Summary
癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。
Abstract
癌は、遺伝的不安定性、突然変異、および環境および他のストレス要因によって開始された細胞の制御されていない増殖のために生じる。これらの獲得した、複雑な多層分子シグナル伝達ネットワークの異常は、異常な細胞増殖と生存、細胞外マトリックス分解、および遠くの器官への転移を誘発する。癌関連死の約90%は、転移性播種の直接的または間接的な影響によって引き起こされると推定される。そのため、遺伝的・環境的操作を行う際に、がん細胞の挙動を特徴づけるための、信頼性の高い総合的なシステムを確立することが重要です。このようなシステムは、癌転移の分子調節と階層化された、正確な治療戦略の開発を成功させる機会を明確に理解することができる。したがって、遺伝子の機能の利得または喪失を伴う移動や侵入などの癌細胞行動の正確な決定は、癌細胞の積極的な性質の評価を可能にする。細胞インピーダンスに基づくリアルタイム測定システムにより、実験全体で継続的にデータを取得し、様々な実験条件下で結果を即座に比較して定量化することができます。従来の方法とは異なり、この方法は、移動または侵入する細胞を分析するために固定、染色、およびサンプル処理を必要としません。本論文では、神経膠芽腫癌細胞の移動と浸潤をリアルタイムに決定するための詳細な手順を強調する。
Introduction
癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。がん遺伝子型と遺伝子型の決定は、効果的な治療戦略を理解し、設計する上で重要です。数十年にわたるがん研究は、がん遺伝子型と型を決定するさまざまな方法の開発と適応につながっています。最新の技術開発の1つは、細胞インピーダンスに基づく細胞移動と浸潤のリアルタイム測定です。細胞接着は、細胞間通信および組織の調節、開発、維持において重要な役割を果たす。細胞接着の異常は、細胞間接触の喪失、細胞外マトリックス(ECM)の分解、および細胞による遊走および侵入能力の利益を招き、そのすべてが異なる器官11、22に癌細胞の転移に寄与する。細胞の移動(創傷治癒およびボイデンチャンバーアッセイ)および侵略(マトリゲルボイデンチャンバーアッセイ)3、4、54,5を決定するために様々な方法が利用可能である。3これらの従来の方法は、細胞の細胞のタイプを測定する実験の前後に蛍光色素または他の色素で標識する必要があるため、半定量的である。さらに、創傷部位への細胞の移動を測定するための創傷を作成するために機械的破壊が必要な場合がある。さらに、これらの既存の方法は時間がかかり、労力を要し、結果を一度に測定するだけです。さらに、これらの方法は、実験手順6の間に一貫性のない処理のために不正確な測定を行う傾向がある。
従来の方法とは異なり、リアルタイムの細胞分析システムは、細胞のプレステインやポストステイン、機械的損傷を必要とせずに、リアルタイムで細胞インピーダンスを測定します。さらに重要なことは、実験の持続時間を延長して、時間依存的な方法で生物学的効果を決定できることである。実験の実行は時間効率が良く、労働集約的ではありません。データの分析は比較的簡単で正確です。他の方法と比較して、この方法は、細胞の移動と浸潤66、7、8、97,8,9を測定するための最良のリアルタイム測定の1つです。
GiaeverとKeeseは電極10の表面上の細胞集団のインピーダンスベースの測定を最初に記述した。リアルタイムセル解析システムは同じ原理で動作します。各マイクロプレートウェルの面積は、金のマイクロ電極の配列で覆われて約80%です。電極表面積が細胞の付着または広がりによる細胞によって占拠されると、電気インピーダンスが変化する。このインピーダンスは、細胞指数として表示され、これは、微多孔膜に浸透した後の電極表面積を覆う細胞に直接比例する(この膜の中央の細孔サイズは8μmである)11。
CrkおよびCrkLはSH2およびSH3ドメインを含むアダプタタンパク質であり、細胞骨格調節、細胞変容、増殖、接着、上皮間葉移行、移行、侵入、転移などの様々な細胞機能において重要な役割を果たす。1,12,13,14,15,16,17, 18.したがって、がん細胞のCrk/CrkL依存性の移動能力と侵襲性能力を決定することが重要です。リアルタイム細胞解析を行い、CrkおよびCrkLの遺伝子ノックダウン時の神経膠芽腫細胞の回遊性および侵襲能力を決定した。
本論文では、ヒト神経膠芽腫細胞のCrk-およびCrkL媒介性移動および浸潤の詳細な測定について述べている。
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Protocol
注:すべての細胞培養材料は滅菌する必要があり、実験全体は滅菌条件下でバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. U-118MG神経膠芽腫細胞株の培養とエレクトロポレーション
- U-118MG細胞株をダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)を含む5%ウシ胎児血清(FBS)で培養し、5%CO2インキュベーターを含む湿潤雰囲気下で37°Cで維持(培養条件)2
- エレクトロポレーションのために70–80%コンフルエント健康細胞を使用してください。
- 細胞を収穫するために、1x PBSで培養皿で成長している細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAの2 mLを加えます。インキュベーターに30s入れ、トリプシン-EDTAを取り除きます。培養液中の細胞を15mLチューブに回収する。
- ハンドヘルド自動セルカウンターを使用してセルを数え、遠心分離細胞を100 x gで5分間カウントし、上清を捨てます。
- 培養液中の細胞ペレットを懸濁し、各条件に対して60万個の細胞をマイクロ遠心チューブに取り込みます。実験計画と成長率に応じてセル数を調整します。
- 細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を800 μL加えます。30 sのミニセントリフュージを使用してスピンダウンし、上清を捨てます。
- 60 μLのリサスペンションバッファーRを細胞ペレットに加え、siRNA(すなわち、非標的siRNA、Crk siRNA、CrkL siRNA、またはCrkおよびCrkL siRNAの両方)を各マイクロ遠心分離チューブに6μMの濃度で加えます。タップして軽く混ぜます。
- エレクトロポレーションシステムを持つ10 μLのセルを1,350 Vで10ミリ秒で3パルスで10ミリ秒で電気ポレートし、電気ポポレートされた細胞を5 mLの培養液に移します。各条件に対して調製した残りの細胞についてエレクトロポレーションを繰り返します。
- すべてのそれぞれのエレクトロポレーションを完了します。電気ポレートされた細胞を条件ごとに2つの35 mm皿に移し、培養条件下で3日間培養します。
- 3日目に、DMEM(低血清培地)を含む全ての電気泳動細胞を、実際の細胞インピーダンス測定の前に6時間、6時間処理します。
2. リアルタイム細胞解析システム、細胞浸潤・移動(CIM)プレート、およびめっき用の電解されたU-118MGセルの調製
- 実験開始の5~6時間前に培養条件下で、リアルタイムの細胞分析システムを培養条件下でCO2インキュベーターに入れ、培養条件に合うようにシステムを安定化させます。
- 浸潤アッセイの場合、CIMプレートの上部チャンバの各ウェルに0.1 μg/μLの細胞外マトリックス(ECM)ゲルを含むDMEM(平野培地)のプレート50μL。気泡を持つことを避けるために、逆ピペット法を使用してください。すぐに30 μLのECMゲルを取り除き、20 μL をウェルに残します。
- ECMゲルコーティング後、蓋をした状態で4時間培養条件下でインキュベーターにプレートを保管します。ECMゲルコーティングおよび乾燥の間、プレートの上部チャンバの電極と手、バイオセーフティキャビネットの表面、またはCO2インキュベーターとの直接接触を避けるため、予防措置を講じてください。
- インピーダンス測定プログラムをセットアップするには、関連するソフトウェアアイコン(「材料表」を参照)をダブルクリックして、システムソフトウェアアプリケーション(制御ユニット)を開きます。各クレードルには、実験条件、インピーダンス測定時間間隔と持続時間、データ分析を設定するためのタブが異なる個別のウィンドウがあります。
- [レイアウト]タブで、各生物学的条件に対して 4 倍のウェルを設定し、[スケジュール]タブで 2 段階のセルインピーダンス測定値を設定します。最初のステップは、1回のベースライン測定(1分間隔で1回のスイープ)を行い、2番目のステップは実際の実験のために個々のクレードルの細胞インピーダンスを測定することです。移行には、10分間隔で145スイープを使用し、侵入のために、10分間隔で577スイープ、個別に設定)それぞれの個々のクレードルで。
- 細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、プレートの下部チャンバのウェルに10%FBSを持つDMEMの160 μLを加えます。ECMゲルコーティングされたウェルを含む上部チャンバーまたは下の部屋でコーティングされていない井戸を組み立てて、それぞれ浸潤と移動を測定します。
- 上部チャンバーのウェルに低血清培地50 μLを充填し、システムのクレードルに入れます。[メッセージ]タブをクリックして、すべてのウェルがコントロールユニットによって認識されているかどうかを確認します。メッセージがOKと表示された場合は、クレードル内のプレートが実験の準備が整います。
- 培養条件下で培養条件下で完全にパックされたプレートを培養器に1時間入れ、リアルタイムの細胞分析システムクレードルでの測定に先立ち、パックされたプレートを細胞培養条件に順応させるために不可欠である。
- 低血清培地で処理した細胞を収穫するために、ステップ1.3のように細胞をトリプシン化し、低血清培地に集め、ステップ1.4のように細胞を数える。
- 計数後、遠心分離細胞を100xgで5分間、上清を捨てる。
- 800,000個の細胞を低血清培地800 μLで再懸濁し、移行および浸潤アッセイを行います。さらに、2 mLの培養培地で30万個の細胞を再懸濁し、35mm皿に種を入れ、ウェスタンブロット分析を行い、CrkおよびCrkLの調節されたノックダウンを確認します。
3. ベースライン読み取り、細胞の播種、細胞インピーダンスの測定と可視化
- クレードルのスタートボタンをクリックして、ベースラインの読み取り値を測定します。ベースラインは、培養条件下でリアルタイム細胞分析システムのクレードルでプレートを1時間予入培養した後、上のチャンバーのそれぞれのウェルに細胞を播種する前に読み取る必要があります。
注:クレードルのスタートボタンをクリックすると、制御ユニットは実験ファイルを保存するかどうかを尋ねます。ファイルが保存されると、クレードル アナライザーは、プログラムで設定されたベースライン セルインピーダンスを測定し、クレードルの開始ボタンが再度クリックされて 2 番目のステップでセルインピーダンスを測定するまで、一時停止モードに入ります。 - ベースライン測定後に揺りかごから移動と侵入のために両方のプレートを取り出し、バイオセーフティキャビネットに保管してください。
- CIMプレートの上部チャンバ内の各生物学的状態に対して4倍の4倍の4倍の種子100μLの細胞(100,000細胞)を、気泡を避けるために逆ピペットによりクレードルの制御ユニットにプログラムした。
- 播種後、プレートをバイオセーフティキャビネットの下に30分間室温で保管し、細胞が均一に底に落ち着くようにします。プレートをそれぞれのクレードルに戻し、クレードルスタートボタンをクリックして、2.5の2番目のステップでプログラムされたセルインピーダンスの測定を開始します。
- 最後のスイープが終了すると、実験が終了し、結果が自動的に保存されます。
- [データ分析]タブで、実験の完了中または完了後に時間依存的にセルインデックスとしてのセルインピーダンスの変化を視覚化します。4倍のそれぞれの条件は、個別に、または平均値または標準偏差のオプションボックスをクリックして、平均または標準偏差として視覚化することができます。
- セルインデックスデータをスプレッドシートファイルにエクスポートするには、空のスプレッドシートファイルを開き、データ分析ウィンドウの中央にカーソルを置いて右クリックします。表示されるダイアログ ボックスで、[データをリスト形式にコピーする] オプションを選択し、開いているスプレッドシートにデータを貼り付けます。
- セルインピーダンス測定の実際の開始時間を表す生データの時間を調整します。2 番目のステップの開始時刻はゼロに設定されます。
注:制御部は、正規化の有無にかかわらずセルインデックスを取得するオプション(すなわち、正規化されたセルインデックス)を、時間依存的な方法でグラフィカルな表示として結果を視覚化するオプションを有する。この例では、セルインデックスデータは、処理およびグラフィック表示のために正規化されずにエクスポートされます。 - 各クレードルのリリースボタンをクリックして実験をリリースします。
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Representative Results
CrkおよびCrkLは、異なる癌細胞株13,17,17における細胞の移動および浸潤にとって重要であると示唆されている。CrkとCrkLタンパク質は構造的にも機能的にも互いに類似しており、本質的な重なり合う機能16、19、20、21を果たしますが19,20,2116、CrkとCrkLの多くの遺伝子ノックダウン研究は、ノックダウンがCrk、CrkL、またはその両方に特異的であるかどうか明確に対処していません。したがって、2つのタンパク質のうち、細胞の移動および浸潤に寄与するタンパク質は不明である。原理実証研究として、CrkまたはCrkLに特異的なsiRNAを用いて、U-118MG GBM細胞株の移動および浸潤に及ぼす影響を研究した。Crkのノックダウンは、CrkLタンパク質レベルを低下させることなく、CrkIIおよびCrkIタンパク質レベルをそれぞれ85%および86%減少した。CrkLのノックダウンによりCrkLタンパク質レベルが85%減少した(図1)。CrkLノックダウンは、CrkIIとCrkIレベルもわずかに低下しました。CrkとCrkLのsiRNAの併用により、CrkII、CrkI、およびCrkLレベルが80%以上減少した(図1B)。一方、CrkとCrkLのノックダウンは、ビンキュリンおよびα-チューブリンレベルに影響を与えなかった(図1)。
U-118MG細胞は高血清(10%FBS)に移行し、実験内部制御として機能する13時間で最大の移行レベルに達した(図2A)。Crkノックダウンでは、細胞の移動が遅れ、細胞は23時間まで移行を続けました。U-118MG細胞は、CrkとCrkL(図2A)の両方のノックダウンで移動能力を失い、CrkとCrkLが癌細胞の移行に不可欠な重複する役割を果たしていることを示唆した。しかし、セルの移動が一定の時点で調べられた場合、この結論は明確ではありません。6または13時間での細胞移動を比較した場合、CrkとCrkLノックダウンによる阻害は明らかであった(図2B、C)。Cこれに対し、Crkノックダウンは18時間(図2D)での細胞移動に対して阻害効果を持たなかったが、比較のために選択された時点に応じて矛盾する結果を招いた。CrkLノックダウンとCrk/CrkLダブルノックダウンの阻害効果は、3つのタイムポイントすべてではっきりと見えました。これらの結果は、遺伝子操作や薬物による効果を正確に分析するために、細胞移動の全期間にわたって細胞移動を評価しなければならないことを明確に示している。
U-118MG細胞は高血清に侵入し、実験内部制御を務めた52時間で最大レベルの侵襲に達した(図3A)。Crkノックダウンでは、細胞の侵入は遅れましたが、60時間で同様の最大レベルに達しました。CrkLのノックダウンにより、U-118MG細胞はコントロール細胞と比較して遅れて減少した浸潤を示した。CrkとCrkLの結合されたノックダウンは細胞の浸潤をさらに阻害した(図3A)。36時間における細胞浸潤の比較は、コントロール細胞が積極的に浸潤を受けていたときに、CrkとCrkLの個別のノックダウンによる阻害とCrk/CrkLダブルノックダウンによる相乗的阻害を明らかに示した(図3B)。しかし、52または60時間での細胞浸潤の比較は、Crkノックダウンによる抑制効果がわずかまたは全く示さなかった(図3C、D)。Dこれらの結果は、細胞の浸潤を実験の全期間にわたって分析すべきであるという提案を明確に裏付けている。
これらの結果は、CrkとCrkLの両方が細胞の移動と侵入を仲介し、リアルタイムの細胞分析システムが細胞の移動と侵入の異なる運動学を理解する上で従来の方法よりも明確な利点を有することを示す時間依存的な方法で細胞の型に特異的な効果を与えます。
図1:U-118MG細胞におけるCrkI、CrkII、およびCrkLのsiRNA媒介性ノックダウン。(A)全細胞ライセートを、非標的対照siRNA(NT)で電気ポポレートした4日後に調製した細胞総ライセート、Crk siRNA、CrkL siRNA、またはCrkおよびCrkL siRNAの両方を用いて、タンパク質レベルを前述のウェスタンブロット分析により決定した。(B)各バンドの信号強度を撮像システムを用いて定量化し、NTの割合として算出した。それらの平均±SD値がグラフに示されている。ビンクリンとチューブリンは内部コントロールとして機能しました。データの統計的分析は、2つの実験グループ間の比較のためにペアになっていない両側のStudentのt検定を使用して行われた。*p < 0.05 と **p < 0.01 NT と比較して、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:U-118MG細胞移動に対するCrk/CrkLノックダウンの影響:(A)U-118MG細胞が非標的対照siRNA(NT)、Crk siRNA、CrkL siRNA、またはCrkおよびCrkL siRNAの両方で電気ポポレートされた3日後に、細胞を採取し、細胞移動をリアルタイム分析システムを使用して検査した。AU-118MG細胞の遊動は、時間依存的な方法でCrkまたはCrkLの単一のノックダウンで阻害された。CrkとCrkLの両方のノックダウンは、細胞の移動を完全にブロックしました。6 (B) 、 13 (C) 、 18 h (D) のセルインデックス値は、異なる時点 (矢印) でのセル移動を比較するために表示されます。13時にコントロールセル(NT)が最大移動に達した。18時間で制御およびCrkノックダウン細胞の両方が同様のレベルの細胞移動を示した。データの統計的分析は、2つの実験グループ間の比較のためにペアになっていない両側のStudentのt検定を使用して行われた。**p < 0.01、 NT と比較して、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:U-118MG細胞浸潤に対するCrk/CrkLノックダウンの影響:(A)U-118MG細胞を非標的対照siRNA(NT)、Crk siRNA、CrkL siRNA、またはCrkおよびCrkL siRNAの両方で電気ポポレートした3日後に、細胞を採取し、細胞浸潤をリアルタイム分析システムを用いて4日間検査した。AU-118MG細胞の浸潤は、CrkまたはCrkLの単一のノックダウンで時間依存的に阻害された。U-118MG細胞株におけるCrkとCrkLの両方のノックダウンは、NTと比較して侵襲的能力を最大48時間低下させた。BCD52時間で、コントロールセル(NT)は侵入の最初のピークに達した。60時間で、Crkノックダウン細胞は侵略の最初のピークに達した。データの統計的分析は、2つの実験グループ間の比較のためにペアになっていない両側のStudentのt検定を使用して行われた。*p < 0.05 と **p < 0.01 NT と比較して、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
リアルタイムセル解析システムを使用した細胞移動と浸潤のリアルタイム測定は、単一のタイムポイントでデータを提供する従来の方法よりも、複数の重要な利点を持つ、シンプルで迅速かつ継続的なモニタリングプロセスです。従来の方法と同様に、実験条件は、リアルタイム細胞分析システムの各細胞株に対して最適化する必要があります。侵略的な能力。これらの違いにより、各細胞株は異なる細胞動態および細胞インピーダンスを示し得る。インピーダンスは、ウェルに播種された細胞の数、細胞接着の時間、細胞が移行または侵入し始める前のラグタイム、およびCIMプレート上のECMゲルの濃度によって大きく影響されます。第一に、リアルタイムセル分析は、特定の期間にわたってリアルタイムで結果を提供し、コントロールセルがアクティブな細胞の移動と侵入を示す時間ポイントを特定し、コントロールがいつ制御するかを研究者が特定することを可能にするので、最適化を容易にします細胞は、移動と侵略の最大レベルに達します。第二に、異所性遺伝子過剰発現または遺伝子ノックダウン研究は、細胞が改変された遺伝子接合性変化から表現型を採用する必要があるため、追加の最適化が必要な場合がある。また、有効な薬物濃度および薬剤の有効性は、リアルタイム細胞分析システムを用いて、正常または改変された遺伝子条件と組み合わせて決定することができる。
創傷治癒、軟寒天、ボイデン室移動、または侵入アッセイのような伝統的な方法は、CrkまたはCrkLのいずれかのノックダウンが異なる癌細胞株13、17,17における移動および浸潤を減少させると判断するために使用されてきた。本研究では、U-118MG細胞株におけるCrkおよびCrkLのシングルまたはダブルノックダウンを誘導し、細胞の移動と浸潤を調査した。実験全体にわたる細胞インピーダンスのリアルタイム測定は、細胞の移動と侵入の動態に関する詳細な情報を提供し、2つの異なる阻害モードを同定することを可能にしました。Crkノックダウンが移行と侵略を遅らせたのに対し、CrkLノックダウンは全期間にわたって移行と侵略を阻害しました。さらに、CrkとCrkLの両方のダブルノックダウンは、細胞の移動を完全にブロックし、実質的に細胞浸潤を阻害した。
この研究は、実験の全期間にわたってCrkとCrkLの単一および二重ノックダウンを誘発する体系的なノックダウンアプローチと、細胞の移動と侵入のリアルタイム分析を組み合わせることが必要であるという概念実証を提供するがん細胞におけるCrkおよびCrkL媒介機能の包括的な分析この研究で提示されたデータは、この方法がCrkおよびCrkLに対する阻害効果の候補薬物をテストするためにも使用できることを示唆している。リアルタイム、詳細、包括的な分析が可能です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
リアルタイムの細胞解析システムデータに関する彼女の技術支援に対して、オリビア・ファンクに感謝します。また、この原稿を編集してくれたチルドレンズ・マーシー・カンザスシティのメディカル・ライティング・センターにも感謝します。この研究は、トム・キーヴェニー小児がん研究基金(TP)と小児慈悲病院中西部がんアライアンスパートナー諮問委員会(TPへの資金提供)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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