Summary
Det nuvarande protokollet fastställer en rigorös och reproducerbar metod för kvantifiering av morfologiska gemensamma förändringar som åtföljer artros. Tillämpning av detta protokoll kan vara värdefullt för att övervaka sjukdomsprogression och utvärdera terapeutiska interventioner i artros.
Abstract
En av de vanligaste ledstörningarna i USA, artros (OA) kännetecknas av progressiv degeneration av ledbrosk, främst i höft- och knälederna, vilket resulterar i betydande effekter på patientens rörlighet och livskvalitet. Hittills finns det inga befintliga botande terapier för OA kunna bromsa eller hämma brosk degeneration. För närvarande finns det en omfattande mängd pågående forskning för att förstå OA patologi och upptäcka nya terapeutiska metoder eller medel som effektivt kan sakta ner, stoppa, eller ens vända OA. Det är därför viktigt att ha en kvantitativ och reproducerbar metod för att noggrant utvärdera OA-associerade patologiska förändringar i ledbrosk, synovium och subkondral ben. För närvarande, OA svårighetsgrad och progression bedöms främst med hjälp av Artros Research Society International (OARSI) eller Mankin scoring system. Trots betydelsen av dessa poängsystem, de är semiquantitative och kan påverkas av användarens subjektivitet. Ännu viktigare, de misslyckas med att exakt utvärdera subtila, men ändå viktigt, förändringar i brosk under de tidiga sjukdomstillstånd eller tidig behandling faser. Protokollet vi beskriver här använder en datoriserad och halvautomatiserad histomorphometrisk programvara för att upprätta en standardiserad, rigorös och reproducerbar kvantitativ metod för utvärdering av gemensamma förändringar i OA. Detta protokoll presenterar ett kraftfullt tillägg till de befintliga systemen och möjliggör effektivare upptäckt av patologiska förändringar i leden.
Introduction
En av de vanligaste ledstörningarna i USA, OA kännetecknas av progressiv degeneration av ledbrosk, främst i höft- och knälederna, vilket resulterar i betydande effekter på patientens rörlighet och livskvalitet1,2,3. Ledbrosk är den specialiserade bindväv av diarthrodial lederna för att minimera friktion, underlätta rörelse, och uthärda ledkompression4. Ledbrosket består av två primära komponenter: kondrocyter och extracellulär matris. Kondrocyter är specialiserade, metaboliskt aktiva celler som spelar en primär roll i utveckling, underhåll och reparation av den extracellulära matrisen4. Chondrocyte hypertrofi (CH) är en av de viktigaste patologiska tecken på OA utveckling. Det kännetecknas av ökad cellulär storlek, minskad proteoglykan produktion, och ökad produktion av brosk matris-förnedrande enzymer som så småningom leder till brosk degeneration5,6,7. Vidare spelar patologiska förändringar i ledens subkondrila ben och synovium en viktig roll i OA-utveckling och progression8,,9,,10,,11,12. Hittills finns det inga befintliga botande behandlingar som hämmar broskdegeneration1,,2,,3,,13,14. Således finns det omfattande pågående forskning som syftar till att förstå OA patologi och upptäcka nya terapeutiska metoder som kan bromsa eller till och med stoppa OA. Följaktligen finns det ett ökande behov av en kvantitativ och reproducerbar metod som möjliggör noggrann utvärdering av OA-associerade patologiska förändringar i brosk, synovium och subkondral ben i leden.
För närvarande bedöms OA svårighetsgrad och progression främst med hjälp av OARSI eller Mankin scoring system15. Dessa poängsystem är dock bara semikvantativa och kan påverkas av användarens subjektivitet. Ännu viktigare, de misslyckas med att exakt utvärdera subtila förändringar som uppstår i leden under sjukdom eller som svar på genetisk manipulation eller en terapeutisk intervention. Det finns sporadiska rapporter i litteraturen som beskriver histomorphometriska analyser av brosk, synovium eller subkondralben16,17,18,19,20,21. Ett detaljerat protokoll för rigorös och reproducerbar histomorphometrisk analys av alla dessa gemensamma komponenter saknas dock fortfarande, vilket skapar ett otillfredsställt behov på fältet.
För att studera patologiska förändringar i OA med hjälp av histomorphometrisk analys, använde vi en kirurgisk OA mus modell för att inducera OA via destabilisering av den mediala menisken (DMM). Bland de etablerade modellerna av murine OA, DMM valdes för vår studie eftersom det innebär en mindre traumatisk mekanism för skada22,23,24,25,26. I jämförelse med meniscal-ligamentous skada (MLI) eller främre korsbandsskada (ACLI) operationer, DMM främjar en mer gradvis progression av OA, liknande OA utveckling hos människor22,24,25,26. Möss avlivades tolv veckor efter DMM kirurgi för att utvärdera förändringar i artikulära brosk, subkondral ben och synovium.
Målet med detta protokoll är att upprätta en standardiserad, rigorös och kvantitativ metod för att utvärdera gemensamma förändringar som åtföljer OA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tolv veckor gamla hanar C57BL/6 möss köptes från Jax Labs. Alla möss var inrymt i grupper om 3-5 möss per mikro-isolator bur i ett rum med en 12 h ljus / mörk schema. Alla djurförsök utfördes enligt National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University.
1. Posttraumatisk artros (PTOA) kirurgisk modell
- Bedöva möss med hjälp av en ketamin (100 mg/kg)/xyazinkombination (10 mg/kg) via intraperitoneal injektion, administrera buprenorfin (1 mg/kg) via intraperitoneal injektion för smärtlindring och raka håret över knäet. Kontrollera om det saknas en pedalreflex innan du påbörjar operationen.
- Utför destabilisering av den mediala menisken (DMM) kirurgi som tidigare beskrivits22,23.
OBS: Se Glasson et al. och Singh et al. referenser för mer detaljerad kirurgisk protokoll information22,23.- Gör ett 3 mm längsgående snitt från den distala patella till proximala tibial platån i höger knäled. Använd en sutur för att tränga undan patellar sena.
- Öppna den gemensamma kapseln mediala till senan och flytta infrapatellar fett pad att visualisera intercondylar regionen, medial menisk, och meniscotibial ligament23.
- Transect den mediala meniscotibial ligament att slutföra DMM och destabilisera den gemensamma22,23. Stäng snittplatsen med häftklamrar eller suturer.
- Utför falska operationer efter ett liknande förfarande, men utan transection av den mediala meniscotibial ligament.
OBS: Möss randomiserades för att få antingen DMM eller skenkirurgi. Enligt den tidigare publicerade litteraturen utvecklar möss betydande PTOA 12 veckor efter DMM-operationen22,23,24.
2. Mus dödshjälp och provsamling
- Mus dödshjälp
- Tolv veckor efter DMM, bedöva möss med hjälp av en ketamin (100 mg/kg)/xyazine (10 mg/kg) kombination via intraperitoneal injektion.
- Gör ett mittgenomsnitt genom huden längs bröstkorgen och dra tillbaka bröstkorgen för att exponera hjärtat för perfusion fixering27.
OBS: Se Gage et al.-referensen för ytterligare information om protokollet för korrekt teckningsfixering samt videoskildring av lämplig utrustningsmontering och procedurer27. - Ställ in perfusionsapparaten enligt tillverkarens protokoll.
- Avliva musen genom att perfusing hepariniserade saltlösning genom den vänstra ventrikeln tills blodet rensas ut och levern blir blek. Granska musen med 10% neutral buffrad formalin tills fullständig musfixering uppnås.
EN framgångsrikt perfunderad mus blir stel. Den genomsnittliga perfusionstiden med det automatiserade pumpsystemet är 5–7 min.
- Provtagning och beredning av prover
- Isolera knäna genom att skära benet i mitten av lårbenet och mitten av skenbenet och dissekera den omgivande muskelvävnaden.
- Fortsätt fixeringen genom att lagra knäleder i 10% neutral buffrad formalin vid rumstemperatur i 24 timmar, sedan vid 4 °C i 6 dagar.
- Avkalka benet genom att förvara provet i EDTA-avkalkningsbuffert i 1 vecka vid rumstemperatur med mild skakning28. Ändra avkalkningsbuffertlösningen var tredje dag.
OBS: Avkalkning buffert utarbetades genom upplösning 140 g ultrapure EDTA tetranatrium i en lösning av 850 ml destillerat vatten plus 15 ml glacial ättiksyra. Bufferten var pH-ekvilibrerad till 7,6 genom dropwise tillsats av glacial ättiksyra till lösningen. När bufferten nåddes pH = 7,6 fördes den till 1 L total volym med destillerat vatten. Avkalkning bufferten var beredd färsk och används inom 1 vecka efter beredning. - Tvätta knäna med 50% etanol, sedan 70% etanol i 15 min vardera, sedan bearbeta för inbäddning.
OBS: Vätskeöverföring bearbetning utfördes av molekylära och histopathology Core på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Konsultera institutionens histologikärna för rekommendationer om optimal provbearbetning. - Bädda in mus knäna i paraffin med den mediala aspekten av leden vänd mot den nedre ytan av paraffinblocket. Tryck lätt på ledens tibialsida under inbäddningen för att säkerställa att tibial- och lårbensytor är så nära samma plan som möjligt.
3. Microtome snittning och bild val
- Mikrotomsektion
- Använd planjusteringsknapparna på mikrotomens blockhållare för att säkerställa att provblocket är korrekt vänt mot.
- Vänd paraffinblocket så att den distala aspekten av lårbenet, proximala regionen i skenbenet, och främre och bakre horn av den mediala menisken visas i samma plan för avsnitt insamling (Kompletterande figur 1A). Börja samla sektioner på diabilder när de främre och bakre hornen i den mediala menisken börjar separera från varandra.
- Se till att skenbenet, lårbenet och menisci visas i samma plan genom att jämföra strukturstorlekar. Skenbenet och lårbenet bör vara av jämförbar storlek, med både meniscal horn liknande i storlek och form (Kompletterande figur 1A). Om en struktur verkar för stor i jämförelse med sin motsvarighet, indikerar detta att ytterligare införing behövs. Viktigt, bekräfta att det gemensamma utrymmet förblir intakt.
- Ta sagittal delar av paraffin-inbäddade mus knän genom mediala gemensamma facket i 5 μm sektioner och samla sektionerna på diabilder. Samla in cirka 30 sektioner per paraffinblock.
- Bildmarkering
- Välj tre representativa sektioner med 50 μm mellanrum för varje prov från det femte avsnittet (dvs. diabilderna 5, 15 och 25). Utvalda diabilder kommer att användas för efterföljande färgning, OARSI-poängsättning och histomorphometrisk analys.
Obs! Välj bilder från liknande djupnivåer mellan exempel.
- Välj tre representativa sektioner med 50 μm mellanrum för varje prov från det femte avsnittet (dvs. diabilderna 5, 15 och 25). Utvalda diabilder kommer att användas för efterföljande färgning, OARSI-poängsättning och histomorphometrisk analys.
4. Hematoxylin, Safranin Orange, och Fast Green färgning
- Deparaffinera de markerade bilderna med tre ändringar av xylen. Återfukta rutschbanorna med två förändringar av 100% etanol, två förändringar av 95% etanol och en förändring av 70% etanol.
- Färga rutschkanorna med hematoxylin i 7 min tvätta sedan med rinnande vatten i 10 min. Fläcka med Fast Green i 3 min och skölj i 1,0% glaciär ättiksyra i 10 s. Fläck med Safranin-O i 5 min och skölj snabbt genom att doppa i 0,5% ikontiksyra.
- Skölj diabilder i två byten av destillerat vatten och låt luften torka.
- Tydliga bilder i tre ändringar av xylen i 5 min vardera och montera sedan med xylenbaserat monteringsmedia och ett täckslip.
OBS: Hematoxylin fungerar som den nukleära fläcken för att identifiera områden av benmärg. Safranin-O används för att färga brosk, proteoglykaner, mucin och mastcellgranulat. Fast Green används som en mothåll för ben.
5. Bildtagning
- Bild safranin-O och Fast Green färgade diabilder med hjälp av en tillgänglig kamera ansluten till ett mikroskop och datorbaserad bildbehandling programvara.
- Öppna bildhanteringsprogrammet (se Tabell över material) och ordna knäleden av intresse (ROI) i mitten av bildfönstret. Om du använder ett roterande mikroskopbildssteg justerar du bilden så att tibialytan sträcker sig över bredden på bildområdets vågräta axel.
- Ställ in kamerans vitbalans innan du börjar avbilda en uppsättning exempel (Tilläggsbild 2). Bild fogfacket vid både 4x och 10x förstoring, se till att både tibial och femorala artikulära ytan och tibial subkondral ben ingår i var och en av bilden ROIs(Tilläggsbild 1A, B). Spara bilder för var och en av de tre valda nivåerna som ska användas för OARSI-bedömning.
Obs: Ställa in kamerans vitbalans beror på vilken programvara och vilka kamerasystem som används. Navigera i allmänhet till kamerafliken eller huvudbildmenyn och bläddra nedåt för att ange vitbalans. Välj Ange vitbalans och en liten markör eller ikon ska visas(Tilläggsbild 2A). Med hjälp av markören markerar du ett område i bilden/provet som är fritt från fläck, till exempel det gemensamma utrymmet, för att ställa in vitbalansen.
6. Artros forskningssamhälle internationellt (OARSI) scoring15
- Randomisera de tre utvalda Safranin-O och Fast Green färgade diabilder från alla prover.
- Utför OARSI-poängsättning på ett förblindat sätt med tre observatörer. Kort, visa en bild i taget i en randomiserad ordning och låta tre observatörer att göra mål varje bild, korrelerar till en av de tre nivåer som valts för varje prov.
OBS: Se OARSI-poängtabellen för detaljerade beskrivningar av betygsskalan15. - Beräkna genomsnittspoängen för varje avsnitt med hjälp av individuella poäng från varje observatör. Bestäm den genomsnittliga poängen per prov genom att ta den genomsnittliga poängen för de tre representativa avsnitten.
7. Histomorphometrisk analys
Livebilder av knäleden visas på en pekskärm med hjälp av en mikroskopkamera, och en penna används för att manuellt spåra ROIs. Inbyggda algoritmer för histomorphometry-programvaran kvantifierar de angivna parametrarna (se protokoll nedan) i de definierade ROIs. Viktigt, samma Safranin-O och Fast Green färgade sektioner som används i OARSI scoring används för histomorphometrisk analys.
- Förberedelse av programvaruinställningar och mätning
- Slå på mikroskop, kamera, dator och pekskärm. Klicka på programvaruikonen för att starta programmet. Placera bilden på mikroskopstadiet för visning.
- Centrera provet i mätfönstret. Se till att mätgallret är inställt på rätt förstoring så att det matchar det mål som används i mikroskopet (tilläggssiffra 3).
- Gå till fliken Arkiv högst upp på skärmen och bläddra ned till Läsinställningar. Öppna fönstret Inställningar och välj lämplig inställningsfil för de parametrar som ska mätas.
- Välj den parameter som ska mätas i listan till höger på skärmen (Tilläggsbild 3). Använd pennan eller muspekaren för att spåra bilder enligt stegen som beskrivs nedan för att mäta specifika vävnads-ROIs. När du är klar med varje mätning högerklickar du för att avsluta mätningen och fortsätter till nästa parameter.
OBS: Listan över parametrar som ska mätas skapas genom en särskild preferensfil som upprättas i samråd med mjukvaruföretaget i syfte att mäta de beskrivna avkastningsrätterna. Se diskussion för mer information om den fullständiga installationen. - Slutför alla mätningar och navigera sedan till fliken Sammanfattningsdata längst ned på programskärmen (Kompletterande bild 3). Klicka på skärmfönstret, tryck på infoga tangenten på tangentbordet eller kopiera och klistra in data i ett separat kalkylblad.
OBS: Utför histomorphometrisk analys på ett randomiserat och förblindat sätt. När du har slutfört alla parametermätningar för alla exempel, organisera data och genomsnitt mätningarna från de tre bilderna från varje prov.
- Mätningar av de totala, förkalkade och ocalcified broskområden
Använd en kommersiellt tillgänglig programvara (se Tabell över material)för att utföra dessa steg. Se kompletterande figur 1B,C för förtydligande av broskregioner, korsningar och subkondralbensregioner som diskuteras i hela detta avsnitt.- Rita en linje över den överlägsna kanten av tibial brosk ytan där brosket möter det gemensamma utrymmet. Rita en andra linje vid den kondrobeniga korsningen där det förkalkade brosket möter det subkondrala benet (figur 1B). Använd funktionen Områdesområde för att automatiskt erhålla den totala mätningen av broskområdet.
- Rita en linje längs tidvattenmärket, en naturligt förekommande linje som skiljer de förkalkade och oförkalkade regionerna av brosk. Rita en andra linje vid den kondrobeniga korsningen där det förkalkade brosket möter det subkondrala benet (figur 1B). Använd funktionen Områdesområde för att automatiskt få mätningen av det förkalkade broskområdet.
- Beräkna det okalkade broskområdet genom att subtrahera det förkalkade broskområdet från det totala broskområdet (figur 1B).
- Bestämning av kondrocyttalet och fenotyp
- Skapa separata räknefunktioner inom inställningarna i histomorphometry-programvaran för att skilja matrisproducerande och matrisfritt kondrocyter (figur 1B).
- Bestäm antalet matriser som producerar eller inte producerar kondrocyter genom att använda pennan för att göra en liten punkt över varje kondrocyt som uttrycker den angivna fenotypen (figur 1B).
OBS: Räkna celler enligt deras fenotyp som antingen matris producerar (dvs stark Safranin-O färgning) eller matris icke-producing (dvs mycket svag eller ingen Safranin-O färgning).
- Mätning av tibial articular yta omkrets
- Mät den absoluta tibial articular ytan omkretsen genom att spåra en linje över ytan av tibial brosk, noggrant definiera enskilda förmaksflimmer (figur 1C).
- Rita en andra linje längs tidvattenmärket för att fungera som en intern kontroll för planet för varje avsnitt (figur 1C).
- Beräkna tibial articular ytan förmaksflimmer index genom att dividera tibial articular ytan omkretsen med tidvattenmärke omkrets.
OBS: Tidemark-omkretsen är i allmänhet lika mellan prover, så skillnaden i artikulära ytomkretsar mellan bluff och DMM var i allmänhet liten oavsett om absolut omkrets eller förmaksflimmer index användes.
- Mätning av de subkondrala ben- och märgutrymmesområdena
- Mät det subkondralfärgade märgutrymmet med hjälp av områdesfunktionen genom att beskriva regioner i regionen subkondral som färgats med endast hematoxylin (dvs. negativt för Fast Green) för att bestämma det totala märgutrymmet inom det subkondrala benet. Rita linjer runt omkretsen av dessa områden för att bestämma den totala ytan av alla märg utrymme inom tibial subchondral ben (figur 2B).
- Mät det totala subkondralområdet med hjälp av områdesfunktionen genom att beskriva regionen mellan chondro-osseous korsningen och den överlägsna gränsen för tillväxtplattan, som sträcker sig i sidled till regionerna av de främre och bakre osteofyter (figur 2B).
- Beräkna det subkondrila benområdet genom att subkondral benmärgsutrymmet subkondralområdet subkondrala från det totala subkondralområdet (figur 2B,C).
- Mätning av de främre och bakre osteofytområdena
- För att mäta osteofytområdet, spåra de främre och bakre osteofyterna i proximala skenbenet med hjälp av områdesfunktionen (figur 2B,E,F).
OBS: Osteofyter är beniga projektioner som bildas mellan ledbrosket och tillväxtplattan, främre eller bakre till regionen subkondral. Osteofyt områden på de främre och bakre sidorna av skenbenet bestäms genom att spåra området främre eller bakre till subkondral ben. Korsningen mellan osteofyter och subkondral ben är tydligt avgränsas av en rad celler som sträcker sig från ledbrosket till tillväxtplattan. Korsningen mellan osteofyt och synovium definieras av en övergång mellan beniga och fibrösa vävnad.
- För att mäta osteofytområdet, spåra de främre och bakre osteofyterna i proximala skenbenet med hjälp av områdesfunktionen (figur 2B,E,F).
- Mätning av synovialtjockleken
- Mät den främre lårbenssynovialtjockleken med hjälp av funktionen Område genom att dra en linje från den inre införingspunkten för det främre synoviumet på lårbenet mot dess fästpunkt på menisken (figur 3B).
- Rita en andra linje från synoviumets yttre införande på lårbenet mot dess fastsättning på menisken (figur 3B).
- Beräkna synovialtjockleken genom att dividera det totala synovialområdet med synovial omkretsen.
8. Statistisk analys
- Samla in de uppmätta parametrarna och beräkna resultaten från de tre representativa avsnitten för varje prov. Analysera data med hjälp av en oparad Students t-test för att jämföra två grupper eller enkelriktad ANOVA för att jämföra tre eller flera grupper.
- Visa data som medelvärdet ± standardfel för medelvärdet.
OBS: Statistisk signifikans uppnåddes vid p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM-inducerad OA resulterar i artikulär brosk degeneration och kondrocyt förlust
DMM-inducerad OA resulterade i en ökad OARSI poäng jämfört med falska möss, tydligt kännetecknas av yterosion och brosk förlust (Figur 1A,D). Histomorphometry protokollet beskrivs här upptäckt flera OA-associerade förändringar, inklusive en minskning av den totala brosk område och i det oförkalkade broskområdet (figur 1A,B,E,G); Minskning av det totala kondrocyttalet. och, viktigast av allt, förlust av matris producerar kondrocyter (Figur 1H,I). Ändringar av den ledande ytan, som tyder på svårighetsgraden av erosion, utvärderades med hjälp av brosk förmaksflimmer index. Totalt sett ökade förmaksflimmersindexet hos DMM-möss (figur 1C,K,L). Det är dock också viktigt att notera att förmaksflimmer index kan minska i slutet av etappen OA på grund av fullständig erosion av broskytan, som diskuteras i protokollet. En ökning av förmaksflimmer index innebär degeneration av ledbrosket ytan under OA utveckling och progression. Dessa resultat belysa förmågan hos histomorphometrisk analys program för att upptäcka och kvantifiera patologiska brosk förändringar som kännetecknar OA progression.
Bedömning av andra gemensamma förändringar i DMM-inducerade OA
OA påverkar andra ledvävnader än brosk, och patologiska förändringar i dessa vävnader spelar en avgörande roll i sjukdomsprogression. Här visade den beskrivna histomorphometrisk analysmetoden en ökning av det subkondrala benområdet och en minskning av benmärgsutrymmets område hos DMM-möss (figur 2A–D), vilket indikerar subkondral benskleros29,30. Både främre och bakre osteofyt områden ökade också i DMM möss(Figur 2E,F), vilket tyder på en pågående subkondral ben remodeling som fungerar som en kompensatorisk mekanism för att hantera förändringar i ledbelastning på skadeplatsen29,30.
Histomorphometrisk analys av synovium visade ökad synovial tjocklek hos DMM möss (Figur 3A–C), vilket är ett typiskt resultat av OA-associerade synovial inflammation och spridning av inflammatoriska cytokiner i ledrummet11,12,31,32,33,34.
Analys av interuservariation mellan OARSI scoring kontra histomorphometry
Figur 4A visar ingen signifikant variabilitet för både histomorphometrisk analys av det okalkade broskområdet (figur 4A) och OARSI-poängen (figur 4B). Men histomorphometrisk analys visade en extremt låg genomsnittlig skillnad mellan observatörer från -0,0001179-0,00120, vilket ledde till en nästan fullständig överlappning av de resultat som erhållits av de tre observatörerna, medan den genomsnittliga skillnaden mellan observatörer var högre i OARSI-poängen från -0,3–0,3 med en tydlig avvikelse av O1-värden från O2- och O3-värden.
Figur 1: Histomorphometry av tibial ledbrosk och artikulära kondrocyt fenotyper från bluff kirurgi och DMM möss. (A)Tibial articular yta färgas med Safranin-O/Fast Green. B)Histomorphometrisk analys användes för att spåra det totala broskområdet och det förkalkade broskområdet (orange). Brosket överlägsen tidvattenmärket området beräknades som den ocalcified brosk (grön). Matris producerar kondrocyter (vit) och matris nonproducing kondrocyter (magenta) räknades inom det oförkalkade broskområdet. (C)Den tibial artikulära ytan omkrets mättes genom att spåra ledytan (blå linje) följt av tidvattenmärket (lila linje) för att bestämma förmaksflimmer index. (D)OARSI-poängen ökade hos DMM-möss. (E–L) Grafisk representation av de kvantifierade broskområdena och kondrocytantal från bluff- och DMM-möss. Jämfört med falska möss hade DMM möss minskat totalt tibial brosk område (E), tibial calcified brosk område (F), tibial okalifierat brosk (G), tibial totala kondrocyt nummer (H), tibial matris producerar kondrocyter, (I) och tibial matris ickeproducerande kondrocyter (J). Jämfört med falska möss, DMM möss hade ökat tibial articular yta omkrets (K) och ökad tibial artikulära ytan förmaksflimmer index (L). Bilder togs med 10x förstoring. *P < 0,05, **P & 0.01, ***P & 0.001, och ****P & 0.0001 med unpaired t-test med Welch korrigering, värden uttrycks som medelvärde ± SEM; n = 5/grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Histomorphometry av subkondral benmärg område och subkondral ben område från bluff kirurgi och DMM möss. (A)Tibial ledbrosk och subkondral ben färgas med Safranin-O/Fast Green. (B)De subkondral benmärg områden (grön), subkondral ben område (magenta), främre osteophyte område (gul) och bakre osteophyte område (grå) spårades med beräknade histomorphometry programvara. (C–F) Graferade histomorphometriska områden mellan bluff och DMM möss. Jämfört med de falska mössen hade DMM-möss ett ökat tibial subkondralbensområde (C) och tibial främre och bakre osteofytområden (E–F), samt minskat tibial subkondral benmärgområde jämfört med falska möss (D). Bilder togs med 4x förstoring. * P < 0,05, ** P < 0,01 med unpaired t-test med Welch korrigering. Värdena uttrycks som medelvärde ± SEM. n = 5/grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Histomorphometry av synovium från simulerad kirurgi och DMM möss. (A)Synovium färgas med Safranin-O/Fast Green. ( B)Synovial tjocklek mättes genom att spåra den främre meniscofemoral synovial membran över den främre aspekten av tibiofemoral gemensamma (grön). (C)Grafisk representation av synovial tjocklek mätningar med hjälp av beräknade histomorphometry programvara. DMM möss hade en ökad synovial tjocklek jämfört med bluff möss. Bilder togs vid 20x förstoring. P < 0,001 med obetald t-test med Welchs korrigering uttrycks värdena som medelvärde ± SEM. n = 5/grupp; S = synovium; F = lårben; och M = menisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Interuser variabilitet i OARSI scoring kontra histomorphometric analys. (A)Mätningar av broskområde som erhållits med hjälp av histomorphometry av tre förblindade observatörer (O1, O2, O3). B)OARSI-poäng för bluff- och DMM-möss som erhållits från de tre förblindade observatörerna. De prickade linjerna anger medelvärdet för varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Histologisk analys av Safranin-O och Fast Green färgade mus tibiofemoral gemensamma sektioner. (A)En 4x förstoring bild av tibiofemoral gemensamma. Fokusområden är märkta. (B)En 10x förstoring bild av tibiofemoral gemensamma ROI. De tibial och femorala ytor samt främre och bakre meniscal horn visualiseras. Menisci är ungefär lika stor och bildbehandlings-ROI är centrerad på fogfacket. (C)En 40x förstoringsbild av proximal tibial ytan. Tidvattenstämpellinjen är märkt som gränsen mellan de ocalcified och calcified broskzonerna. Den osteochondral korsningen är märkt mellan slutet av det förkalkade brosket och början av det subkondrala benet. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Tilläggsfigur 2: Histomorphometry system setup och kamera vitbalans kalibrering. (A) Mus tibiofemoral gemensamma visualiseras vid 4x förstoring i mjukvarufönstret med vitbalans inte inställd. Observera fliken Kamerainställningar högst upp på skärmen och markeringen i rullgardinsmenyn för att ställa in vitbalansen. (B) Mus tibiofemoral gemensamma vid 4x förstoring med vitbalans set. Observera förändringen i färgning och färgning av provet, öka användarens förmåga att skilja vissa områden i tibiofemoral gemensamma när du utför mätningar. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: Installation av histomorphometrisk programvara före histomorphometrisk analysmätningar. Representativ skärmdump av histomorphometric mjukvarufönstret. Observera att den färgade musk knäsektionen är centrerad i mätområdet (gult rutnät) och rätt förstoringsskala för regionen väljs för att matcha det mål som används på mikroskopet (inringat i rött i det övre högra hörnet av skärmen). Listan över parametrar visas i kolumnen till höger om bild- och mätområdet. Om du väljer en parameter markeras parametern, och därför väljs för närvarande Tibial Fibrillation som ska mätas. Fliken Sammanfattningsdata längst ned i fönstret är där mått för varje parameter för varje prov kommer att organiseras och sparas för att exporteras efter att varje parametermätning har slutförts för varje avsnitt. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyligen artros forskning har ökat vår förståelse av överhörningen mellan de olika vävnaderna i leden och den roll varje vävnad spelar i sjukdomsinitiering eller progression8,9,10,35,36. Det har därför blivit uppenbart att bedömningen av OA inte bör begränsas till analys av brosket utan även omfatta analys av det subkondrala benet och synoviumet. Trots detta har ledbrosket varit den primära inriktningen för semikvantitativ scoring av OA15,37,38. Även beräknade histomorphometry har redan tillämpats på olika områden av muskuloskeletal forskning39,40,41,42,43,44, det finns en otillfredsställd lucka i att beskriva ett protokoll för att exakt och reproducerbart analysera diskreta förändringar av de många vävnader i knäleden facket under OA. Tillämpningen av histomorphometrisk analys mätningar för att kvantifiera förändringar i brosk, subkondral ben och synovium ger en mer holistisk bedömning av de primära och sekundära förändringar i OA lederna.
Här beskriver vi för första gången ett detaljerat protokoll som använder en datoriserad och halvautomatiserad histomorphometrisk analys programvara för att kvantifiera patologiska förändringar i olika gemensamma avdelningar och utvärdera OA utveckling, progression eller regression. Försiktighet bör iakttas under provberedning, eftersom tydliga och konsekventa Safranin-O och Fast Green fläckar är nödvändiga för att begränsa tvetydighet vid spårning och mätningar med histomorphometrisk programvara. Använda färska färgningslösningar för varje parti av diabilder är lämpligt. Dessutom måste bildval för färgning ske på konsekventa nivåer mellan blocken. Den första bilden måste tas på en liknande nivå mellan prover, helst så snart de främre och bakre meniscal horn börjar separera.
Under OA minskar de totala brosk- och ocalcified broskområdena på grund av broskförmaksmakning och degeneration. Vid svår OA kan fullständig degeneration av det förkalkade brosket också förekomma. Protokollet belyser betydelsen av att bestämma kondrocytfenotyp som en bedömning av OA progression för utvärdering av anabola kontra katabol signalering i brosk. Det totala antalet kondrocyter och antalet matrisproducerande kondrocyter (anabola) är höga i normalt brosk och låg i OA brosk, där majoriteten av befintliga kondrocyter i OA är matris nonproducing (katabol). Viktigt är att denna viktiga parameter inom OA terapeutisk upptäckt inte utvärderas av OARSI eller Mankins poängsystem. Vissa insatser som inte bara bevara brosk området och antalet kondrocyter men också främja kondrocyt anabola fenotyp kan vara mer effektiva terapeutiska metoder.
Protokollet som beskrivs här ger också en metod för att kvantitativt mäta de subtila förändringarna i brosk ytan förmaksflimmer som finns i mild till måttlig OA. Ett större antal förmaksflimmer innebär en ökad omkretsmätning på grund av närvaron av fördjupningar i den ledrästade ytan. Således är tibial articular yta omkrets och förmaksflimmer index låg i normala brosk, mellanliggande i mild OA på grund av att vissa förmaksflimmer, hög i måttlig OA på grund av att mer förmaksflimmer, men återigen låg i allvarliga OA på grund av att fullständig brosk degeneration och förlust.
Subkondral ben remodeling och skleros är karakteristiska patologiska tecken på OA, vilket resulterar i minskad subkondral märg utrymme område och ökad subkondral ben område8,,9,,10,,29,30. Kvantifiering av förändringar i subchondral ben området och subchondral märg utrymme område som beskrivs i protokollet visar vikten av att förstå multi-vävnad förändringar som en drivande komponent för den komplexa karaktären av OA sjukdom utveckling och progression. Mätning av de främre och bakre osteofytområden ger viktig inblick i omfattningen av ben remodeling förekommer inom leden. Osteofytområdet är extremt litet i simulerade knän och ökar på grund av osteofytbildning i OA. Mätning av den främre osteophyte området skilde sig något från mätningen av den bakre osteophyte området på grund av att den allvarliga karaktären av ben remodeling inträffar vid den mediala regionen i knäet, nära platsen för DMM skada.
Slutligen beskrivs i detta protokoll en kvantifierbar bedömning av förändringar i synovialmembranet. Synovial tjocklek är låg i bluff leder och ökar i OA. Inflammation i OA leder till förtjockning av synovialmembranet för att öka leveransen av inflammatoriska cytokiner och andra faktorer till ledutrymmet10,,11,1231,32. Således är det viktigt att utvärdera ledinflammation som en modulerande faktor för OA sjukdomsprogression.
Användningen av histomorphometry programvara begränsas av tillgången på hårdvaran: pekskärmar eller tabletter med en penna är absolut nödvändigt med tanke på den mängd manuell spårning som krävs för att ta korrekta mätningar. Att försöka mäta små områden med histomorphometry programvara kan också vara begränsande, eftersom pennans storlek är begränsad till en diameter. Även om denna oförmåga att mäta små områden kan vara obekväm, är de gemensamma områden som mäts lätt definieras med områdesverktyget, och den låga diskrimineringen av programvaran gör en försumbar skillnad i den slutliga mätningen.
Det bör också noteras att variabilitet alltid är ett problemområde när det gäller genomförandet av ett tillförlitligt och reproducerbart kvantitativt protokoll. Upprättande av ett effektivt, reproducerbart och rigoröst histomorphometry-protokoll kräver att potentiella kompounderingsvariabler begränsas inom den experimentella analysen, inklusive att minska interuservariationen. Men efter ett kort träningspass (ca 30 min) med programvaran, lab medlemmar kunde generera mycket konsekvent och reproducerbara mätningar, där fördelningen av mätningar mellan användare återspeglar mer av en direkt överlägg som representerar nästan ingen interuser variabilitet. Viktigt, detta histomorphometry protokoll visar en effektiv metod för att kvantifiera även diskreta skillnader mellan bluff prover på ett mycket reproducerbart sätt.
OARSI poängsystem är ett vanligt mått på bedömning för broskskador hos OA-patienter och experimentella murine modeller15. Poängsystemet bygger på en heltalsskala som främst fokuserar på omfattningen av klyftor/erosion eller ledytan. Även om vi hittade ingen betydande interuser variabilitet med OARSI poäng i vårt experiment, det fortfarande fanns en högre genomsnittlig skillnad mellan observatörer, jämfört med nästan ingen i den beskrivna histomorphometry protokollet. Att upprätta detta reproducerbara protokoll för histomorphometrisk analys av definierade parametrar möjliggör således mycket konsekventa mätningar av varje prov, även mellan flera användare, vilket tar bort en del av provanalysens subjektiva karaktär.
OARSI standardiserade poängsystem är ett riktmärke för OA-forskning. Systemets begränsade poängbaserade karaktär tillåter dock inte kvantifiering av subtila förändringar som sker inom leden. Den utökade gemensamma utvärdering som beskrivs i detta manuskript med hjälp av histomorphometry programvara ger en förbättrad och mindre subjektiv karakterisering av svårighetsgraden av OA. Detta protokoll är optimerat för möss som har genomgått en kirurgisk induktion av OA. De förfaranden och tekniker kan tillämpas för utvärdering av OA inom andra modeller och hypoteser, dock.
Sammanfattningsvis ger protokollet som beskrivs här en tydlig vägledning för en rigorös och reproducerbar halvautomatisk kvantitativ metod för att undersöka OA patologi eller utvärdera terapeutiska interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi vill erkänna hjälp av Institutionen för jämförande medicin personal och molekylära och histopathology kärna på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskällor: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
