Summary
نحن نصف بروتوكولات مفصلة لاستخدام FLLIT ، طريقة تعلم آلي بالكامل للحصول على حركة مخلب الساق في نقل Free Drosophila melanogaster والحشرات الأخرى. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات لقياس كمية حركات مشية المشي خفية في الذباب نوع البرية، والذباب متحولة ونماذج ذبابة من التنكس العصبي.
Abstract
كان نموذج Drosophila لا يقدر بثمن لدراسة الوظيفة العصبية وفهم الآليات الجزيئية والخلوية التي تكمن وراء التنكس العصبي. في حين أن تقنيات الطيران للتلاعب ودراسة المجموعات الفرعية العصبية قد نمت بشكل متزايد متطورة ، فإن ثراء الأنماط السلوكية الناتجة لم يتم التقاطها بتفصيل مماثل. أن تكون قادرة على دراسة حركات الساق يطير خفية للمقارنة بين المسوخ يتطلب القدرة على قياس تلقائيا وقياس حركات الساق عالية السرعة وسريعة. وبالتالي ، قمنا بتطوير خوارزمية التعلم الآلي لتتبع مخلب الساق الآلي في الذباب المشي بحرية ، ميزة التعلم القائم على أطرافه التقسيم وتتبع (FLLIT). على عكس معظم أساليب التعلم العميقة ، FLLIT مؤتمتة بالكامل وتولد مجموعات التدريب الخاصة بها دون الحاجة إلى شرح المستخدم ، وذلك باستخدام معلمات مورفولوجية مدمجة في خوارزمية التعلم. تصف هذه المقالة بروتوكول متعمق لتنفيذ تحليل المشي باستخدام FLLIT. تفاصيل الإجراءات اللازمة لإعداد الكاميرا ، وبناء الساحة ، وتسجيل الفيديو ، وتجزئة الساق وتتبع مخلب الساق. كما أنه يعطي لمحة عامة عن البيانات التي تنتجها FLLIT ، والتي تشمل الخام تتبع الجسم والساق المواقف في كل إطار الفيديو ، 20 معلمات مشية ، 5 قطع أرض وفيديو متتبعة. لإثبات استخدام FLLIT، ونحن تحديد المعلمات مشية المريضة ذات الصلة في نموذج ذبابة من ترنح سبينوسيلارلا3.
Introduction
في العقود القليلة الماضية، ازدادت الأمراض العصبية واضطرابات الحركة انتشاراً أكبر في سكاننا المسنين. على الرغم من أن فهمنا للعديد من الأمراض العصبية التنكسية قد تقدم على المستوى الجزيئي والخلوي ، فإن السمات الأساسية للدوائر العصبية المصابة الكامنة وراء المرض لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. وضعت مؤخرا أدوات تتبع السلوك1،2،3،4 تسمح لنا الآن لدراسة تشوهات الحركة في نماذج الأمراض الحيوانية من أجل تحديد الجزيئية والخلوية والدوائر خلل التنظيم الكامنة وراء المرض.
يتم الحفاظ على المسارات الجزيئية المشاركة في العديد من الأمراض العصبية في ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster، وساعدت نماذج مرض Drosophila لتوضيح الآليات الأساسية الكامنة وراء التنكس العصبي5،6. أظهرنا مؤخرا أن نماذج ذبابة من مرض باركنسون (PD) وSpinocerebellar ترنح 3 (SCA3) معرض متميزة, الحفاظ على التوقيعات مشية التي تشبه تلك الأمراض البشرية المعنية1,مما يدل على أن نموذج يطير يمكن استخدامها لفهم آليات الدائرة الكامنة وراء خلل الحركة في اضطرابات حركة محددة. ترسانة غنية ومتزايدة باستمرار من الأدوات في نموذج ذبابة للتلاعب المستهدف وتصور الخلايا العصبية في جين واحد ومستوى الخلية الواحدة7,8,9,10 يجعل ذبابة نموذج مثالي واحد للتحقيق في العلاقة بين مسارات المرض, الدوائر العصبية ومظاهر النهويف السلوكية في الجسم الحي. لتمكين دقيقة، تحليل مشية الحشرات الآلي، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة التعلم الآلي، Feature L كسبالقائم على LI ميغابايت التجزئة وTالاجهاد (FLLIT)1.
FLLIT يتكون من خوارزمية متعددة المراحل مؤتمتة بالكامل أن شرائح الأولى بكسل الساق، والتي تستخدم في وقت لاحق لتحديد موقع وتتبع مخالب الساق المقابلة. FLLIT توظف خوارزمية تعزيز للتجزئة، على النقيض من خوارزميات التعلم العميق المستخدمة في العمل الأخير2،3. هناك بعض أوجه التشابه مع الشبكات العصبية الملتوية في أنه لكلا الإطارين ، يتم استخراج الميزة تلقائيًا من خلال تعلم حبات الالتواء. الخطوة الأولى في FLLIT ينطوي على استخدام العمليات المورفولوجية (الحافة والهيكل العظمي) لتوليد تلقائيا إيجابية (بكسل على الساقين) وسلبية (خلفية أو بكسل على الجسم يطير) عينات التدريب مع ثقة عالية. وبالتالي، FLLIT مؤتمتة بالكامل ولا تتطلب عينات التدريب المشروح المستخدم. باستخدام عينات التدريب المذكورة أعلاه ، يتم تدريب المصنف في إطار خوارزمية تعزيز. يتم تعلم مجموعة من المصنفين الضعفاء بشكل متكرر ، حيث يتكون كل منها من مجموعة من حبات الالتواء لاستخراج الميزات وشجرة القرار. ثم يتم استخدام المصنف المستفاد النهائي لتقسيم الساق وقادر على تمييز أفضل للمناطق الصعبة / العينات الصلبة أفضل من العمليات المورفولوجية ، مما ينتج تجزئة أكثر دقة بشكل عام لتتبع1. من الساقين مجزأة، ونحن تحديد موقع النصائح وتتبع لهم باستخدام الخوارزمية المجرية: عن طريق مطابقة النصائح عبر الإطارات مثل أن يتم تقليل مجموع المسافة التي تحركها كل طرف. FLLIT يمكن التعامل مع حالات الانسداد عن طريق تذكر آخر موقع ينظر (في الإحداثيات محورها ذبابة) بحيث يتم استرداد طرف الساق مرة واحدة لم يعد تحت الانسداد.
أظهرنا سابقا أن FLLIT يمكن تلقائيا وبدقة تتبع حركات الساق وتحليل مشية في ذبابة أو العنكبوت تتحرك بحرية من سرعة عاليةالفيديو 1. FLLIT وبالتالي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع الساق المفصليبود. من خلال استخراج مجموعات التدريب على التعلم الآلي باستخدام معلمات مورفولوجية ، تقوم FLLIT تلقائيًا بتدريب نفسها على تقسيم وتتبع أرجل الحشرات دون الحاجة إلى شرح يدوي شاق ، وهو مطلوب لأساليب التعلم الأكثر عمقًا. FLLIT وبالتالي مؤتمتة بالكامل. بعد تجزئة الساق وتتبع، FLLIT تنتج تلقائيا الخام الجسم وتتبع مواقف الساق في كل إطار الفيديو، 20 معلمات مشية، 5 قطع أرض وفيديو متتبعلتحليل مشية وتصور حركات مشية. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لاستخدام FLLIT.
Protocol
1. إعداد النظام
- تأكد من أن محطة التسجيل لديها كاميرا عالية السرعة ومرحلة أكثر من ذلك لعقد غرفة الساحة(الشكل 1). ضبط الكاميرا لتسجيل ما لا يقل عن 250 لقطة في الثانية (إطارا في الثانية) ، مع سرعة مصراع بسرعة وفقا لذلك (في هذه الحالة ، يتم تنفيذ التسجيل في 1000 إطارا في الثانية مع سرعة مصراع 1 مللي ثانية).
ملاحظة: تأكد من أن الفيديو مناسب للتتبع عن طريق التأكد من وجود الحد الأدنى أو عدم وجود ضبابية حركة للأرجل المتحركة في جميع الإطارات. إذا كانت الساق المتحركة غير واضحة لدرجة أن المشروح البشري لا يمكنه تتبعها ، فيجب زيادة سرعة تسجيل الكاميرا و / أو سرعة الغالق. - ضع أضواء LED بالأشعة تحت الحمراء في أعلى المسرح مع ناشر (ورقة شفافة) بين الكاميرا والعينة(الشكل 1A, B).
- جعل غرفة التسجيل عن طريق قطع ورقة الاكريليك سميكة 1.6 مم. في هذه التجربة، استخدم حقل عرض 11 مم × 11 مم. ضع الغرفة بين مزلقين زجاجيين(الشكل 1C).
2. إعداد الذباب للتسجيل
- نقل الذباب ليتم تسجيله في قارورة طعام جديدة على مدار 24 ساعة قبل التسجيل.
ملاحظة: لا تستخدم CO2 (عادة ما تستخدم لإضفاء الطابع على الذباب عند المجموعة الأولى) على الذباب أقل من 24 ساعة قبل التسجيل. - حوالي 40 دقيقة قبل التسجيل، ونقل الذباب إلى قوارير فارغة والحفاظ على الجليد لمدة 5-7 دقيقة.
- في غضون ذلك، مسح الساحة وشرائح الزجاج واضحة بالماء ومسح.
ملاحظة: لا تستخدم الإيثانول لتنظيف الغرف والشرائح. - إعداد غرفة التسجيل. إصلاح واحدة من الشرائح الزجاجية المجهرية تحت الغرفة مع الشريط.
- عندما تم وضع الذباب في حالة من السّع، قم بنقل ذبابة واحدة في كل غرفة باستخدام فرشاة نظيفة.
ملاحظة: يمكن استخدام الذباب من الذكور والإناث في هذا الإعداد، وإلى أقصى حد ممكن، يجب تحليل الذباب من كلا الجنسين لتجنب التحيز الخاص بالجنس. - تأمين الغرفة مع شريحة زجاجية مجهرية أخرى مع الشريط(الشكل 1C).
- الحفاظ على الذباب غرفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 - 20 دقيقة للتأقلم.
3. إنشاء أشرطة الفيديو لتحليل FLLIT
ملاحظة: هذه الخطوة خاصة بكاميرا الفيديو المستخدمة. في هذه الحالة، يتم استخدام كاميرا فيديو متاحة تجاريًا (انظر جدول المواد).
- قم بتشغيل مصدر الطاقة. انتظر الصمام الأخضر للحصول على الطاقة والصمام البرتقالي لاتصال واجهة إيثرنت لتحقيق الاستقرار. قم بتشغيل الطاقة لـ LED بالأشعة تحت الحمراء. تأكد من أن الجهد لا يزال في 12.5 V.
- افتح تطبيق عارض على نظام الكمبيوتر المتصل.
- تغيير معدل إطار التسجيل إلى 1000 إطار في الثانية. تعيين سرعة مصراع الكاميرا إلى 1/1000 ثانية (1 مللي ثانية).
- ضع الغرفة مع الذبابة على ساحة التسجيل وحدد زر LIVE. تأكد من أن الكاميرا تركز على نصائح الساق عندما يطير هو المشي تستقيم على أرضية الغرفة؛ وينبغي أن تكون نصائح الساق في التركيز الحاد.
- انقر فوق سجل (الشكل 2).
- تسجيل المشي يطير، وضمان أن:
مشى ذبابة في مسار مستقيم نسبيا دون لمس حافة الساحة.
مشى ذبابة ما لا يقل عن ثلاث خطوات لكل ساق.
الذبابة لا تتوقف أثناء المشي.
المسافة التي تسير ما يعادل طول جسم واحد على الأقل.
ملاحظة: وجود الخلفية طرح بشكل نظيف أمر بالغ الأهمية للتجزئة دقيقة. تتطلب خوارزمية الطرح التلقائية للخلفية المستخدمة من قبل FLLIT أن تتحرك ذبابة الصورة بطول جسم واحد على الأقل في المسافة. - انقر فوق Rec Done لإيقاف التسجيل(الشكل 2).
- اقتصاص الفيديو للتأكد من أن التسجيل يشمل فقط المشي مباشرة من الذبابة (كما هو موضح في الخطوة 3.6).
- انقر فوق حفظ (الشكل 2). حفظ الملفات بتنسيق '.mraw' أو '.tiff' في المجلدات المعنية.
ملاحظة: يمنح تنسيق '.mraw' مرونة أكبر لتغيير اسم الملف (إذا لزم الأمر) ولتخزين مقاطع الفيديو مقارنة بتنسيق ملف '.tiff'.
4. تركيب برنامج FLLIT
ملاحظة: يمكن العثور على أحدث الإرشادات على: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
- تحميل FLLIT على أي نظام التشغيل
- تحميل FLLIT من رابط Github التالية: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. استخراج محتويات الملف البريدي.
- قم بتنزيل مجموعات بيانات عينة من رابط Google Drive التالي: https://bit.ly/2EibvNY. إنشاء مجلد البيانات ضمن FLLIT-master/Compiled ووضع مجلدات مجموعة البيانات في دليل البيانات هذا.
- تثبيت FLLIT في أوبونتو
- انتقل إلى الدليل FLLIT/المترجمة.
- انقر بزر الماوس الأيمن وحدد فتح في Terminal.
- إصدار الأمر التالي لتحميل وتثبيت مكتبات وقت التشغيل MATLAB إلى $HOME/MCR:
باش MCR_2016a.sh - بعد اكتمال تثبيت مكتبات وقت التشغيل MATLAB، قم بإصدار الأمر التالي للتأكد من منح الحقوق القابلة للتنفيذ لـ FLLIT:
chmod +x FLLIT - فتح محطة طرفية في الدليل FLLIT/المترجمة وإصدار الأمر التالي لتنفيذ FLLIT:
باش run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
- تثبيت FLLIT في ويندوز
- ل7 و 10 الطبعة الرئيسية ، وتثبيت صندوق أدوات Docker في :
(https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe). - بالنسبة لـ Windows 10 Pro أو Enterprise Edition، قم بتثبيت سطح مكتب Docker لنظام التشغيل Windows على: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\%20Desktop\%20Installer.exe).
- لتمكين تنفيذ تطبيقات واجهة المستخدم الرسومية في حاوية Docker على Windows، قم أولاً بتثبيت VcXSrV (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv). على بدء VcXsrv، تكوين الإعدادات كما هو الحال في الشكل S1.
ملاحظة: تأكد من تشغيل Docker و VcXsrv قبل بدء تشغيل FLLIT. - انقر نقرا مزدوجا FLLIT.bat لتشغيل FLLIT.
ملاحظة: عند التنفيذ لأول مرة، سوف يستغرق بعض الوقت لسحب صورة Docker من Docker Hub.
- ل7 و 10 الطبعة الرئيسية ، وتثبيت صندوق أدوات Docker في :
- تثبيت FLLIT في ماك
- تحميل سطح مكتب دوكر لنظام التشغيل MacOS في https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg
- تثبيت socat عن طريق فتح محطة وإصدار الأمر التالي:
الشراب تثبيت socat - ابدأ بـ socat مع:
socat TCP-LISTEN:6000، reuseaddr، شوكة يونيكس-CLIENT:\"$DISPLAY\" وتبرأ - تثبيت XQuartz (https://www.xquartz.org) لتمكين تنفيذ تطبيقات واجهة المستخدم الرسومية في حاوية دوكر على MacOS. بدء XQuartz وتغيير التفضيلات عن طريق التحقق من السماح الاتصالات من عملاء الشبكة في علامة التبويب الأمان كما هو موضح في الشكل S2.
ملاحظة: تأكد من أن Docker و socat و XQuartz كلها قيد التشغيل قبل بدء FLLIT. - فتح محطة طرفية في الدليل FLLIT/المترجمة وتنفيذ FLLIT مع الأمر التالي:
باش FLLIT_Mac.sh
ملاحظة: عند التنفيذ لأول مرة، سوف يستغرق بعض الوقت لسحب صورة Docker من Docker Hub.
5. تشغيل FLLIT لتتبع الساق الآلي
- تجزئه
- تحويل الفيديو إلى ملفات TIFF الفردية ونسخ إلى مجلد بيانات FLLIT.
- تشغيل FLLIT (في أوبونتو، انقر فوق الحق لفتح FLLIT في المحطة الطرفية).
- حدد المجلد الذي يحتوي على صور TIFF لإطار بإطار للفيديو ليتم تعقبها وانقر فوق الزر إضافة.
- في الإطار المنبثق اختر 0 لتنفيذ تجزئة الساق فقط، أو 1 لتضمين تتبع الساق مع تجزئة الساق.
- انقر فوق القيام به لبدء تجزئة وتتبع الفيديو المحدد.
- تتبع
- للتحقق من دقة التتبع وتنفيذ تصحيحات الأخطاء (إن وجدت)، انقر على تحديد مجلد البيانات. حدد المجلد الذي سيتم تعقبه وانقر فوق فتح.
- انقر على عرض التتبع.
ملاحظة: تحقق من أن وضع العارض يبقى محددًا أثناء عرض مواضع الساق المتتبعة. وإلا، فإن أي تصحيحات سابقة تم إجراؤها ستكون مفرطة في التخلص. - التحقق من وضع العلامات لجميع الساقين في الإطار الأول
ملاحظة: نظرًا لأن ملصقات الساق توضع وفقًا للموقف على الشاشة ، إذا كانت الذبابة تسير منتصبًا ، فإن الجانب الأيمن للذبابة يوصف بـ L1 (الساق الأمامية) ، L2 (منتصف الساق) ، L3 (الساق الخلفية) والجانب الأيسر للذبابة يسمى R1 (الساق الأمامية) ، R2 (منتصف الساق) ، R3 (الساق الخلفية) ، على التوالي (الشكل 3). إذا كان الذبابة تسير رأسا على عقب، أسفل تسميات الساق سيتم المشروح بشكل صحيح. - إذا تم تسمية الساق بشكل خاطئ وكان التصحيح مطلوبًا، فانقر فوق عرض الإيقاف المؤقت، متبوعاً بضبط التنبؤ (الشكل 3).
- من اللوحة اليمنى برئاسة الساق لضبط، حدد الساق التي تتطلب التصحيح.
- انقر نقرا مزدوجا على الموضع الصحيح لهذه الساق في نافذة الصورة، انقر على حفظ،ومن ثم الخروج. للانتقال إلى الإطار السابق أو الإطار اللاحق، انقر فوق عرض الإيقاف المؤقت متبوعاً بالأزرار الأمامية والخلفية I> على التوالي(الشكل 3).
- لتصحيح أي مقاطع فيديو تم تعقبها بشكل غير صحيح، افتح مجلد البيانات للفيديو ليتم إعادة تعقبه وحدد بدء التتبع يدويًا.
- انقر فوق زر التتبع، والذي سيغير التسمية إلى الأولي.
- انقر فوق ضبط التنبؤ وتصحيح تسميات الساق عن طريق النقر المزدوج على كل طرف في الساق ثم تعيينه باستخدام تسمية الساق الصحيحة. انقر فوق حفظ وإنهاء.
- انقر على السيرة الذاتية لبدء التتبع.
- معالجة البيانات وتوليد الفيديو
- انقر على عملية البيانات. في النافذة المنبثقة، اكتب عدد الإطارات في الثانية (fps) التي تم تسجيل مقاطع الفيديو فيها (على سبيل المثال، 1000 إطار ًا في الثانية).
- استخدم المعادلة التالية لحساب الحقل الفعلي لمشاهدة الفيديو الملتقط بحيث يمكن قياس معلمات المشي بالملليمترات:
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان حجم الغرفة الفعلي 7 مم، فإن عرض إطار الصورة هو 137 مم، وعرض الغرفة في إطار الصورة على شاشة الكمبيوتر هو 81 مم، وكان عرض مجال الرؤية 11.83 ملم(الشكل S3). - لمشاهدة نتائج التتبع، انتقل إلى مجلد التتبع ضمن مجلد النتائج.
- لإنشاء فيديو للذبابة المتتبعة، حدد إنشاء فيديو. سيتم حفظ الفيديو في مجلد النتائج نفسه كبيانات الفيديو الأصلية التي تم تحليلها.
ملاحظة: يمكن تحديد إطارات البدء (الأول) ونهاية (الأخير) من الفيديو.
- التطبيع إلى طول الجسم من كل ذبابة.
ملاحظة: بما أن كل ذبابة قد تكون مختلفة قليلاً في الحجم، يجب تطبيع بعض معلمات المشيإلى طول الجسم لكل ذبابة لتسهيل المقارنات (على سبيل المثال، قد يكون طول الخطوة أطول في الذباب الأكبر، وأقصر في الذباب الأصغر).- افتح ثلاث صور ثابتة من فيديو كل ذبابة (عادة ً ما تكون الإطارات الأولى والوسطى والأخيرة) باستخدام برامج الصور.
- قم بتكبير كل إطار صورة إلى 800% وقم بتسمية البكسل الأمامي للرأس وأقصى بكسل للبطن عند خط الوسط باستخدام لون مشرق (على سبيل المثال، أصفر).
- افتح الصور المسماة في ImageJ.
- استخدم مقياس المجموعة لإدخال المقياس وفقًا لذلك: تعيين المسافة بالبكسل: 512; المسافة المعروفة: حقل الرؤية الفعلي (مم) مقيساً في الخطوة 5-3-2.؛ وحدة الطول: مم.
- رسم خط مستقيم بين الرأس وصفت والبطن تلميح بكسل للحصول على طول الجسم.
- فتح مقياس مجموعة مرة أخرى للحصول على القيمة في مسافة معروفة، وهو طول الجسم في مم.
- تأخذ متوسط الطول المحدد في كل من الصور الثلاث للحصول على متوسط حجم الجسم في مم.
Representative Results
بعد تجزئة الساق ، وتتبع ومعالجة البيانات ، FLLIT تلقائيا بتوليد البيانات الخام لمواضع الجسم وكل مخلب الساق ، 20 معلمات مشية ، 5 قطع وفيديو متتبع(الجدول 1).
هنا، نبين هذه التحليلات باستخدام نموذج ذبابة من ترنح سبينوسريفلار 3 (SCA3). تم استخدام سائق عموم الخلايا العصبية ايلف-GAL4 لقيادة إما كامل طول البرية الإنسان SCA3 مع 27 الجلوتامينات في المسالك polyQ (UAS-SCA3-flQ27), أو كامل طول الإنسان متحولة SCA3 مع 84 الجلوتامين في المسالك polyQ (UAS-SCA3-flQ84)11. يتم تصنيف SCA3 من قبل مشية ataxic مع الجسم ينفير، وضع القدم غير منتظم وقصيرة، والخطوات تترنح12،13 (الجدول 2). لتوصيف مشية من الذباب SCA3 متحولة والتحقيق في ما إذا كانت عرض مشية مماثلة لتلك التي من المرضى الإنسان، قمنا بتحليل معلمات مشية ذات الصلة التي تم إنشاؤها بواسطة FLLIT، وهي: عدد من يتحول الجسم، وانتظام البصمة، وتداخل المجال الساق والأحجام، وأطوال خطوة الساق(الجدول 2).
وجدنا أن الذباب SCA3-Q84 أظهرت المزيد من المنعطفات(الشكل 4A، A')،وضع القدم غير منتظم كما هو معروض من قبل انخفاض البصمة الانتظام (الانحرافات المعيارية الموسعة من AEP14)(الشكل 4B)،وزيادة تداخل نطاق الساق(الشكل 4C-D)،توسيع نطاقات الساق في الطول والمنطقة(الشكل 4E، F)،وانخفاض طول خطوة(الشكل 4G).
FLLIT يولد أيضا شريط فيديو يظهر ذبابة متتبعة والساقين في الساحة التي تركز على مناظر الجسم، مسار الجسم واتجاه الاتجاه، والتشريد الرأسي والجانبي لكل ساق(الشكل 5). تسمح مقاطع الفيديو المتتبعة بمقارنة حركات الساق جنبًا إلى جنب في الذباب اتّذي بحركات مختلفة. أشرطة الفيديو التمثيلية من Elav-GAL4> SCA3-flQ27 (فيديو 1) وElav-GAL4> SCA3-flQ84 (فيديو 2)الذباب تثبت أنه بالمقارنة مع Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ27 الذباب(الشكل 5A)، Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 الذباب(الشكل 5B)تقاطع المجالات الساق من أحجام مختلفة، مما يدل على الترنح، مشية ataxic.
الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة إعداد محطة التسجيل والساحة. تسجيلات من(A)الأمامية و(B)وجهات النظر الجانبية. (C)مثال على الساحة المستخدمة لصنع تسجيلات الطيران لتتبع FLLIT. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عرض النافذة النشطة أثناء تسجيل مشية الذباب باستخدام كاميرا رأس مزدوجة ، مما يسمح بالتسجيل المتزامن لذبابين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نافذة FLLIT نشطة تظهر لوحة الزر والساقين الموسومة بعد التقسيم والتتبع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بيانات تمثيلية تم إنشاؤها بواسطة FLLIT لمعلمات مشية ذات صلة من الذباب المعبر عن النمط البري (SCA3-flQ27) مقابل متحولة (SCA3-flQ84) SCA3. (A)عدد المنعطفات في مسار الجسم. (ب)متوسطة الساق بصمة الانتظام تطبيع إلى طول الجسم. (C-C') اجتاز نطاقات الساق من كل ساق. (D)تداخل المجال بين الساقين. (E)متوسط الساق طول المجال تطبيع إلى طول الجسم. (F)منطقة المجال منتصف الساق تطبيع إلى طول الجسم2. (ز)منتصف الساق خطوة طول تطبيع لطول الجسم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: لقطة من مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها بواسطة FLLIT. (أ) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 و (B) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 الذباب. Please click here to view a larger version of this figure.
فيديو 1: فيديو تمثيلي لذبابة تعبر عن نوع الخلايا العصبية البرية من نوع الإنسان كامل الطول SCA3(Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27). يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو 2: فيديو تمثيلي لذبابة تعبر عن متحولة عموم الخلايا العصبية الإنسان كامل الطول SCA3(Elav-GAL4> UAS-SCA3-flQ84). يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الشكل التكميلي 1: تكوينات VcXSrv. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: تكوين Xquartz. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: صورة موسومة بالأبعاد اللازمة لحساب مجال الرؤية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الفئه | معلمات | وصف | ملف / مؤامرة (إن وجدت) |
| البيانات الخام | وضع الجسم | إحداثيات موضعية للجسم المركزي في كل إطار | أول عمودين من CoM.csv |
| مسار الجسم | زاوية دوران محور الجسم بالدرجات (نسبة إلى المحور ص) | العمود الثالث من CoM.csv | |
| مخلب الساق التي تركز على الساحة المواقف |
إحداثيات موضعية لكل مخلب الساق في كل إطار على أساس إحداثيات الساحة | مسار.csv | |
| مخلب الساق التي تركز على الجسم المواقف |
إحداثيات موضعية لكل مخلب الساق في كل إطار على أساس إحداثيات الساحة |
norm_trajectory.csv | |
| حركة الجسم | طول الجسم (مم) | طول عينة الحيوان المقدرة في كل إطار (الأمامي الأكثر موقف على الرأس إلى الخلفي معظم موقف على الأجنحة) |
bodylength.csv |
| سرعة الجسم الفورية (مم/س) |
السرعة الفورية للجسم (centroid) في عينة الحيوان | BodySpeedy.csv; BodySpeedy.pdf | |
| نقاط تحول الجسم مسار |
لتحديد نقاط التحول ، يتم تقليل المسار إلى منحنى خطي بالقطعة باستخدام AsâASPeucker دوغل خوارزمية ، وبعد ذلك يتم تحديد الحدث تحول بأنها تنطوي على زاوية > 50 درجة بين اثنين من الجيران شرائح خطية تشكل المسار المبسط |
Bodyيافيدي.pdf | |
| معلمات الخطوة الفردية | مدة الخطوة (ms) | مدة حدث خطوة بخطوة | StrideParameters.csv |
| فترة خطوة (ms) | المدة من حدث خطوة واحدة إلى أخرى | ||
| إزاحة خطوة (مم) | إزاحة مخلب الساق خلال حدث خطوة | ||
| مسار خطوة مغطاة (مم) | المسار الكلي الذي يغطيه مخلب الساق خلال حدث خطوة | ||
| موقف المتطرفة anterior (ملم) |
موقف الهبوط (بالنسبة للجسم) من مخلب الساق في نهاية حدث خطوة | ||
| الموقف المتطرف الخلفي (مم) | موقف الإقلاع (بالنسبة للجسم) من مخلب الساق في بداية حدث خطوة | ||
| سعة خطوة (مم) | النزوح على طول اتجاه الحركة لحدث خطوة | ||
| خطي الموقف (مم) | تعريف هاوية مسار خطوة من منحنى ممهدة على (على فترات 20ms) في الأمام المقابلة والمواقف المتطرفة الخلفية من خطوة |
||
| خطوة تمتد (ملم) | مسافة من موقف مخلب الساق من مركز الجسم في منتصف حدث خطوة | ||
| حركة الساق | سرعة الساق (مم/س) | السرعة الفورية لكل ساق | LegSpeed.csv; Gait.pdf |
| مؤشر غايت | يقيس هذا نوع تنسيق المشية الذي يظهره الحيوان (ذو الأرجل الستة) أثناء حركته. مشية مؤشر 1 يتوافق مع مشية ترايبود ، _1 يتوافق مع مشية tetrapod في حين أن 0 يشكل مشية غير الكنسي. في تنفيذنا، يتم الحصول على مؤشر مشية من خلال متوسط متحرك على مدى نافذة 120 مللي ثانية |
GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf | |
| النسبة المئوية للحركة | النسبة المئوية للوقت الذي تكون فيه الساق في الحركة | LegParameters.csv | |
| متوسط فترة الخطوة (ms) | متوسط المدة من حدث خطوة إلى أخرى | LegParameters.csv | |
| انتظام البصمة (مم) | تقاس بالانحرافات المعيارية للخلفية و | LegParameters.csv | |
| المواقف المتطرفة للساق | |||
| منطقة نطاق مسار الساق (مم2) |
منطقة الهيكل المحدب الأدنى الذي يحتوي على مسار الساق بأكمله في الإطار المرجعي الذي يركز على الجسم | LegParameters.csv; LegDomain.pdf | |
| طول وعرض مجال مسار الساق (مم) |
تم الحصول عليها عبر المسافة القصوى المتوقعة من مواقف مخلب على الرئيسية (طول المجال) والثانوية (عرض المجال) المحاور الرئيسية |
LegParameters.csv | |
| تقاطع نطاق الساق/التداخل (مم2) |
التقاطع/التداخل بين كل ممكن | LegDomainOverlap.csv | |
| عرض الموقف (مم) | متوسط المسافة بين AEP وPEP من الساقين اليسرى والوسطى | StanceWidth.csv |
الجدول 1: معلمات Gait التي تم إنشاؤها بواسطة FLLIT.
| ميزة Gait | ||||
| ملامح Gait من ترنح سبينوسيسيلار 3 (SCA3) | تنحرف | وضع القدم غير منتظم وعبور الساق أكثر من | خطوات الترنح | خطوات قصيرة |
| معلمة القياس | عدد أحداث تحول الجسم | انتظام البصمة | حجم مجالات الساق، درجة تداخل المجال | طول خطوة |
| FLLIT الملف | Bodyيافيدي.pdf | LegParameters.csv | LegDomainOverlap.csv | StrideParameters.csv |
الجدول 2: الجدول الذي يعرض ميزات مشية SCA3 المميزة في المرضى البشريين مع معلمات FLLIT وملفات الإخراج المقابلة.
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف بالتفصيل الخطوات التي ينطوي عليها استخدام FLLIT ، وهو برنامج آلي للتعلم الآلي الآلي1، لتحليل المشي في Drosophilaالمشي بحرية. بعد التتبع وتحليل البيانات ، FLLIT تلقائيا بتوليد البيانات الخام للمعلومات الموضعية للجسم والساق مخالب ، وإنتاج عشرين الجسم وميزات المشي ، فضلا عن شريط فيديو من ذبابة متتبعة لتمكين تصور مشية.
هناك الآن عدد من الطرق لتتبع حركة الساق من Drosophila وغيرها من الحيوانات1،2،3،4،14،15،16، مما يعطي الباحثين مجموعة واسعة من الخيارات اعتمادا على أهداف التجربة. بعض هذه هي المناهج القائمة على الطباعة القدم، والتي هي دقيقة للغاية ولكن التي تقرير فقط مخلب نقاط الاتصال مع سطح الكشف4،14. من ناحية أخرى ، فإن أساليب التعلم العميق الأخيرة2،3،16 هي متعددة للغاية ، مما يسمح بتحليل السلوكيات التي تتطلب تتبع مفاصل الساق وأجزاء الجسم الأخرى في أي الحيوان ، مع التحذير من أن الخوارزميات تحتاج أولا إلى التدريب مع مجموعات البيانات المشروحة للمستخدم. يستخدم نوع ثالث من النهج مورفولوجيا أو أساليب قائمة على تباين الصور1،15،17 للعثور على الخطوط العريضة لكل ساق لتحديد مواقف المخالب. بشكل عام ، تتعامل هذه الطرق بشكل سيئ مع السلوكيات حيث تتقاطع الساقين (على سبيل المثال أثناء الاستمالة). FLLIT يجمع بين النهج الثاني والثالث ، وذلك باستخدام المعلمات المورفولوجية لتدريب خوارزمية تعزيز لتقسيم الساق. يسمح هذا FLLIT لتجاوز المهمة الشاقة للتعليق التوضيحي للمستخدم لإنشاء مجموعة بيانات التدريب ، مع تعزيز الدقة باستخدام التعلم الآلي. سيتعين على التحسينات المستقبلية على FLLIT التعامل مع الحالات التي تعبر فيها الساقين ، للسماح بتحليل السلوكيات الأكثر تعقيدًا.
FLLIT قوية لتغييرات طفيفة في الإضاءة، وتسجيل القرار وسرعة الإطار1. ومع ذلك ، يجب ألا تقل سرعة الإطار لمقاطع الفيديو المسجلة عن 250 إطارًا في الثانية ، ويتم تشغيل FLLIT بشكل مثالي لمقاطع الفيديو المسجلة بسرعة 1000 إطارًا في الثانية. إذا كان هناك ضبابية الحركة في الصور ، بحيث أنه من الصعب على المشروح البشري لتحديد موقف الساق ، فلن تتمكن FLLIT من تحديد نصائح الساق بدقة في تلك الإطارات. في ضوء ذلك ، من الضروري أن تركز الكاميرا بشكل حاد على نصائح الساق. لمنع القطع الأثرية التقسيم، يجب تنظيف الساحة جيدا، وينبغي عدم نقل أثناء التسجيل. للحصول على طرح دقيق للخلفية وتجزئة نظيفة ، يجب أن تتحرك الذبابة طول جسم واحد على الأقل أثناء التسجيل ، دون التوقف. بعد تجزئة التلقائي وتتبع وضع العلامات من جميع الساقين يجب التحقق. إذا لم يتم تعقب مشية الذبابة أو تعقبها بشكل خاطئ، يجب إعادة تتبع الملف يدويًا باستخدام خيار بدء التتبع يدويًا (الخطوة 5.2.7 - 5.2.10).
الأمراض العصبية واضطرابات الحركة تنتشر بشكل متزايد في مجتمعاتنا الشيخوخة. وقد درست نماذج ذبابة من التنكس العصبي لأكثر من 2 عقود، والتي تم خلالها التقدم فيما يتعلق بالجوانب الجزيئية والخلوية من الفيزيولوجيا المرضية. ومع ذلك ، كان من الصعب من الناحية الفنية تقييم العواقب السلوكية المحددة للمرض. على سبيل المثال ، في حين أن تقارير الحركات المرتجفة في الذبابة قد قدمت18،19، لم تتم دراسة هذه الكمية حتى وقت قريب1. كان قياس التسلق مقياسًا مفيدًا وكمية ، ولكنه خشن نسبيًا6. وبالمثل، أعاق هذا العجز التقني تحليل الحركة عالية الاستبانة في نماذج الحيوانات الأخرى. وبالتالي، فإن ظهور أدوات جديدة للتحليل السلوكي يبشر بتجديد شباب مجال اضطرابات الحركة لتمكين الباحثين من دراسة كيف تؤدي الآليات الجزيئية والخلوية للأمراض العصبية والعضلية إلى نتائج سلوكية محددة في النماذج الحيوانية. في هذه الورقة وفي عملنا السابق1، أظهرنا استخدام FLLIT التي تطير نماذج SCA3 معرض مشية ataxic hyperkinetic ، في حين أن نماذج ذبابة PD تعرض مشية جامدة hypokinetic ، خلاصة الحركة السمات المميزة للأمراض البشرية المعنية1. كما مكننا تحليل مشية لتحديد مجموعات الخلايا العصبية متميزة الكامنة وراء اختلالات حركة محددة. للمضي قدما، وتحليل الحركة مفصلة، جنبا إلى جنب مع التصوير قوية والأدوات الوظيفية المتاحة في الطاير، وسوف تسمح لنا للحصول على نظرة جديدة في آليات الخلل الحركي، وإلقاء الضوء على فهمنا للأمراض العصبية التنكسية فيما يتعلق بآليات الدائرة.
FLLIT ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة مشية في المفصليات الصغيرة الأخرى، كما ثبت سابقا أن تكون دقيقة للغاية لتتبع حركات ساق العنكبوت1. بينما نركز هنا على استخدام فيوجيب الحركة التفصيلية لتحديد المشية المسببة للأمراض ودوائرها الأساسية ، فإن التقدم في تتبع الحركة قد أحدث ثورة بالفعل ، وسيكون له تأثير مستمر على فهم تنسيق المشي العادي ومشيته والدوائر الأساسية ، خاصة في فروع مختلفة لا تعد ولا تحصى من الشجرة التطورية.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفان أن يشكرا موهيتا تشاترجي وأليس ليو على الدعم الفني، ومركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفيرسلالات دروسوفيلا المستخدمة في هذا العمل. وقد دعم هذا العمل معهد البيولوجيا الجزيئية والخلوية، سنغافورة؛ معهد المعلوماتية الحيوية، سنغافورة؛ منظمة المجلس المشترك لوكالة تكنولوجيا العلوم والبحوث (المنحة رقم 15302FG149 إلى SA وLC)؛ البرنامج الرائد للبحوث السريرية (مرض باركنسون) الذي يديره المجلس الوطني للبحوث الطبية التابع لوزارة الصحة السنغافورية (رقم المنحة NMRC/TCR/013-NNI/2014 إلى SA)، وجامعة ألبرتا (منحة بدء التشغيل إلى LC)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) منحة الاكتشاف (رقم المنحة RGPIN-2019-04575 إلى LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any - Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H.
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
