Summary
हमने एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के लिए मानव और अमानवीय रहनुमा खाद्य पदार्थों की स्क्रीनिंग के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का अनुकूलन किया है। हमने यह दिखाकर इस परख को मान्य किया कि ज्ञात एस्ट्रोजेनिक मानव खाद्य सोया उच्च दर्ज करता है, जबकि अन्य खाद्य पदार्थ कोई गतिविधि नहीं दिखाते हैं।
Abstract
पौधे कई जानवरों के लिए भोजन का स्रोत हैं, और वे हजारों रसायनों का उत्पादन कर सकते हैं। इनमें से कुछ यौगिक कशेरुकी में शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित करते हैं जो उनका उपभोग करते हैं, जैसे कि एंडोक्राइन फ़ंक्शन। फाइटोएस्ट्रोजेन, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए एंडोक्राइन-सक्रिय फाइटोकेमिकल्स, कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम के हाइपोथेलामो-पिट्यूटरी गोंडल अक्ष के साथ सीधे बातचीत करते हैं। यहां हम एस्ट्रोजेनिक जैविक गतिविधि वाले यौगिकों की उपस्थिति के लिए पौधे के अर्क को स्क्रीन करने के लिए सेल-आधारित परख का उपन्यास उपयोग प्रस्तुत करते हैं। यह परख अत्यधिक एस्ट्रोजन रिसेप्टर बीटा (ERο) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करता है और है कि एक लूसिफ़ेरेस जीन के साथ संक्रमित किया गया है । एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के साथ यौगिकों के संपर्क में आने से कोशिकाओं में प्रकाश का उत्पादन होता है। यह परख जैविक एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के लिए परीक्षण करने का एक विश्वसनीय और सरल तरीका है। इसमें क्षणिक ट्रांसफेक्शन पर कई सुधार हैं, सबसे विशेष रूप से, उपयोग में आसानी, कोशिकाओं की स्थिरता, और परख की संवेदनशीलता।
Introduction
पौधे कई जानवरों के लिए भोजन का एक आवश्यक स्रोत हैं, जो जीवित रहने, प्रजनन, विकास, विकास और व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण कैलोरी और पोषक तत्व प्रदानकरते हैं। पौधे हजारों रसायनों का उत्पादन करते हैं, कई अपने स्वयं के विकास, स्स्टेमैटिक रखरखाव और प्रजनन के लिए अनुकूलन के रूप में। अन्य यौगिकों, समझा संयंत्र माध्यमिक चयापचय (PSMs), कार्य है कि कम स्पष्ट कर रहे हैं, हालांकि कुछ विषाक्त और संभावना शाकाहारी और परजीवीवाद के खिलाफ एक रक्षा के रूप में इस्तेमाल कर रहे है (जैसे, क्षारीय, टैनिन)2,3। इनमें से कुछ रसायनों में जानवरों में दीर्घकालिक शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित करने की क्षमता होती है, जैसे एंडोक्राइन कार्यप्रणाली, हालांकि ये एंडोक्राइन-एक्टिव फाइटोकेमिकल्स कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम के साथ बातचीत क्यों करतेहैं,यह अभी भी अस्पष्ट है2,4।
फाइटोएस्ट्रोजेन्स, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए एंडोक्राइन-एक्टिव फाइटोकेमिकल्स, पॉलीफेनोलिक पीएसएम हैं जो संरचनात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से एस्ट्रोजेन की नकल करते हैं, सीधे कशेरुकी एंडोक्राइन सिस्टम5के हाइपोथलोमो-पिट्यूटरी गोनाडल धुरी के साथ बातचीत करते हैं। मानव आहार में फाइटोएस्ट्रोजेन का घूस कुछ कैंसर, हृदय रोग और रजोनिवृत्ति के लक्षणों के खिलाफ सुरक्षा से जुड़ा हुआ है, हालांकि अन्य प्रभावों में प्रजनन संबंधी समस्याएं शामिल हैं। वास्तव में, इन यौगिकों के शारीरिक प्रभाव 1940 के दशक में खोज रहे थे जब भेड़ में बांझपन फाइटोएस्ट्रोजन से भरपूर क्लोवर(ट्राइफोलियम सबटेरेरियम)6पर उनके चराई के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था । जब निगला जाता है, फाइटोएस्ट्रोजेन कोशिकाओं में पारित कर सकते हैं और एस्ट्रोजन के प्रभाव की नकल कर सकते हैं। जबकि फाइटोएस्ट्रोजेन का भेड़ प्रजनन क्षमता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा, फाइटोएस्ट्रोजेन और शरीर विज्ञान के बीच संबंध सरल नहीं है। भेड़ की तरह, दक्षिणी सफेद गैंडा सोया और अल्फाल्फा की उच्च मात्रा से प्राप्त फ़ीड में एस्ट्रोजेनिक यौगिकों के प्रति संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है। गर्भावस्था के दौरान इस आहार को खिलाई जाने वाले महिलाओं की बेटियों में7प्रजनन की संभावना कम होती है . हालांकि, अन्य अध्ययनों से पता चला है कि फाइटोएस्ट्रोजेन का सकारात्मक प्रभाव भी हो सकता है, जिसमें पुराने चूहों में अंडाशय के रोम की परिपक्वता8,कुछ कैंसर की रोकथाम, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि और एंटीप्रोलाइफेटिव प्रभाव9शामिल हैं।
फाइटोएस्ट्रोजेन के प्रभावों की चौड़ाई आश्चर्य की बात नहीं है कि एस्ट्रोजेन प्रजनन और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र10के विकास, विकास और विनियमन सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्रभावित करते हैं। यद्यपि कार्रवाई के कई तंत्र हैं, फाइटोएस्ट्रोजेन में अक्सर इंट्रान्यूक्लियर एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा और बीटा (ईआरα और ईआर) के लिए लिगांड के रूप में कार्य करने की क्षमता के माध्यम से एस्ट्रोजन सिग्नलिंग को संशोधित करने, बढ़ाने या बाधित करने की क्षमता होती है। कई फाइटोएस्ट्रोजेन में एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स को बांधने की अनुमति देने वाले एस्ट्रोजेन के समान फेनोलिक रिंग संरचना होती है। एस्ट्रोजन की तरह एगोनिस्टिक एस्ट्रोजेनिक गतिविधि कार्य करने वाले लोग एक सक्रिय ईआर-लिगांड कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जो एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व (ईईआरई) से प्रसारित और बांध सकता है और जीन ट्रांसक्रिप्शन11को ट्रिगर कर सकता है। इस प्रकार, एस्ट्रोजेन और फाइटोएस्ट्रोजेन प्रतिलेखन कारकों के रूप में अपने कार्यों के माध्यम से सेल गतिविधि और प्रणाली कार्यों को विनियमित करते हैं।
यहां हम एस्ट्रोजेनिक जैविक गतिविधि वाले यौगिकों की उपस्थिति के लिए पौधे के अर्क को स्क्रीन करने के लिए सेल-आधारित परख का उपन्यास उपयोग प्रस्तुत करते हैं। यह परख चीनी हम्सटर अंडाशय चो कोशिकाओं का उपयोग करता है जो अत्यधिक ईरा व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं, जो जुगनू(फोटिनस पाइरेलिस)लूसिफ़ेरेस जीन से संक्रमित हुए हैं जो एक एरे प्रमोटर12से जुड़े हैं। जब एस्ट्रोजेनिक यौगिक मौजूद होते हैं, तो वे ईआर से बांधते हैं, डिमराइज करते हैं, और ईरी से बांधते हैं, जिससे लूसिफ़ेरेस जीन का ट्रांसक्रिप्शन होता है। सब्सट्रेट समाधान के अतिरिक्त होने पर, लूसिफ़ेरेस एक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है जिससे फोटॉन उत्सर्जन होता है। इसलिए, सकारात्मक नमूने प्रकाश का उत्पादन करते हैं और नकारात्मक नमूने नहीं करते हैं।
यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख प्रयोगशालाओं के लिए रिपोर्टर जीन और एस्ट्रोजन रिसेप्टर13, 14के साथ स्तनधारी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो प्रभावकारिता में अस्थिर और परिवर्तनीय था। परख एक स्थिर ट्रांसफेक्शन प्लेटफॉर्म प्रदान करती है जो जल्दी से और बस यह निर्धारित करती है कि रिसेप्टर बाइंडिंग के माध्यम से एक पौधे में एस्ट्रोजेनिक गतिविधि है या नहीं।
हम इस परिकल्पना का परीक्षण करते हैं कि सोयाबीन में स्थानीय ग्रॉसर्स से मानव खाद्य पदार्थों का उपयोग करके एस्ट्रोजेनिक आइसोफ्लावोन15 की ज्ञात सांद्रता को देखते हुए अन्य सभी खाद्य पदार्थों की तुलना में उच्च एस्ट्रोजेनिक गतिविधि होती है।
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Protocol
1. पौधे की सामग्री तैयार करना
- सूखे पौधे की वस्तुओं को फ्रीज करें जिन्हें एक लियोफिलिज़र का उपयोग करके ताजा एकत्र किया गया था।
- प्रकाश से नमूनों की रक्षा के लिए, सुखाने की प्रक्रिया के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कक्षों को कवर।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने पूरी तरह से सूखे हैं, lyophilize जब तक कक्षों को छूने के लिए ठंडा महसूस नहीं होता है और पौधे की सामग्री अब वजन होने पर बड़े पैमाने पर खो नहीं जाती है।
- पीसने तक प्रकाश की अनुपस्थिति में बाँझ कम अवशेष बैग में सूखे पौधों को स्टोर करें।
- 0.85 मिमी जाल स्क्रीन के साथ पीसने वाली मिल का उपयोग करके नमूनों को बारीक पीसें।
- निकासी तक प्रकाश के अभाव में बैग में जमीन के नमूने स्टोर करें।
2. पौधे माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की निकासी
- माध्यमिक पौधे मेटाबोलाइट्स निकालने के लिए, एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल के 10 एमएल में सूखे नमूने के 1 ग्राम के अनुपात का उपयोग करें।
- विश्लेषणात्मक संतुलन पर नमूना तौलें और इसे उचित आकार के एर्लेनमेयर फ्लास्क (125 - 250 एमएल) में जोड़ें। फिर मेथनॉल की उचित मात्रा जोड़ें। निकाले गए नमूने के द्रव्यमान को रिकॉर्ड करें।
- एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संयंत्र-मेथनॉल समाधान को कवर करें, और फिर कक्षीय शेखर पर 3 दिनों के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 100 आरपीएम गति से घुमाने के लिए सेट करें, जिससे संभावित एस्ट्रोजेनिक यौगिकों को मेथनॉल में भंग करने की अनुमति मिल सके।
- फिल्टर पेपर (125 मिमी) का उपयोग करके सुपरनेट को ड्रिप फिल्ट्रेशन सिस्टम में डिकंट करें।
- रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करके, पौधे को तब तक सूखा दें जब तक कि नमूना गाढ़ा न हो जाए, लेकिन 300 एमएल राउंड-बॉटम फ्लास्क में डाल सकता है। एक 50 मिलीएल गोल-नीचे फ्लास्क में नमूना डालें, बड़े फ्लास्क को मेथनॉल की थोड़ी मात्रा के साथ कुल्ला करें। जब तक मेथनॉल पूरी तरह से सुखाया न जाए तब तक छोटे फ्लास्क में नमूना सुखाते रहें।
- विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके नमूना अवशेषों का वजन करें। रिकॉर्ड अवशेष द्रव्यमान।
- डीएमएसओ के 2 एमएल तक 0.1 ग्राम एक्सट्रैक्ट की एकाग्रता पर डाइमेथिल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) में पौधे के अर्क को भंग करें। भंवर जब तक समरूप।
- पौधे के अर्क- डीएमएसओ समाधान को अंबर ग्लास शीशियों में 4 डिग्री सेल्सियस पर परख तक स्टोर करें।
सावधानी: पौधे अज्ञात जैविक रूप से सक्रिय रसायनों का उत्पादन कर सकते हैं, और डीएमएसओ एक ऐसा वाहन है जो उन्हें कोशिका झिल्ली में ले जा सकता है। इन नमूनों को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और देखभाल का उपयोग करें।
3. मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर β ट्रांसफेक्शन परख12
नोट: Aseptic तकनीक और एक लेमिनार प्रवाह हुड परख प्रोटोकॉल के दिन 1 के लिए आवश्यक है ।
- मानक वक्र के लिए 17-एस्ट्रेडिओल के कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
- सेल रिकवरी मीडियम और कंपाउंड स्क्रीनिंग मीडियम (सीएसएम) को फ्रीजर स्टोरेज से ट्रांसफर करें और 37 डिग्री सेल्सियस वॉटर बाथ में गल जाएं ।
- लेबल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब मध्यवर्ती 1 और 2 (INT1, INT2) और 1-8।
- सीएसएम के 995 माइक्रोन के साथ INT1 भरें, सीएसएम के 615 माइक्रोन के साथ INT2, सीएसएम के 900 माइक्रोन के साथ ट्यूब 1, और सीएसएम के 600 माइक्रोन के साथ ट्यूब 2-8। ट्यूब 8 को अलग सेट करें।
- 100 माइक्रोन 17m-एस्ट्रेडिओल स्टॉक के 5 माइक्रोन को INT1 में स्थानांतरित करें। टिप को त्याग दें। वातावर्त।
- प्रत्येक स्थानांतरण से पहले, पिपेट को 3 बार कुल्ला करें, और फिर INT1 से 10 माइक्रोन को INT2 में स्थानांतरित करें। टिप को त्याग दें।
- पिपेट को 3 बार कुल्ला करें, और फिर INT2 से 100 माइक्रोल को ट्यूब 1 में स्थानांतरित करें। टिप त्यागें। ट्यूब 1 से 300 माइक्रोन को ट्यूब 2 में स्थानांतरित करें। ट्यूब 3 से 7 के लिए दोहराएं। बेकार कंटेनर में ट्यूब 7 से 300 माइक्रोन फेंकें। ट्यूब 8 एक शून्य है और एस्ट्राडिओल प्राप्त नहीं करता है। प्लेटेड मानकों की अंतिम सांद्रता हैं: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487, और 0 पीएम एस्ट्रडिओल।
- नमूना यौगिक तैयार करें।
- भंवर के नमूने लिए।
- डीएमएसओ में प्रत्येक पौधे के नमूने का 4 माइक्रोन लें और 0.8% डीएमएसओ समाधान प्राप्त करने के लिए सीएसएम के 496 माइक्रोन में जोड़ें।
- तेजी से गल रिपोर्टर कोशिकाओं ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान से सेल रिकवरी माध्यम की ट्यूब को पुनः प्राप्त करें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके बाहरी सतह को कीटाणुरहित करें।
- -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से रिपोर्टर कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करें और जमे हुए कोशिकाओं की ट्यूब में पूर्व गर्म सीआरएम के 10 एमएल स्थानांतरित करके गल जाएं।
- रिपोर्टर कोशिकाओं की ट्यूब बंद करें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए स्थानांतरित करें।
- पानी स्नान से रिपोर्टर सेल निलंबन की ट्यूब पुनः प्राप्त करें। कोशिकाओं की ट्यूब को कई बार धीरे-धीरे कोशिकाओं के समुच्चय को तोड़ने और एक समरूप निलंबन का उत्पादन करने के लिए उलटा करें। ट्यूब की सतह को 70% इथेनॉल से साफ करें।
- परख चढ़ाना
- एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से रिपोर्टर सेल सस्पेंशन के 100 माइक्रोल को वितरित करें।
- उचित परख कुओं में ट्रिप्लिकेट में नमूनों के 100 माइक्रोन वितरित करें।
- प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करें,22-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर को आर्द्रीकृत करें।
- गल डिटेक्शन सब्सट्रेट और डिटेक्शन बफर एक अंधेरे रेफ्रिजरेटर में रात भर 2 दिन के लिए तैयार करने के लिए ।
- इनक्यूबेशन प्लेट के अंत से ठीक पहले, रेफ्रिजरेटर से डिटेक्शन सब्सट्रेट और डिटेक्शन बफर को हटा दें और आरटी में समतुल्य होने तक कम प्रकाश क्षेत्र में रखें। एक बार आरटी में, प्रत्येक ट्यूब को धीरे-धीरे कई बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए उलटा करें।
- इनक्यूबेशन पूरा होने से तुरंत पहले, ल्यूसिफ़ेरेस डिटेक्शन रिएजेंट बनाने के लिए डिटेक्शन सब्सट्रेट की ट्यूब में डिटेक्शन बफर की पूरी सामग्री डालें। धीरे-धीरे मिलाएं ताकि फोम का उत्पादन न हो।
- एक बार इनक्यूबेशन पूरा हो जाने के बाद, सामग्री को उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागने के लिए प्लेट को उलट दें। कुओं से अंतिम बूंदों को हटाने के लिए धीरे-धीरे प्लेट को एक साफ शोषक कागज तौलिया पर टैप करें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से लूसिफ़ेरेस डिटेक्शन रिएजेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें। परख प्लेट को 15 मिनट के लिए आरटी में आराम करने की अनुमति दें। थाली न हिलाएं।
- 96-अच्छी तरह से प्लेट-रीडिंग ल्यूमिनोमीटर का उपयोग करके चमक को निर्धारित करें।
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Representative Results
आमतौर पर मानव आहार में पाए जाने वाले फलों और सब्जियों के बाईस अर्कों की एस्ट्रोजेनिक यौगिकों की उपस्थिति के लिए जांच की गई । सोयाबीन, बर्फ मटर और स्नैप मटर जैसे फलियां सहित विभिन्न प्रकार के खाद्य पदार्थों को आसक्त किया गया था, क्योंकि मटर परिवार फाइटोएस्ट्रोजेन16के साथ-साथ अंजीर, खजूर, मक्का, गाजर, सेब, केले, स्ट्रॉबेरी, टमाटर, गोभी और गोभी का एक ज्ञात स्रोत है। एंडोक्राइन बाधित यौगिक सामान्य पदार्थों (जैसे, प्लास्टिक और कीटनाशकों) में पाए जाते हैं और कुछ ईआरएस17के माध्यम से जैविक रूप से सक्रिय होते हैं। जब संभव हो, दोनों कार्बनिक और nonorganically विकसित वस्तुओं की संभावना है कि एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के साथ कीटनाशकों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है के लिए खाते में कहा गया ।
प्रत्येक पौधे के खाद्य पदार्थ को ट्रिप्लिकेट में चढ़ाया गया था और ल्यूमिनोमीटर ने सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरआरएलयू) में प्रत्येक अच्छी तरह से गतिविधि की सूचना दी। आरआरएलयू की पृष्ठभूमि का स्तर मानक 8, शून्य एकाग्रता के साथ मानक वक्र में निर्धारित किया जाता है, और संदर्भ के लिए उपयोग किया जाता है। गुना सक्रियण मूल्य, जो वक्र पर शून्य बिंदु के लिए आरएलयू के ऊपर गुणक है, समीकरण द्वारा गणना की जाती है:
गुना एक्टिवेशन = अज्ञात (आरएलयू) ÷ स्टैंडर्ड 8 (आरएलयू)
व्याख्यात्मक उद्देश्यों के लिए, एस्ट्रोजेनिक गतिविधि को उच्च, मेड, कम या कोई गतिविधि के एक मौखिक, गुणात्मक तरीके से प्रस्तुत किया जाता है। गतिविधि के उच्च स्तर मानक 4 गुना सक्रियण मूल्य से ऊपर रजिस्टर करते हैं। मध्यम मानक 5 और मानक 4 के बीच आता है, और कम मूल्य मानक 6 और मानक 5 के बीच हैं । मानक 7 से नीचे गुना सक्रियण मूल्यों के साथ किसी भी नमूने को कोई गतिविधि नहीं माना जाता है। टेबल 1का जिक्र करते हुए सोयाबीन, दोनों कार्बनिक और गैर कार्बनिक, गतिविधि के उच्च स्तर पर जांच की, जबकि अन्य सभी फल और सब्जी आइटम कोई गतिविधि दर्ज की गई। सोयाबीन के परिणामों की तुलना मानक वक्र(चित्रा 1)से करने से पता चलता है कि, चाहे बवाल हो गया हो या नहीं, वे इस एकाग्रता पर एस्ट्रडिओल गतिविधि के स्तर के लिए वक्र से उच्च स्कोर करते हैं। सोयाबीन निकालने, आइसोफ्लावोन डिडज़ीन और जेनिस्टीन9का एक ज्ञात शक्तिशाली स्रोत, आगे अधिकतम(चित्रा 2)के लिए एक 50% संकेत उपज कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस निकालने के लिए हमारे मानक कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल के आधे संकेत का उत्पादन करने के लिए 422 गुना अधिक कमजोर पड़ने की आवश्यकता है।
| उत्पादन आइटम | ऑर्गेनिक/नॉन ऑर्गेनिक | सापेक्ष प्रकाश इकाइयां (लूम) | गुना एक्टिवेशन | गुना एक्टिवेशन (मतलब) | फाइटोएस्ट्रोजन गतिविधि |
| सोयाबीन | जैविक | 1687 | 29.016 | 31.06 | उच्च |
| 2023 | 34.796 | ||||
| 1706 | 29.353 | ||||
| सोयाबीन | गैर-कार्बनिक | 2041 | 35.106 | 32.05 | उच्च |
| 1956 | 33.647 | ||||
| 1593 | 27.399 | ||||
| स्नो मटर | गैर-कार्बनिक | 53 | 0.919 | 0.92 | कोई गतिविधि नहीं |
| 59 | 1.015 | ||||
| 49 | 0.836 | ||||
| स्नैप मटर | गैर-कार्बनिक | 66 | 1.142 | 1.21 | कोई गतिविधि नहीं |
| 60 | 1.032 | ||||
| 85 | 1.462 | ||||
| मकई | गैर-कार्बनिक | 29 | 0.502 | 0.53 | कोई गतिविधि नहीं |
| 30 | 0.513 | ||||
| 33 | 0.575 | ||||
| स्ट्रॉबेरि फल | गैर-कार्बनिक | 35 | 0.609 | 0.77 | कोई गतिविधि नहीं |
| 47 | 0.808 | ||||
| 51 | 0.884 | ||||
| स्ट्रॉबेरि फल | जैविक | 56 | 0.956 | 0.88 | कोई गतिविधि नहीं |
| 59 | 1.015 | ||||
| 39 | 0.678 | ||||
| केला | जैविक | 32 | 0.544 | 0.52 | कोई गतिविधि नहीं |
| 28 | 0.489 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| केला | गैर-कार्बनिक | 33 | 0.564 | 0.60 | कोई गतिविधि नहीं |
| 41 | 0.712 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| केला | गैर-कार्बनिक | 37 | 0.64 | 0.70 | कोई गतिविधि नहीं |
| 39 | 0.667 | ||||
| 47 | 0.805 | ||||
| काले | जैविक | 26 | 0.447 | 0.47 | कोई गतिविधि नहीं |
| 26 | 0.444 | ||||
| 30 | 0.519 | ||||
| काले | गैर-कार्बनिक | 40 | 0.685 | 0.63 | कोई गतिविधि नहीं |
| 28 | 0.485 | ||||
| 42 | 0.719 | ||||
| करमकल्ला | जैविक | 33 | 0.568 | 0.54 | कोई गतिविधि नहीं |
| 27 | 0.468 | ||||
| 34 | 0.588 | ||||
| करमकल्ला | गैर-कार्बनिक | 44 | 0.757 | 0.66 | कोई गतिविधि नहीं |
| 34 | 0.585 | ||||
| 36 | 0.626 | ||||
| सेब | जैविक | 30 | 0.523 | 0.49 | कोई गतिविधि नहीं |
| 25 | 0.437 | ||||
| 30 | 0.509 | ||||
| सेब | गैर-कार्बनिक | 41 | 0.705 | 0.62 | कोई गतिविधि नहीं |
| 31 | 0.53 | ||||
| 37 | 0.63 | ||||
| टमाटर | जैविक | 51 | 0.874 | 0.87 | कोई गतिविधि नहीं |
| 57 | 0.974 | ||||
| 44 | 0.76 | ||||
| टमाटर | गैर-कार्बनिक | 61 | 1.056 | 1.19 | कोई गतिविधि नहीं |
| 81 | 1.386 | ||||
| 66 | 1.128 | ||||
| गाजर | जैविक | 33 | 0.575 | 0.51 | कोई गतिविधि नहीं |
| 33 | 0.561 | ||||
| 22 | 0.382 | ||||
| गाजर | गैर-कार्बनिक | 31 | 0.53 | 0.52 | कोई गतिविधि नहीं |
| 21 | 0.365 | ||||
| 38 | 0.657 | ||||
| आलंकारिक रूप | गैर-कार्बनिक | 29 | 0.506 | 0.61 | कोई गतिविधि नहीं |
| 42 | 0.716 | ||||
| 36 | 0.619 | ||||
| दिनांकों | गैर-कार्बनिक | 29 | 0.495 | 0.59 | कोई गतिविधि नहीं |
| 39 | 0.667 | ||||
| 35 | 0.602 |
तालिका 1. फाइटोएस्ट्रोजन गतिविधि के लिए फल और सब्जी वस्तुओं की स्क्रीनिंग के लिए ER1 रिपोर्टर परख प्रणाली के प्रतिनिधि परिणाम । सकारात्मक गतिविधि उच्च, मेड, कम, या कोई गतिविधि द्वारा इंगित किया जाता है।
चित्रा 1. 17-एस्ट्राडिओलमानक का धारावाहिक कमजोरपड़ना (मानक 1 से 8 सांद्रता = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487, और 0 पीएम, क्रमशः ERο रिपोर्टर परख प्रणाली का उपयोग कर. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। ERο रिपोर्टर परख सोयाबीन निकालने के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए कमजोर पड़ने का निर्धारण है कि एक संकेत से पृष्ठभूमि अनुपात है कि अधिकतम संकेत का ५०% है मिले । डीएमएसओ के 2 एमएल तक 0.1 ग्राम एक्सट्रैक्ट की एकाग्रता पर डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में पौधे के निकालने को भंग करने वाली मानक निष्कर्षण विधि से, सोयाबीन को अधिकतम प्रतिक्रिया का 50% संकेत प्राप्त करने के लिए 422 बार पतला किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
व्यक्तिगत रूप से दवा एजेंटों को स्क्रीन करने के लिए विकसित ERο रिपोर्टर परख भी ERο के माध्यम से जैविक रूप से सक्रिय फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए संयंत्र खाद्य पदार्थों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण विचारों में पौधे के नमूनों को देखभाल के साथ इलाज करना शामिल है: मोल्डिंग या अन्य जैविक क्षरण को रोकने के लिए ताजा पौधे सामग्री को तेजी से सूखने की आवश्यकता है, और यौगिकों के फोटोलिसिस को रोकने के लिए इसे प्रकाश से दूर रखने की आवश्यकता है18। निर्माता द्वारा प्रदान की गई परख प्रोटोकॉल12 स्पष्ट है और स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए बहुत कम संशोधनों की आवश्यकता है। निर्माता द्वारा सुझाए गए मानक वक्र को इस प्रोटोकॉल में संशोधित किया गया है ताकि ऊपर और नीचे के पठारों को संरक्षित करते हुए वक्र(चित्रा 1)की घातीय रेंज में आने वाले बिंदुओं की संख्या में वृद्धि की जा सके। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस परख का उपयोग करना संभव है, लेकिन हमारा उद्देश्य पौधों को जैविक प्रभाव, खाद्य पसंद और जानवरों में अन्य व्यवहार के लिए उच्च गतिविधि के साथ संबद्ध करना है जो उनका उपभोग करते हैं।
निष्कर्षण और परख की प्रभावशीलता को और अधिक समझाने के लिए हमने सोयाबीन निकालने(चित्रा 2)के साथ एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र शामिल किया और निर्धारित किया कि सामान्य निष्कर्षण प्रोटोकॉल की शक्ति को देखते हुए, सोया को सिग्नल 50% अधिकतम तक गिरने से पहले बड़े पैमाने पर पतला किया जाना चाहिए। यह इस तथ्य पर प्रकाश डालता है कि फाइटोएस्ट्रोजेन की उच्च सांद्रता पर सिग्नल पठारों को स्थिर अधिकतम संकेत पर। बहुत कम सांद्रता पर संकेत पृष्ठभूमि से प्रतिष्ठित होने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं हो सकता है। एक नमूने में कम मात्रा में मौजूद फाइटोएस्ट्रोजेन का पता लगाने के लिए, अर्क की उच्च सांद्रता के साथ काम करना महत्वपूर्ण है, झूठे नकारात्मक को कम करना। प्रारंभ में प्रयोगशाला ने मेथनॉल निष्कर्षण (यानी, डीएमएसओ के 10 एमएल से 0.1 ग्राम पौधे के अवशेषों) से पौधे के अवशेषों के सापेक्ष डीएमएसओ की अधिक मात्रा का उपयोग किया। नमूने भी कमजोर करने के लिए सकारात्मक नमूनों में एक मजबूत चमक प्रेरित कर रहे थे । रिपोर्टर सेल व्यवहार्यता और प्लेट पर कुओं के भीतर मात्रा की कमी के लिए अधिकतम DMSO प्रतिशत के कारण, नमूना निकालने एकाग्रता जब संयंत्र अवशेषों के लिए DMSO जोड़ने का अनुकूलन किया जाना चाहिए । सोया जैसे सकारात्मक नियंत्रण को हर प्लेट पर शामिल किया जाना चाहिए, इस बात की पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाएं व्यवहार्य हैं और ल्यूमिनेसेंस में सक्षम हैं, और यह कि अर्क एकाग्रता प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।
यह परख उन यौगिकों का पता लगाती है जो ईआर के लिए बाध्य करते हैं, लेकिन सभी फाइटोएस्ट्रोजेन में कार्रवाई का एक ही तंत्र नहीं होता है। इस परख प्रोटोकॉल को एस्ट्रोडियोल और पौधों के यौगिकों के संयोजन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके संशोधित किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि नमूने9,12में एंटी एस्ट्रोजन गतिविधि है या नहीं । एस्ट्रेडिओल में ईआर के लिए महान आत्मीयता है, इसलिए फाइटोएस्ट्रोजेन की उपस्थिति में रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करके एस्ट्रोडिओल की उपस्थिति में एंटीस्ट्रोजेनिक जैविक गतिविधि हो सकती है, जो एस्ट्रोजेन की प्रतिक्रिया को कम करती है। एंटीस्ट्रोजेनिक गतिविधि संयंत्र निकालने की बढ़ती एकाग्रता के साथ कुल सक्रियण में कमी से पता लगाया जाएगा। इस परख से कार्रवाई के अन्य तरीकों का पता नहीं चलेगा, जैसे झिल्ली से बंधे ईआरएस19के लिए बाध्यकारी । इसके अलावा, कुछ फाइटोएस्ट्रोजेन जैविक रूप से सक्रिय नहीं होते हैं जब तक कि उन्हें आंत के रोगाणुओं द्वारा चयापचय नहीं किया जाता20। यह संभव है कि कुछ पौधों जिनके पास अपने अमेटाबोलिजित राज्य में कोई या कम एस्ट्रोजेनिक गतिविधि नहीं है, मेटाबोलाइजेशन के बाद उच्च एस्ट्रोजेनिक गतिविधि होती है कि इस परख का पता नहीं लगेगा।
ERο रिपोर्टर परख पौधों में गतिविधि के लिए फाइटोएस्ट्रोजेन की स्क्रीनिंग का उदाहरण देने के लिए चुना गया है क्योंकि फाइटोएस्ट्रोजेन ERα21की तुलना में ERο के लिए अधिक दृढ़ता से एस्ट्रोडिओल के साथ बाध्यकारी के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं । ERα गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग एक समान परख के माध्यम से संभव है, जिसमें कोशिकाओं ERα जीन के बजाय ERα जीन से संक्रमित हैं ।
सक्रिय फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए सकारात्मक स्क्रीनिंग के बाद, सक्रिय यौगिकों को क्रोमेटोग्राफी विधियों के साथ पहचाना जा सकता है। दरअसल, उस समय इस परख का उपयोग करके अलग-थलग यौगिकों का परीक्षण किया जा सकता है और आधे अधिकतम प्रभावी सांद्रता (ईसी50)को यौगिक की शक्ति के उपाय के रूप में एक कमजोर पड़ने श्रृंखला का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।
यह परख जैविक एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के लिए परीक्षण करने का एक विश्वसनीय और सरल तरीका है, जो एस्ट्रोजेनिक गतिविधि के तंत्र की चौड़ाई में अपनी सीमाओं को ध्यान में रखते हुए है। इसमें क्षणिक ट्रांसफेक्शन पर कई सुधार हैं, सबसे विशेष रूप से उपयोग में आसानी, कोशिकाओं की स्थिरता, और परख की संवेदनशीलता।
मनुष्यों या जंगली जानवरों द्वारा उपभोग किए जाने वाले जंगली पौधों के खाद्य पदार्थों में फाइटोएस्ट्रोजेन की व्यापकता के बारे में बहुत कम जानकारी है , लेकिनअध्ययनोंसे पता चलता है कि आहार में एस्ट्रोजेनिक पीएसएम के संपर्क में आने से23लंबे समय तक चलने वाले प्रभाव हो सकते हैं । एक साधारण मजबूत परख है कि इन यौगिकों का पता लगाता है, अध्ययन के साथ संयोजन के रूप में खाया मात्रा का आकलन करने और जब वे खाया जाता है, आहार में एस्ट्रोजेनिक खाद्य पदार्थों और शारीरिक प्रणालियों पर इन यौगिकों के प्रभाव को शामिल करने के कार्य का निर्धारण करने में एक शक्तिशाली कदम है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक क्षणिक ट्रांसफेक्शन परख के उपयोग में प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए डेल Leitman के आभारी हैं रहनुमा संयंत्र खाद्य पदार्थों की एस्ट्रोजेनिक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए । प्रयोगशाला उपकरण स्थापित करने और निष्कर्षण विधियों में छात्रों को प्रशिक्षित करने में मदद करने के लिए ब्रैडफोर्ड वेस्टरिच और सी एरिक जॉनसन के लिए धन्यवाद। अंत में, इस शोध के वित्तपोषण के लिए इंडियाना विश्वविद्यालय को धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ° water bath | |||
| 37 °, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
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