Summary
我们描述了一种在早期小鼠胚胎中分析微RNA的技术。该协议克服了低细胞输入和小RNA富集的挑战。此测定可用于分析早期小鼠胚胎不同细胞系中 miRNA 表达随时间变化。
Abstract
微RNA（miRNA）对于细胞命运决策和发育时间的复杂调控非常重要。由于细胞数量有限，对miRNA在早期发育过程中的贡献进行体内研究在技术上具有挑战性。此外，许多方法要求在测定中定义感兴趣的miRNA，如北方印迹、微阵列和qPCR。因此，在早期开发过程中，许多miRNA及其等构件的表达尚未被研究过。在这里，我们演示了早期小鼠胚胎中分类细胞的小型RNA测序方案，以便对早期神经峰细胞群中的miRNA进行相对公正的分析。在使用放大和凝胶纯化进行库准备期间，我们克服了低细胞输入和尺寸选择的挑战。我们确定胚胎年龄是复制和阶段匹配小鼠胚胎之间变化的变量，必须使用来准确描述生物复制中的miRNA。我们的结果表明，该方法可以广泛应用来分析来自细胞其他血统的miRNA的表达。总之，此协议可用于研究miRNA如何调节早期小鼠胚胎不同细胞系的发育方案。
Introduction
发育生物学的一个核心问题是，单个未分化的细胞如何产生具有众多复杂细胞类型的整个生物体。在胚胎形成过程中，细胞的发育潜力随着生物体的发展而逐渐受到限制。一个例子是神经峰系，它逐渐从多能细胞群分化成各种终端衍生物，如外周神经元、胶质、颅骨和软骨。在胃化过程中，从外皮细胞中指定神经峰细胞，然后进行上皮到中分质过渡，并通过胚胎迁移到整个身体的离散位置，在那里他们将最终区分1。数十年的工作已经发现了一个转录基因调控网络，但对控制神经峰发育时间的转录后调控机制却远为较少。
先前的研究表明，微RNA（miRNA）抑制基因表达，以适当的发育时间和细胞命运决定2,32，3，4，5，6。,4,5,6神经波峰发育中的miRNA研究主要集中在颅面发育的后期阶段。例如，miR-17×92和miR-140对小鼠和斑马鱼的颅面发育中古生平至关重要，分别是,7、8。miRNA对胚胎最早的神经峰命运决策的贡献尚未得到彻底调查。在早期命运决策中对miRNA的研究受到技术挑战的有限，例如早期胚胎中存在的细胞数量低。
MiRNA在体外被分析，从细胞系使用胚胎体在不同阶段的分化，以模型早期小鼠的发展9。在早期哺乳动物发育期间，对体内小型RNA的调查相对有限。以前对 miRNA 进行剖面分析的方法已导致偏差，因为已知序列用于分析方法（如 qPCR、微阵列和北部印迹10）中特定 miRNA 的表达式。下一代测序和不断改进的分子工具现在允许对miRNA表达进行相对公正的分析，以研究它们对早期哺乳动物发育和细胞命运决策的贡献。
在这里，我们报告一种技术，从早期小鼠胚胎（E7.5）到器官生成（E9.5）开始，在神经波峰细胞中表达的小RNA的收获和序列。此技术非常简单，结合了血统跟踪、细胞排序和基于凝胶的大小选择，以准备从最少数量的细胞中的小型RNA测序库进行下一代测序。我们强调严格胚胎的胚胎阶段匹配的重要性，以解决6小时的时间间隔，以获得在早期发育的快速变化中对miRNA的全面视图。该方法可广泛应用于遗传和发育研究，避免胚胎的集中。我们描述了一种克服当前方法的挑战的方法，例如使用基于凝胶的纯化、库定量和最小化从 PCR 引入的miRNA浓缩方法。这种方法已用于识别miRNA表达模式随着时间的推移，以研究miRNA如何控制发育时间在小鼠胚胎的神经波峰血统。
Protocol
所有研究和动物护理程序均获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准，并存放在贝勒医学院实验室动物护理评估和认证协会批准的动物设施中。所有菌株都保持在C57BL6背景。
1. 胚胎解剖 （E7.5-E9.5）
- 从怀孕的雌性小鼠上取下子宫角，用70%乙醇对腹部进行消毒，并在那里进行切口。
- 使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗来清洁子宫。将子宫放入无菌塑料10厘米的盘子中。
- 使用微切除剪刀，将每个含有区域的德奎亚彼此分开。剥下子宫肌，露出所有十分。一个个，从每个胚胎中去除十分多远。
- 从每个胚胎中去除蛋黄囊，并保存基因分型。
- 将所有胚胎放入新鲜 PBS 的新盘中进行成像。
- 以整个垃圾的图像。分别对每个胚胎进行成像，并计算每个胚胎的卵子数量。在实验之间保持放大和曝光（荧光）相同。
注：我们发现50-200ms的曝光足以进行荧光，20ms的暴露足以进行明亮的磁场设置。
2. 胚胎分离和细胞分选
- 对于要从中排序的每个胚胎，请执行以下操作。
- 对于年龄超过 E8.0 的胚胎，在 otic 质码正上方斩首（如果只需要需要颅骨区域的标记细胞）。对于 E7.5 胚胎，去除外质结构（如果只需要胚胎本身）。
- 将头以最小体积的 PBS 移动到 48 井板的清洁井中。添加 250 μL 的木瓜 （27 U/mL）。使用 p200 轻轻地上下移位。
- 在显微镜下检查并寻找团块和单细胞。
- 重复温和移液上下，直到实现单个细胞悬浮（通常三轮移液向上和向下，这应该相当于30秒至1分钟之间的E7.5-E9.5）。
- 用250μL的胎儿牛血清（FBS）淬火。
- 对要排序的每个胚胎重复步骤 2.1.1-2.1.5。
- 通过 35 μm 尼龙网滤盖管过滤 500 μL 的电池悬浮液，以去除团块。
- 采取过滤和移动到新的1.5 mL管和旋转在200 x g 5分钟。小心地去除上一液并转移到新管中（保存，直到已知活细胞在颗粒中）。
- 在含有0.5-1%牛血清白蛋白的300μLPBS中重新增加细胞颗粒，并一直冰上直到分拣（尽量减少从现在起和分拣结束的时间）。
- 如果需要，服用 10 μL 的细胞悬浮液，并结合 10 μL 的 Trypan 蓝色 （0.4%）并使用血细胞计来识别近似细胞的定量和生存能力，因为 Trypan Blue 只弄脏死细胞。
- 在分拣之前，通过滤芯管再次过滤每个样品，并添加活细胞的DAPI污渍。
- 将每个样品分拣成 70 μm 喷嘴的细胞分拣 器上的 RNA 提取解液 500 μL（参见材料表）。
- 在-80°C下混合和储存，直到收获所有样品。只有当采集实验所需的所有样本以减少库准备之间的技术差异时，才从这一点开始。
3. RNA提取
注：该协议由RNA分离试剂盒改编;请参阅 材料表。
- 在每个样品中加入500μL的RNA提取解液（ 参见材料表），使总体积为1000μL。
- 在室温下解冻每个样品。
- 在开始均质化之前，每个样品的涡流1.5分钟，确保盖子牢固地固定在每个管上。在室温（15~25°C）下孵育均质5分钟。
- 加入140μL的氯仿，盖管牢固，并大力摇动15s。在室温下孵育3分钟。
- 在 4 °C 下以 12，000 x g 的温度下离心 15 分钟。 将上水相转移到冰上新的收集管。不要转移任何相间或任何有机相。接近粉红色有机相时，将管子倾斜到一边，取出小等分，直到无法收集到明显的水相。
- 测量从每个样品中收集的含有水相的RNA体积，以在下一步进行正确的计算。
- 加入 1.5 体积（通常为 525 μL，但可能略多或少），100% 乙醇，通过移液彻底混合。
- 在 2 mL 收集管中，将高达 700 μL 的样品（包括任何沉淀物）放入柱中。在室温下，以 ≥ 8，000 x g 的 15 s 关闭盖子并离心机。丢弃流式。
- 使用示例的其余部分重复步骤 3.8。
- 根据制造商说明清洗柱。全速旋转1分钟，将柱部干燥。将柱转移到新的 1.5 mL 收集管。
- 移液 11 μL 的核酸酶自由水到膜的中心。让我们在室温下坐1分钟。旋转最大速度 1 分钟，以从柱子上滑出。
- 使用分光光度计和平行毛细管电泳仪测量RNA浓度（材料表）。
4. 图书馆编制
注：该协议改编自小型RNA库制备套件手册;请参阅 材料表。
- 使用 3' 适配器的 1/4 稀释，完成小型 RNA 库制备套件手册中所述的变性和 3' 适配器连接。
- 继续多余的 3' 适配器删除。
- 完成小RNA库准备套件手册中所述的适配器损耗。请务必使用新鲜准备好的 80% 乙醇进行珠子清理，并且所有多余的乙醇在无核酸酶水中重新吸收之前完全去除，而不会过度干燥珠子（在过度干燥时观察到珠子颗粒的裂解）。
- 直接转到多余的适配器失活。
- 完成多余适配器失活，如小型 RNA 库制备套件手册中所述，在冰上组装所有试剂。
- 继续 5' 4N 适配器连接。
- 完成 5' 适配器连接，如小型 RNA 库准备套件手册中所述，确保使用 5' 适配器的 1/4 稀释，并在冰上组装所有试剂。
- 继续转录。
- 完整的逆转录第一链合成，如小型RNA库准备套件手册所述，并注意将所有试剂组装在冰上，而不是长时间将酶留在冰柜外。
注：此时，协议可能会停止，样品在 4 °C 下隔夜存储。 或者继续 PCR 扩增。 - 通过组装小型RNA库制备试剂盒手册中规定的试剂，并最大限度地减少PCR周期，完成PCR扩增。应根据每个应用的实验确定 PCR 周期数，并且应使用最小周期数。在这里，我们使用了16个周期成功地放大了我们的小型RNA库。
- 直接进行大小选择。
5. 尺寸选择
- 在每个样品中，加入5μL的6x凝胶加载染料和移液器混合。
- 将 10 μL 的梯子装载到凝胶的第一个井中，使井立即空空。将所有产品从步骤 5.1 装载到 6% 的三酯/乙酰胺四乙酸 + 聚丙烯酰胺凝胶 （TBE-PAGE） 上，并在每个样品之间留下 1 个通道。
注：将凝胶进来的容器保留，以便执行后续步骤。 - 在 0.5 倍 TBE 运行缓冲液中以 150 V 的速度运行凝胶约 30-40 分钟（直到下部染料带靠近凝胶底部，0.5-1 厘米）。
- 在凝胶运行时制造 1 L 的染色溶液：SYBR 金在 0.5x TBE 中稀释 1：10，000。
- 当凝胶完成运行（即，下染料带靠近凝胶底部）时，请小心地从玻璃板上取下凝胶，注意凝胶的方向。
- 将凝胶放在其原始包装的托盘中。拆下 0.5x TBE，然后从步骤 5.5 中更换染色溶液。染色凝胶15分钟。染色时间可能需要增加。
- 将凝胶放在紫外线透光器上，注意不要撕裂凝胶并保持上述方向（如果无法清楚地看到梯子带，请重新染色以等待更多时间）。
- 使用相机在紫外线透光器上染色完成后对凝胶进行成像。
- 如果需要更好的图像，首先使用除紫外线透光器以外的成像设备来捕获凝胶的图像，然后再切断紫外线转光器上的带状光，因为直接在UV转光器上成像会导致背景的可变着色，如图 3A-B所示。不要移动凝胶太多次，因为它很细腻，可能会撕裂。
- 使用干净的剃须刀刀片识别和拆下 ±150 bp 带，并放入干净的 1.5 mL 管中。请勿切断 ±130 bp 频带（适配器二丁车产品）。
- 取出包含库产品的切片后，再次对凝胶进行图像，以便进行记录。
- 以最大速度旋转含有凝胶片的微离心管，以收集每个管底部的切片。
- 对每个样品使用 p200 尖端将凝胶片粉碎成尽可能小的位。将每个尖端喷射到每个管中。
- 在每个管上，加入300μL的洗脱缓冲液，注意从管的一侧清洗凝胶位，并重新连接p200尖端，并洗掉每个样品的尖端。
- 将孵化样品放在 25 °C 的摇培养箱中。 孵育过夜与1000 rpm震动。从培养箱中取出管子，在室温下以最大速度旋转 10 分钟。
- 将包含库产品的上一液转移到 2 mL RNase 无 96 井板中。注意不要转移任何凝胶。
- 将 50 μL 清洁珠添加到每个样品中，然后通过移液混合。立即加入350μL的异丙醇，通过移液混合。在室温下孵育10分钟，带摇。
- 脉冲旋转板颗粒珠，然后磁化2分钟。小心地取出并丢弃上一液。
- 加入950μL的80%乙醇。孵育30 s.卸下所有上一液。重复两次乙醇洗涤。
- 将样品干燥3分钟。在此步骤中，注意清除每个井底部收集的任何残留乙醇（不超过一次），并且不要过度干燥珠子（过度干燥将导致珠子颗粒开裂）。
- 清除井底的所有残留液体。从磁性支架上拆下板。
- 将颗粒重新在13μL的再增缓冲液中。通过移液器混合，直到均匀。孵育2分钟，然后磁化3分钟。
- 将 12 μL 的上清液转移到清洁管或清洁板井中，以便随后储存。将所有样品长期储存在4°C或-20°C。
- 使用毛细管电泳高灵敏度DNA测定，检查每个库中存在的片段的大小和浓度。使用多种方法确认浓度。
注：我们偶尔使用标准灵敏度套件，以避免毛细管电泳过载。
Representative Results
使用此处演示的程序，我们在 E7.5、E8.5 和 E9.5 采集了胚胎。从所有胚胎中去除外质结构，然后胚胎被舞台，以解决6小时的时间间隔（图1A-1B）。利用原理成分分析对基于相似性的样品进行分组，我们发现样品按年龄分组，突出了胚胎年龄的变化，以及生物复制需要仔细的苏米特匹配（图1C）。我们在E7.5分析多能性细胞，在E8.5使用Wnt1-Cre的血统和迁移神经波峰细胞，使用Sox10-Cre在E9.5（图1D）的迁移神经波峰细胞。在这里，我们专门收获颅神经波峰，斩首胚胎就在 otic 质码上方。经常用于标记神经峰细胞的两个 Cre-驱动程序（Wnt1 和 Sox10）的比较证实它们标记了早期小鼠胚胎中的不同种群（图 1E）。浇注策略用于获取活的单个 RFP 阳性细胞，这些细胞直接被分类到 RNA 提取解解溶液中（ 参见材料表），并储存在 -80 °C（图 1F ）。跟踪从每个样本中采集的细胞数量非常重要。
使用RNA试剂盒协议的修改版本进行RNA分离。具体来说，我们使用要储存在4°C的迷你RNA柱。 这些柱可用于小体积（11 μL）的吹水，以便从细胞输入有限的样品中获取RNA的最高浓度。出于同样的原因，在苯酚氯仿萃取后获得所有水相非常重要。缓慢移液和倾斜管到一侧，同时收集是至关重要的，以最大限度地提高产量。在这个程序中，我们使用分光光度计量化RNA，以获取有关盐/蛋白质污染的信息，以及用于测量浓度的毛细管电泳（图2）。分光光度计微量显示RNA被分离，没有污染蛋白，但含盐量高（图2A-2B）。理想情况下，260/280 比率应为 ±1.8，260/230 比率应为 >2.0。分光光度计测量的总RNA产量没有随着E8.5-E9.5之间的年龄增加而增加。这是因为分光光度计的分辨率不够灵敏，无法从我们正在采集的细胞数量中检测RNA浓度的变化，我们建议使用从毛细管电泳中获得的浓度信息（图2C）。毛细管电泳微量可用于估计RNA片段的浓度和大小。峰值<1000核苷酸是降解的指示。代表性的微量与未降解的RNA一致。2000核苷酸和5100核苷酸的峰值分别是18和28s rRNA。小RNA区域位于+150核苷酸（图2D）。
使用材料表中描述的小型RNA库制备试剂库制备了小型RNA 测序库。在这里，我们使用从每个样品获得的RNA的不到一半（11μL洗脱的4μL，+80-120ng），使RNA测序库能够从每个样品的剩余RNA合成。在这里，我们稀释 3' 和 5' 小 RNA 适配器 1/4，以降低适配器二丁字的量，并建议适配器连接、清理和逆转录步骤尽可能以连续方式完成。我们使用 16 个 PCR 周期来放大库，并建议根据经验确定任何实验的 PCR 周期的最小数量。通过完成多余的PCR周期，可以人为地增加低表达miRNA的读取计数。
大小选择对于 miRNA 库（而不是适配器二元）来说至关重要，而适配器二元组通常存在。库产品尺寸（150 bp）和适配器二床（130 bp）的大小非常相似。凝胶提取用于将小型RNA测序库与适配器二分位分离开（图3）。切除前 PAGE 凝胶的图像显示，每个样品中存在多种产品尺寸（图 3A）。在两个样品或装载到凝胶上的梯子之间保持一条车道打开非常重要。凝胶底部的迁移前部稍微弯曲，表示如果所有样品都难以区分 150 bp 波段，可能需要以较慢的速度运行。此代表性图像还显示，与进入每个胚胎样本的正对RNA（大鼠大脑总RNA）浓度较高，有150 bp的丰度。阴性对照显示试剂不含污染核酸的种类（图3A）。150 bp 带的切除应用干净的剃须刀刀片完成，收集的区域如图 3B 所示。毛细管电泳在尺寸选择之前和之后的痕迹显示，150 bp 库产品的纯度与凝胶纯化（图 3C-3D ） 的纯度有了显著改善。需要注意的是，图 3C-3D 中的轨迹的采样峰值高于标记，表示过载。在这些情况下，碎片的大小可能是准确的，但浓度可能不。可以通过将库稀释到标记范围或使用替代方法获得定量。我们发现图书馆量化的替代方法存在一些差异，并建议对多种定量方法进行经验测试。在最大化一次排序的样品数量时，精确定量浓度至关重要。库将被稀释到 1.3 pM 进行测序，通常 15-25 个样本的任意位置都可以在提供 1.4 亿次读取的 150 周期测序套件上一次对样本进行测序。这导致每个样本大约 500 万次读取。通常映射速率在 60-80% 之间。
图1：从小鼠胚胎中采集细胞，进行小RNA测序。（A） E8.5 小鼠胚胎，以突出用于确定小鼠胚胎的胚胎阶段的蛋黄囊和索米特的去除，以捕获从排序的野生型神经波峰细胞中准备的库的神经波峰发育阶段 （ C ） 原理成分分析，显示样本按年龄分组 （D） 方案图，显示样品在 E8.5 时如何使用 Wnt1-Cre 采集样本 在E9.5标记预生长和迁移神经峰细胞和Sox10-Cre，只标记从分类的野生型神经峰细胞中准备的迁移神经峰细胞（E） 原理成分分析，显示Cre-driver的样本组，而不考虑年龄（F） Gating策略，用于使用FACS排序从E8.5和E9.5胚胎中分离RFP® 神经波峰细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：从E7.5-E9.5小鼠胚胎分离的RNA。（A） 我们应用此协议的胚胎最年轻阶段的RNA分离的代表性分光光度计痕迹。（B） 表，显示从分光光度计获得的RNA质量的代表性值。（C） 从各年龄段的胚胎中分拣的神经峰细胞中采集的RNA（D）毛细管电泳微量示有良好质量RNA的例子。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在尺寸选择之前和之后，miRNA库。（A） TBE-PAGE凝胶显示代表性的小RNA库，用于150个基点带切除前的四个样本和对（B）和（B）的四个样本和对控。箭头表示小RNA库之前和（D）在尺寸选择之前要切除的150 bp波段（C）毛细血管电泳痕迹。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
发育过程可以快速进行，并且细胞正在经历许多顺序规范，以便全面了解有助于早期命运决策的 miRNA，需要比广泛使用的半天增量更具体的分期。最近的一项研究从 Theiler 阶段 12 胚胎中进行了 RNA 测序，这些胚胎的范围从 3 到 6 个索米特11。我们发现，在这段时间内，神经峰细胞被指定（3个年龄），去层（4索米年龄），并迁移（5-6索米的年龄）。我们还发现，除了用于血统跟踪细胞群的Cre-driver外，年龄是生物样本之间最大的变异源，只有与体膜匹配的胚胎才应被视为复制。在将转基因胚胎与野生型对控进行比较时，也应考虑这一点。
在早期开发过程中对miRNA进行剖面分析的方法已经使用10-100纳克的RNA输入进行小型RNA测序库制备，并将多个胚胎汇集到一个样本13，14,中。我们演示单个 E7.5 胚胎或 E8.5 和 E9.5 中分离神经峰细胞的 RNA 分离和库制备，使用约 100 ng 的总 RNA 作为输入。分离胚胎进行分选时，应注意在显微镜下观察分离，并淬火反应，以观察获得单细胞时的反应。我们发现，E8.5-E9.5胚胎颅区域的分离几乎是即时的，如协议中描述的温和手动移液。对于较大的组织和越来越老的胚胎，分离时间可能更长，这取决于胚胎分离的部分。对于 E7.5-E9.5 胚胎，在显微镜下很容易看到细胞团，分离应继续下去，直到不再可见团块。如果您在 5-10 倍的任何地方通过井中的解决方案调整焦点，单个单元在溶液中是可见的。以前的方法将细胞直接分拣成解解缓冲液，用于RNA测序，以制备来自低细胞14的散装RNA。在这里，我们直接分拣到RNA提取解解，以便RNA可以在库制备开始前被分离。使用具有 11 μL 洗脱体积的迷你柱，可以达到足够高的 RNA 浓度，因此单个 RNA 制备可以在小 RNA 和散装 RNA 测序之间分离。
大多数小型RNA测序方法的一个当前限制是转化cDNA的PCR扩增。我们的方法没有克服这一限制，但我们能够将 PCR 周期从建议的 25 个最大值缩短到 16 个周期。这种扩增的减少减少了PCR引入的人工放大偏置。另一个偏置源是适配器的连结，已知位于适配器末端的特定序列和 miRNA 可以与其他序列一起结合，效率更高。为了避免这种情况，此协议中使用的适配器在每个适配器的末尾包含 4 个随机基点，以防止结扎反应中出现偏差。此外，另一个常见问题是当RNA输入低时形成适配器的调子数量。库准备套件确实包括减少适配器暗淡形成的步骤，例如适配器失活和珠子清理，以在每次连接后删除多余的适配器。我们还将 3' 和 5' 4N 适配器稀释 1/4，以减少可形成适配器的稀释剂数量。我们发现，当不稀释时，130 bp 波段强度增加，因此很难区分凝胶上包含所需小 RNA 库的 150 bp 波段。
目前准备测序库的另一个挑战是测序前对产品进行精确量化。我们发现，不同的方法在同一库上给出不同的结果。我们建议研究人员使用多种定量方法获得对浓度的准确估计。
该协议可以广泛应用于遗传、发育研究或其他从低数量细胞中采集RNA的应用。这种方法通过避免胚胎的汇集简化了时间研究，并可以很容易地应用于非分拣和分拣细胞。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了安德鲁·麦克多诺B+基金会和NIH（R01-HD099252，R01-HD098131）的支持。 R.J.P. 是癌症研究 （RR150106） 的 CPRIT 学者和癌症研究 （V 基金会） 的 V 学者。作者还感谢BCM的Cytometry和细胞分拣核心为该项目提供必要的设备。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
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