Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61027
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 4, 4, 3, 1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

ERRATUM NOTICE

Summary

Kinetisk tvärbindning och analys av cDNA är en metod som möjliggör undersökning av dynamiken i protein-RNA-interaktioner i levande celler vid hög tidsupplösning. Här beskrivs protokollet i detalj, inklusive tillväxt av jästceller, UV-tvärbindning, skörd, proteinrening och nästa generations sekvenseringsbiblioteksberedningssteg.

Abstract

Samspelet mellan RNA-bindande proteiner (RBP) och deras RNA-substrat uppvisar fluiditet och komplexitet. Inom sin livslängd kan ett enda RNA bindas av många olika RBP som reglerar dess produktion, stabilitet, aktivitet och nedbrytning. Som sådan har mycket gjorts för att förstå dynamiken som finns mellan dessa två typer av molekyler. Ett särskilt viktigt genombrott kom med uppkomsten av "cross-l bläckning och immunoprecipitation" (CLIP). Denna teknik möjliggjorde strikt undersökning av vilka RNA som är bundna av en viss RBP. Kort sagt, proteinet av intresse är UV-tvärbundet till dess RNA-substrat in vivo, renat under mycket stränga förhållanden, och sedan omvandlas RNA: erna kovalent tvärbundna till proteinet till cDNA-bibliotek och sekvenseras. Sedan dess uppfattning har många derivattekniker utvecklats för att göra CLIP mottaglig för vissa studier. Tvärbindning med ultraviolett ljus är dock notoriskt ineffektivt. Detta resulterar i förlängda exponeringstider som gör den tidsmässiga studien av RBP-RNA-interaktioner omöjlig. För att lösa detta problem har vi nyligen designat och byggt mycket förbättrade UV-bestrålnings- och cellskördsenheter. Med hjälp av dessa nya verktyg utvecklade vi ett protokoll för tidsupplösta analyser av RBP-RNA-interaktioner i levande celler med hög tidsupplösning: Kinetic CRoss-linking och Analysis of cDNAs (χCRAC). Vi använde nyligen denna teknik för att studera rollen av jäst RBP i näringsstress anpassning. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över χCRAC-metoden och presenterar de senaste resultaten som erhållits med Nrd1 RBP.

Introduction

RNA förlitar sig ofta på RBP för att utöva sin funktion, vilket har lett till stort intresse för att förstå dynamiken mellan dessa molekyler. Många RBP har identifierats i en mängd olika organismer. Det har dock alltid varit notoriskt svårt att studera RBP-RNA-interaktioner in vivo. Ett stort genombrott i att studera sådana interaktioner kom med uppkomsten av CLIP1. Denna metod använder ultraviolett (UV, 254 nm) bestrålning för att inducera kovalenta bindningar mellan RBP och deras direktbundna RNA (dvs nolldistanstvärbindning). Därefter immunrenas RBP under stränga förhållanden för att säkerställa att endast RNA kovalent tvärbundna till proteinerna identifieras. Bundna RNA smälts sedan delvis med RNaser och omvandlas därefter till cDNA-bibliotek för sekvensering. Den höga reningsstringensen är viktig eftersom den kraftigt ökar specificiteten av protein- och RNA-återhämtning, vilket också förbättras ytterligare genom SDS-PAGE-rening av det tvärbundna ribonukleoproteinkomplexet (RNP). CLIP och relaterade metoder ger också nukleotidupplösningsinsikt i proteinbindningsstället, eftersom aminosyror som tvärbundna till RNA under beredningen av sekvenseringsbiblioteket ofta avslutar det omvända transkriptaset eller får enzymet att införa mutationer på denna plats 1,2,3.

Sedan introduktionen har det ursprungliga CLIP-protokollet producerat en anmärkningsvärd mängd derivatmetoder. Ett särskilt viktigt genombrott kom med utvecklingen av HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som kombinerar sekvensering med hög genomströmning med CLIP-metoden3. Detta har sedan dess antagits av alla CLIP-baserade metoder. iCLIP introducerade förbättringar i RNase-medierade trimnings- och adapterligeringstekniker som underlättar mer exakt kartläggning av RBP-bindningsställena4. PAR-CLIP kombinerade 4tio-uridin/uracilmärkning med tvärbindning vid 365 nm, vilket gjorde det möjligt att kartlägga tvärbindningsplatser genom att analysera T-C-substitutioner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP och uvCLAP introducerade denatureringsförhållanden och reningssteg med dubbel affinitet som ytterligare minskar bakgrundsbindningen till affinitetshartset och ytterligare ökar specificiteten för proteininfångning 2,6,7,8,9. Dessutom introducerade CRAC, uvCLAP och dCLIP märkning av RBP av intresse med en affinitetstagg, vilket övervann behovet av att generera specifika antikroppar.

Flera optimeringar har också gjorts för att påskynda CLIP-metodiken. Det ursprungliga CLIP-protokollet använde radiomärkning av de fångade RNA: erna för att visualisera RBP-RNA-komplexen efter SDS-PAGE. Användningen av radioaktivitet kan dock vara problematisk för laboratorier som inte inrättats för sådant arbete. irCLIP innehåller en fluoroforkopplad adapter som underlättar visualisering genom infraröd avbildning10 och sCLIP använder biotinylering av fångade RNA för att visualisera dem genom streptavidin-konjugerad HRP11. Dessutom avstår eCLIP helt från RNA-märkning; Istället skärs proteinet enbart baserat på dess kända storlek12. Streptavidinbaserad rening har också använts för att påskynda processen för biblioteksberedning i FAST-iCLIP, där en biotinylerad 3'-adapter ligeras på RNA och används för att möjliggöra rening efter omvänd transkription och cirkularisering13. Ytterligare förbättringar av iCLIP-protokollet ökade också bibliotekens komplexitet kraftigt4.

Slutligen har CLIP modifierats för att möjliggöra infångning av RBP från olika cellulära underavdelningar 14,15, för att visualisera nyligen transkriberade RNA med pulsad induktion av fotoaktiverbara ribonukleosider 5,16,17, för att fånga metylerade RNA 18,19,20, för att undersöka RNA-RNA-interaktioner 21,22 och för att kartlägga 3'-ändar 23,24.

Trots de stora bidragen från CLIP-baserade tekniker för att hjälpa vår förståelse av interaktionerna mellan RBP och RNA, har det begränsats av ineffektiviteten hos UV-tvärbindning. Även om odlingsceller som odlas i ett monolager i allmänhet är relativt lätta att tvärbinda, är detta betydligt mer utmanande i vävnader eller celler i lösning. Vävnader kan kräva flera omgångar av UV-exponering för att tränga in i de nödvändiga cellskikten, medan mikrobiella celler ofta odlas i rika medier som innehåller aromatiska, UV-absorberande föreningar25. Faktum är att UV-bestrålningstider på upp till 30 minuter har använts för att generera tillräcklig tvärbindning mellan RBP och deras bundna RNA för sådana prover26,27,28. Denna utökade UV-exponering inducerar stressreaktioner i cellen, såsom UV-inducerad DNA-skada, som kan förorena slutdata i vissa applikationer.

Majoriteten av CLIP-studierna har fokuserat på att generera enstaka "ögonblicksbilder" av specifika protein-RNA-interaktioner i en cell. Protein-RNA-interaktioner är emellertid i sig dynamiska, särskilt när celler utsätts för förändringar i sin miljö. Detta kan inkludera en plötslig minskning av tillgången på viktiga näringsämnen eller snabba temperaturförändringar. Som sådan, för att verkligen förstå rollen som en RBP under stress, är det bäst att utföra tidsupplösta analyser eftersom de kan fånga hela spektrumet av RBP-mål under stress och bestämma i vilket skede av stressresponsen den valda RBP är aktiv. I synnerhet visade studier i jäst att de första minuterna av anpassning är helt avgörande för överlevnad och RNA-halveringstider i bakterier kan variera från minuter till sekunder 29,30,31,32,33. Därför bör sådana tidsupplösta analyser helst utföras med hög tidsupplösning. De långa tvärbindningstiderna gör dock studien av tidiga adaptiva svar särskilt utmanande.

För att övervinna dessa problem utvecklade vi nyligen en förbättrad metod som kan tvärbinda och skörda celler på minutlånga tidsskalor. Vår χCRAC-metod möjliggör kvantitativ mätning av dynamiska förändringar i RBP-RNA-interaktioner vid tidigare obevittnad upplösning. Avgörande för denna metod var utvecklingen av en ny UV-bestrålningsanordning32 som minskar den erforderliga tvärbindningstiden i jäst och bakterier i lösning runt 10-faldig, vilket effektivt fryser RBP-RNA-interaktioner omedelbart. Dessutom, för att snabbt skörda cellerna efter UV-bestrålning, utvecklade vi en vakuumfiltreringsanordning som kan skörda exponentiellt växande jäst i en 0,5 L kultur i cirka 30 s32. Dessa tekniska innovationer möjliggör studier av RBP-RNA-dynamik vid minutskala upplösning. Dessutom introducerade vi flera optimeringar av det ursprungliga CRAC-protokollet2 för att öka dess praktiska egenskaper.

Med hjälp av χCRAC studerade vi nyligen targetome av en jästkärnteknisk RBP, Nab3, som svar på glukosbrist. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 bilda ett komplex med Nrd1, en RBP och RNA-helikasen Sen1 för att bilda NNS-komplexet. NNS-bindning till RNA-polymeraset och det begynnande transkriptet kan utlösa transkriptionsavslutning34. Detta komplex är mestadels involverat i att ta bort kryptiska icke-kodande RNA-transkript men har också visat sig reglera uttryck av proteinkodande gener. Studien visade differentiell inriktning av Nab3 till icke-kodande och kodande transkript efter bara en minut av stress32. Vi visade att samtranskriptionell terminering av Nab3 resulterar i ett mycket övergående, pulsliknande uttryck av retrotransposongener, vilket skulle ha varit svårt att upptäcka med traditionella CLIP-baserade metoder. Dessutom ökade de korta UV-bestrålningstiderna i vår UV-tvärbindning också signifikant återhämtningen av kortlivade icke-kodande RNA32. χCRAC kommer sannolikt att vara ett viktigt verktyg för att belysa inte bara hur RBP formar svaret på stress på omedelbara tidsramar utan också deras förändrade roller under hela livscykeln för en respons. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över alla steg i χCRAC-protokollet. För illustrativa ändamål användes metoden för att studera jäst Nrd1-proteinet, som är involverat i transkriptionell terminering och RNA-sönderfall35,36, och dess RNA-målome som svar på glukosbrist över en mängd tidpunkter. Slutligen visar vi också att vår UV-bestrålningsenhet snabbt kan tvärbinda RBP till RNA i HeLa-celler, vilket gör det möjligt att även utföra högupplösta tidsupplösta analyser i vidhäftande celler.

Protocol

TN150
50 mM Tris pH 7,8
150 mM NaCl
0,1% NP-40
1X proteashämmare
TN1000
50 mM Tris pH 7,8
1M NaCl
0,1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7,8
10 mM MgCl2
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM MgCl2
50 mM beta-merkaptoetanol
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7,8
300 mM NaCl
10 mM imidazol
6M guanidin-HCl
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
WB II
50 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM NaCl
10 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
Elution buffert
50 mM Tris pH 7,8
50 mM NaCl
250 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
Proteas K-buffert
50 mM Tris
0,1% NP-40
5 mM β-merkaptoetanol
1% SDS
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
Buffert för däggdjurslys
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0,5% v/v Triton X-100
0,25% w/v Na-deoxikolat
0,1% w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM DTT (tillsatt färskt)
1X proteashämmare

Tabell 1: De buffertar som krävs för χCRAC och deras sammansättning.

1. UV-tvärbindning och lysatproduktion

  1. Mikroorganismer i lösning
    1. Inokulera 3,5 l av det önskade mediet med jäst från en nattkultur till en utgångs-OD600 på 0,05. Väx vid 30 °C med kontinuerlig skakning vid 180 rpm.
    2. Under tillväxten, förbereda andra nödvändiga material.
      1. Förbered en behållare med flytande kväve.
      2. Bered 3 l stressframkallande medium och värm till 30 °C i ett vattenbad.
      3. Ställ in filterapparaten, slå på tvärbindaren (figur 2A) och märk 50 ml koniska rör, ett för varje tidpunkt.
    3. När cellerna når önskad OD600, häll 500 ml celler rakt in i tvärbindaren och UV-bestråla med 250 mJ 254 nm UV. Se figur 2A och figur 3A för mer information om hur du använder tvärbindaren.
      OBS: UV-bestrålningsenergin måste optimeras noggrant för varje protein av intresse. Se diskussionen för mer information.
    4. Efter tvärbindning, filtrera cellerna med hjälp av en av vakuumfiltreringsanordningarna (figur 2B, C). Rulla ihop membranet med de filtrerade cellerna, placera i t = 0 (tid noll) 50 ml koniskt rör och frys i flytande kväve.
    5. Filtrera de återstående cellerna över sex olika filter. Resuspendera de uppsamlade cellerna i 3 L tidigare uppvärmt spänningsinducerande medium genom att släppa membranen i mediet och blanda kraftigt med en stripett i 50 sekunder. Efter 50 s, förbered dig för att ta t = 1 provet.
    6. Efter 1 minut, tvärbind 500 ml celler och skörda genom filtrering enligt steg 1.1.3–1.1.4. Upprepa efter 2, 4, 8, 14 och 20 minuter eller olika tidpunkter efter behov.
    7. Förvara de koniska rören som innehåller cellerna vid -80 °C. Ställ in fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 °C över natten.
    8. Nästa dag, ta varje koniskt rör som innehåller ett tvärbundet prov och resuspendera cellerna i 25 ml kall PBS genom att skaka kraftigt.
    9. Överför cellsuspensionerna till nya koniska rör och snurra vid 4 600 x g, 5 min vid 4 °C.
    10. Häll av PBS, snurra snabbt igen för att samla kvarvarande PBS och dekantera sedan den återstående vätskan med en pipett.
    11. Beräkna pelletens vikt i röret genom att jämföra det med ett tomt rör.
    12. Tillsätt två pelletsvolymer iskall TN150, 60 μL DNas 1 och 10 μL RNas-hämmare. Inkubera på is i 30 min.
      1. Till exempel, för 400 mg celler, tillsätt 800 μL iskall TN150.
      2. Tillsatsen av DNas är inte nödvändig för de flesta lösliga proteiner men är mycket viktig när man studerar kromatinbundna proteiner såsom RNA-polymeras. Dessutom minskar viskositeten hos bakteriella lysater. Det är mycket viktigt att använda exakt två pelletsvolymer av lysbufferten, annars kan lyseffektiviteten minska.
    13. Tillsätt tre pelletsvolymer (i ml) zirkoniumoxidpärlor till cellsuspensionen. För jäst, använd pärlor med 0,5 mm diameter och för bakterier använd 0,1 mm.
      1. Till exempel, för 400 mg celler, mäta ut 1,2 ml zirkoniumoxidpärlor i ett 1,5 ml rör och tillsätt dem till cellerna återsuspenderade i lysbuffert.
    14. Virvla cellsuspensionerna i 1 minut och lägg sedan på is i 1 min. Upprepa i totalt 5x.
    15. Tillsätt två pelletsvolymer TN150-buffert och virvel kraftigt för att blanda.
    16. Centrifugera suspensionen i det koniska röret vid 4 600 g i 20 min vid 4 °C i en bänkcentrifug.
      1. Efter centrifugering, ta ett 50 μL prov av supernatanten för framtida Western blot-analys för att undersöka hela cellproteinuttrycket.
    17. Överför supernatanterna till 1,5 ml rör och snurra lysatet i 20 minuter vid 20 000 x g vid 4 °C i en mikrofuge.
      1. Alternativt, om 5 ml rör används, centrifugera vid 13 000 x g i 20 minuter.
      2. Efter centrifugering tar du ett 50 μl-prov av supernatanten för framtida Western blot-analys för att undersöka proteinets lösliga uttryck.
    18. Fortsätt till RBP-inspelning (avsnitt 2).
  2. Odlade vidhäftande celler
    1. Frö tillräckligt vidhäftande celler i en petriskål 24 timmar före UV-tvärbindning så att de kan nå 80% sammanflöde nästa dag. Odla över natten i önskat medium i en cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5%CO2.
      OBS: Om du använder kvarts petriskålar är det fördelaktigt att främja celladhesion genom behandling av odlingskärlet med poly-D-lysin (70 000–140 000 vikt) och fosterkalvserum (FCS) 2,5 timmar före sådd. Tillsätt tillräckligt med poly-D-lysin för att täcka hela tillväxtytan och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 5 minuter. Därefter sköljs kvarts petriskålen noggrant med vatten och torkas i cellodlingsinkubatorn i 2 timmar eller tills den är helt torr. Lägg sedan till tillräckligt med FCS för att helt täcka tillväxtytan och placera i inkubatorn i minst 30 minuter. FCS bör avlägsnas helt före såddceller.
    2. När cellerna har nått 80% sammanflöde, ta bort mediet och tvätta med 15 ml iskall PBS. Ta sedan bort all återstående vätska helt och fortsätt omedelbart till nästa steg.
    3. Överför petriskålen till brickan för vidhäftande celler (figur 3B) och UV-bestråla med 300 mJ 254 nm UV. Se figur 2A och figur 3B för mer information om hur du använder tvärbindaren.
      OBS: UV-bestrålningsenergin måste optimeras noggrant för varje protein av intresse. Se diskussionen för mer information.
    4. Omedelbart efter tvärbindning, placera petriskålen på is och tillsätt 10 ml iskall PBS. Samla celler genom att skrapa och överföra till ett 15 ml koniskt rör. Pellet genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    5. Ta bort PBS och återsuspendera cellpelleten i 1 ml iskall PBS och överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pelletsceller igen genom centrifugering i 5 minuter vid 300 x g vid 4 °C.
    6. Ta bort PBS och snäppfrys cellpellets på torris. Förvara cellpelletsen vid -80 °C tills det behövs.
    7. Upprepa steg 1.2.3–1.2.6 för varje tidpunkt.
    8. Återsuspendera cellpelletsen i 1 ml lysbuffert och överför till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt därefter 1 ml lysbuffert för totalt 2 ml.
    9. Tillsätt 5 μl RNashämmare hos däggdjur.
    10. Sonicate 5x för 10 s på is vid 10 amp. Vänta 30 s mellan ultraljudsbehandling rundor.
    11. Beräkna proteinkoncentrationen för varje prov och normalisera till den lägsta koncentrationen.
    12. Överför 1,98 ml lysat till ett 2 ml rör.
    13. Tillsätt 10 μl DNas I och inkubera vid 37 °C i 5 minuter med skakning vid 1 200 varv/min.
    14. Centrifugera lysatet vid 16 000 x g i 20 minuter vid 4 °C.
      1. Efter centrifugering tas ett 50 μl prov av supernatanten för framtida Western blot-analys för att undersöka lösligt uttryck av proteinet.
    15. Fortsätt till RBP-inspelning (avsnitt 2).

2. RBP-fångst

  1. Tvätta de magnetiska anti-FLAG-pärlorna (75 μL uppslamning per prov) eller IgG-agaros (500 μL uppslamning per prov) 3x med 5 ml TN150. Suspendera i en slutlig volym på 700 μl TN150 och tillsätt 100 μL tvättade pärlor till sju 15 ml koniska rör.
    1. Förvara på is tills det behövs.
  2. När lysaterna har klarats, tillsätt supernatanten till röret som innehåller anti-FLAG/IgG-pärlorna.
  3. Nöt vid 4 °C i 2 timmar.
    OBS: Vissa protokoll beskriver inkubationer över natten med pärlorna, men detta rekommenderas inte, eftersom långa inkubationstider dramatiskt kan minska återhämtningen av tvärbundna RNA.

3. Tvätta pärlorna och TEV-klyvningen av taggarna

  1. Skörda pärlorna och ta bort lysatet.
    1. Ta ett 50 μL prov av supernatanten för framtida Western blot-analys för att undersöka det ofångade proteinet.
  2. Återsuspendera pärlorna i iskall TN1000 och överför till ett 1,5 ml rör. Tvätta i 10 min, 4 °C, med nutation. Upprepa i totalt tre tvättar.
    1. Om du använder IgG-agarospärlor, tvätta med 5 ml TN1000. Om du använder anti-FLAG-pärlor, använd 2 ml.
  3. Tvätta sedan pärlorna 3x med TN150, med samma volym som ovan.
  4. Efter den tredje tvätten, återsuspendera pärlorna i 600 μL TN150.
  5. Tillsätt 30 U hemlagat GST-TEV-proteas till pärlsuspensionen och rotera i 2 timmar vid RT.
    OBS: Rekombinant GST-TEV-proteas är nu också kommersiellt tillgängligt, men det har inte testats med detta protokoll.
    1. Under matsmältningen, förbered dig för nästa steg genom att ställa in kolumner med tre 1,5 ml rör för varje prov (dvs. för sju prover, ha tre rader med sju kolumner).
    2. Till den sista raden av rör tillsätt 0,4 g guanidiumhydroklorid, 27 μL 5M natriumklorid och 3 μL 2,5 M imidazol (pH = 8). Observera att imidazolens pH måste vara 8. Detta är avgörande för att upprätthålla RNA-integritet.
    3. Tvätta dessutom den nödvändiga volymen nickelpärlor i WB I 3x. Använd 100 μl flytgödsel per prov. Efter den sista tvätten, återsuspendera pärlorna i samma ursprungliga volym WB I och förvara på is.
  6. När TEV-uppslutningen är klar, samla supernatanten med ett magnetiskt ställ för anti-FLAG-pärlor eller centrifugering för IgG-pärlor och överför till den första raden av rören som tidigare ställts in.
    1. Ta ett 50 μl prov av TEV-eluatet för Western blot-analys.
  7. Ställ in en termoblockinkubator på 37 °C. Till den andra raden av rör, tillsätt 1 μL RNase-cocktail (1:50 utspädning).
  8. Ta 550 μL TEV-eluat från den första raden av rör och tillsätt till den andra raden (innehållande RNase-cocktailen). Pipettera kraftigt för att säkerställa blandning.
  9. Efter att ha slutfört detta för det första provet, placera omedelbart röret i termoblocket och starta en timer. Gå vidare till de efterföljande proverna, så att var och en är förskjuten.
  10. Inkubera i exakt 5 min. När det är klart, ta bort det första provet från termoblocket och överför lösningen till den tredje raden av rör (innehållande guanidiumhydrokloridpulvret).
    OBS: En 5 minuters inkubation med en 1:50 utspädning av RNase-cocktailen är vanligtvis lämplig för de flesta proteiner, men detta steg måste noggrant optimeras med olika inkubationstider eller koncentrationer för varje protein för att säkerställa att de tvärbundna RNA: erna har rätt storlek (30-100 nt).
  11. Virvla omedelbart i några sekunder med full hastighet för att lösa upp guanidiumpulvret och fortsätt sedan till nästa prov.
  12. När alla prover har överförts till guanidiumpulvret, virvla igen för att säkerställa att allt pulver är helt upplöst.
  13. Tillsätt 100 μL tvättade nickelpärlor och rotera över natten vid 4 °C. Denna inkubation kan förkortas till 2 h.

4. Behandling av alkaliskt fosfatas på pärla

  1. Ställ in ett termoblock på 37 °C.
  2. Placera en reningskolonn i ett 2 ml rör, en för varje prov. Överför nickelpärlorna till kolonnerna och låt supernatanten rinna igenom. Se sedan till att alla nickelpärlor avlägsnades från 1,5 ml röret genom att skölja med WB I och applicera på kolonnen.
  3. Ställ in 2 ml rör, sex per prov (en för att samla upp varje tvätt). Håll utsidan av kolumnerna torra för att bibehålla flödet. Tvätta pärlorna 3x med 500 μL WB I och sedan 3x med 500 μL NP-PNK.
  4. Stäng locket på rotationskolonnen och snurra pärlorna kort för att ta bort överflödig buffert.
  5. Sätt proppen på kolonnen, sätt kolonnerna i 1,5 ml rör och tillsätt 60 μL av reaktionsblandningen som ses i tabell 2.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK-buffert 12 90
Alkaliskt fosfatas 4 30
RNashämmare 2 15
H2O 42 315
Slutlig volym 60 μL 450 μL

Tabell 2: Alkalisk fosfatasreaktionsblandning.

  1. Inkubera pärlorna i 1 timme vid 37 °C.
  2. Tvätta pärlorna 1x med 500 μL WB I för att inaktivera alkaliskt fosfatas och sedan 3x med 500 μL NP-PNK-buffert. Se till att noggrant skölja insidan av kolonnen med NP-PNK-bufferten för att ta bort eventuella spår av guanidium.

5. On-bead ligering av App-PE-länkaren till 3'-änden av RNA

  1. Snurra ut den återstående bufferten och tillsätt 60 μl av blandningen som anges i tabell 3 (se tabell 4 för App-PE-sekvensen) i kolumnerna. Inkubera reaktionen i 6 timmar vid 25 °C.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK-buffert 12 90
App-PE-adapter (100 μM) 0.6 4.5
T4 RNA-ligas 2 trunkerad K227Q 3 22.5
RNashämmare 1.5 11.25
50% PEG 8000 12 90
H2O 30.9 231.75
Slutlig volym 60 μL 450 μL

Tabell 3: App-PE-länkningsreaktionsreaktionsblandning.

Oligonukleotidnamn Sekvens (5'-3')
L5Aa invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArGrCrN-OH
L5Ab invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrUrArGrCrN-OH
L5Ac invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrGrCrArGrCrN-OH
L5Ad invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrCrUrUrArGrCrN-OH
L5Ba invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5Bb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrGrUrGrArGrCrN-OH
L5Bc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrArGrCrN-OH
L5Bd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH
L5Ca invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5Cb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrGrArUrCrUrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH
L5Cc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrUrCrArGrCrN-OH
L5Cd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH
L5Da invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrUrGrArUrN-OH
L5Db invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrArCrUrArN-OH
L5Dc invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrArGrUrGrCrN-OH
L5Dd invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrCrArCrGrN-OH
L5Ea invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5Eb invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5Ec invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5Ed invddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PE App-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

Tabell 4: De sekvenser av DNA- och RNA-adaptorer som krävs för ligering på 5'- och 3'-ändarna av fångade RNA. Dessa renades genom RNase-fri HPLC.

  1. Tvätta pärlor 1x med 500 μL WB I och 3x med 500 μL NP-PNK-buffert. Sätt kolonnen i ett nytt rör och snurra ut den återstående bufferten.

6. Fosforylering på pärlan av RNA: s 5'-ändar

  1. Tillsätt 80 μl av den blandning som anges i tabell 5 till kolonnerna. Inkubera reaktionen i 40 minuter vid 37 °C.
    OBS: Proverna kommer nu att vara mycket radioaktiva. Således bör allt efterföljande arbete utföras bakom en skyddande skärm och avfall ska kasseras enligt lokala hälso- och säkerhetsregler.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK-buffert 16 120
32P-ɣATP (10 μCi/μL) 3 22.5
T4 PNK 3 22.5
H2O 58 435
Slutlig volym 80 μL 600 μL

Tabell 5: Fosforyleringsreaktionsblandning.

  1. Tillsätt 1 μl 100 mM ATP och låt reaktionen fortsätta i ytterligare 20 minuter. Detta kommer att se till att nästan alla 5'-ändar har fosfater för att underlätta ligering av 5'-länkaren.
  2. Ställ in 2 ml rör, fem per prov.
  3. Tvätta pärlor 1x med 500 μL WB I och 3x med 500 μL NP-PNK-buffert. Observera att dessa elueringar kommer att vara mycket radioaktiva och därför bör kasseras på lämpligt sätt.
  4. Flytta kolonnen till det sista röret och snurra ut den återstående bufferten.

7. On-bead ligering av 5'-länkaren

OBS: 5'-länkarna innehåller en RNA-streckkod som används för identifiering av varje prov efter sekvensering. Således är det absolut avgörande att notera vilken länkare som används för vilket prov.

  1. Tillsätt 78 μl av den blandning som beskrivs i tabell 6 till kolonnerna. Tillsätt 2 μl 5'-adapter (100 μM, se tabell 4) till varje rör och inkubera över natten vid 18 °C.
Komponent 1x 7,5x
5 x PNK-buffert 16 120
ATP (10 mM) 8 60
RNashämmare 2 15
T4 RNA-ligas 4 30
H2O 48 360
Slutlig volym 78 μL 585 μL

Tabell 6: 5' länkligeringsreaktionsblandning.

  1. Följande dag, tvätta pärlor 1x med 500 μL WB I och 3x med 500 μL WB II och överför kolonnerna till ett nytt 2 ml rör.

8. Elution, SDS-PAGE och RNA-extraktion

  1. Ställ in centrifugen på 4 °C. Bered två rader med 1,5 ml rör per prov för eluering.
  2. Snurra ut kolonnernas tomrumsvolym med nickelpärlor med ett snabbt snurr. Placera kolonnerna i den första raden av elueringsrör och tillsätt 200 μl elueringsbuffert. Vänta 2 minuter och tvinga sedan bufferten genom kolonnen med ett snabbt snurr.
  3. Flytta kolumnerna till den andra rörraden och upprepa steg 8.2. Varje prov kommer nu att ha totalt 400 μL eluat, fördelat på två 1,5 ml rör.
    1. Ta alla eluater och överför dem tillsammans till ett 5 ml rör. Tillsätt 2 μl 20 mg/ml glykogen. Således, om man använder sju prover, kommer det nu att finnas 2,8 ml poolat eluat i 5 ml-röret.
  4. Tillsätt 100 μl triklorättiksyra (TCA) per prov [t.ex. 700 μl TCA för 7 prover (2,8 ml poolat eluat)] till 5 ml röret och virvelbrunn i 30 sekunder.
  5. Inkubera på is i 20 min.
  6. Centrifugera i 30 minuter vid 17 000 x g, 4 °C, i en bänkcentrifug.
  7. Ta försiktigt bort supernatanten från det koniska röret, kontrollera pipetten med en Geiger-räknare för att säkerställa att pelleten inte har tagits bort av misstag. Om så är fallet, sätt tillbaka supernatanten i röret och centrifugera i ytterligare 10 minuter.
    OBS: Supernatanten kan fortfarande vara mycket radioaktiv. Se till att använda korrekt avskärmning.
  8. Resuspendera pelleten helt i 2 ml iskall aceton.
  9. Centrifugera i 15 min vid 17 000 x g, 4 °C.
  10. Ta bort så mycket av acetonen med en P1000-pipett som möjligt. Snurra sedan röret kort för att samla små droppar aceton och ta sedan bort med en P10-pipett. Torka i 2 min i dragskåp.
    OBS: Acetonsupernatanten kan fortfarande vara radioaktiv. Se till att använda korrekt avskärmning.
  11. Resuspendera provet i 30 μL 1x proteinladdningsbuffert. För att säkerställa att pelleten är ordentligt resuspenderad, kontrollera att den stora majoriteten av radioaktiviteten nu finns i laddningsbufferten och inte kvar i 1,5 ml-röret genom att ta bort lösningen i en P200-pipett och mäta aktiviteten kvar i 1,5 ml-röret med en Geiger-räknare.
  12. Värm provet i 10 minuter vid 65 °C. Fyll på en 1 mm, 4–12% prefabricerad Bis-Tris-gel och kör i 1,5 h vid 125 V i MOPS-buffert.
  13. När gelén har slutat springa, öppna gelkassetten. Gelén ska behållas på bottenplattan. Kassera toppen.
  14. Slå in gelen i plastfolie och fäst den sedan med tejp på insidan av en ljustät kassett. Se till att kassetten har en förstärkningsskärm för att förbättra signalen.
  15. Exponera en autoradiografisk film för gelén och förvara kassetten vid -80 °C under exponeringen. Exponeringstiden varierar mellan proteiner med olika tvärbindningseffektivitet.
    1. När du placerar filmen måste det finnas ett sätt att justera den till kassetten för att klippa ut bandet av intresse i nästa steg. För att säkerställa detta, använd en fluorescerande linjal och se också till att gelén är i ett hörn av kassetten, som sedan täcks av filmen som också placeras i det yttersta hörnet.
      OBS: Som en tumregel ger eluater i laddningsbuffert som ger en avläsning på minst ~ 250 cps när de visas på en Geiger-räknare tillräcklig signal för en exponering på 3 timmar. Annars utförs exponering över natten.
  16. Utveckla filmen. Klipp bort plastfilmen som täcker gelén men rör inte gelen. Annars kommer bilden att förskjutas från gelén.
    OBS: Gelén kommer sannolikt att vara mycket radioaktiv. Se till att använda korrekt avskärmning när du skär ut gelskivan.
  17. Placera filmen över gelén och punktmarkera bandet av intresse. Lägg gelskivan i ett 2 ml rör.
  18. Krossa gelskivan med en P1000-pipettspets och tillsätt 600 μL proteinas K-buffert plus 200 μg proteinas K (detta protokoll använder 10 μL av en 20 mg/ml proteinas K-lösning). Inkubera i 2 timmar vid 55 °C med kraftig skakning.
  19. Skär sedan av änden av en P1000-spets med en ren skalpell och överför supernatanten och gelbitarna till en snurrkolonn placerad i ett 2 ml rör.
  20. Snurra kolonnen i 1 min vid 17 000 x g vid RT. Samla upp genomströmningen, som innehåller de radioaktiva, isolerade RNA: erna.
  21. Utför en fenol: kloroformextraktion.
    1. Tillsätt 50 μL 3 M natriumacetat, pH = 5,2 och 500 μL fenol: kloroform och virvelbrunn. Snurra i 5 minuter vid 17 000 x g. Ta bort det vattenhaltiga toppskiktet och placera i ett nytt 1,5 ml rör.
    2. Tillsätt 500 μL kloroform och virvel kraftigt i 10-15 s. Snurra i 5 minuter vid 17 000 x g vid rumstemperatur. Ta bort vattenskiktet och placera det i ett nytt 1,5 ml rör.
    3. Tillsätt 1 μL 20 mg/ml glykogen och 1 ml iskall 96 % etanol. Fäll ut i 30 minuter vid -80 °C eller över natten vid -20 °C.
    4. Centrifugera i 30 min vid 4 °C, 17 000 x g. Ta bort supernatanten, tillsätt 500 μl 70 % etanol och centrifugera i 5 min, 4 °C vid 17 000 x g. Ta bort all etanol, utför en snabb snurrning för att samla rester och ta bort överskott med en P10-pipett.
    5. Torka pelletsen i ~ 3 minuter i en dragskåp. Återsuspendera i 20 μl DEPC-behandlat vatten.
  22. Förvara RNA vid -80 °C över natten eller fortsätt omedelbart till det omvända transkriptionssteget.

9. Omvänd transkription

  1. Tillsätt 2 μL 10 μM RT-oligo (PE_reverse; se tabell 7) och 4 μL 5 mM dNTP till 20 μL RNA.
Oligonukleotidnamn Sekvens (5'-3')
P5 framåt AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
BC1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTCTCTTCCGATCT
BC3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTCTCTTCCGATCT
BC4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTCTCTTCCGATCT
BC8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PE_reverse CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabell 7: PCR-primrar (inklusive streckkodssekvenser) och primer för omvänd transkription.

  1. Överför till ett förvärmt termoblock vid 85 °C i 3 minuter och kyl sedan på is i 5 minuter. Samla upp innehållet i röret genom kort centrifugering och tillsätt sedan 8 μl 5x omvänd transkriptasbuffert, 2 μL 100 mM DTT och 2 μL RNas-hämmare.
  2. Inkubera blandningen vid 50 °C i 3 minuter och tillsätt sedan 2 μl omvänt transkriptas och inkubera i 1 timme vid 50 °C.
  3. Inaktivera omvänt transkriptas genom inkubation vid 65 °C i 15 minuter.
  4. Överför rören till ett förvärmt termoblock vid 37 °C och låt verka i 3 minuter för att acklimatisera sig.
  5. Tillsätt 2 μl RNas H och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
  6. Isolera cDNA med SPRI-pärlor.
    1. Tillsätt två volymer 84 μL pärlor. Inkubera i 15 minuter. Lägg pärlorna på ett magnetiskt ställ och låt stå i 1 minut för att skörda pärlorna.
    2. Ta bort och kassera supernatanten och tillsätt 200 μl 70 % etanol. Ta inte bort pärlorna från magnetstället. Inkubera pärlorna med etanolen i 30 sekunder.
    3. Ta bort etanolen och upprepa tvättsteget. Ta bort all kvarvarande etanol med en P10-spets.
    4. Lägg pärlorna i en dragskåp i 2 minuter för att torka dem. Ta bort pärlorna från stället, suspendera dem igen i 12 μL vatten och lägg sedan tillbaka pärlorna på stället. Ta bort 11 μl supernatant.
  7. Frys cDNA vid -20 °C eller fortsätt omedelbart till PCR-steget.

10. qPCR-reaktion

  1. Före den slutliga PCR för amplifiering av cDNA utförs en kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för att identifiera det optimala antalet cykler för amplifiering av cDNA för att förhindra överamplifiering av biblioteket.
  2. Ställ in en qPCR-reaktion på is enligt tabell 8. Se tabell 7 för alla primers.
Komponent 1x
2x qPCR-reaktion mastermix 5
0,1 μM P5 primer (framåt) 0.8
0,1 μM BC primer (omvänd) 0.8
cDNA (eller vatten som en negativ kontroll) 1
H2O 2.4
Slutlig volym 10 μL

Tabell 8: qPCR-reaktionsblandning.

  1. För korrekt kvantifiering av de cykler som behövs för amplifiering, använd tre tekniska replikat för cDNA och tre negativa (dvs. vatten) kontroller.
  2. Försegla plattorna med optiskt transparent film och kör qPCR enligt kittillverkarens anvisningar.
  3. Analysera proverna genom en absolut kvantifieringsmetod för att identifiera antalet cykler (n) vid vilka knäet för exponentiell tillväxt uppnås (se figur 4C för ett exempel). Detta antal cykler används sedan för den slutliga förstärkningen av resten av cDNA.

11. PCR-reaktion och gelextraktion

  1. Ställ in PCR-reaktionen på is enligt tabell 9. Se tabell 7 för alla primers.
    OBS: Endast 5 μL av cDNA-biblioteket används.
Komponent 1x
10 x polymerasbuffert för korrekturläsning 5
10 μM P5 primer (framåt) 1
10 μM BC primer (omvänd) 1
5 mM dNTP 2.5
Korrekturläsning av polymerasenzym 1
cDNA 5
H2O 34.5
Slutlig volym 50 μL

Tabell 9: PCR-reaktionsblandning.

  1. Kör PCR enligt följande: 95 °C i 2 minuter; n cykler vid 98 °C i 20 s, 52 °C i 30 s och 72 °C i 1 min, och 72 °C i 5 min. Antalet (n) cykler för amplifiering av χCRAC-biblioteket bestäms av qPCR som beskrivs i avsnitt 10.
  2. Tillsätt 1 μl exonukleas I och inkubera vid 37 °C i 60 minuter.
  3. Rengör det förstärkta cDNA med SPRI-pärlor enligt beskrivningen ovan med två volymer pärlor (dvs. 100 μL). Eluera i 11 μL.
  4. Tillsätt 3 μL 6x laddningsfärg och kör på en prefabricerad 6% TBE-gel vid 100 V i 1 h i 1x TBE-buffert. Använd en stege som är lämplig för kvantifiering av korta DNA-fragment.
  5. När du är klar, ta bort gelen från kassetten och placera den i en lämplig, vätsketät behållare med tillräckligt med 1x TBE för att täcka gelen (t.ex. ~ 50 ml). Tillsätt en lämplig mängd SYBR-säkert färgämne (använd t.ex. 5 μl 10 000x färgämne för 50 ml)
  6. Låt gelen färga av sig genom försiktig blandning i 15 minuter vid rumstemperatur. Töm SYBR-innehållande 1x TBE och ersätt med ren 1x TBE. Tvätta gelen i 10 minuter med försiktig skakning vid rumstemperatur.
  7. Töm 1x TBE och lägg gelen i en genomskinlig mapp. Klipp ut mappen till lämplig storlek.
  8. Avbildar gelen på lämpligt sätt, t.ex. en fosforbildare. Punktskatte-DNA-fragment mellan ~ 175 bp och ~ 400 bp. Lägg gelskivan i ett 1,5 ml rör.
  9. Krossa gelskivan noggrant med en P1000-spets och tillsätt 400 μLH2O. Inkubera vid 37 °C med skakning i 1 timme i ett termoblock.
  10. Frys provet på torris i 10 minuter och lägg sedan tillbaka i termoblocket vid 37 °C under skakning i 1 timme.
  11. Skapa en filterenhet genom att ta en filterkolonn och sätta in två glasmikrofiberfilter inuti. Placera enheten i ett 1,5 ml rör.
  12. Skär av änden på en P1000-spets med en ren skalpell och ta upp den krossade TBE-gelsuspensionen och fördela sedan i filterenheten som skapades i steg 11.12. Snurra vid 17 000 x g i 30 sekunder.
  13. Tillsätt 1 μL glykogen till supernatanten, tillsammans med 40 μL natriumacetat, pH = 5,2 och 1 ml 96% etanol. Inkubera vid -80 °C i 30 minuter.
  14. Centrifugera i 30 min vid 17 000 x g, 4 °C. Kassera supernatanten och tvätta med 500 μl 70 % etanol.
  15. Snurra i 5 min, ta bort etanolen helt och torka sedan pelletsen i en dragskåp i 3 min.
  16. Resuspendera i 10 μlH2Ooch mät DNA-koncentrationen.

Representative Results

För att demonstrera effekten av χCRAC-metoden utfördes ett tidsförloppsexperiment med jäststammar som uttryckte ett HTP-märkt Nrd1-protein. En detaljerad schematisk representation som beskriver hur metoden fungerar finns i figur 1. Liksom Nab3 är Nrd1 involverad i nukleärt RNA-sönderfall av en mängd olika RNA-transkript37. Tidigare arbete från Corden-laboratoriet föreslog att Nrd1-bindning till dess RNA-mål förändras signifikant när celler utsätts för glukossvält28,38. Som sådan flyttades celler som växte exponentiellt i medium innehållande glukos (SD-TRP) till samma medium utan glukos (S-TRP) under en tidsförlopp för att övervaka dynamiska förändringar i Nrd1-RNA-interaktioner. Prover togs och tvärfästes i vari-X-länkkammaren (figur 3A) före skiftet och sedan efter 1, 2, 4, 8, 14 och 20 minuter. Mediet som användes för celltillväxt var medvetet bristfälligt i tryptofan för att minska UV-absorptionen av denna aromatiska aminosyra. Observera att det är bäst att använda syntetiskt medium som är filtersteriliserat eftersom autoklavering av mediet kan leda till karamellisering av sockerarterna. Detta minskar sedan tvärbindningseffektiviteten.

Figur 4A visar en representativ autoradiograf från ett χCRAC-experiment. Observera att i det här exemplet har exemplen inte slagits samman. Istället kördes var och en individuellt på gelén. Detta rekommenderas för inledande experimentella tester för att visa att proteinet tvärbinder effektivt till RNA vid alla testade tidpunkter. En särskilt intensiv signal observerades vid den förväntade molekylvikten för RBP, vilket representerar proteinet bundet till mycket korta, radioaktivt märkta RNA som inte är mottagliga för sekvensering. Därför isolerades smetsignalen ovanför detta band, vilket är proteinet tvärbundet till längre RNA-fragment. Fragmentet skars från strax ovanför proteinbandet plus cirka 30 kDa. Figur 4B visar ett autoradiogram efter excision, med proteinet tvärbundet till korta RNA kvar i gelén och den tidigare utstrykande signalen nu utskuren.

Efter omvänd transkription måste cDNA-biblioteket amplifieras med PCR. Överamplifiering av biblioteket måste dock undvikas eftersom detta kan introducera bias mot sekvenser som företrädesvis förstärks av polymeraset och generera PCR-artefakter. Överförstärkta bibliotek innehåller också ett stort antal dubbla sekvenser som slösar bort läsningar på sekvenseraren. För att beräkna det ideala antalet PCR-cykler för amplifiering av det slutliga biblioteket amplifierades en alikvot av cDNA genom qPCR med användning av P5- och BC-oligonukleotiderna. Den första cykeln där biblioteket nådde toppfluorescens valdes som PCR-cykelräkning. Figur 4C ger ett exempel på en qPCR från ett typiskt cDNA-bibliotek, vilket gav ett toppcykelantal på 16. Detta värde användes sedan för den slutliga χCRAC PCR. För att bearbeta sekvenserade data använde vi programvara som tidigare utvecklats i vårt labb (pyCRAC) och motsvarande pipeline för analys av kinetiska CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Dessa programvaruverktyg med öppen källkod möjliggör demultiplexering och trimning av data, borttagning av PCR-dubbletter, identifiering av statistiskt signifikanta toppar, klusterläsningar i sammanhängande sekvenser och identifiering av bindningsmotiv39. Mer information om hur dessa verktyg fungerar finns på deras respektive webbsidor.

Vi började också utveckla ett χCRAC-protokoll för däggdjursceller. Majoriteten av däggdjurens cellinjer odlas som ett monolager och brickan i vår tvärbindare med den UV-genomsläppliga påsen är inte lämplig för experiment med vidhäftande celler. För att övervinna detta problem utvecklade vi ett stadium där användare kan UV-bestråla 1–2 petriskålar (150 mm diameter och 25 mm djup) med vidhäftande celler (figur 3B). Som ett första test mättes tvärbindningseffektiviteten för däggdjursceller genom tvärbindning och infångning av stabilt märkt GFP-RBM7 med hjälp av anti-GFP-antikroppar och en traditionell CLIP-baserad rening. Som visas i figur 5A kunde tvärbindaren återvinna protein-RNA-komplex från däggdjursceller odlade som ett monolager med 254 nm UV-bestrålning vid effektivitet som är jämförbar med en allmänt använd UV-bestrålningsanordning. Standardcellodlingsplastvaror som normalt används för UV-tvärbindningsexperiment är emellertid ogenomträngliga för 254 nm UV. Därför skulle cellerna i vår tvärbindare endast få bestrålning från den övre stranden av UV-lampor. För att övervinna detta utvecklade vi en UV-permeabel kvartspetriskål för celltillväxt och tvärbindning. Användning av kvartsodlingskärl visade robust återvinning av protein-RNA-komplex med så få som 2 s UV-bestrålning (figur 5B). I kombination med RBP-infångningsmetoder för däggdjursceller, såsom CLIP-teknik, är dessa korta tvärbindningstider mottagliga med tidsförlopp för att återställa spatiotemporala RNA-bindande profiler av RBP som svar på genotoxiska påfrestningar eller snabba uttömningar av proteinfaktorer, eller parallellt med transkriptionell eller cellcykelsynkronisering.

Figur 6 visar flera exempel på Nrd1-data som bearbetas av χCRAC-pipelinen. Den här figuren har tagits fram med hjälp av bedgraph-filerna som genererades av pipelinen och python GenomeBrowser-paketet (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi utformade för att förenkla skapandet av genomwebbläsarbilder av data av publikationskvalitet. De grå rektanglarna representerar genomiska regioner som uttryckte icke-kodande RNA, såsom kryptiskt instabilt transkript (CUT), stabila okarakteriserade transkript (SUT)40 och Xrn1-känsliga instabila transkript (XUT)41. Data i figur 6 visar att Nrd1 binder till många av dessa icke-kodande RNA-transkript, vilket överensstämmer med tanken att detta protein är involverat i nedbrytning av denna klass av transkript42. Figur 6A visar en ~ 15 kb region på kromosom IV. Här sågs en signifikant ökning av bindningen av Nrd1 till transkript som kodar för glukostransportörerna HXT6 och HXT7 med hög affinitet, vilka båda är uppreglerade under glukossvält. Det är troligt att transkriptionsavslutning av NNS-komplexet kan påverka induktionskinetiken hos dessa gener under glukossvält. Figur 6B visar ett exempel på Nrd1-tvärbindning till Imd3-transkriptet, som är känt för att regleras av Nab343. I detta fall visade data en signifikant minskning av bindningen vid glukossvält. Tidigare arbete visade minskad bindning av Nab3 till Tye7-transkriptet under glukossvält44. I överensstämmelse med denna observation tyder χCRAC-data på att bindningen av Nrd1 minskade under glukossvält och Nrd1-tvärbindningen till Tye7 var som lägst efter 8 minuters stress (figur 4C). Det verkar dock som om denna effekt endast var övergående, för efter 14 minuters glukossvält gick Nrd1-bindningen tillbaka till startnivåerna.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av χCRAC-protokollet. Märkta stammar odlades tills önskad densitet. RBP indikerar RNA-bindande protein. Därefter togs ett referensprov och tvärfästes med 254 nm UV-ljus. De återstående cellerna skördades genom filtrering och skiftades sedan snabbt till det spänningsinducerande mediet. För χCRAC-experimentet som beskrivs här togs prover och tvärbands 1, 2, 4, 8, 14 och 20 minuter efter skiftet (1). RBP av intresse renades sedan med hjälp av en mycket sträng tvåstegs affinitetsrening (2). Därefter smältes de fångade tvärbundna RNA: erna delvis med RNaser, radiomärkta i 5'-änden och adaptrar ligerades på dem (3). 5'-adaptrarna innehöll unika "in-read" streckkodssekvenser så att de enskilda proverna kunde separeras bioinformatiskt efter sekvensering. RBP-RNA-komplexen eluerades, poolades och fälldes ut tillsammans (4), löstes av SDS-PAGE och visualiserades genom autoradiografi (5). Därefter klipptes en enda gelskiva innehållande den radioaktiva signalen strax ovanför huvudbandet, illustrerad med streckad röd ruta i autoradiografibilden, från gelén (5). Gelskivorna behandlades med proteas K och RNA extraherades därefter (6), omvandlades till cDNA och amplifierades genom PCR (7). PCR-steget introducerade ytterligare streckkoder (gult block introducerat av P7-oligo) så att många bibliotek kunde multiplexeras till ett enda körfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Tvärbindning och vakuumfiltrering. (A) Tvärbindaren. Cellsuspensionen hälls i en tratt längst upp till höger på maskinen (se även figur 3A för en närbild) och hålls i en UV-transparent påse i mittfacket. Denna påse flankeras av två fönsterluckor som förblir stängda tills användaren instruerar maskinen att starta bestrålningssteget. Cellerna bestrålas med UV-ljus från brickorna både ovan och under. Maskinen levereras med 254 och 365 nm UV-lampor, där den senare är tillämplig för PAR-CLIP-experiment. Maskinen manövreras via en pekskärmspanel längst upp till höger som gör att man kan kontrollera UV-dosering eller exponeringstid. B) Efter tvärbindning dräneras cellerna från maskinens vänstra sida. Cellsuspensioner återvinns genom vakuum och dräneras i en glaskolv där de därefter kan hällas i en vakuumfiltreringsanordning för skörd. c) Anordningar för vakuumfiltrering. Dessa öppnas och stängs via ett klipp och ett filter sätts in mellan det. Fyra filtreringsanordningar användes parallellt för mycket korta tidsserier för att inte förlora någon tid till följd av filterbyte. D) Efter filtrering dränerades mediesupernatanten i flaskor för senare bortskaffande. Ventiler installerades under vakuumfiltreringsanordningarna för att bibehålla vakuumet i systemet när filtret tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Tvärbindning suspenderad kontra vidhäftande celler. (A) Tvärbindningen med vari-X-linkerkammaren för suspensionsceller. Cellkulturen hälls i provinloppet (tratten) som ligger längst upp till höger på brickan. (B) Bricka som kan hålla petriskålar av plast eller kvarts för tvärbindning av vidhäftande celler eller små volymer suspensionsceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Förberedelse av bibliotek. (A) Exempel på ett autoradiogram från ett Nrd1-HTP χCRAC-experiment. Den starka, koncentrerade signalen representerar proteinet tvärbundet till mycket korta RNA, medan utstryket ovan representerar proteinet tvärbundet till RNA med tillräcklig längd för sekvensering. (B) Utstryket skars ut som visas i ett autoradiogram som tagits efter gelexcision. (C) En representativ qPCR från ett χCRAC cDNA-bibliotek. I detta exempel uppnåddes maximal amplifiering av cDNA vid 16 cykler. Således användes 16 cykler för den slutliga förstärkningen. Felstapeln representerar standardavvikelsen för tre tekniska qPCR-repliker. (D) Exempel på en fosforbild från ett cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. (E) cDNA-längd och kvalitetsanalys från en chipbaserad kapillärelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: iCLIP-experiment med högt RNas-test för att testa tvärbindning i däggdjursceller. Här visas autoradiogram från GFP-RBM7 iCLIP-experiment som testade effektiviteten av RNP-återhämtning över olika tvärbindningsenergier. Immunprecipitationar utfördes med användning av anti-GFP-antikroppar kopplade till magnetiska pärlor på tvärbundna celler som stabilt uttryckte GFP-RBM7. Immunfällningar inkuberades med höga koncentrationer av RNas I för att trimma associerade RNA till korta, enhetliga längder. RNP visualiserades genom 32P-märkning och SDS-PAGE och migrerades som ett definierat band, nära migrationen av det icke-tvärbundna proteinet. Kvantifiering indikerar resultaten av densitometriska analyser av radioaktivt märkt RBM7-RNA-signal normaliserad till anti-GFP western blot-signalen. (A) Tvärbindningstid för den vanliga UVP-tvärbindaren kontra vår tvärbindning (Vari-X-linker; VxL). (B) Tvärbindningstid för vår tvärbindning på kvarts (vänster) och plast (höger) kulturartiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Exempel på genomwebbläsardiagram som visar kraften hos χCRAC för att visa differentiell, tidsmässig bindning av Nrd1 till dess mål. Varje ruta visar diagram för enskilda genomiska regioner. Pilarna anger på vilken sträng generna är kodade (vänster pekande pil = minus sträng; höger pekande pil = plus sträng). Tidpunkterna (min) anges med t0, t1, t2 osv. på y-axlarna i varje delområde. Romerska siffror som anger kromosomerna och koordinaterna visas. (A) Vid glukosbrist binder Nrd1 två glukostransportörer med hög affinitet, HXT6 och HXT7, som båda är uppreglerade i detta tillstånd. (B) Nrd1 har observerats binda till Imd3, ett redan validerat mål för Nab344, med minskad intensitet efter glukossvält. (C) Nrd1-bindning av Tye7 uppvisar en dynamisk och övergående natur, som minskar efter glukossvält till ett minimum efter 8 minuters stress. Bindningen återgår emellertid därefter till basala nivåer efter 14 minuter. Läsningar normaliserades till "läsningar per miljon" (RPM; y-axel). Grå rutor anger regioner som kodar för icke-kodande RNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

χCRAC-metoden, i kombination med de nya tvärbindnings- och cellskördeanordningarna, har stor potential eftersom den är tillämplig på ett brett spektrum av modellorganismer och därför bör vara av allmänt intresse för RNA-fältet. Det finns många områden där χCRAC kan användas. Metoden skulle till exempel kunna användas för att mäta den hierarkiska sammansättningen av proteiner i stora makromolekylära komplex, såsom spliceosomen och ribosomen, vilket ofta involverar dynamiska interaktioner mellan proteiner och RNA-molekyler. Vi använder det nu också rutinmässigt för att övervaka interaktioner mellan RNA-sönderfallsfaktorer och deras substrat när celler utsätts för olika slags påfrestningar. Detta gör det möjligt för oss att bestämma i vilket skede av det adaptiva svaret dessa faktorer är mest aktiva, vilka substrat de binder till och hur dynamiska dessa interaktioner är. Sådana uppgifter bör göra det möjligt för forskare att avgöra varje faktors relativa bidrag till anpassningen till miljöförändringar.

χCRAC använder dubbla affinitetsreningstaggar (HTF eller HTP) för att rena proteinet under mycket stränga och denatureringsförhållanden. Detta säkerställer att det korenade RNA är mycket anrikat för RNA som kovalent korsbundet till proteinet av intresse. Att förlita sig på tillhörighetstaggar har dock nackdelar. Till exempel kan taggen störa proteinfunktionen, vilket kan ge en förvrängd avläsning av dess RNA-bindande interaktom. Dessutom kan det för vissa modellorganismer inte alltid vara möjligt att använda taggar eftersom de genetiska verktygen för att integrera DNA-fragment i genomet eller för att omvandla expressionsplasmider ännu inte är tillgängliga. Det är dock enkelt att ändra vissa delar av χCRAC-protokollet för att göra det kompatibelt med CLIP-baserade protokoll som förlitar sig på antikroppar för rening av RBP. Faktum är att denna studie visade att det är möjligt att kombinera iCLIP-baserade reningar med vår tvärbindare. Vi är nu i färd med att utveckla CLIP-protokoll för att studera den tidsmässiga associeringen av humana RNA-bindande proteiner med begynnande RNA-transkript.

Vid χCRAC på ett nytt protein måste UV-exponeringen optimeras för att inducera maximal tvärbindning. Detta är viktigt eftersom höga UV-exponeringar kan minska återhämtningen av RNA under reningssteget. Celler som uttrycker den rekombinanta RBP exponerades för olika UV-doser, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 och 1 J/cm 2. RNP fångades sedan och RNA fragmenterades och radiomärktes. Därefter löstes RNP: erna av SDS-PAGE och ett autoradiogram togs för att härleda vilken exponering som gav den mest intensiva signalen (dvs. maximal tvärbindning).

När experimentella förhållanden har optimerats rekommenderas flera kontrollexperiment när χCRAC utförs. Först kan ett UV-bestrålat, omärkt prov användas för att övervaka bakgrundsbindningen till reningspärlorna. För det andra, när χCRAC appliceras under ett skiftexperiment, möjliggör en andra tidsserie där cellerna flyttas tillbaka till det ursprungliga mediet undersökning av huruvida filtreringen av cellerna i sig inducerar förändringar i RNA-nivåer eller protein-RNA-interaktioner.

Som nämnts i inledningen föreslår många nyligen publicerade artiklar ett antal optimeringar av CLIP-protokollet. Detta inkluderar användning av fluorescerande märkta adaptrar för detektering av protein-RNA-komplexet genom infraröd skanning10 samt optimeringar av olika nukleinsyrarening och storleksvalsteg som visat sig öka komplexiteten hos de resulterande biblioteken 12,45. Vi implementerar för närvarande några av dessa förbättringar för att ytterligare förfina χCRAC-protokollet. Protokollet som presenteras här innehåller redan ett antal förbättringar av de ursprungliga CRAC- och χCRAC-protokollen som ökar komplexiteten hos data. Till exempel, tidigare, efter att ha löst de tvärbundna, radioaktiva protein-RNA-komplexen på SDS-PAGE-geler, överfördes de till ett nitrocellulosamembran och det tvärbundna RNA isolerades från fläcken. Överföringen av RNP och efterföljande RNA-extraktion kan emellertid vara mycket ineffektiv, särskilt när det handlar om stora RBP såsom RNA-polymerasunderenheter. Detta kan resultera i en signifikant minskning av återhämtningen av det tvärbundna RNA. I det nuvarande protokollet extraheras det tvärbundna RNA direkt från SDS-PAGE gelskivor som illustreras i figur 1. Detta ökade återhämtningen av tvärbundna RNA. Dessutom, efter PCR-amplifiering av cDNA: erna löstes produkten ursprungligen på 3%, agarosgeler med låg smälttemperatur och sedan extraherades 175–300 bp PCR-produkter från gelén. Dessa geler kan emellertid lätt överbelastas, vilket resulterar i mycket dålig separation av DNA. Att ersätta agarosgeler med prefabricerade TBE-geler resulterade i en jämnare storleksseparation och bättre återvinning av PCR-produkter.

Disclosures

A. Langford och W. Worboys är anslutna till UVO3, ett kommersiellt företag. De hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning, eller beslutet att skicka in arbetet för publicering.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från Wellcome Trust (091549 till S.G och 109093/Z/15/A till S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) och Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 till S.G.), European Molecular Biology Organization under ett långsiktigt postdoktoralt stipendium (ALTF 1070-2017 till R.A.C), och Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369 (2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632 (2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49 (2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12 (2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité? Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8 (2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

Tags

Biokemi utgåva 159 CRAC CLIP RNA-proteininteraktion UV-tvärbindning teknik stressrespons tidsupplöst

Erratum

Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 02/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKellar, S. W., Ivanova, I., van… More

McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter