Summary
Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.
Abstract
Como la función celular está influenciada por factores específicos de nicho en el microambiente celular, los métodos para diseccionar la localización y migración celular pueden proporcionar más información sobre la función celular. Las células B-1a son un subconjunto único de células B en ratones que producen anticuerpos IgM naturales protectores contra epítopos específicos de oxidación que surgen durante la salud y la enfermedad. La producción de IgM de célula b-1a difiere dependiendo de la ubicación de la célula B-1a, y por lo tanto se vuelve útil desde un punto de vista terapéutico para apuntar a la localización B-1a a nichos que apoyan la alta producción de anticuerpos. Aquí describimos un método para apuntar a la migración celular B-1a a la médula ósea mediante sobreexpresión mediada por retroviral del receptor de quimiocina 4 (CXCR4) del motivo C-X-C. La inducción génica en las células murinas primarias B puede ser difícil y normalmente produce bajas eficiencias de transfección de 10-20% dependiendo de la técnica. Aquí demostramos que la transducción retroviral de células murinas primarias B-1a da como resultado una eficiencia de transducción del 30-40%. Este método utiliza la transferencia de células adoptivas de células B-1a transducidas en ratones receptores con deficiencia de células B para que se pueda visualizar la migración y localización de células B-1a del donante. Este protocolo se puede modificar para otras construcciones retrovirales y se puede utilizar en diversos ensayos funcionales después de la transferencia adoptiva, incluyendo el análisis del fenotipo y la función de células de donantes o células huésped, o el análisis de factores solubles secretados después de la transferencia celular B-1a. El uso de ratones donantes y receptores distintos diferenciados por el alotipo CD45.1 y CD45.2 y la presencia de un reportero de GFP dentro del plásmido retroviral también podrían permitir la detección de células donantes en otros modelos de ratón inmunes y inmunes que contienen poblaciones de células B endógenas.
Introduction
Estudios recientes han demostrado células inmunitarias considerables, y específicamente células B, heterogeneidad fenotípica y funcional dependiendo de la localización celular1,2,3,4,5. Las células B-1a son una de esas poblaciones con capacidad heterogénea para producir anticuerpos IgM protectores; Las células B-1a de la médula ósea secretan IgM de forma constitutiva y contribuyen significativamente a los títulos de Plasma IgM6,mientras que las células peritoneales B-1a tienen secreción IgM de bajo nivel en homeostasis y en su lugar se pueden activar a través de receptores innatos similares a peajes (TLR) o señalización mediada con citoquinas para proliferar, migrar y secretar rápidamente IgM7,8,9,10. Los anticuerpos IgM de células B-1a reconocen epítopos específicos de la oxidación (OSE) que están presentes en patógenos, células apoptóticas y LDL oxidado, y la unión igM a OSE puede prevenir la señalización inflamatoria aguas abajo en enfermedades como la aterosclerosis11. Por lo tanto, las estrategias para aumentar la producción de IgM a través del aumento de la migración celular peritoneal B-1a a sitios como la médula ósea pueden ser terapéuticamente útiles. Sin embargo, es importante que tales estrategias sean dirigidas y específicas de tipo celular, ya que los efectos fuera del objetivo pueden afectar negativamente la función inmune o la salud.
Aquí describimos un método para la sobreexpresión dirigida y a largo plazo de CXCR4 en células B-1a murinas primarias y posterior transferencia adoptiva para visualizar la migración celular y la producción funcional de anticuerpos IgM (Figura 1). La manipulación genética de las células B primarias está limitada por una baja eficiencia de transfección en comparación con la transfección de líneas celulares transformadas. Sin embargo, como las líneas celulares transformadas pueden desviarse significativamente de las celdas primarias12,,13, es probable que el uso de células primarias proporcione resultados que se alineen más estrechamente con la fisiología normal. Se han descrito varias técnicas para la transferencia de genes en células B murinas primarias, incluyendo transducción retroviral, transducción adenoviral, lipofección o transfección basada en electroporación, que tienen diferentes niveles de eficiencia, transiencia e impacto en la salud celular13,,14,,15. El siguiente método utilizó la transducción retroviral, ya que produjo una eficiencia adecuada de transferencia de genes de >30%, mientras que afectaba mínimamente a la viabilidad celular. El retrovirus expresivo de CXCR4 se generó utilizando la proteína fluorescente verde verde de entrada de células madre murinas de construcción retroviral anteriormente descrita anteriormente (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, en el que el gen del ratón CXCR4 fue sub-clonado4. Las partículas retrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) y CXCR4-GFP se generaron utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente4,,14.
Las células B-1a transducidas con éxito se transfirieron por vía intravenosa a ratones Rag1-/- con deficiencia de linfocitos. Tanto los ratones donantes como los receptores contenían además la noción del gen Apolipoproteína E (ApoE), lo que resulta en una mayor acumulación de OSE y aterosclerosis, proporcionando así un modelo para la activación celular in vivo B-1 y la producción de IgM. Además, los ratones donantes y receptores diferían en el alostipo CD45; las células de donante B-1 provenían de ratones CD45.1+ ApoE-/- y se transfirieron a receptores Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-. Esto permitió la diferenciación del donante CD45.1 de las células CD45.2 B receptoras después de la transferencia sin la necesidad de manchar adicionalmente para los marcadores de células B durante el análisis de citometría de flujo. Los resultados proporcionados aquí demuestran que la sobreexpresión de CXCR4 dirigida en células B-1a se asocia con una mayor capacidad de las células B-1a para migrar a la médula ósea, que se asocia con el aumento del plasma anti-OSE IgM. Además, proporcionamos un método para el enriquecimiento de células B-1 peritoneales a través de la selección negativa y demostramos el requisito de activación de la célula B-1 para la transducción eficiente. Este método se puede adaptar para otras construcciones retrovirales para estudiar el efecto de la sobreexpresión de proteínas en la migración celular B-1a, fenotipo o función. Además, el uso de la distinción de alotipo CD45.1 frente a CD45.2 teóricamente podría permitir la transferencia a otros modelos murinos inmunes y suficientes que contengan células B endógenas.
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Protocol
Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia.
1. Separación magnética y enriquecimiento de células peritoneales B-1
- Eutanasia un ratón de 12 a 14 semanas, macho, CD45.1+ApoE-/- usando CO2.
- Haz un corte superficial en el abdomen usando tijeras quirúrgicas rectas y pela la piel usando tijeras curvas para exponer la pared peritoneal. Enjuague la cavidad peritoneal con 10 ml de 37 oC RPMI-1640 medio utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Agitar el ratón para desenganchar las células agarrando la cola y moviendo el ratón de lado a lado a fondo durante 15 x 20 s.
NOTA: Masajear el peritoneo lavado también puede maximizar la recuperación celular. - Recoger el líquido peritoneal con una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G dibujando líquido en la parte inferior derecha del peritoneo justo por encima del nivel de la cadera, cerca de los intestinos. Evite interrumpir los depósitos epidimales de grasa y los órganos subyacentes. Evite extraer líquido del lado izquierdo del ratón, ya que la grasa omental se puede extraer fácilmente en la jeringa.
- Una vez que se recogen 6 x 7 ml de líquido, dispensar en un tubo cónico de 50 ml colocado sobre hielo. A continuación, eleve el ratón verticalmente sosteniendo la pared peritoneal por encima del diafragma utilizando fórceps para que cualquier líquido restante permanezca en la parte inferior de la cavidad peritoneal. Haga un pequeño corte en la pared peritoneal usando tijeras quirúrgicas por encima del hígado (asegúrese de no cortar el hígado) y recoja cualquier líquido peritoneal restante usando una pipeta de vidrio y una bombilla.
- Acopia de células de lavado peritoneal de todos los ratones CD45.1+ApoE-/- (n a 15-20) en tubos cónicos de 50 ml, y guárdelos en hielo.
NOTA: Para calcular el número de ratones necesarios: Las células B-1a comprenden el 5-10% de la población peritoneal total y producen aproximadamente 2,5 x 5 x 105 células B-1a por ratón en las manos de los autores. La eficiencia de la transducción es de 30 a 40 %, como se muestra a continuación. - Recuento de células vivas utilizando un tinte de viabilidad como el azul tripano y un hemocitoómetro (diluir muestras 1:5 en azul tripano y cargar 10 l en la cámara del hemocitociómetro). Células de grupo a hasta 1 x 108 células por tubo. Células centrífugas a 400 x g durante 5 min a 4 oC, luego aspirar sobrenadante.
- Resuspender hasta 1 x 108 células en 1 ml de anticuerpos anti-CD16/CD32 (Tabla de materiales) diluidos 1:50 en tampón de ensayo (1x solución salina tamponada de fosfato [PBS], albúmina sérica bovina 0,5% [BSA], 2 mM EDTA) para bloquear los receptores Fc. Escale según sea necesario en función del recuento de celdas. Incubar sobre hielo durante 10 min a 4oC.
- Preparar una mezcla maestra 2x de los anticuerpos biotinilados (Tabla 1) en el tampón del ensayo para el agotamiento. La mezcla maestra 2x explica el volumen del líquido en el que ya se encuentran las células al incubar con anti-CD16/CD32. Por ejemplo, si las células están incubando en 500 l de anti-CD16/CD32 diluido, a continuación, añada 500 l de 2x mezcla maestra que contenga 10 l de anticuerpos biotinilados Ter119, Gr-1, CD23 y NK1.1, y 25 l de anticuerpo F4/80 biotiniloado para alcanzar las concentraciones finales indicadas en la Tabla 1. Añadir 2x mezcla maestra a las células y manchar durante 20 minutos a 4 oC.
- Lavar las células con 5 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar sobrenadante.
- Resuspender e incubar células con microperlas antibiotinas (Tabla de materiales) diluidas en tampón de ensayo según la concentración y el protocolo recomendados por el fabricante.
- Lavar con 5 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4oC. Aspirar sobrenadante y resuspender hasta 1 x 108 células en 500 l de tampón de ensayo.
- Primeras columnas de selección magnética (Tabla de materiales) con 3 ml de tampón de ensayo. Transfiera las células a columnas de selección magnética cebada y recoja las eluyentes que contienen células B-1 enriquecidas en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo. Lave la columna de selección magnética con búfer de ensayo adicional hasta que el volumen total acumulado sea de 10 ml.
NOTA: Una alícuota de las fracciones celulares pre purificadas y post-purificadas debe analizarse por separado mediante la citometría de flujo para la eficiencia de purificación mediante la tinción de células CD19+ B, macrófagos F480+ y células T CD5+ como se muestra en la Figura 2. - Contar la fracción celular post-purificada (eluente que contiene células B-1 enriquecidas) contando las células vivas como en el paso 1.6, y resuspender a 1 x 106 células/ml en medio de cultivo celular B (RPMI-1640, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor [FBS], 10 mM HEPES, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 50 g/ml de gentamicina, 55 mM-merceptoetanol).
2. Estimulación celular de células B-1
- Dividir celdas agrupadas para las dos condiciones transducidas (Ctl-GFP y CXCR4-GFP), al tiempo que se apartan y enchacan al menos 10 x 106 celdas para un control no transducido.
- Placa de hasta 150 l (150.000 células) por pozo en placas de fondo redondo de 96 pocillos.
- Añadir 100 nM TLR9 agonista ODN1668 a todos los pozos para estimular la proliferación celular.
- Incubar durante 16-18 h a 37oC, 5% CO2.
3. Transducción retroviral de células B peritoneales
- Generar partículas retrovirales Ctl-GFP (MigR1) y CXCR4-GFP utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente14.
NOTA: Esto tomará varios días, así que prepare y titer las existencias retrovirales y almacene alícuotas a -80 oC antes de iniciar este protocolo. - Descongelar las existencias de retrovirus sobre hielo. Utilícelo inmediatamente y no vuelva a congelar, ya que el título de virus disminuye significativamente durante los ciclos de congelación y descongelación. Añadir sobrenadantes retrovirales Ctl-GFP o CXCR4-GFP a 20:1 multiplicidad de infección (MOI) a las células, en presencia de polibrena de 8 g/ml y fresco de mercaptoetanol a 55 m de concentración final. No añada existencias virales a las células reservadas para el control no transducido.
- Realizar la espinfección centrifugando las placas a 800 x g durante 90 min a temperatura ambiente.
- Incubar placas con retrovirus a 37oC, 5%coc 2 durante 3 h adicionales.
- Cosechar y replatear las células en medio de células B frescas e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
4. Clasificación celular de células B-1a peritoneales transducidas
- Cosecha las células cultivadas y se agrupa en tres tubos cónicos separados de 50 ml para cada condición: no transducido, transducido por Ctl-GFP y transducido por CXCR4-GFP.
- Contar las células vivas como en el paso 1.6, luego centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar sobrenadante.
- Células resuspendidas a 100.000 células/L en el búfer de clasificación (PBS + 1% BSA) que contienen 1:50 anticuerpos anti-CD16/CD32 (Tabla de materiales) para bloquear los receptores Fc. Incubar sobre hielo durante 10 min a 4oC.
- Células Aliquot para controles de compensación (30.000 células por control de compensación): para controles de una sola mancha y alícuotas no mantenidas a partir de muestras no transducidas y para alícuotas de control de manchas únicas de GFP a partir de muestras transducidas.
NOTA: Los cordones de compensación disponibles comercialmente se pueden utilizar alternativamente para controles de una sola mancha si el número de celda no transducido es bajo. - Preparar una mezcla maestra de anticuerpos 2x que contenga los anticuerpos conjugados con fluoróforo en el tampón de clasificación (Tabla 1). Agregue 2x mezcla maestra a muestras no transducidas, transducidas por CTL-GFP y transducidas por CXCR4-GFP. Añada anticuerpos individuales a los controles de una sola mancha. Incubar durante 20 min a 4oC en la oscuridad.
NOTA: La mezcla maestra 2x representa el volumen de líquido en el que ya se encuentran las células al incubar con anti-CD16/CD32, como en el paso 1.8. Una alícuota de células de cada condición se puede teñir por separado para CXCR4 para confirmar la sobreexpresión de CXCR4. - Lavar las muestras con 1 ml de tampón de clasificación y colar a través de filtros de 70 m en tubos de polipropileno.
- Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4oC y aspirar sobrenadante. Resuspender muestras a 50.000 células/L en el búfer de clasificación.
- Antes de la clasificación celular, prepare tubos de recolección de células activados por fluorescencia (FACS) con etiqueta que contengan 1 ml de medio de recogida (RPMI-1640, 20% de FBS inactivado por calor, 10 mM HEPES, 1x aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato sódico, 50 g/ml de gentamicina, 55 m-mercaptoetanol) para cada población a clasificar.
- Antes de ejecutar muestras en el clasificador de celdas, agregue 2x DAPI (preparado como dilución 1:5000 en el búfer de ordenación) para la discriminación de células muertas.
- Ordene las células GFP+ B-1a en tubos FACS que contengan medios de recolección como muestras DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ de las muestras CTL-GFP y CXCR4-GFP. Utilice la muestra no transducente para establecer la puerta GFP+ y para ordenar las celdas DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ no transdéducidas B-1a.
NOTA: Alternativamente, las células no transducidas también se pueden ordenar de las muestras CTL-GFP y CXCR4-GFP mediante el gating por separado de las celdas B-1a dentro de la fracción GFP-. Las células B-1b transducidas o no transducidas también se pueden ordenar utilizando esta estrategia de ordenación como DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- células.
5. Transferencia adoptiva
- Después de la clasificación celular, las células centrífugas a 400 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante cuidadosamente.
- Células resuspendidas en frío estéril 1x PBS a 1.000 células/L.
- Anestesiar macho Rag1-/- ApoE-/- ratones utilizando isoflurano e inyectar 100 l (100.000 células) por ratón a través de inyección intra-orbital o de vena de cola utilizando una jeringa de insulina ultrafina. Inyecte algunos ratones con 1x PBS como control.
6. Cuantificación de células donantes e IgM plasmática
- En el momento deseado de la transferencia post-adoptiva, analizar las células transferidas en ratones receptores por la médula ósea y la cosecha de tejido del bazo4 y la citometría de flujo. Cuantifique la localización de células de donantes y la sobreexpresión de CXCR4 tinndo para CD45.1, CD45.2 y CXCR4 y analice los resultados de la citometría de flujo utilizando un software como Flowjo.
NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver los anticuerpos utilizados en este paso. Asegúrese de no utilizar un conjugado de anticuerpos que fluoresces en el canal FITC como GFP estará presente en las células de donantes transducidas. - Aislar el plasma añadiendo 10 l de 0,5 M EDTA a la sangre entera recogida a través de una punción cardíaca en el momento del sacrificio animal. Centrifugar la sangre entera a 7.000 x g y aliquot plasma en tubos centrífugos separados de 1,5 ml. Conservar a -80 oC hasta realizar el análisis de factores secretados como IgM por ELISA4.
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Representative Results
En la Figura 1se ofrece una visión general del protocolo. La Figura 2 muestra el enriquecimiento de las células peritoneales B-1a después del agotamiento magnético de otros tipos de células peritoneales. Las células individuales vivas en la fracción posterior al agotamiento tienen una mayor proporción de células CD19+ B en comparación con F4/80+ macrófagos, carecende cd5 hi CD19- células T, y contienen una mayor frecuencia de células CD19+ CD5medianas B-1a en comparación con la fracción de pre-agotamiento. La Figura 3 muestra el requisito de activación de células B para la transducción exitosa de células B retrovirales, y un aumento dependiente de la dosis en la frecuencia de subconjuntos de células GFP+ B transducidos con éxito con el aumento del MOI del virus mediante el retrovirus Ctl-GFP. La Tabla 2 muestra una mayor eficiencia de transducción utilizando 96 placas de fondo redondo de pozo en comparación con las placas de 24 o 6 pozos. La Figura 4 muestra una sobreexpresión exitosa de CXCR4 (>40%) en células B-1 y aumento de la migración de células B-1 hacia CXCL12 in vitro después de la transducción con retrovirus CXCR4-GFP, sin un impacto significativo en la viabilidad de las células B. La Figura 5 muestra la estrategia de medición para la clasificación de células live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a de una condición no transducida (GFP-) o de las dos condiciones transducidas (GFP+). Tenga en cuenta que las células CD23+ B-2 no están presentes en estas muestras debido al agotamiento magnético previo. Las células en vivo, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b también se pueden ordenar utilizando esta estrategia de medición. La Figura 6 muestra células donantes CD45.1+ transferidas y sobreexpresión sostenida de CXCR4 en células de donantes recuperadas de la médula ósea y bazo de ratones receptores CD45.2 17 semanas después de la transferencia celular. La Tabla 3 muestra una asociación positiva entre la expresión cxCR4 y la localización celular del donante en la médula ósea, pero no en el bazo. La Tabla 4 muestra una asociación positiva entre el número de células del donante en la médula ósea y la cantidad plasmática de IgM anti-MDA-LDL.
Figura 1: Esquema de diseño experimental para transducción retroviral y transferencia adoptiva. Las células peritoneales aisladas de ratones de alotipo CD45.1 se enriquecen para las células B-1 mediante el agotamiento magnético utilizando anticuerpos biotinilados y microperlas antibiotinas. Las células B-1 peritoneales enriquecidas se activan para estimular la proliferación celular con el oligodeoxicótido agonista TLR9 CpG. Las células activadas se transducen con partículas retrovirales Ctl-GFP o CXCR4-GFP. Las células GFP+ B-1a transducidas con éxito se ordenan mediante FACS y se transfieren de forma adoptiva a ratones host de alostipo CD45.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Enriquecimiento para células B-1 peritoneales. Gráficas representativas de citometría de flujo de las células peritoneales de enriquecimiento premagnético (arriba) y enriquecimiento postmagnético (abajo) para células CD19+ B. Las células CD19+ F4/80- son células B, las células CD19- F4/80+ son macrófagos, las célulasmedias CD19+ CD5 son células B-1a y las células CD19- CD5hi son células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La transducción retroviral requiere la activación de la célula B. Las células peritoneales B se transujeron con retrovirus Ctl-GFP a las 5:1, 10:1 o 25:1 MOI o no se transujeron en presencia o ausencia del agonista TLR9 CpG ODN1668. La frecuencia de las células GFP+ B2, B1, B-1a o B-1b transducidas con éxito se cuantificó mediante citometría de flujo 18 h después de la transducción. Las barras de error representan la media de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Confirmación de la sobreexpresión de CXCR4 y aumento de la migración de B-1a in vitro. Las células B peritoneales de ratones ApoE-/- con deficiencia específica de células B de CXCR4 fueron aisladas y transducidas con retrovirus Ctl-GFP o CXCR4-GFP, o cultivadas sin transducción. (a) Gráficas de flujo representativas de expresión CXCR4 y GFP en celdas B-1 a partir de condiciones no transducidas (arriba a la izquierda), transducidas por Ctl-GFP (izquierda inferior) o CXCR4-GFP (abajo a la derecha). FMO-CXCR4 (arriba a la derecha) utilizado para establecer la puerta positiva CXCR4. (b) Cuantificación de la IMF de CXCR4 en celdas GFP+ B-1 a partir de condiciones no transducidas (n a 1), transducidas por Ctl-GFP (n a 2) o transducidas por CXCR4-GFP (n a 2). (c) Frecuencia de células B-1 no transducidas (n a 1), transducidas Ctl-GFP (n a 2) o CXCR4-GFP transducidas (n a 2) células B-1 que migraron hacia CXCL12 como porcentaje del número total de células B-1 cargadas en el transpocil en. (d) Estrategia representativa de gating para la cuantificación de células viables dentro de la población de células B transducidas con éxito (CD19+GFP+). (e) Frecuencia de las células B vivas después de la transducción con el retrovirus Ctl-GFP (n a 2) o cxCR4-GFP (n a 2). Las barras de error representan la media de SEM. Esta cifra ha sido modificada de nuestra publicación anterior4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Estrategia de medición para la clasificación de células GFP+ B-1a transducidas. Gráficas representativas de citometría de flujo para clasificar células GFP+ o GFP- B-1a a partir de una muestra no transducidas (arriba), una muestra transducente Ctl-GFP (media) y una muestra transducente CXCR4-GFP (abajo). Células B-1a definidas como células live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cuantificación de las células de donantes transferidas. Gráficas representativas de citometría de flujo que muestran células de donante CD45.1+ CD45.2 desde un control PBS (arriba), un receptor de células Ctl-GFP+ B-1a (medio) y un receptor de células CXCR4-GFP+ B-1a (abajo) y un análisis posterior de la expresión CXCR4 en células donantes en médula ósea(a) o bazo(b). Cuantificación de la expresión CXCR4 (intensidad media de fluorescencia, IMF) en células donantes de médula ósea (c) o bazo (d). Cuantificación del número de células donantes recuperadas en la médula ósea (e) o bazo (f) de los receptores. *P < 0.05 o **P < 0.01 por prueba Mann-Whitney. Las barras de error representan la media de SEM. Esta cifra ha sido modificada de nuestra publicación anterior4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso de protocolo | Anticuerpo | Concentración final |
| Paso 1.8 | Biotina Ter119 | 1 l por cada 100 ml de volumen final |
| Biotina CD3e | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| Biotina Gr-1 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| Biotina CD23 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| NK1.1 biotina | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| F4/80 biotina | 2,5 l por volumen final de 100 l | |
| Anticuerpo | Concentración final | |
| Paso 4.5 | CD5 PE | 1 l por cada 100 ml de volumen final |
| IgM PECF594 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| CD23 PECy7 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| B220 APC | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| CD19 APCef780 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| Anticuerpo | Concentración final | |
| Paso 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 l por cada 100 ml de volumen final |
| CD45.2 BV421 | 1 l por cada 100 ml de volumen final | |
| CXCR4 APC | 2,5 l por volumen final de 100 l |
Tabla 1: Anticuerpos y sus concentraciones finales utilizadas en el protocolo.
| Condición | %GFP+ de la población total | %GFP+ de células CD19+ B |
| Placa de fondo redondo de 96 pozos | 30.9% | 52.7% |
| Placa de 24 pozos | 8.4% | 21.2% |
| Placa de 6 pozos | 16.2% | 27.3% |
Tabla 2: Optimización de placas. Frecuencia de células GFP+ totales transducidas con éxito o células GFP+ CD19+ B después de la transducción de 6 x10 6 células B-1 peritoneales enriquecidas en una placa de fondo redondo de 96 pozos (40 pozos a 150.000 células por bueno), una placa de 24 pozos (6 pozos a 1 x 106 celdas por pozo), o una placa de 6 pozos (3 pozos a 2 x 106 celdas por pozo) a un MOI 20:1 con retrovirus Ctl-GFP.
| Variable | IMF de CXCR4 en células de donante B-1a | |
| r-valor | valor p | |
| • de células del donante B-1a en la médula ósea | 0.71 | *0.014 |
| • de células de donante B-1a en bazo | 0.43 | 0.18 |
Tabla 3: Asociación entre la expresión CXCR4 en las células donantes y la localización de células de donantes. La intensidad media de fluorescencia (IMF) de CXCR4 en células B-1a del donante se correlacionó con el número de células B-1a del donante en la médula ósea o el bazo de Rag1-/- ApoE-/- ratones receptores 17 semanas después de la transferencia adoptiva. Datos presentados como coeficiente de correlación (r) y significancia estadística (p). Esta tabla ha sido modificada de nuestra publicación anterior4.
| Variable | • de células de donante en la médula ósea | |
| r-valor | valor p | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabla 4: Asociación entre la localización celular del donante y la cantidad plasmática de IgM anti-OSE. El número de células de donante B-1a en la médula ósea de Rag1-/- ApoE-/- ratones receptores 17 semanas de transferencia post-adoptiva se correlacionó con la cantidad circulante de IgM anti-MDA-LDL, E06/T15 o anti-1,3-dext IgranM. Datos presentados como coeficiente de correlación (r) y significancia estadística (p). Esta tabla ha sido modificada de nuestra publicación anterior4.
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Discussion
El método proporcionado aquí permite la administración estable y relativamente eficiente del gen celular B-1a primario, la transferencia adoptiva in vivo y la identificación y localización de las células inyectadas. Las células pudieron ser detectadas 17 semanas después de la transferencia celular y retenían el aumento de la expresión CXCR4. La entrega mediada por retrovirus produjo una eficiencia de transducción del 30-40% de las células B-1a murinas primarias con un impacto mínimo en la viabilidad celular en nuestras manos (Figura 4e). Esto está en línea con los resultados de un estudio previo de Moghimi y colegas que comparó las técnicas para la transferencia de genes a células murinas primarias B incluyendo infección retroviral, infección adenoviral, nucleofección, o lipofecamine15. Sin embargo, encontramos que el rango de sobreexpresión de CXCR4 varió considerablemente dentro de los destinatarios que recibían células B-1a transducidas por CXCR4-GFP (Figura 6c,d). Por lo tanto, utilizamos el análisis asociativo para demostrar que el aumento de la expresión de CXCR4 se correlacionó con el aumento de la migración de B-1a y la localización a la médula ósea, que se asoció con el aumento del plasma IgM(Tabla 3 y Tabla 4).
Las limitaciones de este método incluyen el gran número de ratones necesarios para obtener un número suficiente de células B-1a transducidas con éxito, y la variabilidad en la eficiencia de la transducción de un experimento a otro. La eficiencia de la transducción se mejora con títulos más altos de las poblaciones virales, que deben ser de al menos 2 x 107 partículas infecciosas/ml14. El uso de ratones más viejos, de 12 a 16 semanas de edad también puede mejorar el rendimiento celular peritoneal B-1, ya que el número de células peritoneales B-1 aumenta con la edadde 17años.
También es importante tener en cuenta que la cantidad de IgM secretada por células B-1a transducidas fue de 5 veces menor que la cantidad secretada por las células B-1a no transducidas después de la transferencia adoptiva al mismo modelo Rag1-/- ApoE-/- (datos no mostrados). Esto puede deberse al requisito de activación de la célula B-1 con agonista TLR9 antes de la transducción retroviral (Figura 3), que puede limitar la activación secundaria y la producción de IgM en respuesta a la transferencia post-adoptiva in vivo de OSE. Por lo tanto, para los estudios que requieren una producción robusta de IgM mediante células B-1a transferidas, las técnicas alternativas de transferencia de genes que no requieren la activación previa de la célula B-1a, como la entrega lentiviral18,19, pueden resultar útiles. Alternativamente, las modificaciones a este protocolo que implican estrategias de activación para inducir la proliferación pero no la diferenciación B-1a en células secretoras de IgM también podrían ser suficientes para la transducción retroviral exitosa sin afectar la activación de la célula B secundaria. IL-5 es una importante mediación de citoquinas de proliferación y supervivencia celular B-1a, y puede ser una alternativa eficaz a la estimulación TLR920,21.
Estudios previos han utilizado células baplénicas aisladas a través de estrategias de selección positivas o negativas utilizando anticuerpos contra B220 (marcador de células B) o Thy1.2 (marcador de células T)13,14. Sin embargo, las células B esplénicas B B220+ son una población heterogénea que contiene subconjuntos de células B-1 y B-2. Además, la frecuencia de las células B-1 dentro de la población total de células B de CD19+ esplénicos es baja (1-2%). Por el contrario, este método utiliza la cavidad peritoneal como una fuente celular B-1 para la transducción, ya que las células B-1 comprenden el 60-70% del total de células CD19+ B en este compartimiento22,y utiliza CD23 como marcador para agotar las células peritoneales B-2. La clasificación posterior de células B-1a transducidas con éxito basadas en la expresión GFP, CD19, B220, CD23, IgM y CD5 permite aún más la transferencia de un tipo de celda definido más específicamente. La estrategia de agotamiento magnético para enriquecer las células B-1 peritoneales agotó efectivamente las células T, y redujo la frecuencia de los macrófagos peritoneales F4/80 en un 50% en nuestras manos(Figura 2),aunque una mayor optimización y solución de problemas de este paso crítico podría aumentar la eficiencia de la transducción. Por ejemplo, el uso de una mayor concentración de anticuerpos F4/80 biotinilados para un mejor agotamiento de los macrófagos podría aumentar aún más la eficiencia de la transducción celular B-1a, ya que habría menos transducción retroviral "fuera de destino" de otros tipos de células. El uso de placas de fondo redondo de 96 pozos para la transducción, en lugar de placas planas de 24 o 6 pozos, mejoró considerablemente la eficiencia de la transducción(Tabla 2),aunque aumenta el tiempo de manipulación y pipeteo.
En general, este método proporciona un enfoque útil de prueba de concepto para determinar si la entrega de genes dirigidos a células B-1a puede alterar la localización celular B-1a y la producción funcional de IgM. Las aplicaciones futuras de esta técnica podrían incluir la entrega ex vivo de construcciones retrovirales dirigidas a otras proteínas, y la transferencia adoptiva para determinar su efecto en los procesos de donantes o células huésped in vivo, incluyendo la supervivencia celular, la migración, la proliferación o la función. La transferencia adoptiva a huéspedes inmunocompetentes, en lugar de a los huéspedes con deficiencia de linfocitos, también sería posible con esta técnica, ya que las células donantes (CD45.1+ GFP+) podrían diferenciarse de las células huésped (CD45.2+ GFP-). Dirigirse a otros receptores de quimiocina utilizando este método podría apoyar aún más la hipótesis de que apuntar a la migración de células B-1a hacia nichos permisivos de alta producción de IgM puede aumentar eficazmente los niveles de IgM protector.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Proyecto 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), y R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye fue apoyado por la beca predoctoral American Heart Association 16PRE30300002 y 5T32AI007496-20. Agradecemos a Joanne Lannigan, Mike Solga y Claude Chew de la Universidad de Virginia Flow Cytometry Core por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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