevó a un volumen total de 1 L con agua destilada. El tampón de descalcificación se preparó fresco y se utilizó dentro de 1 semana de preparación. - Lavar las rodillas con 50% de etanol, luego 70% etanol para 15 min cada uno, luego proceso para la incrustación.
NOTA: El procesamiento de transferencia de fluidos fue realizado por el Núcleo Molecular e Histopatología en Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consulte el núcleo de histología de la institución para obtener recomendaciones sobre el procesamiento óptimo de muestras. - Incruste las rodillas del ratón en parafina con el aspecto medial de la articulación frente a la superficie inferior del bloque de parafina. Aplique una ligera presión en el lado tibial de la articulación durante la incrustación para asegurar que las superficies tibiales y femorales estén lo más cerca posible del mismo plano.
3. Seccionamiento de microtome y selección de diapositivas
- Seccionamiento de microtomos
- Utilice las perillas de ajuste de plano en el soporte de bloque del microtome para asegurar una cara adecuada del bloque de muestra.
- Enfréntate al bloque de parafina para que el aspecto distal del fémur, la región proximal de la tibia y los cuernos anteriores y posteriores del menisco medial aparezcan en el mismo plano para la recolección de secciones(Figura Suplementaria 1A). Comience a recoger secciones en diapositivas cuando los cuernos anterior y posterior del menisco medial comiencen a separarse unos de otros.
- Asegúrese de que la tibia, el fémur y el menisco aparezcan en el mismo plano comparando los tamaños de la estructura. La tibia y el fémur deben ser de tamaño comparable, con ambos cuernos meniscales similares en tamaño y forma(Figura Suplementaria 1A). Si una estructura parece demasiado grande en comparación con su contraparte, esto indica que se necesita una orientación adicional. Es importante destacar que confirme que el espacio de la unión permanece intacto.
- Tome secciones sagitales de las rodillas del ratón incrustadas en la parafina a través del compartimiento de la articulación medial en secciones de 5 m y recoja las secciones en los portaobjetos. Recoger aproximadamente 30 secciones por bloque de parafina.
- Selección de diapositivas
- Seleccione tres secciones representativas a 50 m de distancia para cada muestra a partir de la quinta sección (es decir, las diapositivas 5, 15 y 25). Las diapositivas seleccionadas se utilizarán para la tinción posterior, la puntuación OARSI y el análisis histomorfométrico.
NOTA: A partir de un bloque con 30 secciones totales, seleccione diapositivas desde el principio (diapositivas 5–10), medio (diapositivas 15–20) y final (diapositivas 25–30) del conjunto para representar claramente toda la muestra. Seleccione diapositivas de niveles de profundidad similares entre muestras.
- Seleccione tres secciones representativas a 50 m de distancia para cada muestra a partir de la quinta sección (es decir, las diapositivas 5, 15 y 25). Las diapositivas seleccionadas se utilizarán para la tinción posterior, la puntuación OARSI y el análisis histomorfométrico.
4. Hematoxilina, Naranja Safranina y Tinción Verde Rápida
- Deparaffinize las diapositivas seleccionadas con tres cambios de xileno. Hidratar los portaobjetos con dos cambios de 100% etanol, dos cambios de 95% etanol, y un cambio de 70% etanol.
- Mancha los portaobjetos con hematoxilina durante 7 min y luego lávese con agua corriente durante 10 min. Mancha con verde rápido durante 3 min y enjuague en ácido acético glacial 1.0% durante 10 s. Mancha con Safranin-O durante 5 min y enjuague rápidamente sumergiendo en 0.5% ácido acético glacial.
- Enjuague los portaobjetos en dos cambios de agua destilada y deje secar al aire.
- Despeje las diapositivas en tres cambios de xileno durante 5 minutos cada uno y luego monte con medios de montaje basados en xileno y un cubreobjetos.
NOTA: La hematoxilina sirve como mancha nuclear para identificar áreas de médula ósea. Safranin-O se utiliza para manchar el cartílago, proteoglicanos, mucina y gránulos de células del mástil. El verde rápido se utiliza como contramancha para el hueso.
5. Deslice la imagen
- Imagen de las diapositivas teñidas Safranin-O y Fast Green utilizando una cámara disponible conectada a un microscopio y un software de imágenes basado en computadora.
- Abra el software de imágenes (consulte Tabla de materiales)y organice la región de la articulación de la rodilla de interés (ROI) en el centro de la ventana de imágenes. Si utiliza una etapa de diapositiva sesión de microscopio rotacional, alinee la diapositiva para que la superficie tibia abarque el ancho del eje horizontal de la región de imágenes.
- Establezca el balance de blancos de la cámara antes de comenzar a crear una imagen de un conjunto de muestras(Figura complementaria 2). Imagen del compartimiento de las articulaciones en el aumento 4x y 10x, asegurando que tanto la superficie articular tibial y femoral como el hueso subcondral tibial se incluyan dentro de cada uno de los ROI de la imagen(Figura Suplementaria 1A, B). Guarde las imágenes para cada uno de los tres niveles seleccionados que se utilizarán para la puntuación OARSI.
NOTA: La configuración del balance de blancos de la cámara dependerá del software y de los sistemas de cámara que se utilicen. Por lo general, vaya a la pestaña Cámara o al menú Imágenes principales y desplácese hacia abajo hasta Establecer balance de blancos. Seleccione Establecer balance de blancos y debería aparecer un pequeño cursor o icono(Figura suplementaria 2A). Con el cursor, seleccione un área dentro de la imagen/muestra que esté libre de manchas, como el espacio de unión, para establecer el balance de blancos.
6. Sociedad de Investigación de la Osteoartritis Internacional (OARSI) puntuación15
- Aleatoriza las tres diapositivas teñidas Safranin-O y Fast Green seleccionadas de todas las muestras.
- Realizar oARSI puntuación de una manera ciega con tres observadores. Brevemente, muestre una imagen a la vez en un orden aleatorio y permita que tres observadores anoten cada imagen, correlacionando con uno de los tres niveles seleccionados para cada muestra.
NOTA: Consulte la tabla de puntuación oARSI para obtener descripciones detalladas de la escala de calificación15. - Calcule la puntuación media de cada sección utilizando puntuaciones individuales de cada observador. Determine la puntuación media por muestra tomando la puntuación media de las tres secciones representativas.
7. Análisis histomorfométrico
NOTA: Las imágenes en vivo de la articulación de la rodilla se ven en un monitor de pantalla táctil utilizando una cámara de microscopio, y se utiliza un lápiz óptico para rastrear manualmente los IU. Los algoritmos integrados del software de histomorfometría cuantifican los parámetros especificados (consulte Protocolo a continuación) en los ROI definidos. Es importante destacar que las mismas secciones teñidas Safranin-O y Fast Green utilizadas en la puntuación OARSI se utilizan para el análisis histomorfométrico.
- Configuración del software y preparación de la medición
- Encienda el microscopio, la cámara, el ordenador y el monitor de pantalla táctil. Haga clic en el icono de software para iniciar el programa de software. Coloque la diapositiva en el escenario del microscopio para verla.
- Centre la muestra dentro de la ventana de medición. Asegúrese de que la rejilla de medición esté ajustada a la ampliación adecuada para que coincida con el objetivo que se utiliza en el microscopio(Figura complementaria 3).
- Vaya a la pestaña Archivo en la parte superior de la pantalla y desplácese hacia abajo hasta Configuración de lectura. Abra la ventana Configuración y seleccione el archivo de configuración adecuado para los parámetros que se van a medir.
- Seleccione el parámetro que se va a medir de la lista en el lado derecho de la pantalla(Figura complementaria 3). Utilice el lápiz o el cursor del ratón para trazar imágenes de acuerdo con los pasos descritos a continuación con el fin de medir ROI de tejido específicos. Cuando se complete con cada medición, haga clic con el botón derecho para finalizar la medición y continuar con el siguiente parámetro.
NOTA: La lista de parámetros a medir se crea a través de un archivo de preferencias distinto que se configura en consulta con la empresa de software con el fin de medir los ROI descritos. Consulte la discusión para obtener más detalles sobre la configuración completa. - Complete todas las mediciones y, a continuación, vaya a la pestaña Datos de resumen en la parte inferior de la pantalla del software(Figura complementaria 3). Haga clic en la ventana de la pantalla, presione la tecla Insertar en el teclado o copie y pegue los datos en una hoja de cálculo independiente.
NOTA: Realice análisis histomorfométricos de manera aleatoria y ciega. Después de completar todas las mediciones de parámetros para todas las muestras, organice los datos y promedie las mediciones de las tres diapositivas de cada muestra.
- Mediciones de las áreas de cartílago total, calcificada y no calcificada
NOTA: Utilice un software disponible comercialmente (consulte La Tabla de materiales)para realizar estos pasos. Consulte la Figura suplementaria 1B,C para obtener aclaraciones sobre las regiones de cartílago, las uniones y las regiones óseas subcondrales que se describen a lo largo de esta sección.- Dibuja una línea a través del borde superior de la superficie del cartílago tibial donde el cartílago se encuentra con el espacio de la articulación. Dibuje una segunda línea en la unión consódro-óseo donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral(Figura 1B). Utilice la función de área de software para obtener automáticamente la medición total del área del cartílago.
- Dibuja una línea a lo largo de la marca de la marea, una línea natural que separa las regiones calcificadas y no calcificadas del cartílago. Dibuje una segunda línea en la unión consódro-óseo donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral(Figura 1B). Utilice la función de área de software para obtener automáticamente la medición del área del cartílago calcificado.
- Calcular el área del cartílago uncalcificado restando el área del cartílago calcificado de la zona total del cartílago(Figura 1B).
- Determinación del número de condrocitos y el fenotipo
- Crear funciones de recuento separadas dentro de los ajustes del software de histomorfometría para distinguir los condrocitos no productores de matriz y matriz(Figura 1B).
- Determinar el número de matrices que producen o no condrocitos utilizando el lápiz para hacer un pequeño punto sobre cada condrocitos que expresan el fenotipo especificado(Figura 1B).
NOTA: Cuente las células según su fenotipo como matriz que produce (es decir, tinción fuerte de Safranina-O) o matriz no producedora (es decir, muy débil o no tiene tinción Safranin-O).
- Medición del perímetro de la superficie articular tibial
- Mida el perímetro absoluto de la superficie articular tibial trazando una línea a través de la superficie del cartílago tibial, definiendo cuidadosamente las fibrilaciones individuales(Figura 1C).
- Dibuje una segunda línea a lo largo de la marca de marca para servir como control interno para el plano de cada sección(Figura 1C).
- Calcular el índice de fibrilación de la superficie articular tibial dividiendo el perímetro de la superficie articular tibial por el perímetro de la marca de la marca de la marca.
NOTA: Los perímetros de Tidemark son generalmente iguales entre las muestras, por lo que la diferencia en los perímetros de la superficie articular entre la farsa y el DMM era generalmente pequeña, ya fuera que se utilizara el perímetro absoluto o el índice de fibrilación.
- Medición de las áreas espaciales de hueso y médula subcondral
- Mida el área del espacio de la médula subcondral utilizando la función Area delineando regiones de la región subcondral manchadas únicamente con hematoxilina (es decir, negativa para El verde rápido) para determinar el área del espacio de la médula total dentro del hueso subcondral. Dibuje líneas alrededor del perímetro de estas áreas para determinar el área total de todo el espacio de la médula dentro del hueso subcondral tibial(Figura 2B).
- Mida el área subcondal total utilizando la función de área delineando la región entre la unión conndro-oseo y el borde superior de la placa de crecimiento, extendiéndose lateralmente a las regiones de los osteofitos anteriores y posteriores(Figura 2B).
- Calcule el área ósea subcondral restando el área del espacio de la médula ósea subcondral del área subcondral total(Figura 2B,C).
- Medición de las áreas osteofidas anterior y posterior
- Para medir el área osteofito, trace los osteofitos anteriores y posteriores de la tibia proximal utilizando la función Area (Figura 2B,E,F).
NOTA: Los osteofitos son proyecciones óseas que se forman entre el cartílago articular y la placa de crecimiento, anterior o posterior a la región subcondral. Las áreas osteofitosas en los lados anterior y posterior de la tibia se determinan trazando el área anterior o posterior al hueso subcondral. La unión entre los osteofitos y el hueso subcondral está claramente delineada por una línea de células que se extiende desde el cartílago articular hasta la placa de crecimiento. La unión entre el osteofito y el sinovium se define por una transición entre el tejido óseo y el tejido fibroso.
- Para medir el área osteofito, trace los osteofitos anteriores y posteriores de la tibia proximal utilizando la función Area (Figura 2B,E,F).
- Medición del espesor sinovial
- Mida el espesor sinovial femoral anterior utilizando la función Area dibujando una línea desde el punto de inserción interno del sinovium anterior en el fémur hacia su punto de fijación en el menisco(Figura 3B).
- Dibuje una segunda línea desde la inserción externa del sinovium en el fémur hacia su apego al menisco(Figura 3B).
- Calcular el espesor sinovial dividiendo el área sinovial total por el perímetro sinovial.
8. Análisis estadístico
- Recopile los parámetros medidos y promedie los resultados de las tres secciones representativas de cada muestra. Analice los datos mediante la prueba t de un alumno no emparejado para comparar dos grupos o ANOVA unidireccional para comparar tres o más grupos.
- Visualice los datos como media - error estándar de media.
NOTA: La significación estadística se logró en p a 0,05.
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Representative Results
Resultados de OA inducidos por DMM en degeneración del cartílago articular y pérdida de condrocitos
La OA inducida por DMM dio lugar a un aumento de la puntuación de OARSI en comparación con los ratones falsos, claramente caracterizado por la erosión superficial y la pérdida de cartílago(Figura 1A,D). El protocolo de histomorfometría detallado aquí detectó varios cambios asociados a La OA, incluyendo una disminución en el área total del cartílago y en el área del cartílago no calcificado(Figura 1A,B,E,G); reducción del número total de condrocitos; y, lo que es más importante, la pérdida de matriz que produce condrocitos(Figura 1H,I). Los cambios en la superficie articular, indicativos de la gravedad de la erosión, se evaluaron utilizando el índice de fibrilación del cartílago. En general, el índice de fibrilación aumentó en ratones DMM(Figura 1C,K,L). Sin embargo, también es importante tener en cuenta que el índice de fibrilación puede disminuir en la etapa final de la OA debido a la erosión completa de la superficie del cartílago, como se discute en el Protocolo. Un aumento en el índice de fibrilación significa degeneración de la superficie del cartílago articular durante el desarrollo y progresión de la AE. Estos resultados destacan la capacidad del programa de análisis histomorfométrico para detectar y cuantificar los cambios patológicos del cartílago que caracterizan la progresión de la OA.
Evaluación de otros cambios conjuntos en la OA inducida por DMM
La OA afecta a los tejidos articulares que no son el cartílago, y los cambios patológicos en estos tejidos juegan un papel crucial en la progresión de la enfermedad. Aquí, el método de análisis histomorfométrico descrito reveló un aumento en el área ósea subcondral y una reducción en el área del espacio de la médula ósea en ratones DMM(Figura 2A–D), indicando esclerosis ósea subcondral29,30. Tanto las áreas de osteofitos anteriores como posteriores también aumentaron en ratones DMM(Figura 2E,F), lo que sugiere una remodelación ósea subcondral continua que actúa como mecanismo compensatorio para manejar los cambios en la carga articular en el lugar de la lesión29,,30.
El análisis histomorfométrico del sinovium mostró un aumento del espesor sinovial en ratones DMM(Figura 3A–C),que es un resultado típico de la inflamación sinovial asociada a la OA y la difusión de citoquinas inflamatorias en el espacio articular11,,12,31,32,33,34.
Análisis de la variabilidad entre usuarios entre la puntuación OARSI frente a la histomorfometría
La Figura 4A no muestra ninguna variabilidad interuser significativa tanto del análisis histomorfométrico de la zona del cartílago no calcificado(Figura 4A)como de la puntuación OARSI(Figura 4B). Sin embargo, el análisis histomorfométrico mostró una diferencia media extremadamente baja entre los observadores que oscilaba entre -0.0001179-0.00120, lo que llevó a una superposición casi completa de los resultados obtenidos por los tres observadores, mientras que la diferencia media entre los observadores fue mayor en la puntuación OARSI que oscilaba entre -0.3-0.0.3 con una clara desviación de los valores de O1 de los valores de O2 y O3.
Figura 1: Histomorfometría del cartílago articular tibial y fenotipos de condrocitos articulares de la cirugía falsa y ratones DMM. (A) Superficie articular tibial teñida con Safranin-O/Fast Green. (B) El análisis histomorfométrico se utilizó para rastrear el área total del cartílago y el área del cartílago calcificado (naranja). El cartílago superior al área de la marca de la marca se calculó como el cartílago no calcificado (verde). Dentro del área del cartílago no calcificado se contaron los condrocitos productores de matriz (blanco) y los condrocitos no productores de matriz (magenta). (C) El perímetro de la superficie articular tibial se midió trazando la superficie articular (línea azul) seguida de la marca de marea (línea púrpura) para determinar el índice de fibrilación. (D) La puntuación de OARSI aumentó en ratones DMM. (E–L) Representación gráfica de las áreas cuantificadas del cartílago y recuentos de condrocitos de ratones falsos y DMM. En comparación con los ratones falsos, los ratones DMM habían disminuido el área total del cartílago tibial(E), el área del cartílago calcificado tibial(F), el cartílago tibial no calcificado (G), el número de condrocitos totales tibiales (H), la matriz tibial que produce condrocitos, (I) y los condrocitos no productores de matriz tibial (J). En comparación con los ratones falsos, los ratones DMM habían aumentado el perímetro de la superficie articular tibial(K)y el aumento del índice de fibrilación de la superficie articular tibial (L). Las imágenes se tomaron utilizando aumento de 10x. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, y ****P < 0.0001 usando la prueba t no emparejada con la corrección de Welch, los valores se expresan como media s SEM; n 5/grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Histomorfometría del área de la médula ósea subcondral y del área ósea subcondral de la cirugía falsa y de los ratones DMM. (A) Cartílago articular tibial y hueso subcondral manchado con Safranin-O/Fast Green. (B) Las áreas subcondrales de la médula ósea (verde), área ósea subcondral (magenta), área osteofitoa anterior (amarillo) y área osteofitoa posterior (gris) se trazaron con software de histomorfometría computarizada. (C–F) Graficar áreas histomorfométricas entre los ratones falsos y DMM. En comparación con los ratones falsos, los ratones DMM tenían un aumento del área ósea subcondral tibial(C)y áreas de osteofitos tibials anteriores y posteriores (E–F),así como disminución del área ósea subcondral tibial en comparación con ratones falsos (D). Las imágenes se tomaron con aumento 4x. *P < 0.05, **P < 0.01 usando la prueba t sin emparejar con la corrección de Welch. Los valores se expresan como medias - SEM; n 5/grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Histomorfometría de synovium de cirugía falsa y ratones DMM. (A) Synovium teñido con Safranin-O/Fast Green. (B) El espesor sinovial se midió trazando la membrana sinovial meniscofemoral anterior a través del aspecto anterior de la articulación tibiofemoral (verde). (C) Representación gráfica de las mediciones de espesor sinovial utilizando el software de histomorfometría computada. Los ratones DMM tenían un mayor grosor sinovial en comparación con los ratones falsos. Las imágenes se tomaron a 20x de aumento. P < 0,001 utilizando la prueba t no emparejada con la corrección de Welch, los valores se expresan como medias - SEM; n 5/grupo; S - sinovium; F - fémur; y el menisco de M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Variabilidad entre usuarios en la puntuación OARSI frente al análisis histomorfométrico. (A) Mediciones del área del cartílago no calcificado obtenidas mediante histomorfometría por tres observadores cegados (O1, O2, O3). (B) Puntuaciones OARSI para ratones falsos y DMM obtenidos de los tres observadores cegados. Las líneas punteadas denotan el valor medio de cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Análisis histológico de las secciones de las articulaciones tibiofemorales del ratón teñida de Safranin-O y Fast Green. (A) Una imagen de aumento 4x de la articulación tibiofemoral. Las áreas de enfoque están etiquetadas. (B) Una imagen de aumento 10x del ROI conjunto tibiofemoral. Se visualizan las superficies tibial y femoral, así como los cuernos meniscales anteriores y posteriores. Los menisci tienen aproximadamente el mismo tamaño y el ROI de imágenes se centra en el compartimiento de la junta. (C) Una imagen de aumento de 40x de la superficie tibial proximal. La línea de marca de marca se etiqueta como la línea entre las zonas de cartílago no calcificado y calcificado. La unión osteocondral se etiqueta entre el extremo del cartílago calcificado y el comienzo del hueso subcondral. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: Configuración del sistema de histomorfometría y calibración del balance de blancos de la cámara. (A) Junta tibiofemoral del ratón visualizada con aumento 4x en la ventana del software con balance de blancos no establecido. Observe la pestaña de configuración de la cámara en la parte superior de la pantalla y la selección en el menú desplegable para establecer el balance de blancos. (B) Junta tibiofemoral del ratón con aumento 4x con balance de blancos. Observe el cambio en la coloración y la tinción de la muestra, aumentando la capacidad del usuario para distinguir ciertas áreas de la articulación tibiofemoral al realizar mediciones. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 3: Configuración del software histomorfométrico antes de las mediciones de análisis histomorfométrico. Captura de pantalla representativa de la ventana del software histomorfométrico. Tenga en cuenta que la sección de rodilla del ratón manchada está centrada en la región de medición (cuadrícula amarilla) y la escala de aumento correcta para la región se selecciona para que coincida con el objetivo que se utiliza en el microscopio (círculo en rojo en la esquina superior derecha de la pantalla). La lista de parámetros se muestra en la columna situada a la derecha del área de imágenes y medición. Al seleccionar un parámetro se resaltará el parámetro, por lo tanto, la Fibrilación Tibial está seleccionada actualmente para ser medida. La pestaña Datos de resumen en la parte inferior de la ventana es donde las mediciones de cada parámetro para cada muestra se organizarán y guardarán para exportarse después de completar cada medición de parámetros para cada sección. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Investigaciones recientes de osteoartritis han mejorado nuestra comprensión de la interferencia entre los diferentes tejidos dentro de la articulación y el papel que cada tejido desempeña en la iniciación de la enfermedad o progresión8,9,10,35,36. En consecuencia, se ha vuelto obvio que la evaluación de la OA no debe limitarse al análisis del cartílago, sino que también debe incluir el análisis del hueso subcondral y el sinovium. A pesar de eso, el cartílago articular ha sido el foco principal de puntuación semicuantitativa de OA15,,37,38. Aunque la histomorfometría computarizada ya se ha aplicado a varias áreas de investigación musculoesquelética39,40,41,42,43,44, hay una brecha insatisfecha en la descripción de un protocolo para analizar con precisión y reproduciblemente cambios discretos a la multitud de tejidos dentro del compartimiento de la articulación de la rodilla durante OA. La aplicación de mediciones de análisis histomorfométricos para cuantificar los cambios en el cartílago, el hueso subcondral y el sinovium proporciona una evaluación más holística de los cambios primarios y secundarios en las articulaciones de OA.
Aquí, describimos por primera vez un protocolo detallado que utiliza un software de análisis histomorfométrico computarizado y semiautomatizado para cuantificar los cambios patológicos en diferentes compartimentos articulares y evaluar el desarrollo, progresión o regresión de OA. Se debe tener cuidado durante la preparación de la muestra, ya que las manchas claras y consistentes de Safranin-O y Fast Green son esenciales para limitar la ambiguedad al rastrear y tomar medidas con software histomorfométrico. Es aconsejable utilizar soluciones de tinción fresca para cada lote de diapositivas. Además, la selección de diapositivas para la tinción debe producirse a niveles constantes entre bloques. La primera diapositiva debe tomarse a un nivel similar entre las muestras, idealmente tan pronto como los cuernos meniscales anteriores y posteriores comiencen a separarse.
Durante la OA, el cartílago total y las áreas de cartílago no calcificados disminuyen debido a la fibrilación del cartílago y la degeneración. En la OA grave, también puede ocurrir una degeneración completa del cartílago calcificado. El protocolo destaca la importancia de determinar el fenotipo de condrocitos como una evaluación de la progresión de la OA para la evaluación de la señalización anabólica versus catabólica en el cartílago. El número total de condrocitos y el número de condrocitos productores de matriz (anabólicos) son altos en cartílago normal y bajos en cartílago OA, donde la mayoría de los condrocitos existentes en OA son matriz no productora (catabólica). Es importante destacar que este parámetro esencial en el campo del descubrimiento terapéutico de OA no es evaluado por los sistemas de puntuación de OARSI o Mankin. Ciertas intervenciones que no sólo preservan el área del cartílago y el número de condrocitos, sino que también promueven el fenotipo anabólico de condrocitos pueden ser enfoques terapéuticos más eficaces.
El protocolo detallado aquí también proporciona un método para medir cuantitativamente los cambios sutiles en las fibrilaciones superficiales del cartílago presentes en la OA leve a moderada. Un mayor número de fibrilaciones significa un aumento de la medición perimetral debido a la presencia de hendiduras en la superficie articular. Por lo tanto, el perímetro de la superficie articular tibial y el índice de fibrilación son bajos en cartílago normal, intermedios en OA leves debido a algunas fibrilaciones, altos en OA moderadas debido a más fibrilaciones, pero de nuevo bajos en OA grave debido a la degeneración completa del cartílago y la pérdida.
La remodelación y la esclerosis ósea subcondral son signos patológicos característicos de la OA, lo que resulta en una reducción del área del espacio de la médula subcondral y un aumento del área ósea subcondral8,9,10,29,30. La cuantificación de los cambios en el área ósea subcondral y en el área espacial de la médula subcondral descrita en el protocolo demuestra la importancia de comprender los cambios multitejidos como un componente conductor para la naturaleza compleja del desarrollo y progresión de la enfermedad de OA. La medición de las áreas osteofitosa anterior y posterior proporciona una visión importante de la escala de remodelación ósea que ocurre dentro de la articulación. El área osteofito a isalmente extremadamente pequeña en las rodillas a través de las farsas y aumenta debido a la formación de osteofitos en OA. La medición del área osteofitoanterior difería ligeramente de la medición del área osteofito posterior debido a la naturaleza grave de la remodelación ósea que se produce en la región medial de la rodilla, cerca del lugar de la lesión dMM.
Por último, este protocolo describe una evaluación cuantificable de los cambios en la membrana sinovial. El espesor sinovial es bajo en las articulaciones falsas y aumenta en OA. La inflamación en OA conduce al engrosamiento de la membrana sinovial para aumentar la administración de citoquinas inflamatorias y otros factores al espacio articular10,11,1231,32. Por lo tanto, es esencial evaluar la inflamación de las articulaciones como un factor modulador de la progresión de la enfermedad de OA.
El uso del software de histomorfometría está limitado por la disponibilidad del hardware: los monitores de pantalla táctil o tabletas con un lápiz óptico son absolutamente necesarios dada la cantidad de rastreo manual necesario para tomar mediciones precisas. Intentar medir áreas pequeñas con el software de histomorfometría también puede ser limitante, ya que el tamaño de la pluma está restringido a un diámetro. Si bien esta incapacidad para medir áreas pequeñas puede ser inconveniente, las áreas conjuntas medidas se definen fácilmente con la herramienta de área, y la baja discriminación del software hace una diferencia insignificante en la medición final.
También debe señalarse que la variabilidad entre usuarios es siempre un ámbito de preocupación con respecto a la aplicación de un protocolo cuantitativo fiable y reproducible. El establecimiento de un protocolo de histomorfometría eficaz, reproducible y riguroso requiere limitar las variables de composición potenciales dentro del análisis experimental, incluida la reducción de la variabilidad entre usuarios. Sin embargo, después de una breve sesión de entrenamiento (alrededor de 30 minutos) con el software, los miembros del laboratorio fueron capaces de generar mediciones altamente consistentes y reproducibles, donde la distribución de mediciones entre los usuarios refleja más de una superposición directa que representa casi ninguna variabilidad entre usuarios. Es importante destacar que este protocolo de histomorfometría demuestra un método eficiente para cuantificar incluso las diferencias discretas entre muestras falsas de una manera altamente reproducible.
El sistema de puntuación OARSI es una medida de evaluación comúnmente utilizada para el daño del cartílago en pacientes con OA y modelos murinos experimentales15. El sistema de puntuación se basa en una escala de número entero centrada principalmente en la extensión de las hendiduras/erosión o la superficie articular. Aunque no encontramos ninguna variabilidad interuser significativa con las puntuaciones OARSI en nuestro experimento, todavía había una diferencia media más alta entre los observadores, frente a casi ninguna en el protocolo de histomorfometría descrito. Por lo tanto, el establecimiento de este protocolo reproducible para el análisis histomorfométrico de los parámetros definidos permite mediciones altamente consistentes de cada muestra, incluso entre múltiples usuarios, eliminando parte de la naturaleza subjetiva del análisis de la muestra.
El sistema de puntuación estandarizado OARSI es un punto de referencia para la investigación de OA. Sin embargo, la naturaleza limitada basada en la puntuación del sistema no permite cuantificar los cambios sutiles que se producen dentro de la articulación. La evaluación conjunta ampliada descrita en este manuscrito utilizando el software de histomorfometría proporciona una caracterización mejorada y menos subjetiva de la gravedad de La OA. Este protocolo está optimizado para ratones que han sido sometidos a una inducción quirúrgica de OA. Sin embargo, los procedimientos y técnicas pueden aplicarse para la evaluación de OA dentro de otros modelos e hipótesis.
En resumen, el protocolo detallado aquí proporciona una guía clara para un enfoque cuantitativo semiautomático riguroso y reproducible para investigar la patología de OA o evaluar las intervenciones terapéuticas.
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Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer la asistencia del personal del Departamento de Medicina Comparada y del núcleo Molecular e Histopatología en Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fuentes de financiación: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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