Summary
Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.
Abstract
El protocolo descrito aquí describe cómo inyectar soluciones de forma segura e manual a través de la cisterna magna, al tiempo que se elimina el riesgo de daño al parénquima subyacente. Los protocolos publicados anteriormente recomiendan el uso de agujas rectas que deben reducirse a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura. La caída repentina de la resistencia una vez perforada la membrana dura hace que sea difícil mantener la aguja en una posición estable. Nuestro método, en cambio, emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar contra el hueso occipital del cráneo, evitando así que la jeringa penetre en el tejido después de la perforación de la membrana dural. El procedimiento es sencillo, reproducible y no causa molestias duraderas en los animales operados. Describimos la estrategia de inyección intracisternal en el contexto de la cartografía genética del destino de las células leptomeningeales vasculares. La misma técnica puede, además, utilizarse para abordar una amplia gama de cuestiones de investigación, como el sondeo del papel de los leptomeninges en el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana, a través de la ablación genética de genes implicados putativamente en estos fenómenos. Además, el procedimiento se puede combinar con un sistema de perfusión automatizado para un parto constante y se utiliza para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo a través de la inyección de moléculas etiquetadas fluorescentesmente.
Introduction
Las células leptomeningeales son una población similar a los fibroblastos de células organizadas en una capa delgada que superpone el cerebro y expresa genes implicados en la reticulación de colágeno (por ejemplo, Dcn y Lum),y en el establecimiento de una barrera cerebro-meningeal (por ejemplo, Cldn11)1,2. Las células leptomeningeales están implicadas en una amplia gama de funciones fisiológicas, desde un estricto control sobre el drenaje del líquido cefalorraquídeo3 hasta la guía de progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo4,5. Un estudio reciente también ha propuesto que los leptomeninges en el recién nacido pueden albergar células radiales similares a la glia que migran al parénquima cerebral y se convierten en neuronas corticales funcionales6.
Las células leptomeningeales se encuentran muy cerca de los astrocitos de superficie y comparten con ellos, así como otras astroglia parenquimales, expresión de connexina-30 (Cx30)7. El procedimiento quirúrgico descrito a continuación permite un etiquetado generalizado y específico de estas células meningeales a través de una entrega única de endoxifeno en la cisterna magna de ratones transgénicos que expresan condicionalmente tdTomato en Cx30+ células (es decir, utilizando un sistema CreER-loxP para la cartografía del destino). Endoxifeno es un metabolito activo de tamoxifeno e induce la recombinación de células que expresan CreER de la misma manera que el tamoxifeno. Es, sin embargo, la solución recomendada para la aplicación tópica porque se disuelve en 5-10% DMSO, en lugar de altas concentraciones de etanol. Además, el endoxifeno no cruza la barrera cerebro-meningeal, lo que permite una recombinación específica de células leptomeningeales, sin etiquetado de la población subyacente Cx30+ astroglial (ver Resultados Representativos).
La técnica presentada aquí tiene como objetivo inyectar manual y segura mente el compuesto en el líquido cefalorraquídeo, a través del acceso directo a la cisterna magna. A diferencia de otros procedimientos más invasivos que requieren craneotomía, este enfoque permite infundir compuestos sin causar daño al cráneo o al parénquima cerebral. Por lo tanto, no se asocia con la inducción de reacciones inflamatorias desencadenadas por la activación de células de la glia parenquimal. Similar a otras estrategias de inyección descritas antesde 8,9,10, el enfoque actual se basa en la exposición quirúrgica de la membrana dural atlanto-occipital que cubre la cisterna magna, después de la disección contundente de los músculos del cuello superpuestos. Sin embargo, a diferencia de otros procedimientos, recomendamos el uso de una aguja doblada en la punta, que se puede estabilizar contra el hueso occipital durante la administración. Esto evitará el riesgo de que la aguja penetre demasiado profundo y dañe el cerebelo subyacente y la médula.
Este procedimiento quirúrgico es compatible con las investigaciones de rastreo de linaje que apuntan a mapear los cambios en las identidades celulares y las rutas de migración a través de capas parénquimas. También se puede adaptar a estudios de ablación genética que pretenden investigar el papel de las células leptomeningeales en la salud y la enfermedad, como su contribución al desarrollo cortical5 o la propagación de la meningitis bacteriana3,11. Finalmente, se puede utilizar para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo cuando se combina con la entrega de marcadores fluorescentes en animales de tipo salvaje.
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Protocol
Los procedimientos quirúrgicos presentados por la presente fueron aprobados por Stockholms Norra Djurf-rs-ksetiska N'mnd y llevados a cabo de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el Instituto de Investigación (Instituto Karolinska, Suecia).
NOTA: La inyección intracisternal se puede adaptar de forma flexible para múltiples fines de investigación. A continuación presentamos un procedimiento desarrollado para etiquetar eficientemente las células leptomeningeales para el mapeo del destino basado en la inyección de endoxifeno en una línea de ratón transgénica que transporta R26R-tdTomato12 y CreER, este último bajo el promotor Cx3013. El etiquetado de esta población de células puede lograrse mediante la inyección de construcciones virales utilizando el mismo procedimiento descrito a continuación. Finalmente, este enfoque se puede emplear para el seguimiento del flujo de líquido cefalorraquídeo, mediante la infusión de marcadores fluorescentes.
1. Preparación del sistema de inyección
NOTA: Recomendamos llevar a cabo el procedimiento en una sala quirúrgica adecuada, y en condiciones asépticas. Las herramientas quirúrgicas se pueden esterilizar con calor (autoclave, esterilizador de perlas de vidrio) o desinfectarse con un desinfectante químico de alto nivel si son sensibles al calor. Enjuague los instrumentos antes de usarlos cuando emplee la desinfección química o deje que se enfríen cuando estén desinfectados con calor.
- Con fórceps, doble la aguja de la jeringa de inyección a 30o a 3 mm de la punta.
NOTA: Utilice jeringas Hamilton con una aguja biselada de 30 G. - Preparar 1 mg/ml de solución de endoxifeno, diluido en 10% DMSO y rellenar la jeringa con la aguja doblada.
NOTA: Administrar 5 ml del compuesto para garantizar una exposición generalizada de las células meningeales en el ratón adulto C57Bl/6j (ca. 25-30 g), aunque pueden ser necesarios experimentos piloto que prueben diferentes concentraciones y volúmenes de inyección al tratar animales de diferentes edades y cepas. - Ajuste el soporte del cabezal del ratón para que la boquilla esté aproximadamente a 30o de la superficie de la mesa quirúrgica.
NOTA: Un marco estereotáctico con fijación de tres puntos (es decir, orejas y boca) también se puede utilizar para este procedimiento. En este caso, sin embargo, el animal sólo se fijará con la boquilla, mientras que las barras de oído se pueden extender debajo de las extremidades anteriores del animal y se utilizan para apoyar el cuerpo del animal durante el procedimiento.
2. Inducción de la anestesia
- Para los anestésicos inyectables, utilice las concentraciones y modos de administración recomendados por la unidad veterinaria de la institución local.
- Para anestésicos inhalatores, como el isoflurano, prepare la unidad de administración de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
- Con isoflurano, establecer la concentración del compuesto en 4% para la inducción de la anestesia.
- Entregar aire a una velocidad de 400 ml/min.
- Deje que la unidad de anestesia llene la cámara con el anestésico durante unos minutos y coloque el ratón en la cámara después.
NOTA: Para los experimentos actuales, hemos utilizado ratones transgénicos macho (>2 meses de edad y aproximadamente 30 g) macho y hembra que llevan Cx30-CreER y R26R-tdTomato, y criadosobre sobre un fondo C57Bl/6j. - Monitoree al animal durante la inducción de la anestesia. El patrón de respiración debe disminuir la velocidad cuando el ratón está bajo anestesia completa.
- Retire el animal de la cámara y compruebe la supresión del reflejo de la pata pellizcando delicadamente las patas traseras.
NOTA: El reflejo todavía puede estar presente, pero se retrasó un par de segundos. Si ese es el caso, coloque el animal de nuevo en la cámara hasta que se haya logrado la supresión completa del reflejo de la pata. - Administrar analgésicos (p. ej., Carprofeno, 5 mg/kg a través de inyección subcutánea) para ayudar al manejo del dolor postoperatorio.
3. Posicionamiento del Animal para el Procedimiento
- Fije la cabeza del animal en el soporte de la cabeza. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, coloque el cuerpo del animal a aproximadamente 30o de la superficie de la mesa y la cabeza titulada hacia abajo, para establecer un ángulo de 120o con el resto del cuerpo y extender la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna (Figura 1A).
- Agregue toallas de papel debajo del animal para apoyar su cuerpo durante todo el procedimiento.
- Asegurar el parto de anestesia a través de la boquilla y reducir la concentración de isoflurano al 2,5% y el suministro de aire a 200 ml/min.
- Aplicar pomada oftálmica.
4. Exposición de la Cisterna Magna
- Afeitar la parte posterior del cuello del animal y desinfectar la zona con 70% de etanol y betadina.
- Usando tijeras quirúrgicas, realice una incisión de línea media (aprox. 7 mm de longitud) comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndolo posteriormente.
- Separe suavemente los músculos superficiales del tejido conectivo y del cuello tirando lateralmente de la línea media con pinzas finas. Esto expondrá la membrana dural que se superpone a la cisterna magna, formada como un triángulo invertido.
- Utilice lanzas de absorción estériles o hisopos de algodón para controlar cualquier sangrado resultante.
- Coloque un pequeño separador quirúrgico para mantener los músculos del cuello retirados y permitir la visualización de la cisterna magna durante todo el procedimiento.
5. Inyección intraciternal
- Para acceder a la cisterna magna, identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja que previamente estaba doblada inmediatamente debajo.
NOTA: Habrá una caída repentina de la resistencia a medida que se perfora la membrana dura. Sin embargo, la punta de la aguja sólo penetrará ligeramente debajo de la superficie meningeal, gracias a su forma enganchada. - Una vez perforada la dura, permita que la punta doblada de la aguja penetre debajo de la superficie dura tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, con el fin de "enganchar" la aguja al cráneo (ver Figura 1B). Esto asegurará una mejor estabilidad y evitará que la aguja penetre más profundamente, evitando así el riesgo de dañar el cerebelo o la médula subyacentes.
- Inyectar el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo.
NOTA: Dependiendo del propósito del experimento, la velocidad de perfusión puede variar. Si se requiere una velocidad de perfusión lenta y constante (por ejemplo, cuando se utiliza el procedimiento para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo), puede ser aconsejable utilizar un sistema de microinfusión automatizado en combinación con la jeringa. - Después de la inyección, deje reposar la aguja en el lugar durante 1 min y retírela cuidadosamente. Utilice fórceps de punta fina para ayudar a la retracción de la aguja de su posición enganchada.
NOTA: El uso de una aguja delgada (p. ej., 30 G) no conduce a daños sustanciales de la membrana meningeal, y la consiguiente salida del líquido cefalorraquídeo. Si se requieren tamaños de aguja más grandes, se recomienda detener la fuga de líquido aplicando presión en el lugar de inyección utilizando una punta de algodón estéril.
6. Concluir el Procedimiento y la Atención Postoperatoria
- Retire el separador y permita que los músculos vuelvan a su posición original superponiendo la membrana dura.
- Cierre la incisión cutánea con unas gotas de adhesivo de cianoacrilato.
NOTA: Alternativamente, utilice suturas absorbibles (por ejemplo, suturas de 5-0 vicryl) y cierre la incisión cutánea con puntos interrumpidos. - Aplicar anestesia local (p. ej., 100 ml de 5% de lidocaína) en el lugar de la incisión.
- Retire el animal del soporte y colóquelo en una jaula limpia colocada en una almohadilla de calentamiento. Monitorea al animal hasta que recupere la conciencia.
NOTA: No se espera que el procedimiento cause dolor o angustia de larga duración en el animal. No obstante, el ratón debe ser monitorizado de cerca durante los primeros días postoperatorios y se pueden tomar medidas de alivio del dolor cuando se considere necesario, y de acuerdo con las recomendaciones proporcionadas por la unidad veterinaria de su institución.
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Representative Results
La inyección intracisternal de endoxifeno en ratones transgénicos que expresaN CreER bajo el promotor Cx3013 y un reportero fluorescente inducible permite una recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar la superficie vecina de expresión Cx30 y los astrocitos parénquimas en la corteza(Figura 1). Con el fin de acceder a la cisterna magna, el animal anestesiado se coloca con su cuerpo y su cabeza en un ángulo de aproximadamente 120o, permitiendo así que la parte posterior de su cuello se estire(Figura 1A). La porción atlanto-occipital de la membrana dural se expone a través de la disección contundente de los músculos del cuello, obteniendo así acceso a la cisterna magna subyacente. Se realiza una inyección manual segura con una aguja doblada a aproximadamente 30o a 3 mm de la punta. Esto permite que la jeringa se mantenga contra el hueso occipital del cráneo, mejorando así la estabilidad durante la administración(Figura 1B). Aprovechando el movimiento fisiológico del líquido cefalorraquídeo, la solución de endoxifeno se distribuye por todo el espacio subaracnoideo para recombinar eficientemente las células leptomeningeales superponiendo bulbos olfativos, corteza y cerebelo(Figura 1C). Como se muestra en la Figura 1, la solución no cruza la barrera cerebro-meningeal y no entra en contacto con células astrogliales del parénquima, a diferencia de la administración sistémica a través de gavage oral (2 mg/ml por día, en cinco días consecutivos; Figura 1C-E).
Figura 1: Etiquetado específico de células leptomeningeales mediante inyección intracisternal de endoxifeno. Los grupos A y B ilustran el procedimiento desarrollado para la administración intracisternal. Con el fin de acceder a la cisterna magna, la parte posterior del cuello debe ser estirada. El animal anestesiado se coloca, por lo tanto, en un ángulo aproximado de 120o entre el cuerpo y la cabeza, que se inclina hacia abajo (A). La aguja enganchada permite fijar la jeringa al cráneo y proceder con seguridad con una administración manual de la solución (B). El panel C muestra una sección sagital del cerebro después de la administración intracisternal de endoxifeno en un modelo de ratón transgénico que lleva CreER bajo el promotor Cx30 y la expresión inducible del reportero fluorescente tdTomato. El asterisco (*) marca el lugar de inyección y demuestra la ausencia de daños en la operación después del procedimiento. Endoxifen induce selectivamente la recombinación genética y la expresión génica del reportero en células en la capa meningeal que superponen la bombilla olfativa (Ob), la corteza (Ctx) y el cerebelo (Cb). Sólo unos pocos astrocitos en el cerebro medio (cabeza de flecha) se recombinan después de la entrega intracisternal de endoxifeno. Los paneles D-F son aumentos de la zona en caja en C en animales tratados con solución vehicular (D), sometidos a inyección intracisternal de endoxifeno (E), o tratados sistémicamente a través de gavage oral (F). Mientras que la administración intracisternal etiqueta específicamente las células de los leptomeninges, la entrega sistémica también conduce a la recombinación de astrocitos expresos de Cx30 en todas las capas corticales (L1 a L6). El panel G ilustra la recombinación de células leptomeningeales (asterisco), identificadas a través de la reactividad de Pdgfra, después de la inyección intracisternal. Por el contrario, los astrocitos de superficie (cabeza de flecha) y parénquima (flecha) que expresan Gfap permanecen sin etiquetar. Barras de escala a 1.000 m(C), 150 m(D-F) y 40 m (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento sencillo y reproducible para etiquetar células leptomeningeal es para la cartografía del destino. Utilizamos la inyección intracisternal de endoxifeno, un metabolito activo de tamoxifeno, para inducir la expresión del reportero fluorescente tdTomato en Cx30-CreER; R26R-tdTomato ratones12,13.
En comparación con otros protocolos utilizados para acceder al líquido cefalorraquídeo a través de la cisterna magna9,nuestro enfoque garantiza una administración manual segura gracias al uso de una aguja doblada que se puede estabilizar en el hueso occipital del cráneo. Una vez perforada la membrana dura de la cisterna magna, hay una caída repentina de la resistencia. En este punto, otros protocolos recomiendan bajar la aguja a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura y mantenerla manualmente en una posición estable durante todo el procedimiento9. A diferencia de una aguja recta, la aguja enganchada se fija al cráneo y no puede penetrar más profundamente en el tejido, eliminando así el riesgo de dañar el cerebelo o la médula subyacente. Nuestro sistema de enganche permite una administración más segura de la solución, especialmente cuando se utiliza una velocidad de perfusión lenta.
No se espera que el procedimiento descrito aquí cause molestias duraderas al animal operado. Sin embargo, se debe tener cuidado al administrar grandes volúmenes de solución. Una tasa de administración rápida puede conducir a alteraciones en la presión intracraneal y el desarrollo de síntomas neurológicos en el ratón. Sugerimos inyectar volúmenes de hasta 5-10 l para evitar este riesgo o montar la jeringa en un micromanipulador que tenga control sobre la tasa de entrega. Esto es particularmente importante al adaptar este procedimiento al estudio del movimiento del líquido cefalorraquídeo. Se recomienda evitar la inyección manual y utilizar una velocidad de perfusión lenta (p. ej., 1 L/min) para evitar una perturbación excesiva del flujo fisiológico. Además, el protocolo actual está diseñado para realizar una única inyección intraciternal, que etiqueta eficientemente las células leptomeningeales. Recomendamos considerar las especificaciones éticas, así como la capacidad del animal para soportar múltiples procedimientos quirúrgicos, en caso de que el estudio requiera la administración repetida de compuestos.
Además de la administración de endoxifenos, la técnica descrita aquí se puede combinar con la entrega de virus portadores de genes de reportero bajo un promotor específico de células leptomeningeales. Además, el actual sistema de administración se puede utilizar para el rastreo agudo del flujo de líquido cefalorraquídeo10. Para este propósito, los trazadores fluorescentes como Cell Tracker (ca. 700 Da) o Dextran Fluorescin (ca. 3000 Da) pueden ser entregados a través de la cisterna magna, y la jeringa puede montarse en un micromanipulador para permitir el control sobre la tasa de perfusión del compuesto. Esto puede ser importante para evitar la alteración excesiva del movimiento natural del líquido cefalorraquídeo en los experimentos de rastreo.
Las células leptomeningeales expresan claudina-11 y otras proteínas asociadas con uniones estrechas, que contribuyen al establecimiento de una barrera de líquido cefalorraquídeo en el espacio subaracnoideo y al control homeostático de la circulación de líquidos y nutrientes3. El enfoque descrito aquí puede combinarse con la ablación condicional de genes implicados en el control de la unión de la barrera para sondear su función putativa en el mantenimiento de la composición estrictamente regulada del líquido cefalorraquídeo. Además, las células de los leptomeninges juegan un papel en el desarrollo, donde proporcionan señales extrínsicas que contribuyen a la generación de neuronas corticales5 y la formación de conexiones callosales4. Nuestro método también se puede adaptar para obtener más información sobre el papel de los leptomeninges en el correcto desarrollo cortical y la búsqueda de caminos axonales. Por último, se ha demostrado que bacterias como Neisseria meningitidis se unen a las células leptomeningeales humanas14,y se han desarrollado modelos animales para la enfermedad para estudiar la invasión bacteriana y el daño neurológico resultante15,,16,aunque los ligandos superficiales responsables de la infección aún no están completamente determinados. La recombinación selectiva de células leptomeningeales logradas con nuestra técnica podría ayudar a identificar los sitios de adhesión utilizados por las bacterias para infectar el espacio subaracnoideo. Cabe destacar que el protocolo presentado en el presente documento puede requerir modificaciones para tener en cuenta los requisitos éticos y de seguridad adicionales necesarios para llevar a cabo procedimientos que impliquen infecciones bacterianas.
En conclusión, la inyección intracisternal aquí descrita representa un enfoque quirúrgico simple y bien tolerado que ofrece la oportunidad de investigar una amplia gama de funciones de líquido leptomeningeal y cefalorraquídeo, cuando se combina con enfoques de edición de genes o infusión de moléculas etiquetadas.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad Sueca contra el Cáncer, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse y el Programa de Investigación Estratégica en Células Madre y Medicina Regenerativa en Karolinska Institutet (StratRegen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30 G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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