Summary
Presentert her er en protokoll som beskriver overvåking av hele livssyklusen til rovbakterien Bdellovibrio bakteriovorus ved hjelp av time-lapse fluorescens mikroskopi i kombinasjon med en agarose pad og celle-imaging retter.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus er en liten gram-negativ, obligatorisk rovdyr bakterie som dreper andre gram-negative bakterier, inkludert skadelige patogener. Derfor regnes det som et levende antibiotika. For å bruke B. bakteriovorus som et levende antibiotika, er det først nødvendig å forstå de store stadiene av sin komplekse livssyklus, spesielt spredning inne i byttedyr. Så langt har det vært utfordrende å overvåke påfølgende stadier av rovlivssyklusen i sanntid. Presentert her er en omfattende protokoll for sanntidsavbildning av hele livssyklusen til B. bakteriovorus, spesielt under veksten inne i verten. For dette formålet brukes et system bestående av en agarosepute i kombinasjon med celleavbildningsretter, der rovcellene kan bevege seg fritt under agaroseputen mens immobiliserte byttedyrceller er i stand til å danne bdelloplasts. Anvendelsen av en stamme som produserer en fluorescerende merket β-underenhet av DNA polymerase III ytterligere tillater kromosom replikering som skal overvåkes under reproduksjonsfasen av B. bakteriovorus livssyklus.
Introduction
Bdellovibrio bakteriovorus er en liten (0,3–0,5 μm med 0,5–1,4 μm) gram-negativ bakterie som bytter på andre gram-negative bakterier, inkludert skadelige patogener som Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Shigella flexneri1,2,3. Siden B. bakteriovorus dreper patogener, regnes det som et potensielt levende antibiotika som kan brukes til å bekjempe bakterielle infeksjoner, spesielt de som er forårsaket av multiresistente stammer.
B. bakteriovorus viser en særegen livssyklus bestående av to faser: en frittlevende ikke-repliktiv angrepsfase og en intracellulær reproduksjonsfase (figur 1). I frilivsfasen søker denne svært motile bakterien, som beveger seg med hastigheter på opptil 160 μm/s, etter byttet. Etter å ha festet seg til byttets ytre membran, kommer den inn i periplasma4,5. Under den interperiplasmiske reproduktive fasen bruker B. bakteriovorus en mengde hydrolytiske enzymer for å forringe vertens makromolekyler og gjenbruke dem for sin egen vekst. Kort tid etter å ha invadert periplasma, dør vertscellen og bloats inn i en sfærisk struktur kalt en bdelloplast, inne som rovcellen langstrakte og replikerer kromosomene. Replikeringsprosessen starter på replikeringsopprinnelsen (oriC)6 og fortsetter til flere kopier av kromosomet er fullstendig syntetisert7. Interessant, replikering av hvert kromosom etterfølges ikke av celledeling. I stedet forlenger rovdyret for å danne en lang, multinukleoid og filamentøs celle. Ved uttømming av næringsstoffer gjennomgår filamentet synkron septering og avkomceller frigjøres fra bdelloplast8.
Før B. bakteriovorus kan brukes som et levende antibiotika mot bakterielle infeksjoner, er det avgjørende å forstå de viktigste stadiene av livssyklusen, spesielt de som er relatert til spredning inne i byttet. Live-celle avbildning av B. bakteriovorus har vært utfordrende, på grunn av de ulike morfologiske former for rovdyret og dens byttedyr under den komplekse livssyklusen. Så langt har interaksjonene mellom B. bakteriovorus og vertscellen hovedsakelig blitt studert av elektronmikroskopi og snap-shot analyse2,9,10, som begge har begrensninger, spesielt når de brukes til å overvåke påfølgende stadier av rovlivssyklusen. Disse metodene gir høyoppløselige bilder av B. bakteriovorusceller og muliggjør observasjon av et lite rovdyr under angreps- eller vekstfasen. Imidlertid tillater de ikke sporing av enkelt B. bakteriovorusceller gjennom begge livssyklusfasene.
Presentert her er en omfattende protokoll for bruk av time-lapse fluorescens mikroskopi (TLFM) for å overvåke hele livssyklusen til B. bakteriovorus. Et system bestående av en agarose pad brukes i kombinasjon med en celle-imaging parabolen, der de rovdyrcellene kan bevege seg fritt under agarose pad mens immobiliserte byttedyr celler er i stand til å danne bdelloplasts (Figur 2). Dette oppsettet er utarbeidet basert på spesifikke stammer av både E. coli og B. bakteriovorus, men protokollen kan lett endres for å passe til en brukers individuelle stammer (f.eks. bærer forskjellige utvalgsmarkører, proteiner smeltet sammen med forskjellige fluoroforer, etc.).
I dette tilfellet, for å visualisere B. bakteriovorus under angrepsfasen, ble en bestemt stamme (HD100 DnaN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) konstruert som uttrykker en fluorescerende merket versjon av cytoplasmatisk protein, PilZ (tilgjengelig i vårt laboratorium på forespørsel)7. Denne stammen produserer i tillegg DnaN (β-glidende klemme), en underenhet av DNA polymerase III holoenzyme, smeltet sammen med et fluorescerende protein. Dette gjør det mulig å overvåke pågående DNA-replikering inne i rovcellene etter hvert som de vokser innenfor bdelloplasts.
Selv om den beskrevne protokollen og programvaren som brukes til bildeoppkjøp refererer til et omvendt mikroskop levert av en bestemt produsent (se Materialstabell), kan denne teknikken justeres for ethvert invertert mikroskop utstyrt med et miljøkammer eller en annen ekstern varmeholder og i stand til tidsforløp. For dataanalyse kan brukerne velge hvilken som helst tilgjengelig programvare som er kompatibel med de enkelte utdataformatene.
Figur 1: B. bakteriovorus livssyklus i E. coli som vertscelle. Under angrepsfasen søker en frittsvømming B. bakteriovoruscelle etter og festes til en vert E. coli-celle. Etter invasjonen blir rovcellen lokalisert i byttets periplasma, endrer vertscellens form og danner en bdelloplast. Den reproduktive fasen starter med bdelloplast dannelse. Rovcellen fordøyer byttedyrcellen og gjenbruker enkle forbindelser for å bygge sine egne strukturer. B. bakteriovorus vokser som en lang enkelt filament inne i vertens periplasma. Når byttedyrcellens ressurser er oppbrukt, er B. bakteriovorus filament synkront septater og danner avkomceller. Etter at avkomcellene utvikler sin flagella, lyser de bdelloplast. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av B. bakteriovorus lysat for mikroskopisk analyse
- I en 250 ml kolbe, sett opp kokulturen ved å kombinere 1 ml fersk 24 h B. bakteriovoruskultur (f.eks. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) og 3 ml byttekultur over natten (f.eks. E. coli S17-1 pZMR100) med 50 ml Ca-HEPES buffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) supplert med antibiotika ved behov (her, 50 μg/ml kanamycin).
- Inkuber coculture for 24 t ved 30 ° C med risting ved 200 rpm.
- Kontroller at byttedyrcellene er fullt lysert av væskemontert fasekontrastmikroskopi. På dette punktet bør mange motile angrepsfase B. bakteriovorusceller være tilstede, og ingen E. coli-celle eller bdelloplast skal være synlige.
- Filtrer B. bakteriovoruskulturen gjennom et 0,45 μm porestørrelsesfilter for å fjerne eventuelle gjenværende vertsceller. Rovceller (0,3–0,5 μm x 0,5–1,4 μm) trenger fritt inn i 0,45 μm porer, mens vertsceller beholdes på filteroverflaten.
- Spinn ned filtratet i 20 min ved 2469 x g og 30 °C i et konisk 50 ml konisk rør for å samle rovceller. Resuspend B. bakteriovorus pellet i 3 ml Ca-HEPES buffer (til en endelig OD600 på ca 0,2) og inkuber ved 30 ° C og 200 rpm i 30 min.
2. Utarbeidelse av vertsceller for B. bakteriovorus invasjon
- Bruk en enkelt koloni av vertsstammen (E. coli S17-1 pZMR100 anbefales på grunn av ulike cellestørrelser som resulterer i dannelsen av uqually size bdelloplasts) for å inokulere 10 ml YT medium (0,8% Bacto tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% NaCl [pH = 7,5]) som har blitt supplert med antibiotika, om nødvendig (her, 50 μg / ml kanamycin). Kulturceller over natten ved 37 °C og 180 omdr./min.
- Overfør 2 ml E. coli-kultur (OD600 på ~3,0) til et 2 ml-testrør og sentrifuge ved romtemperatur (RT) og 2469 x g i 5 min. Bruk pelleten på nytt i 200 μL ca-HEPES-buffer.
3. Oppsett av mikroskopet (se Materialtabell)
- Forvarm et mikroskopisk kammer med et 100x oljenedsenkingsmål til 30 °C i minst 1 time før bruk. Dette trinnet er nødvendig for å hindre feil i å opprettholde fokus under eksperimentet.
- Slå på både mikroskopet og mikroskopautomatiseringen. Initialiser kontrollprogramvaren og velg de riktige filtrene for å skaffe brightfield / DIC / fasekontrast og fluorescensbilder etter behov (her: BF-bilder, GFP / mCherry polychromic filter, og utslipp / eksitasjon for mCherry og GFP).
4. Montering av oppsett for time-lapse fluorescens mikroskopi
- Bland 200 mg lav fluorescerende molekylær karakter agarose med 20 ml Ca-HEPES buffer (1% endelig agarose konsentrasjon) og oppløse agarose i en mikrobølgeovn. Batchen kan brukes om igjen flere ganger etter at den stivner, så bare gjenta varmetrinnet.
- Hell 3 ml smeltet agarose i en 35 mm glassbunnsfat (Table of Materials). La agarose å stivne.
- Bruk en mikrospatel for laboratorier til å forsiktig fjerne agaroseputen fra 35 mm-parabolen uten å forstyrre midtstangen på agaroseputen. Snu puten nederst opp og legg den i et petriskåldeksel (figur 2).
- Sett 5 μL konsentrert E. coli suspensjon på toppen av den snudde puten og spre celler i midtstangen ved hjelp av en inokulasjonssløyfe. Tilsett 5 μL konsentrert B. bakteriovorus suspensjon (OD600 av ~ 0,2) på E.coli-belagt overflate. Ikke spre cellene.
- Returner raskt agarosegelen til den 35 mm glassbunnsfatet (oversiden vendt ned), og dekk deretter med et lokk. Fjern eventuelt eventuelle luftbobler ved å trykke forsiktig ned agaren mot platen.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. Agaroseputen fjernes fra 35 mm parabolen og vendes slik at bunnen vender oppover. Ferske suspensjoner av rovceller og over natten kultur av byttedyr celler er plassert på den snudde puten for å belegge "bunnen" side. Agarose pad vendes deretter til sin opprinnelige orientering og plasseres tilbake i 35 mm parabolen, som er montert på det inverterte mikroskopstadiet i mikroskopkammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Ledning av time-lapse fluorescens mikroskopi
- Plasser 35 mm parabolen i petriskålholderen slik at den ikke vil bevege seg i løpet av eksperimentet. Plasser en dråpe nedsenkingsolje (1,518 brytningsindeks) på målet, samt bunnen av 35 mm parabolen.
- Monter holderen på scenen av det inverterte mikroskopet i mikroskopkammeret.
- Konfigurer alternativene i mikroskopkontrollprogramvaren for å samle inn flere bilder på flere trinns posisjoner over tid.
- Still inn forstørrelsen (100x) og polykrom linse (GFP/mCherry). Ved hjelp av et øyestykke og brightfield (BF), finn fokusflyet og åpne punktlistelederen.
- Velg minst 10 posisjoner av interesse ved å flytte scenen og lagre koordinatene for hver posisjon i mikroskopprogramvaren ved å klikke på Merk punkt-knappen. Unngå posisjoner som ligger nær hverandre for å forhindre fotobleaching og fototoksisitet. Vri kameraventilen fra okularet til skjermen og kalibrer hvert punkt ved å stille inn fokusplanet og klikke på Erstatt punkt-knappen i punktlistebehandlingen.
- Åpne eksperimentutformingen, og angi alle eksperimentelle parametere i hver fane på følgende måte:
- Fjern merket for Z-stablingsboksen.
- Velg fluorescerende kanaler og still inn de optimale belysningsinnstillingene. Her ble følgende innstillinger brukt: for mCherry-kanalen, mCherry-filtersett (EX575/25; EM625/45), 50 % intensitet og 200 ms eksponeringstid; for GFP-kanalen, GFP-filtersettet (EX475/28; EM525/48), 50 % intensitet og 80 ms; og for BF bilder, POL kanal, 5% intensitet, og 50 ms.
- Velg intervaller mellom å anskaffe bilder og den totale tiden for eksperimentet. Her ble det utført 5 min intervaller i løpet av 10-timersperioden av eksperimentet.
- Aktiver fokusvedlikehold for de valgte posisjonene (for systemet som brukes her, ved å merke av for Vedlikehold fokus med UltimateFocus).
- Velg datamappen der bildefilene skal lagres automatisk.
- Kontroller alle innstillingene i mikroskopprogramvarekontrollen på nytt, og start deretter tidsforløpseksperimentet.
- Etter den første timen av eksperimentet, sjekk at alle trinnstillinger fortsatt er i fokus. Juster fokus under tidsintervaller mellom bildeanskaffelse, om nødvendig.
- Når time-lapse eksperimentet er ferdig, fjerne Petri parabolen og bruke 35 mm parabolen med en agarose pad i henhold til biosikkerhet protokollen.
MERK: Alle deltrinn etter trinn 5.2 er spesifikke for DeltaVision Elite-brukere. Forskere som bruker andre systemer må justere innstillingene i henhold til individuelle systemer.
6. Behandling av tidsforløpsbilder og generering av filmer ved hjelp av Fiji-programvare
- Overfør eksperimentelle data til en datamaskin lastet med Fiji-programvaren. Start Fiji-programmet og åpne et bilde ved hjelp av Fil | Åpne eller ved ganske enkelt å dra og slippe bildefilen til Fiji.
- I Bio-Formater Importalternativer, velg Vis stabel med Hyperstack i stabelen visningsalternativer, Klikk på Kompositt fargemodus i fargealternativene, og merk Autoskala.
- Ved å bla gjennom bildestablene, bør du vurdere om cellene og bdelloplastene forble i fokus i løpet av eksperimentet. Sjekk om grønne fluorescerende flekker fra DnaN-mNeonGreen er til stede i B. bakteriovorusceller inne i bdelloplasts gjennom vekstfasen, og sørg for at alle stadier av rovlivssyklusen kan visualiseres.
- Hvis du vil analysere en bestemt B. bakteriovoruscelle/bdelloplast, merker du den ved hjelp av markeringsverktøyene i Fiji-menyen (Rektangel, Oval, Polygon eller Freehand). Duplisere det valgte området ved hjelp av Bilde | Duplisere eller ved hjelp av Ctrl + Shift + D.
- Juster lysstyrken og kontrasten for hver fluorescenskanal på følgende måte:
- Hvis du vil velge én enkelt kanal, åpner du Kanalverktøy ved å klikke bilde | Farge | Kanalverktøy eller Ctrl + Shift + Z, og velg interessekanalen (Kanal 1: mCherry, Kanal 2:mNeonGreen, Kanal 3: brightfield).
- Juster lysstyrken og kontrasten til bildene i fluorescenskanalen ved å åpne B&C-menyen i Bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast eller ved å klikke Ctrl + Shift + C.
- Legge til skaleringslinje ved hjelp av Analyser | Verktøy | Skaleringslinjen. Legg til tidsstempleren på bildene ved å klikke Bilder | Stabler | Tid Stamper.
- Hvis du vil lagre endrede bilder, går du til Fil | Lagre som og velg TIFF for å lagre som en bildesekvens, AVI for å produsere en film eller PNG for å lagre ett enkelt bilde av gjeldende ramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrevne TLFM-baserte systemet gjør at individuelle celler av B. bakteriovorus kan spores i tide (Figur 3, Movie 1) og gir verdifull informasjon om hvert trinn i den komplekse rovlivssyklusen. PilZ-mCherry-fusjonen gjør at hele rovcellen kan merkes i angrepsfasen, samt tidlig stadium av vekstfasen (figur 3). Overgangen fra angrepet til replikeringsfasen ble visualisert ikke bare av verten bdelloplast formasjon, men også ved utseendet av replisom (replikering maskiner), som var preget av DnaN-mNeonGreen fluorescerende foci (Figur 3).
Som tidligere demonstrert, ble replisome satt sammen på den invaderende cellestangen (pili-polet)7, og mer enn ett svar ble observert i en voksende B. bakteriovorus filament som reproduksjonsfasen utviklet seg (figur 3). Etter at flere kopier av kromosomet ble syntetisert, ble replikeringen avsluttet (visualisert som forsvinningen av DnaN-mNeonGreen foci). Til slutt gjennomgikk multinukleoid filament septering, og avkomcellene ble frigjort fra bdelloplast (figur 3).
Den presenterte protokollen som beskriver bildebehandlingen ved hjelp av Fiji-programvaren gir en trinnvis forklaring på hvordan du produserer en film for publisering fra den oppkjøpte time-lapse-serien (Film 1).
Figur 3: B. bakteriovorus livssyklus etterfulgt av time-lapse fluorescens mikroskopi. (A)Frittlevende rovdyr (B. bakteriovorus DNAN-mNeonGreen / PilZ-mCherry) og vert (E. coli) celler. (B)Vedlegg av B. bakteriovorus til E. coli. Bdelloplast dannelse.C (D, E) Filamentøs vekst og kromosomreplikasjon. (F)Avslutning av kromosomreplikasjon. (G)Start av synkron filament septering. (H)Bdelloplast lysis og frigjøring av avkomceller. Øvre paneler viser brightfield bilder, lavere paneler representerer sammenslått brightfield og fluorescens kanaler. Skala bar = 1 μm, tid = hh: min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Time-lapse imaging av B. bakteriovorus livssyklus i E. coli som en vertscelle. Subcellulær lokalisering av DnaN-mNeonGreen (grønn) i stamme HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. Rød kanal indikerer merking av rovdyrcellene med cytoplasmatisk PilZ-mCherry. Grå indikerer brightfield. Bilder ble samlet hver 5 min. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av den økte interessen for å bruke B. bakteriovorus som et levende antibiotika, er det nødvendig med nye verktøy for å observere rovlivssyklusen, spesielt rovdyr-patogeninteraksjoner. Den presenterte protokollen brukes til å spore hele B. bakteriovorus livssyklus, spesielt under veksten inne i verten, i sanntid. Videre, anvendelsen av en stamme som produserer fluorescerende merket beta klemme av DNA polymerase III holoenzyme aktivert overvåking av kromosom replikering progresjon gjennom reproduksjonsfasen av B. bakteriovorus.
Et kritisk trinn i denne metoden er riktig fremstilling av oppsett i 35 mm parabolen. En utfordring i å observere livssyklusen til B. bakteriovorus under mikroskopet er å etablere forhold som støtter rovvekst (involverer andre gram-negative bakterielle celler som vertsceller) og sørge for rovdyrcellemotilitet. En av de avgjørende aspektene ved effektive mikroskopiske observasjoner er behovet for en jevn fordeling av byttedyr på agaroseputen, som oppnås ved å spre cellene med en inokuleringssløyfe. Vertscelletettheten kan ikke være for høy, og de valgte observasjonspunktene skal inneholde et tilstrekkelig antall separate vertsceller. I mellomtiden bør Bdellovibrio-cellene være motile nok til å aktivt søke etter byttet sitt. Dermed bør de ikke spres ut eller lufttørkes før puten vendes tilbake og plasseres i parabolen. Noen ganger er større mengder rovdyr suspensjon nødvendig for å gi tilstrekkelig motilitet i et tynt lag med væske mellom agarose og glassoverflate.
En μ-Dish brukes her; Dette er imidlertid ikke avgjørende for protokollen. Enhver glassbunnsrett kan brukes. En fordel med μ-Dish er den optimale høyden og volumet av agarose banen, som gjør at kokultur av rovdyr og vert kan plasseres på undersiden av agarose pad. Det er også viktig å bruke friske B. bakteriovorusceller i forsøkene, da cellene mister motiliteten under langvarig lagring. En begrensning av denne protokollen er at brukere på ett enkelt synsfelt kan telle ca. 100 rovdyrceller og 100 vertsceller, men MOI kan anslås til 50 %–60 %.
Nåværende kunnskap om Bdellovibrio cellesyklusen er i stor grad basert på studier som har ansatt E. coli eller P. aeruginosa. Dette systemet tillater overvåking av B. bakteriovorus preying på en rekke bakterielle patogener, inkludert Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis, eller K. pneumoniae. Videre kan denne plattformen være nyttig i eksperimenter som involverer multiresistente patogener. Dermed kan det bidra til å lette forbedringer i genteknologi av B. bakteriovorus som et levende antibiotika i menneskelig og veterinærmedisin, spesielt for å bekjempe multiresistente patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Science Centre grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 til J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
