Summary
Vi beskriver detaljerede protokoller for brug af FLLIT, en fuldautomatisk maskine llære metode til ben klo bevægelse sporing i frit at flytte Drosophila melanogaster og andre insekter. Disse protokoller kan bruges til kvantitativt at måle subtile gangart bevægelser i vilde type fluer, mutant fluer og flyve modeller af neurodegeneration.
Abstract
Drosophila-modellen har været uvurderlig for studiet af neurologisk funktion og for forståelsen af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration. Mens flyve teknikker til manipulation og undersøgelse af neuronal delmængder er vokset stadig mere sofistikeret, den rigdom af de resulterende adfærdsmæssige fænotyper er ikke blevet fanget på en lignende detalje. For at kunne studere subtile fluebenbevægelser til sammenligning blandt mutanter kræver evnen til automatisk at måle og kvantificere højhastigheds- og hurtige benbevægelser. Derfor har vi udviklet en machine-learning algoritme til automatiseret ben klo sporing i frit gående fluer, Feature Learning-baserede Limb segmentering og Tracking (FLLIT). I modsætning til de fleste deep learning-metoder er FLLIT fuldt automatiseret og genererer sine egne træningssæt uden behov for brugeranmærkning ved hjælp af morfologiske parametre, der er indbygget i læringsalgoritmen. I denne artikel beskrives en dybdegående protokol til udførelse af ganganalyse ved hjælp af FLLIT. Det beskriver procedurerne for kamera opsætning, arena konstruktion, videooptagelse, ben segmentering og ben klo sporing. Det giver også et overblik over de data, der produceres af FLLIT, som omfatter rå sporede krop og ben positioner i hver video ramme, 20 gangart parametre, 5 parceller og en sporet video. For at demonstrere brugen af FLLIT kvantificerer vi relevante syge gangartparametre i en fluemodel af Spinocerebellar ataksi 3.
Introduction
I de sidste par årtier, neurodegenerative sygdomme og bevægelsesforstyrrelser er vokset mere udbredt i vores aldrende befolkninger. Selv om vores forståelse af mange neurodegenerative sygdomme har udviklet sig på det molekylære og cellulære niveau, grundlæggende elementer i de berørte neuronal kredsløb underliggende sygdom forbliver dårligt forstået. Nyligt udviklede adfærdsmæssige tracking værktøjer1,2,,3,,4 nu giver os mulighed for at studere bevægelse abnormiteter i dyresygdomme modeller med henblik på at identificere molekylære, cellulære og kredsløb dysregulering underliggende sygdom.
Molekylære veje, der er involveret i mange neurodegenerative sygdomme, bevares i frugtfluen Drosophila melanogaster, og Drosophila-sygdomsmodeller har bidraget til at belyse grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration5,6. Vi har for nylig viste, at flyve modeller af Parkinsons sygdom (PD) og Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) udviser forskellige, bevarede gangart signaturer, der ligner de respektive menneskelige sygdomme1, viser, at flyve model kan bruges til at forstå kredsløb mekanismer underliggende bevægelse dysfunktion i specifikke bevægelsesforstyrrelser. Den rige og konstant voksende arsenal af værktøjer i flyve model for målrettet manipulation og visualisering af neuroner på enkelt gen og enkelt celle niveau7,,8,,9,,10 gør fluen en ideel model en til at sonde forholdet mellem sygdomsveje, neuronal kredsløb og adfærdsmæssige fænotypiske manifestation in vivo. For at muliggøre præcis, automatiseret insekt gangart analyse, vi for nylig udviklet en machine learning metode, Feature Ltjener-baserede LImb segmentering og Treoler (FLLIT)1.
FLLIT består af en fuldautomatisk flertrinsalgoritme, der først segmenterer benpixel, som efterfølgende bruges til at lokalisere og spore de tilsvarende benkløer. FLLIT anvender en forstærkende algoritme til segmentering i modsætning til deep learning algoritmer, der anvendes i det seneste arbejde2,3. Der er nogle ligheder med convolutional neurale netværk i, at for begge rammer, funktion udvinding sker automatisk gennem læring convolutional kerner. Det første skridt i FLLIT indebærer brug af morfologiske operationer (kant og skeletonisering) til automatisk at generere positive (pixels på benene) og negative (baggrund eller pixels på fluekroppen) uddannelse prøver med høj sikkerhed. Fllit er derfor fuldautomatisk og kræver ikke brugerkommenterede træningsprøver. Ved hjælp af ovenstående træningsprøver trænes en klassificering derefter inden for rammerne af en forstærkende algoritme. Et ensemble af svage klassificeringer er iterativt lært, med hver bestående af et sæt af convolutional kerner til funktionen udvinding og en beslutning træ. Den endelige lærte klassificering bruges derefter til bensegmentering og er i stand til bedre at skelne vanskelige regioner / hårde prøver bedre end morfologiske operationer, der producerer en samlet langt mere præcis segmentering til sporing1. Fra de segmenterede ben finder vi spidserne og sporer dem ved hjælp af den ungarske algoritme: ved at matche tips på tværs af rammer, således at summen af den afstand, der flyttes af hver spids, minimeres. FLLIT kan håndtere okklusion tilfælde ved at huske den sidst sete placering (i flyve centreret koordinater), således at et ben spids er inddrevet, når det ikke længere er under okklusion.
Vi har tidligere vist, at FLLIT automatisk og præcist kan spore benbevægelser og analysere gangart i en umærket, frit bevægende flyve eller edderkop fra high-speed video1; FLLIT bør derfor være bredt anvendelig for leddyr ben sporing. Ved at udtrække maskinlæringstræningssæt ved hjælp af morfologiske parametre træner FLLIT automatisk sig selv til at segmentere og spore insektben uden behov for besværlig manuel anmærkning, hvilket er nødvendigt for de fleste deep learning-metoder. FLLIT er derfor fuldt automatiseret. Efter ben segmentering og sporing, FLLIT automatisk producerer rå sporede krop og ben positioner i hver video ramme, 20 gangart parametre, 5 parceller og en sporet video til gangart analyse og visualisering af gangart bevægelser. Denne protokol indeholder en trinvis vejledning til brug af FLLIT.
Protocol
1. Systemopsætning
- Sørg for, at optagestationen har et højhastighedskamera og et trin over det for at holde arenakammeret (Figur 1). Juster kameraet for at optage med mindst 250 billeder pr. sekund (fps) med en tilsvarende hurtig lukkertid (i dette tilfælde udføres optagelsen ved 1000 fps med en lukkertid på 1 ms).
BEMÆRK: Kontroller, at videoen er egnet til sporing ved at sikre, at der er minimal eller ingen bevægelsesløring af bevægelige ben i alle billeder. Hvis det bevægelige ben er så sløret, at en menneskelig anmærkningsenhed ikke kan spore det, skal kameraets optagehastighed og/eller lukkertid øges. - Placer de infrarøde LED-lys øverst på scenen med en diffusor (gennemsigtigt ark) mellem kameraet og prøven (Figur 1A,B).
- Gør optagelse kammer ved at skære en 1,6 mm tyk akryl ark. I dette eksperiment skal du bruge et synsfelt på 11 mm x 11 mm. Placer kammeret mellem to glasglas (Figur 1C).
2. Forberedelse af fluer til optagelse
- Flyt de fluer, der skal registreres, overføres til et nyt madhætteglas 24 timer før optagelse.
BEMÆRK: Brug ikke CO2 (normalt bruges til at bedøve fluerne ved første samling) på fluerne mindre end 24 timer før optagelse. - Ca. 40 min før optagelse, overfør fluerne til tomme hætteglas og hold på is i 5-7 min.
- I mellemtiden tørre arenaen og klare glas dias med vand og en tør.
BEMÆRK: Brug ikke ethanol til at rengøre kamrene og objektglassene. - Gør optagelseskammeret klar. Fastgør en af de mikroskopiske glasdias under kammeret med tape.
- Når fluerne er blevet bestøvet på is, overføres en flue i hvert kammer ved hjælp af en ren børste.
BEMÆRK: Både mandlige og kvindelige fluer kan bruges i denne opsætning, og så vidt muligt bør fluer af begge køn analyseres for at undgå kønsspecifik bias. - Fastgør kammeret med en anden mikroskopisk glasrutsjebane med tape (Figur 1C).
- Hold de chambered fluer ved stuetemperatur i 15 - 20 min for akklimatisering.
3. Generation af videoer til FLLIT analyse
BEMÆRK: Dette trin er specifikt for det anvendte videokamera. I dette tilfælde bruges et kommercielt tilgængeligt videokamera (se Materialetabel).
- Tænd for strømkilden. Vent på, at den grønne LED er strøm, og den orange LED for at ethernet-grænsefladeforbindelsen stabiliseres. Tænd for strømmen til den infrarøde LED. Sørg for, at spændingen forbliver på 12,5 V.
- Åbn fremviserprogrammet på det tilsluttede computersystem.
- Skift optagelsesbilledhastigheden til 1000 fps. Indstil lukkerhastigheden til 1/1000 s (1 ms).
- Placer kammeret med fluen på optagelsesarenaen, og vælg LIVE-knappen. Sørg for, at kameraet er fokuseret på benspidserne, når fluen går oprejst på gulvet i kammeret; benspidserne skal være i skarpt fokus.
- Klik på Post (Figur 2).
- Optag fluen gå, sikre, at:
Fluen gik i en relativt lige bane uden at røre kanten af arenaen.
Fluen gik mindst tre skridt per ben.
Fluen holder ikke pause under gåturen.
Den tilbageede afstand svarer til mindst én kropslængde.
BEMÆRK: Det er afgørende at få fratrukket baggrunden rent, hvis du vil have den nøjagtige segmentering. Den automatiserede baggrundssubtraktionsalgoritme, der anvendes af FLLIT, kræver, at den afbildede flue bevæger sig mindst én kropslængde i afstand. - Klik på Rec Done for at stoppe optagelsen ( Figur2).
- Beskær videoen for at sikre, at optagelsen kun omfatter en lige gang i fluen (som beskrevet i trin 3.6).
- Klik på Gem (Figur 2). Gem filerne i '.mraw' eller '.tiff'-format i de respektive mapper.
BEMÆRK: '.mraw'-formatet giver større fleksibilitet til at ændre filnavnet (hvis det er nødvendigt) og til opbevaring af videoer sammenlignet med '.tiff'-filformat.
4. Installation af FLLIT-program
BEMÆRK: Opdaterede instruktioner kan findes på: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
- Hent FLLIT på ethvert operativsystem
- Hent FLLIT fra følgende Github-link: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. Udpak indholdet af zip-filen.
- Hent eksempeldatasæt fra følgende Google Drev-link: https://bit.ly/2EibvNY. Opret en mappe Data under FLLIT-master/Compiled og placer datasætmapper i denne datamappe.
- Installer FLLIT i Ubuntu
- Gå til mappen FLLIT/kompileret.
- Højreklik, og vælg Åbn i Terminal.
- Problemfà ̧r fà ̧lgende kommando for at hente og installere MATLAB-kørselsbibliotekerne til $HOME/MCR:
bash MCR_2016a.sh - Når installationen af MATLAB-kørselsbibliotekerne er fuldført, skal du udstede følgende kommando for at sikre, at FLLIT tildeles eksekverbare rettigheder:
chmod +x FLLIT - Åbn en terminal i mappen FLLIT/kompileret, og udfør følgende kommando for at udføre FLLIT:
bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
- Installer FLLIT i Windows
- For 7 og 10th Home Edition, installere Docker Toolbox på:
(https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe). - Til Windows 10 Pro eller Enterprise Edition skal du installere Docker Desktop til Windows på: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\%20Desktop\%20Installer.exe).
- Hvis du vil aktivere udførelse af GUI-programmer i en Docker-beholder i Windows, skal du først installere VcXSrV (https://sourceforge.net/projects/vcxsrv). Når vcxsrv startes, skal du konfigurere indstillingerne som i figur S1.
BEMÆRK: Sørg for, at Docker og VcXsrv kører, før FLLIT startes. - Dobbeltklik fllit.bat at køre FLLIT.
BEMÆRK: Når du udfører for første gang, vil det tage lidt tid at trække Docker billedet fra Docker Hub.
- For 7 og 10th Home Edition, installere Docker Toolbox på:
- Installer FLLIT i MacOS
- Download Docker Desktop til MacOS på https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg
- Installer socat ved at åbne en terminal og udstede følgende kommando:
brygge installere socat - Start socat med:
socat TCP-LISTEN:6000,reuseaddr,gaffel UNIX-CLIENT:\"$DISPLAY\" og forældet - Installer XQuartz (https://www.xquartz.org) for at muliggøre udførelse af GUI-programmer i en Docker-beholder på MacOS. Start XQuartz, og rediger indstillingerne ved at kontrollere tillad forbindelser fra netværksklienter under fanen Sikkerhed som vist i figur S2.
BEMÆRK: Sørg for, at Docker, socat og XQuartz alle kører, før du starter FLLIT. - Åbn en terminal i mappen FLLIT/kompiler, og udfør FLLIT med følgende kommando:
bash FLLIT_Mac.sh
BEMÆRK: Når du udfører for første gang, vil det tage lidt tid at trække Docker billedet fra Docker Hub.
5. Kører FLLIT til automatiseret bensporing
- Segmentering
- Konverter videoen til individuelle TIFF-filer, og kopiér den til FLLIT-datamappen.
- Kør FLLIT (I Ubuntu, højreklik for at åbne FLLIT i Terminal).
- Vælg den mappe, der indeholder TIFF-billederne af den video, der skal spores, og klik på knappen Tilføj.
- I pop-up-vinduet skal du vælge 0 til kun at udføre bensegmentering eller 1 for at medtage bensporing med bensegmentering.
- Klik på Udført for at starte segmentering og sporing af den valgte video.
- Tracking
- Hvis du vil kontrollere nøjagtigheden af sporing og udføre eventuelle fejlrettelser, skal du klikke på Vælg datamappe. Vælg den mappe, der skal spores, og klik på Åbn.
- Klik på Vis sporing.
BEMÆRK: Kontroller, at fremvisertilstanden forbliver markeret, mens du får vist de sporede benpositioner. Ellers vil eventuelle tidligere rettelser blive over-redet. - Kontroller mærkningen for alle benene i den første ramme
BEMÆRK: Da benetiketterne er placeret i henhold til positionen på skærmen, er fluens højre side mærket som L1 (forben), L2 (midtbenet), L3 (bagbenet) og fluens venstre side er mærket som R1 (forben), R2 (midtbenet), R3 (bagbenet), henholdsvis (Figur 3). Hvis fluen går på hovedet, vil ned benetiketterne være korrekt kommenteret. - Hvis et ben er forkert mærket, og der kræves en rettelse, skal du klikke på Pausevisningefterfulgt af Juster forudsigelse (Figur 3).
- Fra højre panel overskriften Ben for at justere, skal du vælge det ben, der kræver korrektion.
- Dobbeltklik på den korrekte position for dette ben i billedvinduet, klik på Gem, og afslutderefter . Hvis du vil gå til den forrige ramme eller efterfølgende ramme, skal du klikke på Pausevisning efterfulgt af knapperne Frem og tilbage og I> (Figur 3).
- Hvis du vil rette eventuelle forkert sporede videoer, skal du åbne mappen Data i videoen for at blive sporet igen og vælge Initier sporing manuelt.
- Klik på knappen Sporing, som derefter ændrer etiketten til Initial.
- Klik på Juster forudsigelse, og ret benetiketterne ved at dobbeltklikke på hvert benspids og derefter tildele den med den korrekte benetiket. Klik på Gem og afslut.
- Klik på Genoptag for at starte sporing.
- Generering af databehandling og video
- Klik på Dataproces. I pop op-vinduet skal du skrive antallet af billeder pr. sekund (fps), hvor videoerne blev optaget (f.eks. 1.000 fps).
- Brug følgende ligning til at beregne det faktiske synsfelt for den optagne video, så gangparametre kan måles i millimeter:
BEMÆRK: Hvis den faktiske kammerstørrelse for eksempel er 7 mm, er billedrammens bredde 137 mm, bredden af kammeret i billedrammen på computerskærmen er 81 mm, og synsfeltets bredde var 11,83 mm (figur S3). - Hvis du vil se resultaterne af sporingen, skal du gå til mappen Sporing under mappen Resultater.
- Hvis du vil generere en video af den sporede flue, skal du vælge Lav video. Videoen gemmes i den samme mappe Resultater som i de oprindelige videodata, der analyseres.
BEMÆRK: Startrammerne (første) og (sidste) i videoen kan vælges.
- Normalisering til kroppenlængde af hver flue.
BEMÆRK: Da hver flue kan være lidt forskellig i størrelse, bør visse gangartparametre normaliseres til kropslængden af hver flue for at lette sammenligninger (f.eks. kan skridtlængde være længere i større fluer og kortere i mindre fluer).- Åbn tre stillbilleder fra videoen af hver flue (normalt første, midterste og sidste billeder) ved hjælp af billedsoftware.
- Forstørre hver billedramme til 800% og mærk den forreste pixel i hovedet og den bageste pixel i maven ved midterlinjen med en lys farve (f.eks. gul).
- Åbn de mærkede billeder i ImageJ.
- Brug Angiv skalering til at indtaste skalaen i overensstemmelse hermed: Angiv afstand i pixel: 512; Kendt afstand: Faktisk synsfelt (mm) målt i trin 5.3.2. Længdeenhed: mm.
- Tegn en lige linje mellem de mærkede hoved- og mavespidspixel for at opnå kropslængden.
- Åbn Indstil skala igen for at opnå værdien i en kendt afstand, som er kropslængden i mm.
- Tag et gennemsnit af længden bestemmes i hvert af de tre billeder for at opnå den gennemsnitlige kropsstørrelse i mm.
Representative Results
Efter bensegmentering, sporing og databehandling genererer FLLIT automatisk rådata for kroppens positioner og hver benklo, 20 gangparametre, 5 parceller og en sporet video (tabel 1).
Her demonstrerer vi disse analyser ved hjælp af en fluemodel af Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3). Den pan-neuronale driver Elav-GAL4 blev brugt til at drive enten den fulde længde wildtype human SCA3 med 27 glutaminer i polyQ-kanalen (UAS-SCA3-flQ27), eller en fuld-længde mutant human SCA3 med 84 glutaminer i polyQ-tarmkanalen (UAS-SCA3-flQ84)11. SCA3 er karakteriseret ved en ataxic gangart med krop veering, uregelmæssig fod placering og korte, lurching trin12,13 (Tabel 2). For at karakterisere gangart af mutant SCA3 fluer og undersøge, om de viser en lignende gangart til menneskelige patienter, vi analyserede relevante gangart parametre genereret af FLLIT, nemlig: Antal krop sving, fodaftryk regelmæssighed, ben domæne overlap og størrelser, og ben skridtlængder (Tabel 2).
Vi konstaterede, at SCA3-Q84 fluer udviste flere sving (figur 4A,A'),uregelmæssig fodplacering som udstillet af lav fodaftryksregelmæssighed (forstørrede standardafvigelser for AEP14) (Figur 4B), øget bendomæneoverlapning ( figur4C-D), udvidede bendomæner i længde og område (figur 4E,F) og nedsat længde på tværs (figur 4G).
FLLIT genererer også en video, der viser sporet flyve og ben i arena-centreret og krop-centreret synspunkter, krop bane og kursretning, og lodrette og laterale forskydninger af hvert ben (Figur 5). De sporede videoer tillader side-by-side sammenligning af benbevægelser i forskellige fluer. Repræsentative videoer af Elav-GAL4>SCA3-flQ27 (Video 1) og Elav-GAL4>SCA3-flQ84 (Video 2) fluer viser, at fluer i forhold til Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 -fluer (Figur 5A), Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84-fluer (Figur 5B) udviser uregelmæssige, skærer ben domæner af forskellige størrelser, hvilket indikerer en lurching, ataxic gangart.
Figur 1. Opsætning af optagestationen og arenaen. Optagelser fra (A) front og (B) sidevisninger. (C) Et eksempel på en arena, der bruges til at lave flueoptagelser til FLLIT-sporing. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Visning af det aktive vindue under flygangartoptagelse ved hjælp af et dobbelthovedkamera, som giver mulighed for samtidig optagelse af to fluer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Aktivt FLLIT-vindue, der viser knappanelet og mærkede ben efter segmentering og sporing. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative FLLIT-genererede data for relevante gangartparametre for fluer, der udtrykker vildtype (SCA3-flQ27) vs. mutant (SCA3-flQ84) SCA3. (A) Antal omdrejninger i kroppens bane. (B) Mid-ben fodaftryk regelmæssighed normaliseret til kroppens længde. (C-C') Traversed ben domæner af hvert ben. (D) Domæne overlapning mellem benene. (E) Mid-leg domæne længde normaliseret til kroppens længde. (F) Midtbenet domæneområde normaliseret til kroppens længde2. (G) Mid-ben skridtlængde normaliseret til kroppens længde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Øjebliksbillede af repræsentative FLLIT-genererede videoer. (A) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27 og (B) Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 fluer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Repræsentativ video af en flue, der udtrykker pan-neuronal vildtype-typen sca3 i fuld længde (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27). Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 2: Repræsentativ video af en flue, der udtrykker pan-neuronal mutant human tCA3 (Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84). Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Supplerende figur 1: Konfigurationer til VcXSrv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: Konfiguration for Xquartz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: Billede mærket med de dimensioner, der er nødvendige for beregning af synsfelt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kategori | Parametre | Beskrivelse | Fil/plot (hvis relevant) |
| Rådata | Kropsstilling | Positionelle koordinater for kroppen centroid i hver ramme | De første to kolonner af CoM.csv |
| Krop bane | Vinkel på karrosseriaksens rotationsvinkel i grader (i forhold til y-aksen) | Tredje kolonne af CoM.csv | |
| Arena-centreret ben klo Positioner |
Positionelle koordinater for hvert ben klo i hver ramme baseret på arena koordinater | bane.csv | |
| Body-centreret ben klo Positioner |
Positionelle koordinater for hver benklo i hver ramme baseret på arenakoordinater |
norm_trajectory.csv | |
| Krop bevægelse | Kropslængde (mm) | Prøvedyrets længde, der er anslået i hver ramme (forreste position på hovedet til position på vingerne) |
bodylength.csv |
| Øjeblikkelig kropshastighed (mm/s) |
Kroppens øjeblikkelige hastighed (centroid) i prøvedyret | BodyVelocity.csv; BodyVelocity.pdf | |
| Vendepunkter af kroppen Bane |
For at finde vendepunkterne reduceres banen til en stykkelineær kurve ved hjælp af Dougl asâASPeucker algoritme, hvorefter en drejehændelse identificeres som involverer en vinkel > 50 grader mellem to tilstødende lineære segmenter, der udgør den forenklede bane |
BodyTrajectory.pdf | |
| Individuelle skridtparametre | Længdelængde (ms) | Varigheden af en stride begivenhed | StrideParameters.csv |
| Stride periode (ms) | Varigheden fra den ene skridthændelse til den næste | ||
| Forskydning af skridtlængde (mm) | Forskydning af benkloen under en stride begivenhed | ||
| Sporvej dækket (mm) | Samlet sti dækket af benkloen under en stride begivenhed | ||
| Anterior ekstrem position (mm) |
Landingsposition (i forhold til kroppen) af en benklo ved afslutningen af en stride begivenhed | ||
| Bageste ekstrem position (mm) | Startposition (i forhold til kroppen) af en benklo ved starten af en stride begivenhed | ||
| Stride amplitude (mm) | Forskydning langs bevægelsesretningen for en skridtlængde begivenhed | ||
| Holdningslinearitet (mm) | Defineret som afvigelsen af skridtkurven fra en kurve udjævnet over (med 20 ms intervaller) den tilsvarende anterior og bageste ekstreme positioner af skridtlængde |
||
| Skridtlængde (mm) | Afstanden mellem benklopositionen og karrossericentret midt i en stride-hændelse | ||
| Ben bevægelse | Benhastighed (mm/s) | Den øjeblikkelige hastighed af hvert ben | LegSpeed.csv; Gait.pdf |
| Gangindeks | Dette måler den type gangart, som det (seksbenede) prøvedyr udviser under dets bevægelse. En gangart indeks på 1 svarer til en stativgangart, _1 svarer til en tetrapod gangart, mens 0 udgør en ikke-kanonisk gangart. I vores implementering opnås gangindekset ved et glidende gennemsnit over et vindue på 120 ms |
GaitIndex.csv; GaitIndex.pdf | |
| Satsprocent | Procentdel af tiden, hvor et ben er i bevægelse | LegParameters.csv delte et | |
| Gennemsnitlig skridtperiode (ms) | Gennemsnitlig varighed fra en skridtlængde hændelse til den næste | LegParameters.csv delte et | |
| Fodaftryk stilighed (mm) | Målt som de bageste og | LegParameters.csv delte et | |
| anterior ekstreme positioner af et ben | |||
| Ben bane domæne område (mm2) |
Det område af det minimale konvekse skrog, der indeholder hele benbanen i den kropscentrerede referenceramme | LegParameters.csv; LegDomain.pdf delte et andet år op til dagens tid. | |
| Længde og bredde af ben bane domæne (mm) |
Opnået via den maksimale forventede afstand af klopositioner på den overordnede (domænelængde) og mindre (domænebredde) primære akser |
LegParameters.csv delte et | |
| Skæringspunkt/overlapning af bendomæne (mm2) |
Skæringspunktet/overlapningen mellem de enkelte mulige | LegDomainOverlap.csv delte et andet | |
| Holdningsbredde (mm) | Gennemsnit af afstanden mellem AEP og PEP i venstre og midterste ben | StanceWidth.csv |
Tabel 1: Gangartparametre genereret af FLLIT.
| Gangart funktion | ||||
| Gangart funktioner i Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) | Kovending | Uregelmæssig fodplacering og benkrydsning over | Lurching trin | Korte fremskridt |
| Måleparameter | Antal hændelser for body turn-hændelser | Fodaftryks regelmæssighed | Størrelsen af ben domæner, graden af domæne overlap | Skridtlængde |
| FLLIT-fil | BodyTrajectory.pdf | LegParameters.csv delte et | LegDomainOverlap.csv delte et andet | StrideParameters.csv |
Tabel 2: Tabel, der viser kendetegnende SCA3 gangart funktioner hos menneskelige patienter med deres tilsvarende FLLIT parametre og output filer.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi i detaljer de trin, der er involveret i at bruge FLLIT, en automatiseret machine-learning program1, at analysere gangart i frit gå Drosophila. Efter sporing og dataanalyse genererer FLLIT automatisk rådata til positionsoplysninger om krops- og benkløer, der producerer tyve krops- og gangartfunktioner samt en video af den sporede flue for at muliggøre gangvisualisering.
Der er nu en række metoder til ben bevægelse sporing af Drosophila og andre dyr1,2,3,4,,14,15,16, giver forskerne en bred vifte af muligheder afhængigt af målene for forsøget. Nogle af disse er fodprint-baserede tilgange, som er meget præcise, men som rapporterer kun klo kontaktpunkter med detektionsoverfladen4,14. På den anden side, de seneste deep learning tilgange2,3,16 er meget alsidige, så analyse af adfærd, der kræver sporing af benled og andre kropsdele i ethvert dyr, med det forbehold, at algoritmerne skal først trænes med brugeren kommenterede datasæt. En tredje type tilgang bruger morfologi eller billedkontrastbaserede metoder1,15,17 til at finde konturen af hvert ben til at identificere klopositioner. Generelt handler disse metoder dårligt om adfærd, hvor benene krydser over (f.eks. under grooming). FLLIT kombinerer den anden og tredje tilgang ved hjælp af morfologiske parametre til at træne en forstærkende algoritme til bensegmentering. Dette gør det muligt for FLLIT at omgå den møjsommelige opgave brugeranmærkning til at generere træningsdatasættet, samtidig med at nøjagtigheden ved hjælp af machine learning forbedres. Fremtidige forbedringer af FLLIT bliver nødt til at beskæftige sig med tilfælde, hvor benene krydser over, at give mulighed for analyse af mere komplekse adfærd.
FLLIT er robust til mindre ændringer i belysning, optagelsesopløsning og rammehastighed1. Dog bør frame hastighed optagede videoer ikke falder til under 250 fps, og FLLIT kører optimalt for videoer optaget på 1000 fps. Hvis der er bevægelsesløring i billederne, så det er en udfordring for en menneskelig anmærkningsator at identificere benpositionen, vil FLLIT ikke være i stand til præcist at identificere benspidser i disse rammer. I lyset af dette er det vigtigt, at kameraet fokuseres skarpt på benspidserne. For at forhindre segmentering artefakter, skal arenaen rengøres grundigt, og bør ikke flyttes under optagelsen. For nøjagtig baggrundssubtraktion og ren segmentering skal fluen bevæge sig mindst én kropslængde under optagelsen uden at holde pause. Efter automatisk segmentering og sporing skal mærkningen af alle benene kontrolleres. Hvis fluegangden ikke spores eller spores forkert, skal filen spores manuelt ved hjælp af indstillingen Inituer sporing manuelt (trin 5.2.7 - 5.2.10).
Neurodegenerative sygdomme og bevægelsesforstyrrelser er i stigende grad udbredt i vores aldrende samfund. Flyve modeller af neurodegeneration er blevet undersøgt i mere end 2 årtier, hvor der er gjort fremskridt med hensyn til de molekylære og cellulære aspekter af sygdomspatofysiologi. Men, specifikke adfærdsmæssige konsekvenser af sygdom har været teknisk vanskeligt at vurdere. For eksempel, mens rapporter om rystende bevægelser i fluen er blevet gjort18,19, disse var ikke blevet kvantitativt undersøgt indtil for nylig1. Klatreanalysen har været en nyttig og kvantitativ, men relativt grov foranstaltning6. Dette tekniske underskud har ligeledes hæmmet analysen af højopløsningsbevægelser i andre dyremodeller. Fremkomsten af nye værktøjer til adfærdsanalyse, derfor, har lovet at forynge inden for bevægelsesforstyrrelser at gøre det muligt for forskere at undersøge, hvordan molekylære og cellulære mekanismer af neuromuskulære sygdomme føre til specifikke adfærdsmæssige resultater i dyremodeller. I dette papir og i vores tidligere arbejde1, viste vi ved hjælp af FLLIT at flyve modeller af SCA3 udviser en hyperkinetisk ataksisk gangart, mens PD flyve modeller udviser en hypokinetisk stiv gangart, opsummerer bevægelse kendetegnende for de respektive menneskelige sygdomme1. Gait analyse også gjort det muligt for os at identificere forskellige neuronal populationer underliggende specifikke bevægelse dysfunktioner. Fremadrettet vil detaljeret bevægelsesanalyse kombineret med de kraftfulde billedbehandlings- og funktionsværktøjer, der er tilgængelige i fluen, give os mulighed for at få ny indsigt i mekanismer for bevægelsesdysfunktion, der oplyser vores forståelse af neurodegenerative sygdomme med hensyn til kredsløbsmekanismer.
FLLIT bør være almindeligt anvendelig til at studere gangart i andre små leddyr, da det tidligere blev påvist at være meget præcis til sporing af edderkoppebensbevægelser1. Mens vi fokuserer her på brugen af detaljerede bevægelse fænotypebestemmelse til kvantificering af patogen gangart og dens underliggende kredsløb, fremskridt i bevægelse sporing har allerede revolutioneret, og vil have fortsat indflydelse på, forståelsen af normal gangkoordinering og gangart og dens underliggende kredsløb, især i utallige forskellige grene af det evolutionære træ.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Moumita Chatterjee og Alice Liu for teknisk support, og Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) for at stille drosophila stammer, der anvendes i dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore; Bioinformatikinstituttet, Singapore; Organisationen for Det Fælles Råds Organisation for Videnskabsteknologi og Forskning (tilskudsnummer 15302FG149 til SA og LC) det flagskibsprogram for klinisk forskning (Parkinsons sygdom), der administreres af SingaporeS sundhedsministeriums Nationale Medicinske Forskningsråd (tilskudsnummer NMRC/TCR/013-NNI/2014 til SA), University of Alberta (opstartstilskud til LC) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (tilskudsnummer RGPIN-2019-04575 til LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any - Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H.
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson's disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, Pt 11 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
