Summary
組織クリアリングと光シート蛍光顕微鏡(LSFM)を組み合わせて、脳脊髄液(CSF)および脊髄硬膜外液を収集するリンパ管およびリンパ節(LN)の3次元および細胞分解能画像を得るプロトコルが提示される。
Abstract
中枢神経系(CNS)に関連するリンパ系には、脳、脊髄、および関連するRNの周りを回るリンパ管が含まれる。CNS関連リンパ系は、CNS-ドレインルンに向かうCSF高分子および髄膜免疫細胞の排出に関与し、それによってCNS組織内の廃棄物クリアランスおよび免疫監視を調節する。提示は、周囲の組織内の回路の完全性を維持しながら、CNS関連リンパ系の3次元(3D)および細胞分解能画像を取得するための新しいアプローチです。iDISCO+ プロトコルは、後にライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)で画像化される椎骨カラムのリンパ管を脱灰およびクリアされた全てのマウント調製物に免疫標識するために使用されます。この技術は、脊髄周囲の髄膜および硬膜外空間を椎体外リンパ管に接続するリンパネットワークの3D構造を明らかにする。提供される分子トレーサーの排水回路の3D画像は、以前に水槽マグナまたは胸部脊髄パレンチマを介してCSFに注入された。iDISCO+/LSFMアプローチは、神経血管生物学、神経免疫学、脳および椎骨癌、または椎骨および関節生物学におけるCNS関連リンパ系の構造と機能を探求する前例のない機会をもたらします。
Introduction
CNSはCSFに囲まれ、髄膜、硬膜外組織、および骨の層を重ね合わせている。全体として、CSFは柔らかい脳および脊髄に物理的な保護を提供する。それは主に脈絡叢と髄膜(すなわち、ピア・マーター、くも膜、および硬膜)によって分泌される。CSF-髄膜複合体はまた、CNS組織と身体の残りの部分との間に機能的なインターフェースを確立し、それによってCNS恒常性に寄与する。まず、CSFは、CNSパラ動脈空間を介してCNSパレンチマを貫通し、血管周囲の血管内腔およびアストロサイトの端足膜からなるリンパ管(グリアリンパ)系を介して間質流体(ISF)1と動的に相互作用する12、3、4。4,3リンパモデル,2,4によると、代謝廃棄物および過剰流体は、最終的には脳の気質から全身循環3に向かって直接壁内血管内排液によって、CSFに向かう静脈内空間と脳を排出するリンパ管を介して最終的にクリアされる。2,CSF流出は、主にリンパ系を介して、クリブリフォームプレートおよび関連する頭蓋外リンパ管5、6、7、6,7ならびに脳水流5LNs8、9、10、11、12で収束する髄膜リンパ管を介してである(図1)。8,9,1011,12重要な、二次的であるが、CSF流出における役割は、髄膜性静脈洞13のラクノイド絨毛を貫通する頭蓋くも膜絨毛によって取られる。
CFS排水回路は、CNSまたはCSFへの着色/蛍光トレーサーの注入に基づく実験的アプローチを通じて広範囲に調査され、続いてCNS内および注入後の異なる時点で全身のトレーサーパターンの画像化を行った。長い間、CSFの流出は、血液循環によって独占的かつ直接的に取られると考えられていたが、硬膜静脈洞13に突出するくも膜絨毛を介して。しかしながら、CSF流出は、マウス,9,10における近赤外(NIR)による近赤外(NIR)動的イメージングによる最近の示されるように、主にリンパ管構造によって行われる。9CSFを排出するリンパ管は、右鎖骨下静脈を介してリンパを血流に戻す。補相的なアロッホは、頭蓋外66、7、137,13および頭蓋内99、10、11、1210,11のリンパ出口の両方を検出し、CSF12が2つのリンパ経路(1つは外部およびもう1つは頭蓋骨および椎骨柱の内部)によって吸収されることを示唆している。CSFの排水の主要部分は、鼻粘膜の頭蓋骨の外側に位置するリンパ管を介して急速に起こり、エトモイド骨33、6、13、6,13および、完全に特徴付けられていない側側路を通る腰仙骨椎骨の外側の経路を介して7,7、14。また、頭蓋骨の髄膜において、硬膜直下のリンパ毛細血管は、頭蓋骨を横切ってCNS水切りLNs12,14,14に接続する硬直リンパコレクターに向けてCSFおよび髄膜免疫細胞を吸収する。これらの髄膜リンパ管は、脳の髄膜リンパ管が老化時に変化し、神経変性、神経炎症,、脳癌15、16、1716を含む神経学的脳疾患の結果にも影響を与えるため、CNS病態生理学15において重要な役割を果たす。17したがって、CNS関連リンパ管系(すなわち、CSFを排出する硬直および末梢リンパ管)は、ヒトにおけるCNS疾患と戦う有望な新しい標的となり得る。
免疫構造と高解像度の磁気共鳴画像法を用いて行われた収束研究は、髄膜リンパ系血管系が、一般的なマーモセットサルおよびヒト77、11、1311,を含む霊長類にも存在することを実証した。13また、髄膜リンパ管は頭蓋骨に限定されず、脊柱内に及び脊髄神経節とラミ13,18,18の表面まで延びる。脊椎柱リンパ管の3次元(3D)画像化は、上にある骨、筋肉、靭帯、ならびに隣接する内臓組織を含む、標識された椎骨および脊髄試料の全体的な解剖学を保存し、最近14を行った。iDISCO+プロトコル19,20を用いて、20膜受容体LYVE1 21または転写因子PROX122のいずれかに対するリンパ系特異的抗体を用いて脊椎柱全体の免疫標識およびクリアされた製剤を用いた。次いで、光シート蛍光顕微鏡(LSFM)およびイマリスソフトウェアを用いて画像取得と解析を行った。LSFMは、照明の軸性閉じ込めによって大きな標本の迅速かつ低侵襲的な3Dイメージングを可能にし、これは光漂白および光毒性23を低減させる。
iDISCO+/LSFMアプローチは、硬膜および硬膜外リンパ管の異なる層の特徴付け、および椎体外リンパ回路および脊椎列に隣接するRNへのこの血管系の接続を可能にする。このプロトコルは、脊椎管排水を実証するために、以前に蛍光トレーサーを注入した組織に適用された。本論文は、椎体リンパ管系をイメージするiDISCO+/LSFM方法論の詳細を提供し、CSFおよび硬膜外液排水調査との関連性を示す。
Protocol
この研究で使用されるすべての生体内手順は、実験動物の使用ガイドライン(L358-86/609EEC)のための欧州共同体に従って、動物実験および研究のための関連する倫理規則をすべて遵守した。この研究は、INSERMの倫理委員会(n°20161101111126651)とICMの制度的動物ケアと使用委員会(セルヴォー・エ・ド・ラ・モエル・エピニエール研究所)によって倫理的承認を受けました。
1. 準備
- 手術用の解剖ツールを準備します:メス(1)、マイクロフォースプス(2)、鉗子(1)、解剖はさみ、およびミシェル縫合クリップ。26G針(0.45mm x 13mm)、1mLシリンジ、10μLマイクロシリンジを用意します。
- ガラスマイクロピペットプーラーを使用して、67.5 °Cのシングルステッププロトコルでマイクロキャピラーを引っ張ります。注射ごとに2つのマイクロキャピラーを準備します。
- リンパドレナージの試薬を調製する(表1):オボアルブミンアレクサフルオール555コンジュゲート(OVA-A555、リン酸緩衝生理食塩水1xで2mg/mL)および抗LYVE1抗体(1mg/mL 1x PBS)を調製します。
- iDISCO+用に抗体を準備する (表 1) 。一次抗体の場合は、抗LYVE1ウサギポリクローナル抗体(1:1,600)および抗PROX1ヤギポリクローナルIgG抗体(1:2,000)を使用してください。二次抗体の場合は、Alexa Fluorロバ抗ウサギ-568、ロバ抗ウサギ-647、ロバ抗ヤギ-647(1:2,000)を使用してください。
2. 水槽内マグナ(ICM)および胸腔鏡(ThLb)注射の手術
- 手術のための動物の準備
- 8~12週齢の成人の雄と雌のC57BL6/Jマウスを使用してください。
- 0.015 mg/mLブプレノルフィン溶液を0.9%塩化ナトリウム0.1mg/kg、手術前15分に希釈して、腹腔内(IP)をマウスに注入します。
- 2~3%のイソフルランガスを用いて誘導ボックス内でマウスを麻酔します。
- トレーサーの注入のための麻酔動物の準備
- 麻酔マウスとその加熱パッドをステレオタックス装置に置きます。耳棒を使用してマウスの頭部を保持し、頭部に対して〜135°の角度で体を下ろすか、脊椎レベル(Th12-L1)で脊髄を脊椎アダプターで固定します。麻酔の効率を確認するために、鉗部で尾や足をつまむ。
- マウス水和のために0.9%塩化ナトリウムのIP 200 μLを注入してください。
- メスの刃を使用して、ICM注射のための頸部領域に向かって後頭部領域で、またはThLb脊髄質根に注射するためのThLb椎レベル(Th10-L3)のいずれかで皮膚切開を行う。
- トレーサー注入
- 頸部および柱を覆う寄縁筋と寄脊髄筋を捨てて、髄膜の最外層である硬膜の表面を視覚化する。
- 硬膜の中央部を慎重に穿刺し、26G針でくも膜を下敷きにする。
- マイクロキャピラリー移植
- ガラスキャピラリーチップの2mmをカットし(ステップ1.2を参照)、10 μLシリンジに連結したカニューレに接続されたマイクロキャピラリーを使用して、OVA-A555 またはLYVE1抗体の2-8 μLを吸引します。
- ICM注射用の30°角度またはThLb脊髄注射の10°角度で硬膜の内側領域にマイクロキャピラリーを導入し、硬膜の下1.5mmに押し込みます。
注:靭帯は穿刺されますが、ラミノクトミーは行われません。 - 10 μLの外科用接着剤を加え、ガラス毛細血管の周りの切開部を閉じ、乾燥するのを待ちます。
- 蛍光トレーサを1μL/分でゆっくり注入してください。射出量が届いたら、キャピラリーを1分間維持します。マイクロキャピラリーを引っ込み、注射孔を閉じるために外科用接着剤を追加します。
- 注射後、縫合クリップで皮膚切開部を閉じる。ステレオタックス装置からマウスを取り出し、37°Cの手術後の温室に入れ、回復するまで下します。
3. 灌流と組織解剖
- CSFトレーサー注射後15分または45分で、ペントバルビタールナトリウムの致死量(100μL)をIPに注入します。尾または足をつまんで、反射がないことを確認します。
- 解剖はさみで、皮膚を切り、下腹部領域から胸部ケージに向かって腹膜層を開きます。胸部ケージをはさみで開き、心臓にアクセスします。
- 心臓の左腹腔内に26G針を挿入し、2mL/minで1x PBSで20mLの氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA)で浸透し始めます。はさみを使用して、右心房を迅速に切断し、灌流液流を放出します。
- 鉗子で皮膚を完全に取り除き、はさみで4本の脚を切ります。すべての内臓を取り除くが、LNsをそのまま維持するように注意してください。
注:下顎のLNは表面的であるため、皮膚を切り落とすときは取り除かないように注意してください。深頚部LN(dcLNs)は、気管の両側に位置し、内部頸静脈の側面に接触し、立体筋に近い。 - 肋骨を切り取り、脊髄を内側から腰部に取り除きます。
- 解剖した組織を氷冷4%PFAに1x PBSで50mLチューブ(〜18時間)で一晩4°Cで浸漬します。 5分間PBSの50mLで固定組織3xを洗浄します。
4. 椎体セグメントの蛍光マクロコピー
- カメラを使用して蛍光ステレオズーム顕微鏡の下にサンプルを配置します (材料表)。サンプルの概要を確認するか、特定の領域をズームします。
5. 全体のマウント免疫染色のためのサンプル調製
- マイクロトームブレードを使用して、後頭部および頸部レベルで頭と椎骨の柱を横切って切断する。
注:この解剖は、脊椎柱の残りの部分から頭部および頸椎領域を分離することを可能にする。 - マイクロトームブレードで、椎骨柱の頸部、胸部、および仙骨領域を、それぞれ約0.5cmの2-4椎骨のセグメントに横切って切断します。
- 椎体の頸部領域と胸部領域の全長に沿って、椎体軸から分離された順序で各セグメントを分離する。2 mL 1x PBS のチューブ内の各サンプルを保持します。
6. iDISCO+ 椎体セグメントの全体マウント免疫染色
注: iDISCO+ プロトコルの詳細な説明は、http://www.idisco.infoでアクセスできます。
- 1日目:組織脱水
- 椎体組織試料(すなわち、椎体セグメント)を20%、40%、60%、80%、100%メタノールを1時間攪拌して1時間PBSで連続浸漬して脱水する。
- 室温(RT)で33%メタノール/66%ジクロロメタン(DCM)の溶液に一晩攪拌してサンプルをインキュベートします。
- 2日目:組織の漂白
- サンプルを100%メタノールで1時間洗浄し、1時間RTで、サンプルをメタノール(30%H2O2およびメタノール1:52v/v)で一晩4°Cでインキュベートします。22
- 3日目:脱灰・透過化工程
- サンプルを80%、60%、40%、20%メタノールで徐々に再水和し、次いで1x PBS(各溶液中1時間)で攪拌しながらRTに再水和する。
- 骨構造を維持するために、骨構造を維持するために、モルス溶液(クエン酸三ナトリウム10%、ギ酸45%のギ酸1:1 v/v)で30分間、サンプルをインキュベートして椎骨を脱灰します。
- サンプルを1x PBSで2xリンスし、PTx2溶液で1時間2倍インキュベート(1x PBSでは0.2%トリトンX-100、2回目のインキュベーションのために更新)を攪拌してRTで行います。次に、前処理したサンプルをパーメアビライズ溶液(PTx2と20%ジメチルスルホキシド[DMSO]、2.3%w/vグリシン)を37°Cで24時間インキュベートします。
- 4 日目: ブロックステップ
- サンプルをブロッキング溶液(PTx2と6%ロバ血清、10%DMSO)で37°Cで24時間インキュベートします。
- 日 5-16: 全体マウント免疫標識
- PTwHで希釈された一次抗体のインキュベートサンプル(1x PBSでは10mg/mLで0.2%Tween-20および0.1%ヘパリンを含む1x PBS)を37°Cで5%DMSO/3%ロバ血清で6日間培養した。一晩攪拌でRTでPTwHで4-5倍のサンプルを洗浄します。
- 37°Cで37°CでPTwHの二次抗体希釈液中のサンプルを4日間インキュベートする。PTwH 4-5xで、一晩攪拌下でサンプルを洗浄してからクリアします。
- 17日と18日目:iDISCO+ 組織クリアリング
- サンプルを1xPBSに連続浸漬して徐々に脱水し、次いで20%、40%、60%、80%、および2xを100%メタノール(各溶液中で1h)にする。各サンプルを33%メタノール/66%DCMの溶液で一晩インキュベートします。
- メタノールを取り除くために100%DCMで2倍を15分間洗浄する。ジベンジルエーテル(DBE)で、クリアされるまで振盪せずにインキュベートし(4時間)、イメージング前にRTでDBEに保存する。
7. LSFMイメージング
- 画像は、4x / 0.3の目的を備えたLSFMを持つトランスバーサル平面内のサンプルをクリアしました。
- 片側 3 枚のシート照明構成、固定 x 位置(ダイナミック フォーカスなし)を使用します。561 nm、100 mWに調整されたLEDレーザーを使用してください。および639 nm、70 mW。ライトシートの数値開口を30%に設定します。
- 異なるエミッションフィルタを使用する:Alexa Fluor-568または-555の場合は595/40、Alexa Fluor-647の場合は-680/30。
- 顕微鏡室にDBEを充填します。
- Aquire スタック 2.5 μm z ステップと 30 ms のカメラとステップあたりの露出時間 (材料表)。x2 光学ズームを使用して、(x8)、0.8 μm/ピクセルの有効な倍率を実現し、フルフレームで10%のオーバーラップを使用してモザイクの取得を実行します。
- 取得ソフトウェアで.tif形式の画像を取得し、ファイル変換ソフトウェアで3D形式に変換します。
- スティッチソフトウェア(資料表)を使用してモザイクの取得を再構築します。画像を開き、画像の10%の重なりをガイドラインとして使用して、モザイク画像全体を再構成するために手動で移動します。
- 図1、図2、図3、図4に示すように、3Dソフトウェア(材料表)を使用してデータの直交投影を生成し、リンパ管および他の解剖学的構造に色分け属性を追加します。メーカーの指示に従ってLSFMから得られた生データに1.47のガンマ補正を設定します。
Representative Results
椎体リンパ管の3D画像
図1は、iDISCO+ /LSFM手順のステップと、iDISCO+-処理されたThLb椎骨の脊椎管内のリンパ回路+のLSFM画像を示す。iDISCO+とLSFMの組み合わせは、椎体解剖学を保存し、周囲の骨、靭帯、筋肉、神経節内のリンパ管ネットワーク(すなわち、椎体外血管に接続された椎骨外血管が椎体から外側に出る)の図を捉えた。
dcLN排水の蛍光マクロコピーイメージング
CNS関連リンパ系における高分子排液を画像化するために、高分子トレーサーはCSFまたは脊髄パレンチマのいずれかに注射することによって生体内で管理された。高分子トレーサーは、水槽マグナのCSFに容易に送達することができる。システルナマグナは、小脳と延髄の延髄の後面の間に位置し、前兆のマグナムの上にあります。高分子トレーサーはまた、椎骨柱に沿って異なるレベルでの立体性手術によって脊髄質転換に注入することができる。
使用した高分子トレーサーは、フルオロフォアで直接標識するか、特定の抗体を用いた免疫組織化学によって死後を検出した。図2Aは、OVA−A555、赤色蛍光および小分子量トレーサー(約45kDa)を、CSF(図2B)または脊髄のThLb領域のいずれかに注入した(図2C)を追跡するための実験計画を示す。
高分子トレーサー注射後45分で、マウスを屠殺し、4%PFAを透過させ、脱カルシウム化・明示した頭部の脳幹領域と椎骨柱の解剖セグメントを分離するために処理した。その後、CSFおよび硬膜外液を収集するLNの蛍光マクロコピーイメージングによって、高分子排液を容易に評価した。図2に示すように、脊髄のCSF(図2B)またはThLb(図2C)領域へのOVA-A555注入は、注射後45分でDCRNにOVA-A555蓄積をもたらした。この観察は、リンパ系による蛍光トレーサの取り込みと排水を示す。椎体リンパドレナージを画像化するiDISCO+/LSFM手順を追求する前に前提条件です。
椎体リンパ系における高分子排液の3Dイメージング
dcRnにおけるOVA-A555 標識の検出に基づいて、iDISCO+/LSFM手順を、OVA-A555-注入マウスから分離された脱カルシウム化および事前にクリアされた椎体サンプルに適用することができる。このアプローチにより、トレーサー注射後の特定の時点でのCSFおよび脊髄硬膜外液のリンパドレナージの3Dマップを作成することができた。この3Dマッピングは、連続したCNSセグメントを、椎骨柱の各レベルで、射出点からイメージングすることによって行うことができる。
図3Aは、THLb脊髄質に対するOVA-A555注入の実験計画と、リンパ管管構造と併せて、頸部および胸部椎間セグメントにおけるOVA-A555分布の結果として生じる3Dパターンを示す。555OVA-A555注射後45分で、OVA-A555蓄積が脊髄組織およびdcRN(図3Bの白矢印)で検出され、図2に示す顕微鏡観察と一致した。555しかし、抗LYVE1抗体で標識された子宮頸部および胸部リンパ管系血管系では検出されなかった。脊椎リンパ管におけるCSF注入トレーサーの不在は、リンパ管内トレーサーの短い持続時間またはリンパ管によるトレーサーの取り込みの欠如のいずれかによるものであってもよい(図3C)。
第1の仮説をテストするために、ウサギ抗LYVE1抗体をリンパ管内皮細胞タグとして使用し、CNS関連リンパ管を結合した。注射されたウサギ抗LYVE1抗体は、その後、抗ウサギ二次抗体を用いて免疫組織化学によって検出され、リンパ性内皮細胞は抗PROX1抗体で免疫標識された。図4は、ThLb脊髄質素への抗LYVE1注射の実験設計を表し(図4A)、およびPROX1+リンパ系に関して、注射部位に近いThLbセグメントにおけるLYVE1抗体の3D分布パターン+を示す(図4B)。椎体リンパ管とその椎外リンパ系の両方を注射した抗LYVE1抗体によって標識され、椎体リンパ管によるトレーサー取り込みと椎外リンパ系に向けたリンパドレナージを立証した。LN は ThLb 領域に欠けていたため、イメージされたセグメントでは視覚化できませんでした。さらに、リンパ管に沿って観察されたLYVE1マーカーの不連続パターンは、リンパ管構造におけるLYVE1の不連続発現を反映している可能性が高く、これまでの研究14,21,21で報告された。全体として、本研究の結果は、トレーサー注射後45分で、LYVE1抗体が、OVA-A555ではなく、局所的な脊椎リンパ系の取り込みの検出を可能にし、局所脊椎リンパドレナージの持続的マーカーとしてOVA-A555より好まれることを示した。
図1:脊椎リンパ管系の3次元図。(A) プロトコルの概略表現。(B) 後頭前から見たThLb椎骨リンパ管の3D図の平面図。リンパ管を、iDISCO+プロトコルを用いて抗PROX1抗体(緑色)で免疫標識し、次+いでLSFMによって画像化した。3つの連続した椎骨(白い矢頭)の脊椎管内の血管系の血管系のメタマー状のパターンに注意してください。半円体の後頭部(白い矢印)に加えて、各椎骨ネットワークには、腹側枝(黄色の矢印)、脊髄ラミと神経節(白い矢印)に沿った両側の側方向出口経路、および正中線の後側出口経路(白い二重矢印)が含まれていました。椎骨ネットワークは縦方向の血管(紫色の矢印)と相互接続された。完全な説明については、ヤコブ L. ら18 SC = 脊髄を参照してください;アスタリスク = 腹側椎体;D = ドーサル;L = 横V = 腹側;スケールバー= 300 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: DCL は、OVA-A555ラベル付き CSF 流体を収集しました。(A) 実験計画のスキームOVA-A555をICMまたはThLb脊髄質間のいずれかに注射し、次いで注射後45分のマウスを屠殺した。サンプルをクリアし、蛍光マクロスコープイメージング(B、C)によって観察したC。ICM-(B)およびThLb-(C)から生膜椎骨の蛍B光マクロスコープ画像がマウスをC注射した。OVA-A555は、dcRn(B、C、B白矢印C)、頸髄の頭脳および血管内腔(B、C)およびICM注射後、子宮C頸神経(B、白矢印)に沿って起こりうる腹腔出口経路に蓄積していることに注意してください。SC = 脊髄。アスタリスク = 腹側椎体;D = ドーサル;L = 横V = 腹側;BとC = 2 mmのスケールバーをクリックして、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脊椎リンパ系におけるOVA-A555-標識CSF液の検出。(A) 実験計画のスキームOVA-A555をThLb脊柱パレンチマに注射し、次いで注射後45分でマウスを屠殺した。サンプルは iDISCO+プロトコルで処理され、LSFM でイメージ化されました。(B,C)頸部(B)および胸部(C)脊椎セグメントのLSFM捕獲前頭3Dビューの平面図。OVA-A555蓄積(赤色)は、脊髄組織およびdcRn(B、B白矢印)で検出されたが、図2に示すように、抗LYVE1抗体(緑色)でここで標識された子宮頸部および胸部リンパ管系血管系には検出されなかった。SC = 脊髄;アスタリスク = 腹側椎体;D = ドーサル;L = 横V = 腹側;スケールバー = 1 mm(B),300 μm(C).この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:抗LYVE1抗体の脊髄内注射後の椎体リンパドレナージの検出。(A) 実験計画のスキーム抗LYVE1抗体をThLb脊髄パレンチマに注射し、次いでマウスを注射後45分を屠殺した。サンプルは iDISCO+プロトコルで処理され、LSFM でイメージ化されました。(B) LSFM でキャプチャされた、ThLb (B) スパイン セグメントの正面 3D ビューの平面図。抗LYVE1抗体は抗ウサギ抗体(紫色)および抗PROX1抗体(緑色)を用いたリンパ管系で検出された。白い血管はPROX1+リンパ球と抗LYVE1抗体(B);である。これらには、椎骨(黄色い矢印)および椎外(二重黄色の矢印)リンパ薬が含まれます。SC = 脊髄;アスタリスク = 腹側椎体;D = ドーサル;L = 横V = 腹側;スケールバー = 300 μm(B)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | ターゲット | 図 | プロトコルのステップ | コメント |
| OVA-A555 | CSFトレーサー | 図2と図3 | 2. ICM または ThLb インジェクション 7. LSFMイメージング。 |
水溶性、注入が容易で、高い強い蛍光 |
| 抗ライブ1抗体 | 細胞の膜マーカー | 図 3 | 6. iDISCO+全体マウントイムヌーノステイン。 7. LSFMイメージング。 |
全型マウントイムヌーノステインに対する効率的な抗体 |
| 硬膜および硬膜外のLVのトレーサー排水 | 図 4 | 2. ICM または ThLb インジェクション 6. iDISCO+ 全マウントイムヌーノステイン 7. LSFMイメージング |
||
| 抗プロックス1抗体 | LV細胞の核マーカー | 図1と図4 | 6. iDISCO+ 全マウントイムヌーノステイン 7. LSFMイメージング |
全型マウントイムヌーノステインに対する効率的な抗体 |
表1:研究で使用した抗体およびトレーサー。
| 問題 | 考えられる理由 | ソリューション | |
| トレーサー注射のための外科 | 望ましくないCNS組織病変 | 1. ガラス毛管挿入の制御の欠如 2. ガラス毛管挿入の不正確な深さ |
1.慎重に穿刺しますが、完全には、ガラス毛細血管挿入の前に26 G針を持つ硬膜のマーター。 2. ガラスキャピラリー挿入の深さを減らす(<1.5 mmの硬膜から)。 3. ガラスキャピラリー径を小さくします。 |
| 硬膜外または椎外腔に注入されたトレーサーの不要な脱出 | トレーサーの誤った注入 | 1. ガラスマイクロキャピラリーが硬膜を穿刺に十分に挿入されているかどうかを確認します。 2. トレーサーを注入する前に、ガラスのマイクロキャピラリーと囲まれた組織の間に外科用接着剤を追加します。 |
|
| 注入されたトレーサーの過剰な量 | 注入されたトレーサーの容積を減らす(<2 μL)。 | ||
| iDISCO+ 免疫染色 | 組織における標識の不在、不均一性または過剰な背景 | 1. 一次抗体の濃度に関する問題 2. パーメアビライゼーションが不十分 3. 洗浄が不十分 4. 不十分な清算 |
インキュベーションステップの数および/または時間を増やす:透過、強打、一次抗体およびクリアリング。http://www.idisco.info(FAQ とトラブルシューティング)を参照してください。 |
| 不十分なデカチケーション | 特に、ヘッド組織に対してEDTA21 またはモールス溶液を用いたサンプルのより厳格な脱灰処理を使用してください。 | ||
| iDISCO+ クリアリング | サンプルは不透明または茶色 | 漂白不足 | 新鮮なH2O2 溶液を使用して、ボリュームおよび/またはインキュベーション時間を増加させます。 |
| 酸化の存在 | 空気の存在を避けるために完全にチューブを充填します。 | ||
| クリアリングが不十分 | ボリュームやインキュベーション時間を増やします。http://www.idisco.info(FAQ とトラブルシューティング)を参照してください。 | ||
| トレーサー検出 | 検出不可能なトレーサー | 選択したトレーサーの不適切な組み合わせ | Alexa 555、594および647フルオロ,クロムはiDISCO+ プロトコル5、6、7、8、9、106,7に耐性があります。,9,1058ただし、FITC、GFP、RFPフルオロクロムについては、この場合とは言えない。 |
| 注射後の犠牲のタイムポイント | 局所脊椎リンパ管の短期(15分)排水分析のためにOVA-A555 を好む。リンパ節の排水分析では、OVA-A555 およびLyve1抗体を長期間(>45分)分析に使用できます。 | ||
| イメージング:キャプチャと分析 | リンパ回路の撮影画像は満足のいくものではない | 解剖の問題(リンパ節が欠けている) | あなたが画像したいリンパ回路に従って、あなたの解剖されたサンプルに椎骨/頭蓋骨の隣接する組織を注意深く含めます。 |
| イメージングの問題 | 1. LSFMの取得パラメータを変更する:レーザー強度、光シートの数値開口、光シートの厚さ、博覧会の時間。 2. サンプルを支持体に入れ、目的になるまで組織を通る光によって移動する経路を減らします。 3. 取得中に組織サンプルの内部に気泡がないことを確認してください。 |
表 2: プロトコルの各ステップに関するトラブルシューティングのアドバイス (考えられる問題や解決策など)。
Discussion
iDISCO+/LSFM プロトコルは、周囲の組織内の CNS 関連リンパネットワークを細胞分解能レベルで前例のない 3 D ビューで表示します。このプロトコルは、LSFM光学系の限界、作業距離の短縮、および高解像度顕微鏡23用の商用対物レンズの大きなサイズのために、1.5cm3をexededしていない中型サンプルにうまく適応される。3この制限は、脳関連リンパ系全体をキャプチャすることを防ぎます.調査領域は慎重に区切られなければいけませんし、CNSを取り巻く組織は、リンパ回路全体に寄与する頭蓋外リンパ管およびLNを含めるために注意深く解剖されなければならないことに注意することが重要です(表2)。
サイズと解剖学的考察に加えて、周囲の間葉組織の複雑さは頭蓋骨および椎骨柱に沿って変化し、均質なサンプルの明確化を得るために脱灰および前駆除処理の適応を必要とし、柔らかい等方性の生物学的組織内で光線の伝播を可能にする。骨の不在時には、脳または脊髄組織のLFSMイメージングは、脱灰工程を必要とせず、そして、キャプチャされた画像の最終的な解像度は最適19である。上記のプロトコルは、モールスの溶液を用いた軽度の脱灰ステップを含むが、図1および図4に示すように、椎骨カラムのLSFMイメージングに適している。対照的に、首領域は、筋肉、脂肪、および腺組織の複数の層に加えて特に複雑な骨解剖学を表示し、キャプチャしたLSFM画像の品質を低下させる、図3Bに反映される。首と頸部領域のLSFMイメージングは、このように組織のより厳しい治療によって改善され得る;たとえば、EDTA では、前に報告された24などです。したがって、デケイシングステップは重要であり、完全なiDISCO+プロトコルを開始する前に使用される各抗体についてデケイシング条件を事前にテストする必要があります(表2)。
iDISCO+/LSFM プロトコルでは、髄膜と硬膜外の空間と関連する LUN 間の接続回路の 3D ビューを生成できます。 LSFMキャプチャ画像からのリンパ管系の直接定量的分析は、以下の理由で実現不可能である:1)リンパ管回路の線引きはリンパマーカー発現の不連続パターンのために信頼性が低い。なぜなら、membranar LYVE1は異端分布21であり、PROX1は核発現パターンを有する。2)抗体の異種の浸透、ならびに不完全で不均一な不均一な脱灰および予めのクリアリングのために生体組織に持続し得る異方性。LSFMイメージングは、インタラクティブな可視化を可能にし、リンパ管構造の定量化を容易にするバーチャルリアリティツール(www.syglass.io)によって拡張される必要があります。また、CNS関連回路の正確な記述は、特に,14,硬膜およびCSFに関するリンパ管の位置を正確に局在させるために、薄い(5〜10 μm)の凍結スタットまたはパラフィン埋め込まれた組織切片上で従来の免疫標識によって得られた高解像度共焦点データを用いてLSFM情報をバックアップする必要があることにも注目に値する。
iDISCO+/LSFM プロトコルにより、図 3および図 4に示すように、CNS 関連リンパ系における高分子排液の三次元可視化が可能になります。しかしながら、リンパドレナージの機能評価は、上記で詳述したiDISCO+/LSFMプロトコルに+関する勧告に加えて、厳密な手順に従い、最終的な結果は注射手術の質、送達部位の選択、使用される高分子マーカーの種類および注入量、およびトレーサー投与後の犠牲の時間に依存する必要がある(表2)。. 注入された動物間のトレーサーパターンの変化のために、リンパドレナージ回路の特徴付けには、大規模な実験群が必要です(注入条件による10)。提示されたプロトコルでは、1)硬膜は、不必要な病変およびCNS組織への浸透を防ぐために注入前に穿刺されなければならない。2)注入された容積は、注入穴を通る不必要な拡散を制限するために2μL未満でなければならない、 注入毛細管に沿って、硬膜外の空間または椎体外組織に;3)注射毛細血管挿入の深さは、ICMおよび脊髄内注射におけるCNS傷害または誤標的化を避けるために、硬膜下2mmに制限されなければならない。また、リンパ管内に注入されたトレーサーの存在を評価するために、隣接する椎体セグメントの相補的な高解像度共焦点解析を行う必要があることにも注意してください。この分析では、マーカー標識リンパ管の断面にトレーサーとリンパマーカーの強度プロファイルプロットを確立する必要があります。このアプローチは、注射後15分でThLbリンパ球によるOVA555取り込みを実証するために以前に使用されてきた(補助図5F(ヤコブ14))。しかしながら、本研究では抗LYVE1トレーサーについては図示されていない(図4)。
可能なCSFトレーサーの間で、OVA-A555はiDISCO+プロトコルの処置に対して抵抗力があり、LSFMのイメージ投射のための高い蛍光を維持するので優秀な選択である。ただし、トレーサーのタイプは、解析の時点(表1および表2)に従って選択する必要があることに注意してください。上記で報告されたように、局所脊椎リンパ管のOVA-A555標識は、注射14後15分で観察される。しかし、OVA-A555は、抗LYVE1抗体とは対照的に、注射後45分(図3)でこれらの局所リンパ回路で検出されなくなりました(図4)。
結論として、iDISCO+/LSFMプロトコルは、CNSおよび脊椎列癌、または椎骨および関節疾患などの生理学的および病理学的状態におけるCNS関連リンパ系の3D構造および排水を調査するために十分に適合している。完全な手順は長く、方法論的な厳格さを必要としますが、バーチャルリアリティツールと高解像度共焦点イメージングを使用して補完的な分析を使用すると、貴重でユニークな情報を提供します。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、サンテ・エ・ラ・レシェルシュ・メディカルの研究所によって支えられ、 アジェンス・ナショナル・レシェルシュ(ANR-17-CE14-0005-03)、連盟はラ・レシェルシュ・シュル・ル・セルヴォー(FRC 2017)、カルノー・マチュレーション(L.J.へ)、ユニバーシダーデ連邦デリオ・デ・ジャニエロ(J.B.のためのUFRJ)、(R01EB016629-01)を注ぎます。私たちは、ICMプラットフォームを認めます: 細胞イメージングのためのICM-QUANTと免疫細胞化学のためのICM-ヒストミック.すべての動物の作業は、PHENO-ICMice施設で行われました。コアは2「投資ダベニール」(ANR-10- IAIHU-06とANR-11-INBS-0011-NeurATRIS)と「フォンダシオンはレシェルシュメディカルを注ぐ」によってサポートされています。私たちは、方法論的なアドバイスと原稿の読書のためにニコラス・ルニエを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
| Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
| Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
| Needles 26G (0.45x13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
| Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
| Microscopes and imaging softwares | |||
| AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
| Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
| Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
| LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
| Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
| Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
| Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
| Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
| Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
| Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
| Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
| Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
| Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
| Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
| Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
| Surgical tools and equipments | |||
| Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
| Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
| Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
| Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
| Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
| Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
| Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
| Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |
References
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